DE69928995T2

DE69928995T2 - Reagenz und Verfahren zu fester Phase Synthese

Info

Publication number: DE69928995T2
Application number: DE69928995T
Authority: DE
Inventors: Glenn H. Mcgall; Anthony D. San Jose Barone; Martin Diggelmann
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1998-06-22
Filing date: 1999-06-21
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2019-06-22
Also published as: HK1024920A1; EP0967217A2; US20040106728A1; EP0967217A3; ATE313548T1; EP0967217B1; JP2000044494A; DE69928995D1; EP1632496A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Festphasenpolymersynthese. Insbesondere stellt die Erfindung Verfahren und Reagenzien für die Festphasensynthese von Anordnungen (arrays) aus Oligomeren und kombinatorischen chemischen Bibliotheken bereit, die z.B. bei Screening-Untersuchungen zur Bestimmung der Bindungsaffinität oder einer anderen biologischen Aktivität verwendet werden können.
Die Synthese von Oligomeranordnungen und kombinatorischen Bibliotheken aus kleinen organischen Molekülen erzielte sowohl bei akademischen als auch industriellen Forschungsgruppen beträchtliche Aufmerksamkeit. Teilweise resultierte diese Aufmerksamkeit aus der Anwendung derartiger Anordnungen und Bibliotheken bei der Wirkstoffentdeckung oder beim Screening zum Erhalt von Sequenzinformationen von nicht sequenzierten Genen oder Genfragmenten. Viele dieser Anwendungen beinhalten die anfängliche Herstellung von Anordnungen oder Bibliotheken auf einem festen Träger.
Die Entwicklung der Festphasensynthese von biologischen Polymeren begann mit der frühen Festphasenpeptidsynthese nach „Merrifield", beschrieben in Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2154 (1963). Festphasensynthesetechniken wurden auch zur Synthese von verschiedenen Peptidsequenzen z.B. auf mehreren Stiften (pins) bereitgestellt. Siehe z.B. Geysen et al., J. Immun. Meth. 102: 259–274 (1987). Andere Festphasentechniken beinhalten z.B. die Synthese von verschiedenen Peptidsequenzen auf verschiedenen Celluloseplättchen, die in eine Säule eingebettet sind. Siehe Frank und Doring, Tetrahedron 44: 6031–6040 (1988). Noch andere Festphasentechniken sind in US-Patent Nr. 4,728,502, erteilt an Hamill, und WO 90/00626 (Beattie, Erfinder) beschrieben. Derivatisierte feste Träger mit einer spezifischen Formel zur Herstellung einer Vielfalt an Oligonukleo tiden sind in WO 95/31434 offenbart, wobei unter anderem eine symmetrische Verbindung offenbart ist, die eine Disulfid-Bindung umfasst.
Jede der obigen Techniken stellt nur Polymeranordnungen mit relativ niedriger Dichte her. Zum Beispiel ist die in Geysen et al. beschriebene Technik auf die Herstellung von 96 verschiedenen Polymeren auf Stiften beschränkt, die in den Abmessungen einer Standardmikrotiterplatte voneinander auf Abstand gehalten werden.
Verbesserte Verfahren zum Bilden von großen Anordnungen von Oligonukleotiden, Peptiden und anderen Polymersequenzen in einem kurzen Zeitraum wurden entwickelt. Es ist besonders zu erwähnen, dass Pirrung et al., US-Patent Nr. 5,143,854 (siehe auch die PCT-Anmeldung Nr. WO 90/15070) und Fodor et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/10092, Verfahren zum Bilden von enorm großen Anordnungen von Peptiden, Oligonukleotiden und anderen Polymersequenzen offenbaren; z.B. unter Verwendung von lichtgesteuerten Synthesetechniken. Siehe auch Fodor et al., Science, 251: 767–777 (1991). Diese Verfahren werden nun als VLSIPS^TM-Verfahren bezeichnet.
In der obigen genannten PCT-Anmeldung von Fodor et al. ist ein elegantes Verfahren zur Verwendung eines computergesteuerten Systems zum Durchführen eines VLSIPS^TM-Verfahrens beschrieben. Unter Verwendung dieser Vorgehensweise wird eine heterogene Polymeranordnung durch gleichzeitiges Koppeln an mehrere Reaktionsstellen in eine andere heterogene Anordnung umgewandelt. Siehe die US-Patent Nrn. 5,384,261 und 5,677,195.
Die Entwicklung der wie im oben genannten US-Patent Nr. 5,143,854 und in den PCT-Patentveröffentlichungen WO 90/15070 und 92/10092 beschriebenen VLSIPS^TM-Technologie wird als bahnbrechende Technologie auf diesem Gebiet der kombinatorischen Synthese und des Screenings von kombinatorischen Bibliotheken betrachtet. Die Patentanmeldung Serien-Nr. 08/082,937, eingereicht am 25. Juni, 1993, beschreibt Verfahren zur Herstellung von Anordnungen von Oligonukleotidsonden, die zum Bereitstellen eines Teils der Sequenz oder der vollständigen Sequenz einer Ziel-Nukleinsäure sowie zum Nachweis einer Nukleinsäure, welche eine spezifische Oligonukleotidsequenz enthält, verwendet werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die bei einer Festphasensynthese, einschließlich der Herstellung von Anordnungen von verschiedenen Polymersequenzen mit hoher Dichte, wie z.B. von diversen Peptiden und Oligonukeotiden, sowie bei der Herstellung von Anordnungen von verschiedenen Polymeren Anwendung finden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind diejenigen, die typischerweise als Verknüpfungsgruppen, Verknüpfer oder Abstandshalter bezeichnet werden.
Erfindungsgemäß werden neue Verbindungen bereitgestellt, bei denen es sich um asymmetrische Disulfid-Verknüpfungsgruppen handelt. Diese Verknüpfungsgruppen erlauben die schnelle und sanfte Abtrennung der synthetisierten Verbindung von dem festen Träger. Derartige Verbindungen weisen die Formel P¹-X¹-(W¹)_n-S-S-(W²)_m-X²-P² auf. P¹ ist eine photolabile Schutzgruppe und P² ein Mitglied, das aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer aktivierenden Gruppe und einer Schutzgruppe ausgewählt ist. X¹ und X² sind jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus einer Bindung, -O-, -NH-, -NR- und -CO₂- ausgewählt, wobei R eine niedere Alkylgruppe mit ein bis vier Kohlenstoffatomen ist. W¹ und W² sind jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Methylen, Oxyethylen und Oxypropylen ausgewählt. n und m sind jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 12. n und m sind nicht gleich, wenn W¹ und W² gleich sind. P¹ und P² sind nicht beide Wasserstoffatome.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A, 1B und 1C stellen Syntheseschemata zur Herstellung von asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungen bereit.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
INHALT

I. Glossar
II. Allgemeines
III. Neue asymmetrische Disulfid-Verknüpfungsgruppen
IV. Beispiele
V. Schlussfolgerung

I. Glossar
Die folgenden Abkürzungen werden vorliegend verwendet: AcOH, Essigsäure; ALLOC, Allyloxycarbonyl; BOC, t-Butyloxycarbonyl; BOP, Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat; DIEA, Diisopropylethylamin; DMF, Dimethylformamid; DMT, Dimethoxytrityl; DTT, Dithiothreitol; EtOAc, Ethylacetat; FMOC, Fluorenylmethyloxycarbonyl; MeNPOC, α-Methylnitropiperonyloxycarbonyl; MeNVOC, α-Methylnitroveratryloxycarbonyl; Schmp., Schmelzpunkt; NVOC, Nitroveratryloxycarbonyl; OBt, Hydroxybenzotriazolradikal; PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung; TFA, Trifluoressigsäure; DIPAT, Diisopropylammoniumtetrazolid; 2-CEBAP, 2-Cyanoethyl tetraisopropylphosphorodiamidit; DDZ, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl.
Die folgenden Begriffe sollen, wie vorliegend verwendet, die folgenden allgemeinen Bedeutungen aufweisen:
Chemische Begriffe: Wie vorliegend verwendet, bedeutet der Begriff „Alkyl" einen gesättigten Kohlenwasserstoffrest, der geradkettig oder verzweigt sein kann (z.B. Ethyl, Isopropyl, t-Amyl oder 2,5-Dimethylhexyl). Wird „Alkyl" oder „Alkylen" zum Benennen einer Verknüpfungsgruppe oder eines Abstandhalters verwendet, wird er als Gruppe mit zwei verfügbaren Wertigkeiten zur kovalenten Anheftung, z.B. -CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH(CH₃)CH₂- und -CH₂(CH₂-CH₂)₂CH₂- verwendet. Bevorzugte Alkylgruppen als Substituenten sind diejenigen, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wobei diejenigen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, besonders bevorzugt sind. Bevorzugte Alkyl- oder Alkylengruppen als Verknüpfungsgruppen sind diejenigen, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthalten, wobei diejenigen, die 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, besonders bevorzugt sind.
Der Begriff „Aryl" bedeutet wie vorliegend verwendet einen aromatischen Substituenten, bei dem es sich um einen einzelnen Ring oder mehrere Ringe handeln kann, die aneinander kondensiert, kovalent verknüpft oder mit einer gemeinsamen Gruppe wie einer Ethylen- oder Methyleneinheit verknüpft sind. Die aromatischen Ringe, z.B. Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Diphenylmethyl, 2,2-Diphenyl-1-ethyl, Thienyl, Pyridyl und Chinoxalyl, können jeweils Heteroatome enthalten. Die Aryleinheiten können auch mit Halogenatomen oder anderen Gruppen wie Nitro, Carboxyl, Alkoxy, Phenoxy und dergleichen gegebenenfalls substituiert sein. Zudem können die Arylreste an anderen Einheiten an einer beliebigen Position am Arylrest, die sonst von einem Wasserstoffatom belegt wäre (wie z.B. 2-Pyridyl, 3-Pyridyl und 4-Pyridyl) angelagert sein. Wie vorliegend verwendet, bedeutet der Begriff „Aralkyl" eine Alkylgruppe, die einen Arylsubstituenten trägt (z.B. Benzyl, Phenylethyl, 3-(4-Nitrophenyl)propyl und dergleichen).
Der Begriff „Schutzgruppe" bedeutet wie vorliegend verwendet eine beliebige der Gruppen, die dazu vorgesehen sind, eine reaktive Stelle in einem Molekül zu blockieren, während eine chemische Reaktion an einer anderen reaktiven Stelle durchgeführt wird. Insbesondere kann es sich bei den vorliegend verwendeten Schutzgruppen um beliebige derjenigen Gruppen handeln, die in Greene, et al., Protective Groups In Organic Chemistry, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York, NY, 1991, beschrieben sind. Die angemessene Auswahl von Schutzgruppen für eine bestimmte Synthese wird von dem bei der Synthese verwendeten Gesamtverfahren bestimmt. Zum Beispiel wird es sich im Falle einer „lichtgesteuerten" Synthese (nachstehend erörtert) bei den Schutzgruppen um photolabile Schutzgruppen wie Dimethoxybenzoin, NVOC, McNPOC und diejenigen, die in WO 94/10128 offenbart sind, handeln. In anderen Verfahren können die Schutzgruppen durch chemische Verfahren entfernt werden und schließen Gruppen wie FMOC, DMT und andere dem Fachmann bekannte ein.
Der Begriff „aktivierendes Mittel" bezieht sich auf diejenigen Gruppen, die – wenn sie an eine bestimmte funktionelle Gruppe oder reaktive Stelle angelagert sind – diese Stelle für die Ausbildung einer kovalenten Bindung mit einer zweiten funktionellen Gruppe oder reaktiven Stelle reaktiver machen. Zum Beispiel umfasst die Gruppe von aktivierenden Gruppen, die für eine Carbonsäure nützlich sind, einfache Estergruppen und Anhydride. Die Estergruppen umfassen Alkyl-, Aryl- und Alkenylester und insbesondere derartige Gruppen wie 4-Nitrophenyl, N-Hydroxylsuccinimid und Pentafluorphenol. Andere aktivierende Gruppen umfassen Phosphodiester-bildende Gruppen wie Phosphor amidate, Phosphittriester, Phosphotriester und H-Phosphonate. Dem Fachmann sind noch andere aktivierende Gruppen bekannt.
Monomer: Ein Monomer ist ein Mitglied der Gruppe von kleinen Molekülen, miteinander verbunden sind oder verbunden sein können, wobei ein Polymer oder eine Verbindung gebildet wird, das/die aus zwei oder mehreren Mitgliedern zusammengesetzt ist. Die Gruppe von Monomeren schließt z.B. die Gruppe der gewöhnlichen L-Aminosäuren, die Gruppe der D-Aminosäuren, die Gruppe der synthetischen und/oder natürlichen Aminosäuren, die Gruppe der Nukleotide und die Gruppe der Pentosen und Hexosen ein, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Die bestimmte Reihenfolge von Monomeren in einem Polymer wird vorliegend als „Sequenz" des Polymers bezeichnet. Wie vorliegend verwendet, bezihet sich „Monomere" auf ein beliebiges Mitglied einer Basisgruppe für die Synthese eines Polymers. Zum Beispiel bilden Dimere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren eine Basisgruppe von 400 Monomeren zur Synthese von Polypeptiden. Verschiedene Basisgruppen von Monomeren können in aufeinander folgenden Schritten bei der Synthese eines Polymers verwendet werden. Weiterhin kann jeder der Gruppen geschützte Mitglieder einschließen, die nach der Synthese modifiziert werden. Die Erfindung wird vorliegend in erster Linie im Hinblick auf die Herstellung von Molekülen beschrieben, die Sequenzen von Monomeren wie Aminosäuren enthalten. Sie kann jedoch bei der Herstellung von anderen Polymeren leicht angewendet werden. Derartige Polymere umfassen z.B. sowohl lineare als auch cyclische Polymere von Nukleinsäuren, Polysaccharide, Phospholipide und Peptide mit entweder α-, β- oder ω-Aminosäuren, Heteropolymere, in denen ein bekanntes Arzneimittel an einem der oben genannten kovalent gebunden ist, Polynukleotide, Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimide, Polyacetate oder andere Polymere, die bei der Durchsicht dieser Offenbarung ersichtlich sein werden. Derartige Polymere sind „verschieden", wenn Polymere mit verschiedenen Monomersequenzen an verschiedenen vordefinierten Regionen eines Substrats gebildet werden. Verfahren der Cyclisierung und Polymerumkehr von Polymeren sind in der anhängigen Anmeldung USSN 07/978940 offenbart, bei der es sich um eine CIP der US-Patent Nr. 5,242,974 mit dem Titel „POLYMER REVERSAL ON SOLID SURFACES" handelt.
Polymer: Ein Polymer wird durch kovalente Verknüpfung von mindestens zwei Monomereinheiten gebildet. Polymere können eine Anzahl an Monomereinheiten beinhalten. Beispiele für Polymere umfassen Oligonukleotide, Peptide und Kohlenhydrate.
Oligonukleotide: Bei einem Oligonukleotid kann es sich um DNA oder RNA (d.h. eine Nukleinsäure) handeln; es kann einzel- oder doppelsträngig sein. Oligonukleotide können natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Die Segmente weisen gewöhnlich zwischen 2 und 100 Basen auf, können jedoch jede beliebige Länge aufweisen. Längen zwischen 5–10, 5–20, 10–20, 10–50, 20–50 oder 20–100 Basen sind üblich.
Peptid: Ein Peptid ist ein Polymer, bei dem die Monomere Aminosäuren sind, die durch Amidbindungen miteinander verbunden sind, und das alternativ auch als Polypeptid bezeichnet wird. Handelt es sich bei den Aminosäuren um α-Aminosäuren, kann entweder das optische L-Isomer oder das optische D-Isomer verwendet werden. Zudem sollen auch unnatürliche Aminosäuren, z.B. β-Alanin, Phenylglycin und Homoargenin, eingeschlossen sein. Peptide sind zwei oder mehrere Aminosäuremonomere lang, können von beliebiger Länge sein und weisen häufig eine Länge von mehr als 20 Aminosäuremonomeren auf.
Substrat: Ein Material mit einer starren oder halbstarren Oberfläche. In vielen Ausführungsformen ist mindestens eine Oberfläche des Substrats im Wesentlichen flach, obwohl es in einigen Ausführungsformen erwünscht sein kann, die Syntheseregionen für verschiedene Polymeren physikalisch voneinander zu trennen, z.B. durch Vertiefungen, erhöhte Regionen, geätzte Rinnen oder dergleichen. In einigen Ausführungsformen enthält das Substrat selbst Vertiefungen, Rinnen, Durchflussregionen usw., die die gesamten Syntheseregionen oder einen Teil der Syntheseregionen bilden. Gemäß anderer Ausführungsformen können kleine Perlen (beads) auf der Oberfläche bereitgestellt werden, und die darauf synthetisierten Verbindungen können bei der Fertigstellung der Synthese freigesetzt werden.
Kanalblock: Ein Material mit einer Vielzahl von Rillen oder vertieften Regionen auf einer seiner Oberflächen. Die Rillen oder vertieften Regionen können eine Vielfalt an geometrischen Konfigurationen annehmen, einschließlich Streifen, Kreise, gewundene Verläufe oder dergleichen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt auf. Kanalblöcke können auf vielfältige Weise hergestellt werden, einschließlich Ätzen von Siliconblöcken, Gießen oder Pressen von Polymeren usw.
Vordefinierte Region: Eine vordefinierte Region ist ein lokalisierter Bereich auf einem Substrat, der zur Bildung eines ausgewählten Polymers verwendet wird, wurde oder dazu vorgesehen ist, und vorliegend ansonsten alternativ als „Reaktions"-Region, „ausgewählte" Region oder einfach „Region" bezeichnet wird. Die vordefinierte Region kann jede beliebige günstige Form aufweisen, z.B. kreisförmig, rechteckig, elliptisch, keilförmig usw. In einigen Ausführungsformen ist eine vordefinierte Region und deshalb die Fläche, auf der jede einzelne Polymersequenz synthetisiert wird, kleiner als etwa 1 cm², stärker bevorzugt kleiner als 1 mm² und noch stärker bevorzugt kleiner als 0,5 mm². In besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen die Regionen eine Fläche von weniger als etwa 10.000 μm² oder stärker bevorzugt weniger als 100 μm² auf. Innerhalb dieser Regionen wird das darin synthetisierte Polymer vorzugsweise in einer im Wesentlichen reinen Form synthetisiert. Zudem können typischerweise mehrere Kopien des Polymers in einer beliebigen vorher ausgewählten Region synthetisiert werden. Die Anzahl an Kopien kann in den Tausenden bis Millionen liegen.
II. Allgemeines
Die Verbindungen, Substrate und Verfahren der vorliegenden Erfindung können in mehreren Festphasensyntheseanwendungen, einschließlich lichtgesteuerten Verfahren, Fließkanal- und Spotting-Verfahren, Verfahren auf Stift-Basis und Verfahren auf Perlen (bead)-Basis verwendet werden.
Lichtgesteuerte Verfahren
„Lichtgesteuerte" Verfahren (bei denen es sich um eine Technik aus der Familie von Verfahren handelt, die als VLSIPS^TM-Verfahren bekannt sind) sind in US-Patent-Nr. 5,143,854 beschrieben. Die lichtgesteuerten Verfahren, die im '854-Patent erörtert sind, beinhalten das Aktivieren von vordefinierten Regionen auf einem Substrat oder festen Träger und das anschließende Inkontaktbringen des Substrats mit einer zuvor ausgewählten Monomerlösung. Die vordefinierten Regionen können mit einer Lichtquelle aktiviert werden, die typischerweise durch eine Maske gezeigt wird (wie bei Fotolithografietechniken, die bei der Herstellung von integrierten Schaltkreisen verwendet werden). Andere Regionen des Substrats bleiben inaktiv, da die Belichtung durch die Maske blockiert wird und sie chemisch geschützt bleiben. Folglich definiert ein Lichtmuster, welche Regionen des Substrats mit einem vorgegebenen Monomer reagieren. Durch wiederholtes Aktivieren von verschiedenen. Gruppen von vordefinierten Regionen und In kontaktbringen von verschiedenen Monomerlösungen mit dem Substrat wird eine unterschiedliche Anordnung an Polymeren auf dem Substrat hergestellt. Natürlich können ggf. andere Schritte wie Abwaschen der nicht umgesetzten Monomerlösung von dem Substrat verwendet werden.
Fließkanal- oder Spotting-Verfahren
Zusätzliche Verfahren, die zur Synthese einer Bibliothek auf einem einzelnen Substrat anwendbar sind, sind in den US-Patent-Nrn. 5,677,195 und 5,384,261 beschrieben.
In den in diesen Patenten offenbarten Verfahren werden Reagenzien zu einem Substrat gebracht, indem sie entweder (1) in einen auf vordefinierten Regionen definierten Kanal fließen oder (2) auf vordefinierte Regionen „getüpfelt" werden (spotting). Jedoch können andere Vorgehensweisen sowie Kombinationen von Spotting und Fließen eingesetzt werden. In jedem Fall werden bestimmte aktivierte Regionen des Substrats von anderen Regionen mechanisch abgetrennt, wenn die Monomerlösungen zu den verschiedenen Reaktionsstellen gebracht werden.
Ein typisches „Fließkanal"-Verfahren, das für die Verbindungen und Bibliotheken der vorliegenden Erfindung anwendbar ist, kann im Allgemeinen wie folgt beschrieben werden. Verschiedene Polymersequenzen werden an ausgewählten Regionen eines Substrats oder festen Trägers synthetisiert, indem Fließkanäle auf einer Oberfläche des Substrats gebildet werden, durch die geeignete Reagenzien fließen oder in die geeignete Reagenzien eingebracht wurden. Es wird beispielsweise angenommen, dass ein Monomer „A" an das Substrat in einer ersten Gruppe von ausgewählten Regionen gebunden werden soll. Sofern erfordelich wird die gesamte Oberfläche des Substrats oder ein Teil derselben in den gesamten ausgewählten Regionen oder in einem Teil derselben für die Bindung aktiviert, z.B. durch Fließen von geeigneten Reagenzien durch alle oder einige der Kanäle oder durch Abwaschen des gesamten Substrats mit geeigneten Reagenzien. Nach dem Aufsetzen einer Kanalblocks auf die Oberfläche des Substrats fließt ein Reagenz mit dem Monomer A durch alle oder einige der Kanäle oder wird darin eingebracht. Die Kanäle stellen einen Fluidkontakt mit den ersten ausgewählten Regionen bereit, wodurch das Monomer A auf dem Substrat direkt oder indirekt (über einen Abstandshalter) in den ersten ausgewählten Regionen gebunden wird.
Anschließend wird ein Monomer B an zweite ausgewählte Regionen gekoppelt, wobei einige derselben von den ersten ausgewählten Regionen umfasst sein können. Die zweiten ausgewählten Regionen befinden sich in Fluidkontakt mit (einem) zweiten Fließkanal (Fließkanälen); entweder durch Übertragung, Drehung oder Verschiebung des Kanalblocks auf der Oberfläche des Substrats; durch Öffnen oder Schließen eines ausgewählten Ventils; oder durch Ablagerung einer Schicht aus einer Chemikalie oder einem Fotoresist. Gegebenenfalls wird ein Schritt zum Aktivieren zumindest der zweiten Regionen durchgeführt. Anschließend lässt man Monomer B durch den (die) zweiten Fließkanal (Fließkanäle) fließen oder es wird in diese(n) eingebracht, indem Monomer B an die zweiten ausgewählten Orte gebunden wird. In diesem besonderen Beispiel handelt es sich bei den resultierenden Sequenzen, die an das Substrat in dieser Verarbeitungsstufe gebunden sind, z.B. um A, B und AB. Das Verfahren wird wiederholt, um eine sehr große Anordnung von Sequenzen von gewünschter Länge an bekannten Orten des Substrats zu bilden.
Nach dem Aktivieren des Substrats kann Monomer A durch einige der Kanäle fließen, Monomer B kann durch andere Kanäle fließen, ein Monomer C kann durch noch andere Kanäle fließen usw. Auf diese Weise werden viele oder alle der Reaktionsregionen mit einem Monomer umgesetzt, bevor der Kanalblock bewegt oder das Substrat gewaschen und/oder erneut aktiviert werden muss. Durch die gleichzeitige Verwendung von vielen oder allen verfügbaren Reaktionsregionen kann die Anzahl an Wasch- und Aktivierungsschritten minimiert werden.
Der Fachmann wird erkennen, dass es alternative Verfahren zum Bilden von Kanälen oder andere Arten zum Schützen eines Teils der Oberfläche des Substrats gibt. Zum Beispiel wird gemäß einiger Ausführungsformen eine Schutzbeschichtung, wie eine hydrophile oder hydrophobe Beschichtung (je nach Natur des Lösungsmittels) auf Teilen des zu schützenden Substrats verwendet, manchmal in Kombination mit Materialien, die das Benetzen durch die Reaktantlösung in anderen Regionen erleichtern. Auf diese Weise wird weiter verhindert, dass die fließenden Lösungen aus ihren vorbestimmten Fließwegen herauslaufen.
Das Spotting-Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen und Bibliotheken kann in derselben Weise wie die Fließkanalverfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein Monomer A zu einer ersten Gruppe von Reaktionsregionen, die in geeigneter Weise aktiviert wurden, gebracht werden oder damit gekoppelt werden. Anschließend kann ein Monomer B zu einer zweiten Gruppe von aktivierten Reaktionsregionen gebracht werden und damit umgesetzt werden. Anders als die oben beschriebenen Fließkanal-Ausführungsformen werden die Reaktanten durch direktes Abscheiden (anstelle von Fließen) von relativ kleinen Mengen derselben in ausgewählte Regionen abgegeben. In einigen Schritten kann natürlich die gesamte Substratoberfläche mit einer Lösung besprüht oder auf andere Weise beschichtet werden. In bevorzugten Ausführungsformen bewegt sich ein Spender von Region zu Region, wobei nur so viel Monomer wie nötig an jedem Haltepunkt abgeschieden wird. Typische Spender umfassen eine Mikropipette zum Abgeben der Monomerlösung an das Substrat und ein Robotersystem zum Kontollieren der Position der Mikropipette in Bezug auf das Substrat oder einen Tinten strahldrucker. In anderen Ausführungsformen schließt der Spender eine Reihe von Röhren, einen Verteiler, eine Anordnung von Pipetten oder dergleichen ein, sodass verschiedene Reagenzien gleichzeitig an die Reaktionsregionen abgegeben werden können.
Verfahren, die auf Stiften basieren
Ein anderes Verfahren, das zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen und Bibliotheken nützlich ist, beinhaltet die „auf Stiften (pins) basierende Synthese". Dieses Verfahren ist detailliert in der US-Patent-Nr. 5,288,514 beschrieben. Das Verfahren verwendet ein Substrat mit einer Vielzahl von Stiften oder anderen Erhebungen. Die Stifte werden gleichzeitig in einzelne Reagenzbehälter in einer Schale eingesetzt. In einer üblichen Ausführungsform wird eine Anordnung mit 96 Stiften/Behältern verwendet.
Jede Schale wird mit einem bestimmten Reagenz zum Koppeln in einer bestimmten chemischen Reaktion auf einem einzelnen Stift gefüllt. Demgemäß enthalten die Schalen häufig verschiedene Reagenzien. Da die vorliegend offenbarten chemischen Vorgänge derart aufgebaut wurden, dass eine relativ ähnliche Gruppe von Reaktionsbedingungen zum Durchführen jeder der Reaktionen verwendet werden kann, wird es möglich, mehrere chemische Kopplungsschritte gleichzeitig durchzuführen. Im ersten Schritt des Verfahrens stellt die Erfindung die Verwendung eines (von) Substrats (Substraten) bereit, auf dem (denen) die chemischen Kopplungsschritte durchgeführt werden. Das Substrat ist wahlweise mit einem Abstandhalter versehen, der aktive Stellen hat. Im Fall von Oligonukleotiden kann z.B. der Abstandhalter aus einer großen Vielzahl von Molekülen ausgewählt werden, die in organischen Umgebungen verwendet werden können, welche mit der Synthese assoziiert sind, sowie in wässrigen Umgebungen, die mit Bindungsuntersuchungen assoziiert sind. Beispiele für geeignete Abstandhalter sind Polyethylenglycole, Dicarbonsäuren, Polyamine und Alkylene, die z.B. mit Methoxy- und Ethoxygruppen substituiert sind. Zudem weisen die Abstandhalter eine aktive Stelle am entfernten Ende auf. Die aktiven Stellen sind ggf. anfänglich durch Schutzgruppen geschützt. Unter einer großen Vielzahl von nützlichen Schutzgruppen befinden sich FMOC, BOC, t-Butylester, t-Butylether und dergleichen. Verschiedene beispielhafte Schutzgruppen sind z.B. in Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press (1989) beschrieben. In einigen Ausführungsformen kann der Abstandhalter für eine spaltbare Funktion sorgen, beispielsweise durch Einwirken einer Säure oder Base.
Verfahren, die auf Perlen (beads) basieren
Ein weiteres Verfahren, das zur Synthese von Polymeren und kleinen Liganden-Molekülen auf einem festen Träger nützlich ist, ist die „Synthese auf Perlen-Basis". Eine allgemeine Vorgehensweise für eine Synthese auf Perlen-Basis ist in den US-Patent-Nrn. 5,770,358; 5,384,261; 5,693,603; 5,541,061 und WO 93/22684 beschrieben.
Zur Synthese von Molekülen, wie z.B. Oligonukleotiden, auf Perlen wird eine große Vielzahl von Perlen in einem Behälter in einen geeigneten Träger (wie Wasser) suspendiert. Die Perlen werden wahlweise mit Abstandhaltermolekülen versehen, die eine aktive Bindungsstelle haben. Die aktive Stelle wird wahlweise durch eine Schutzgruppe geschützt.
In einem ersten Schritt der Synthese werden die Perlen zur Kopplung in mehrere Behälter aufgeteilt. Zum Zwecke dieser Kurzbeschreibung ist die Anzahl an Behältern auf drei beschränkt, und die Monomere werden als A, B, C, D, E und F bezeichnet. Die Schutzgruppen werden anschließend entfernt, und ein erster Teil des zu synthetisierenden Moleküls wird jedem der drei Behälter zugesetzt (d.h. A wird Behälter 1 zugesetzt, B wird Behälter 2 zugesetzt und C wird Behälter 3 zugesetzt).
Anschließend werden die verschiedenen Perlen in geeigneter Weise durch Waschen von überschüssigen Reagenzien befreit und in einem Behälter erneut gemischt. Es wird wiederum erkannt werden, dass durch die bei Beginn verwendete große Anzahl von Perlen gleichermaßen eine große Anzahl von Perlen vorliegt, die im Behälter zufallsverteilt sind, wobei jede einen bestimmten ersten Anteil des zu synthetisierenden Monomers auf ihrer Oberfläche aufweist.
Anschließend werden die verschiedenen Perlen wiederum zum Koppeln in eine andere Gruppe von drei Behältern aufgeteilt. Die Schutzgruppen der Perlen im ersten Behälter werden entfernt, und die Perlen werden einem zweiten Monomer (D) ausgesetzt, während die Perlen im zweiten und dritten Behälter an Molekülteile E bzw. F gekoppelt werden. Demzufolge liegen die Moleküle AD, BD und CD im ersten Behälter vor, während AE, BE und CE im zweiten Behälter und die Moleküle AF, BF und CF im dritten Behälter vorliegen. Jede Perle weist jedoch nur einen einzelnen Molekültyp auf ihrer Oberfläche auf. Folglich wurden alle der möglichen Moleküle ausgehend von den ersten Teilen A, B, C und den zweiten Teilen D, E und F gebildet.
Die Perlen werden dann in einem Behälter erneut kombiniert, und zusätzliche Schritte werden durchgeführt, um die Synthese der Polymermoleküle zu vervollständigen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Perlen mit einer Identifikationsmarkierung markiert, die für die auf jeder Perle vorliegende bestimmte Verbindung einzigartig ist. Eine vollständige Beschreibung von Identifikationsmarkierungen zur Verwendung in synthetischen Bibliotheken wird in der US-Patent-Nr. 5,693,603 bereitgestellt.
Verwendungen von chemischen Bibliotheken
Das Aufkommen von Verfahren zur Synthese von verschiedenen chemischen Verbindungen auf festen Trägern führte zur Entstehung einer Vielzahl von diagnostischen Anwendungen für derartige chemische Bibliotheken. Mehrere dieser diagnostischen Anwendungen beinhalten das Inkontaktbringen einer Probe mit einem festen Träger oder einem Chip mit mehreren angelagerten biologischen Polymeren, wie Peptiden und Oligonukleotiden, oder mit anderen kleinen Liganden-Molekülen, die aus Bausteinen schrittweise synthetisiert wurden, um jegliche Spezies zu identifizieren, die sich spezifisch an ein oder mehrere der angelagerten Polymere oder an ein oder mehrere der kleinen Liganden-Molekülen bindet.
Zum Beispiel beschreibt die Patentanmeldung Seriennummer 08/082,937, eingereicht am 25. Juni 1993, Verfahren zur Herstellung von Anordnungen von Oligonukleotidsonden, die zum Bereitstellen der kompletten Sequenz einer Zielnukleinsäure und zum Nachweisen des Vorhandenseins einer Nukleinsäure, die eine spezifische Oligonukleotidsequenz enthält, verwendet werden können. US-Patent Nr. 5,556,752 beschreibt Verfahren zur Herstellung von Anordnungen von unimolekularen Doppelstrang-Oligonukleotiden, die in diagnostischen Anwendungen verwendet werden können, bei denen Protein/DNA-Bindungswechselwirkungen betailigt sind, wie z.B. diejenigen, die mit dem p53-Protein und den Genen assoziiert sind, die zu mehreren Krebserkrankungen beitragen. Anordnungen von Doppelstrang-Oligonukleotiden können auch zum Screening nach neuen Arzneimitteln mit bestimmten Bindungsaffinitäten verwendet werden. Die vorliegend bereitgestellten Verknüpfungsgruppen und Markierungen sind bei jeder dieser Bibliotheksanwendungen nützlich, sowie auch bei anderen Anwendungen, die nunmehr in der Literatur bekannt sind.
III. Asymmetrische Disulfid-Verknüpfungsgruppen
Die vorliegende Erfindung stellt neue asymmetrische Disulfid-Verknüpfungsgruppen bereit, die die Synthese von Oligomeren oder kleinen Molekülen auf einem festen Träger erleichtern und eine schnelle Freisetzung von dem Träger unter sehr sanften Bedingungen bereitstellen können.
Eine Gruppe von asymmetrischen Disulfid-Verbindungen, die als Verknüpfungsgruppen verwendet werden können, ist durch die folgende Formel dargestellt: P¹-X¹-(W¹)_n-S-S-(W²)_m-X²-P² (I)
In dieser Formel ist P¹ eine photolabile Schutzgruppe, und P² ist ein Wasserstoffatom, eine aktivierende Gruppe (z.B. eine Phosphodiester-bildende Gruppe) oder eine selektiv entfernbare Schutzgruppe. Die Symbole X¹ und X² stellen jeweils unabhängig voneinander eine Bindung, -O-, -NH-, -NR- und -CO₂- dar, wobei R eine Alkylgruppe mit ein bis vier Kohlenstoffatomen ist. Die Symbole W¹ und W² stellen jeweils unabhängig voneinander eine Methylengruppe (-CH₂-), eine Oxyethylengruppe (-OCH₂CH₂- oder -CH₂CH₂O-), eine Oxypropylengruppe (z.B. -OCH₂CH₂CH₂-, -OCH₂CH(CH₃)- oder -CH(CH₃)CH₂O-) dar. Die Buchstaben n und m stellen jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 12 dar, mit der Bedingung, dass n und m nicht dieselbe ganze Zahl sind; wenn W¹ und W² identisch sind. Vorzugsweise stellen die Buchstaben n und m ganze Zahlen von 3 bis 8 dar. Alle Zahlenbereiche in dieser Anmeldung sollen einschließlich ihrer oberen und unteren Grenzen gelten.
P¹ ist eine durch Licht abspaltbare Schutzgruppe, vorzugsweise NVOC, McNPOC, Dimehtoxybenzoinyl oder α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl (DDZ). Stärker bevorzugt ist P¹ eine MeNPOC-Schutzgruppe.
Die Verknüpfungsgruppen der Formeln (I) sind als am 3'-Ende abspaltbare Verknüpfungsgruppe in jeder beliebigen Festphasensynthese von Oligonukleotiden nützlich. Werden sie für diese Festphasenherstellung von Oligonukleotiden verwendet, ist P² vorzugsweise eine aktivierende Gruppe wie ein Phosphoramidit oder eine andere funktionell äquivalente Gruppe, die üblicherweise bei der Festphasen-Oligonukleotidsynthese verwendet wird. Detaillierte Beschreibungen der Verfahren zur Festphasensynthese von Oligonukleotiden durch chemische Phosphittriester-, Phosphotriester- und H-Phosphonat-Vorgänge sind allgemein erhältlich. Siehe z.B. Itaknra, US-Patent Nr. 4,401,796; Caruthers, et al., US-Patente Nrn. 4,458,066 und 4,500,707; Beaucage, et al., Tetrahedron Lett., 22: 1859–1862 (1981); Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc., 103: 3185–3191 (1981); Caruthers, et al., Generic Engineering, 4: 1–17 (1982); Jones, Kapitel 2; Atkinson, et al., Kapitel 3 und Sproat, et al., Kapitel 4, in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait (ed.), IRL Press, Washington DC (1984); Froehler, et al., Tetrahedron Lett., 27: 469–472 (1986); Froehler, et al., Nucleic Acids Res., 14: 5399–5407 (1986); Sinha, et al. Tetrahedron Lett., 24: 5843–5846 (1983); und Sinha, et al., Nucl. Acids Res., 12: 4539–4557 (1984). In diesen Ausführungsformen ist X² vorzugsweise -O-.
Die asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppen der vorliegenden Erfindung können durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden. Die 1a und 1b stellen Syntheseschemata zur Herstellung der Verknüpfungsgruppen bereit. Gemäß 1a kann im Handel erhältliches 6-Bromhexanol (Aldrich Chemical Company, Milawaukee, Wisconsin, USA) mit einem Allylchlorformiat in Pyridin behandelt werden, um das Allylcarbonat (2 in 1a) herzustellen. Das terminale Bromid kann durch Behandlung mit Natriumhydrogensulfid in THF/H₂O bei pH 7 zu einem Thiol umgewandelt werden. Die Disulfid-Funktionalität kann anschließend durch Umsetzen des Thiols 4 mit 2-Pyridyl-2-hydroxyethyldisulfid in THF und Triethylamin eingebracht werden. Der Schutz der terminalen Hydroxylgruppe wird mit DMT-Chlorid in Pyridin zum Bereitstellen von 6 erzielt. Die Umwandlung von 6 zu 8 kann durch Entfernen des Allylcarbonats (katalytisches K₂CO₃ in MeOH) und Behandeln der resultierenden Hydroxylgruppe mit DIPAT und BAP erzielt werden. Wie ersichtlich, stellt diese Methodik eine Verknüpfungsgruppe der obigen Formel bereit, in der P¹ DMT ist, X¹ -O- ist, n 2 ist, m 6 ist, X² -O- ist und P² Phosphoramidit ist.
Wie in 1c dargestellt spaltet sich (wenn N = 2) die Disulfidbindung von 1 unter neutralen oder basischen Bedingungen in Gegenwart von DTT unter Erhalt eines Oligonukleotids 3, das den 2-Mercaptoethylphosphatester am 3'-Ende aufweist. Es wurde beobachtet, dass diese Esterfragmente effizient bei der Herstellung des 3-phosphorylierten Oligonukleotids 3 sind. Es zeigte sich, dass dieses Produkt mit demjenigen identisch war, das durch Basen-katalysierte Spaltung von Oligonukleotiden hergestellt wurde, die durch das bekannte Phosphat-ON-Reagenz (Glen Research) an der Oberfläche angelagert wurden. Der asymmetrische Disulfid-Verknüpfer, wenn N = 2, ist bevorzugt, wenn es erwünscht ist, die Oligonukleotide von der Oberfläche abzuspalten und mittels HPLC zu analysieren, da die resultierenden Oligonukleotide keinen 3'-Thiolanhang aufweisen. In dem Falle, dass N > 2 ist, sollten die Mercaptoalkylester stabiler sein und die abgespaltenen Oligonukleotide den entsprechenden Thiolanhang behalten. Dies erschwert die anschließende Analyse der abgespaltenen DNA auf Grund der Oxidation der Thiolgruppe.
Die eben beschriebenen Schritte können vom Fachmann in geeigneter Weise modifiziert werden, um mehrere verwandte Analoga auf der Basis der Verfügbarkeit von Bromalkoholen (1 als Ausgangsmaterial) und 2-Pyridyldisulfidalkoholen herzustellen. Gemäß 1b wird Pentaethylenglycol (1a) zuerst mit DMT-Cl geschützt, dann mit Kaliumthioacatat zu einem Monothioester (2a) umgewandelt. Die Abspaltung der Acetylgruppe mit der Base und die Umsetzung der resultierenden Thiolfunktionalität mit 2-Pyripyl-3-hydroxyethyldisulfid stellen einen monogeschützten asymmetrischen Disulfid-Verknüpfer (3a) bereit. Der Schutz der Hydroxylgruppe mit McNPOC-Cl, gefolgt von der Entfernung der DMT-Schutzgruppe und Umwandlung der freigesetzten Hydroxylgruppe zu einem Phosphoramidit stellt den Verknüpfer (4a) bereit, der in einer automatischen Oligomer-Syntheseapparatur nützlich ist.
In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung modifizierte Substrate bereit, die bei der Festphasensynthese von Oligonukleotiden sowie als Anordnungen (arrays) von verschiedenen Polymeren nützlich sind. Die Substrate werden mit den oben beschriebenen asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppen derivatisiert und sind durch die folgende Formel dargestellt: A¹-B¹-L¹ (II)in der A¹ ein festes Substrat ist, B¹ eine Bindung oder ein Abstandshalter ist, und L¹ eine asymmetrische Disulfid-Verknüpfungsgruppe der Formel: P¹-X¹-(W¹)_n-S-S-(W²)_m-X²- (IIa)ist.
In der Formel (IIa) stellt das Symbol P¹ eine photolabile Schutzgruppe dar. Die Symbole X¹ und X² sind jeweils unabhängig voneinander eine Bindung, -O-, -NH-, -NR- und -CO₂-, wobei R eine niedere Alkylgruppe mit ein bis vier Kohlenstoffatomen ist. Die Symbole W¹ und W² sind wie oben beschrieben. Die Buch staben n und m stellen (wie oben) ganze Zahlen von 2 bis 12 dar, wobei verstanden werden muß, dass n und m nicht gleich sind wenn W¹ und W² identisch sind.
In diesem Aspekt der Erfindung können die festen Substrate biologisch, nicht biologisch, organisch, anorganisch oder eine Kombination von beliebigen davon sein, die als Partikel, Stränge, Präzipitate, Gele, Lagen, Röhren, Kügelchen, Behälter, Kapillaren, Kissen, Scheiben, Filme, Platten, Scheiben usw. vorliegen. Das feste Substrat ist vorzugsweise flach, kann jedoch auch alternative Oberflächengestaltungen aufweisen. Zum Beispiel kann das feste Substrat erhöhte oder vertiefte Regionen enthalten, auf denen die Synthese stattfindet. In einigen Ausführungsformen ist das Substrat derart ausgewählt, dass geeignete lichtabsorbierende Eigenschaften bereitgestellt werden. Zum Beispiel kann das Substrat ein polymerisierter Film vom Typ Langmuir Blodgett, funktionalisiertes Glas, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO₂, SiN₄, modifiziertes Silicium oder ein beliebiges einer Vielfalt von Gelen oder Polymeren wie (Poly)tetrafluorethylen, (Poly)vinylidenfluorid, Polystyrol, Polycarbonat oder Kombinationen davon sein. Andere geeignete feste Substratmaterialien werden dem Fachmann leicht klar. Vorzugsweise enthält die Oberfläche des festen Substrats reaktive Gruppen, bei denen es sich um Carboxyl, Amino, Hydroxyl, Thiol oder dergleichen handelt. Stärker bevorzugt ist die Oberfläche optisch transparent und weist derartige Si-OH-Funktionalitäten auf der Oberfläche auf, wie sie Silika-Oberflächen zu finden sind.
Für diejenigen Ausführungsformen, in denen B¹ ein Abstandhalter ist, ist er auf dem festen Substrat durch Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen unter Verwendung z.B. von Substraten mit (Poly)trifluorchlorethylen-Oberflächen oder stärker bevorzugt durch Siloxanbindungen (unter Verwendung z.B. von Glas oder Siliciumoxid als festes Substrat) angelagert. Siloxanbindungen mit der Oberfläche des Substrats werden in einer Ausführungsform durch Reaktionen von Derivatisierungsreagenzien gebildet, die Trichlorsilyl oder Trialkoxysilylgruppen tragen.
Der bestimmte Abstandhalter kann auf Basis seiner hydrophilen oder hydrophoben Eigenschaften ausgewählt werden, um die Präsentation eines angelagerten Oligomers oder einer angelagerten Verbindung an bestimmten Rezeptoren, Proteinen oder Arzneimitteln zu verbessern. Vor der Anlagerung des festen Substrats weist der Abstandhalter eine substratanlagernde Gruppe an einem Ende und eine reaktive Stelle am anderen Ende auf. Die reaktive Stelle ist eine Gruppe, die zur Anlagerung der Verknüpfungsgruppe L¹ geeignet ist. Zum Beispiel würden Gruppen, die zur Anlagerung einer Silika-Oberfläche geeignet sind, Trichlorsilyl- und Trialkoxysilyl-funktionelle Gruppen umfassen. Gruppen, die zur Anlagerung an eine Verknüpfungsgruppe geeignet sind, umfassen Amin, Hydroxyl, Thiol, Carbonsäure, Ester, Amid, Isocyanat und Thioisocyanat. Bevorzugte Abstandhalter umfassen Aminoalkyltrialkoxysilane, Hydroxyalkyltrialkoxysilane, Polyethylenglycole, Polyethylenimin, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol und Kombinationen davon.
Die in den vorliegenden modifizierten Substraten verwendeten asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppen sind durch Reste der folgenden Formel dargestellt: P¹-X¹-(W¹)_n-S-S-(W²)_m-X²- (IId)in der X¹, W¹, W², n, m, X² und P¹ die wie oben dargestellten Bedeutungen aufweisen. In bevorzugten Ausführungsformen sind n und m ganze Zahlen von 3 bis 8 und sind W¹ und W² entweder Methylengruppen oder Oxyethylengruppen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind X¹ und X² jeweils unabhängig voneinander -O- oder -NH-, am meisten bevorzugt sind X¹ und X² beide -O-. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen sind W¹ und W² beide Methylen, und X¹ und X² sind beide -O-; oder X¹ und X² sind beide -O- und n und m sind jeweils ganze Zahlen von 2 bis 8. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen ist P¹ eine DMT-Gruppe.
Die Anlagerung der Verknüpfungsgruppe L¹ an eine funktionelle Gruppe auf dem festen Träger oder an einer reaktiven Stelle am Abstandhalter kann unter Verwendung von chemischen Standardverfahren erzielt werden. Zum Beispiel kann, wenn X² Sauerstoff ist, die Verknüpfung mit einer Carbonsäure oder einer aktivierten Carbonsäure unter Verwendung von esterbildenden Standardreaktionen hergestellt werden. Alternativ dazu kann die X²-Gruppe (abgeleitet von einer Hydroxylgruppe) mit trägergebundenen Isocyanatgruppen unter Bildung von Carbamatverknüpfungen umgesetzt werden. In anderen Ausführungsformen wird X² durch eine Phosphodiester- oder Phosphotriester-Verknüpfung an einen festen Träger angelagert. In diesen Ausführungsformen erfolgt die Anlagerung typischerweise über eine Phosphoamidit-bildende Gruppe oder eine andere Phosphodiester- oder Phosphotriesterbildende Gruppe, die anfänglich auf der asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppe vorliegt.
In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer Anordnung von verschiedenen Polymeren auf einem festen Träger bereit. Die Verfahren umfassen typischerweise folgendes:

(a) das Inkontaktbringen des festen Trägers mit einer asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppe der Formel: P¹-X¹-(W¹)_n-S-S- (W²)_m-X²-P² (IIb)in der P¹ und P² jeweils unabhängig voneinander ausgewählte Mitglieder der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer aktivierenden Gruppe und einer Schutzgruppe sind; X¹ und X² jeweils unabhängig voneinander eine Bindung, -O-, -NH-, -NR- oder -CO₂- sind, wobei R eine niedere Alkylgruppe mit ein bis vier Kohlenstoffatomen ist, die Symbole W¹ und W² jeweils unabhängig voneinander eine Methylengruppe (-CH₂-), eine Oxyethylengruppe (-OCH₂CH₂- oder -CH₂CH₂O-), eine Oxypropylengruppe (z.B. -OCH₂CH₂CH₂-, -OCH₂CH(CH₃)- oder -CH(CH₃)CH₂O-) und dergleichen darstellen; und n und m jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 12 sind, mit der Bedingung, dass n und m nicht gleich sind, wenn W¹ und W² gleich sind; unter Bedingungen, die zum Herstellen eines derivatisierten festen Trägers mit angelagerten asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppen, die in geeigneter Weise mit Schutzgruppen geschützt sind, ausreichend sind;
(b) wahlweise das Entfernen der Schutzgruppen von dem derivatisierten festen Träger zum Bereitstellen eines derivatisierten festen Trägers mit asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppen mit Synthese-Startorten; und
(c) das Koppeln von verschiedenen Polymeren an die Synthesestartorte an dem derivatisierten festen Träger zur Herstellung eines festen Trägers mit einer angelagerten Anordnung an verschiedenen Polymeren, die durch Anwendung eines Disulfid-Spaltungsreagenzes davon entfernbar sind.

Die Anlagerungen des asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppenrests an den festen Träger kann im Allgemeinen durch chemische Standardverfahren durchgeführt werden, wie durch diejenigen, die oben beschrieben sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist X² -O- und ist P² ein Phosphoramidit. In dieser Ausführungsform kann die asymmetrische Disulfid-Verknüpfungsgruppe mit einem festen Träger mit verfügbaren Hydroxylgruppen unter Verwendung von Standard-Nukleinsäuresynthesetechniken umgesetzt werden. Das Produkt ist ein fester Träger mit asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppen, die durch eine Phosphodiester-Verknüpfung angelagert sind. Das entfernte Ende der Verknüpfungsgruppe (das Ende, das am weitesten von dem festen Träger entfernt ist) ist entweder ein Synthesestartort oder ein geschützter Synthesestartort.
Falls diese vorliegen, können die optionalen Schutzgruppen unter Verwendung von bekannten Verfahren entfernt werden, die nicht mit den auf dem Träger vorliegenden Moleküle oder Gruppen interferieren. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Entfernung von Schutzgruppen an bestimmten vordefinierten Regionen auf dem Träger unter Verwendung von Licht und fotolithografischen Masken oder durch Fließkanal- oder Spotting-Verfahren mit geeigneten Entfernungsmitteln durchgeführt werden. Die Entfernung der Schutzgruppen stellt einen festen Träger mit angelagerten asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungen und Synthesestartorten bereit.
Die präparativen Verfahren werden dann mit der Kopplung von Monomeren, Molekülen oder Bestandteilen von Molekülen an die Synthesestartorte fortgesetzt. Wiederum folgen die chemischen Kopplungsvorgänge der dem Fachmann bekannten Standardsynthesemethodik.
Bevorzugte Ausführungsformen für diesen Aspekt der Erfindung sind im Allgemeinen wie oben für die verwandten Verbindungen und modifizierten Substrate beschrieben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist -(W¹)_n- -CH₂CH₂-.
IV. BEISPIELE
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese einer asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppe mit einer DMT-Schutzgruppe an einem Terminus und einer aktivierenden Phosphoramiditgruppe am anderen Terminus.
(a) Umwandlung von 6-Bromhexanol zu 6-Bromhexylallylcarbonat
Einer Lösung von 6-Bromhexanol (4,8 g) in 20 ml Pyridin bei 0°C bis 20°C wurde Allylchlorformiat (4,5 ml, 40 mmol) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Diethylether wurde zugesetzt und das Gemisch nacheinander mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, Wasser und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft, um rohes 6-Bromhexylallylcarbonat 12 (3,627 g) als farbloses Öl bereitzustellen. Eine Flash-Chromatografie (Hexan/Et₂O, 2/1 als Eluent) stellte das gereinigte Produkt 12 (2,158 g) bereit.
(b) Herstellung von 6-Mercaptohexylallylcarbonat
Natriunhydrogensulfid (3,6 g) wurde in wasserfreiem Puffer mit einem pH-Wert von 7 (10 ml) gelöst, und 6-Bromhexylallylcarbonat (0,4 g) wurde zugesetzt. Tetrahydrofuran (~15 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde mit 25 ml Diethylether verdünnt. Die organische Schicht wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Das Salz wurde abfiltriert und das Lösungsmittel vom Filtrat entfernt, um ein Rohprodukt bereitzustellen, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
(c) Herstellung von Disulfid 14
6-Mercaptohexylallylcarbonat 13 (388 mg), 2-Hydroxyethyl-2-pyridyldisulfid (350 mg) und Triethylamin (1,0 ml) wurden in 5 ml THF kombiniert. Die Reaktion wurde für eine Dauer von 1 Stunde gerührt. Das Gemisch wurde unter reduziertem Druck eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatografie (Silica; Hexan/Diethylether, 1/1) gereinigt, um das gewünschte Disulfid 14 (422 mg) als farbloses Öl bereitzustellen.
(d) Herstellung von mono-geschütztem Disulfid 16
Das Hydroxydisulfid 14 (1,8 g, 6,1 mmol, 1,0 Äqu.) wurde mit DMT-Cl (2,4 g, 6,7 mmol, 1,1 Äqu.) in 20 ml trockenem Pyridin unter Argon-Atmosphäre kombiniert. Nach 4 Stunden wurde das Gemisch mit Ethylacetat (50 ml) verdünnt und in 50 ml gesättigte wässrige NaHCO₃-Lösung gegossen. Das erhaltene Gemisch wurde mit EtOAc (50 ml) extrahiert und das organische Extrakt mit gesättigter wässriger NaCl-Lösung gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Das Abdampfen des Lösungsmittels stellte das rohe Zwischenprodukt 16 als orangefarbenes Öl bereit.
Das Öl wurde mit 50 ml 20 %igem THF in wasserfreiem MeOH kombiniert, und eine katalytische Menge wasserfreies K₂CO₃ wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. EtOAc (50 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch in 50 ml gesättigte, wässrige NaHCO₃-Lösung gegossen. Die Schichten wurden getrennt und der wässrige Teil mit zwei Portionen von 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Portionen wurden mit gesättigter, wässriger NaCl-Lösung gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Das Abdampfen des Lösungsmittels stellte das Rohprodukt als orangefarbenes Öl bereit. Die Reinigung wurde durch Flash-Chromatografie (Hexan/EtOAc, 3/7 mit 1 % Triethylamin) durchgeführt, um 2,65 g (73 % der beiden Schritte) von Produkt 16 als blassgelbes Öl bereitzustellen.
(e) Herstellung von DMT-geschütztem Phosphoramidit (UDL) 17
DMT-geschütztes Disulfid 16 (2,0 g, 3,35 mmol, 1,0 Äqu.) und DIPAT (2,87 g, 1,68 mmol, 0,5 Äqu.) wurden in 20 ml trockenem CH₂Cl₂ unter Argon-Atmosphäre kombiniert. CEBAP (1,1 g, 1,2 ml, 3,69 mmol, 1,1 Äqu.) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 3 Stunden gerührt. Das resultierende Gemisch wurde in gesättigte, wässrige Na₂HCO₃-Lösung gegossen, und die organische Schicht wurde abgetrennt, mit gesättigter, wässriger NaCl-Lösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck stellte das DMT-geschützte Phosphoramidit 17 als blassgelbes Öl bereit. Die Reinigung durch Flash-Chromatografie und das Eluieren zuerst mit Hexan, enthaltend 1 Triethylamin, dann mit Ethylacetat/Hexan (1/9, enthaltend 1 Triethylamin) stellte 2,06 g (77 %) von 17 als blassgelbes Öl bereit. Die ¹H-NMR und ³¹P-NMR stimmten mit der zugewiesenen Struktur überein.
Die asymmetrische Disulfid-Verknüpfungsgruppe kann in einer automatischen Syntheseapparatur unter für Standardphosphoramidite nützlichen Bedingungen verwendet werden. Typischerweise wird die Molarität der in diesen Synthesen verwendeten Iodlösung von 0,2 M auf 0,02 M reduziert.

Claims

Verbindung der Formel P¹X¹-(W¹)_n-S-S-(W²)_m-X²P² (I)worin P¹ eine photolabile Schutzgruppe ist und P² ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer aktivierenden Gruppe und einer Schutzgruppe ist; X¹ und X² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus einer Bindung, -O-, -NH-, -NR- und -CO₂- ausgewählt sind, wobei R eine niedere Alkylgruppe mit ein bis vier Kohlenstoffatomen ist; W¹ und W² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Methylen, Oxyethylen und Oxpropylen ausgewählt sind; und n und m jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 12 sind, mit der Bedingung, dass n und m nicht gleich sind, wenn W¹ und W² gleich sind, und mit der weiteren Bedingung, dass P¹ und P² nicht beide Wasserstoffatome sind.
Modifiziertes Substrat zur Verwendung in der chemischen Festphasensynthese, wobei das Substrat die folgende Formel aufweist: A¹-B¹-L¹ (II), worin A¹ ein fester Träger ist, B¹ eine Bindung oder eine derivatisierende Gruppe ist und L¹ eine Verknüpfungsgruppe der Formel: P¹-X¹-(W¹)_n-S-S-(W²)_m-X²- (IIa)ist, worin P¹ eine photolabile Schutzgruppe ist; X¹ und X² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus einer Bindung, -O-, -NH-, -NR- und -CO₂- ausgewählt sind, wobei R eine niedere Alkylgruppe mit ein bis vier Kohlenstoffatomen ist; W¹ und W² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Methylen, Oxyethylen und Oxypropylen ausgewählt sind; und n und m jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 12 sind, mit der Bedingung, dass n und m nicht gleich sind, wenn W¹ und W² gleich sind.
Substrat nach Anspruch 2, bei dem W¹ und W² beide Methylen sind, und bei dem X¹ und X² beide -O- sind.
Substrat nach Anspruch 2, bei dem X¹ und X² beide -O- sind, und bei dem n und m jeweils ganze Zahlen von 2 bis 8 sind.
Verfahren zur Synthese einer Anordnung verschieder Polymere auf einem festen Träger, der optional Abstandshalter aufweist, wobei die Polymere von diesem durch Behandlung mit einem geeigneten Disulfid-spaltenden Reagenz entfern bar sind, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man: (a) einen festen Träger mit einer asymmetrischen Disulfid-Verknüpfungsgruppe der Formel: P¹-X¹-(W¹)_n-S-S-(W²)_m-X²-P² (IIb),in Kontakt bringt, worin P¹ und P² jeweils unabhängig voneinander ausgewählte Mitglieder der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer aktivierenden Gruppe und einer Schutzgruppe sind; X¹ und X² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus einer Bindung, -O-, -NH-, -NR- und -CO₂- ausgewählt sind, wobei R eine niedere Alkylgruppe mit ein bis vier Kohlenstoffatomen ist; W¹ und W² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe aus Methylen, Oxyethylen und Oxypropylen ausgewählt sind; und n und m jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 12 sind, mit der Bedingung, daß n und m nicht gleich sind, wenn W¹ und W² gleich sind; um einen derivatisierten festen Träger herzustellen, an den asymmetrische Disulfid-Verknüpfungsgruppen angeheftet sind, die in geeigneter Weise durch Schutzgruppen geschützt sind; (b) gegebenenfalls die Schutzgruppen von dem derivatisierten festen Träger entfernt, um einen derivatisierten festen Träger bereitzustellen, der asymmetrische Disulfid-Verknüpfungsgruppen mit Synthese-Startorten aufweist; und (c) die Polymere an die Synthese-Startorte auf dem derivatisierten festen Träger koppelt, um einen festen Träger herzustellen, an den eine Anordnung aus verschiedenen Polymeren geheftet ist, die von diesem durch Verwendung des Disulfid-spaltenden Reagenz entfernbar sind.
Verfahren zur Synthese einer Anordnung verschiedener Polymeren auf einem Substrat, das Schritte umfasst, bei denen man: (a) ein modifiziertes Substrat zur Verwendung in der chemischen Festphasensynthese bereitstellt, wobei das Substrat die Formel: A¹-B¹-L¹ (II)aufweist, worin A ein fester Träger, B eine Bindung oder eine Abstandshaltergruppe ist, und L eine Verknüpfungsgruppe mit der Formel: P¹-X¹-(W¹)_n-S-S-(W²)_m-X²- (IIa) ist, worin P¹ eine Schutzgruppe ist; X¹ und X² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus einer Bindung, -O-, -NH-, -NR- und -CO₂- ausgewählt sind, wobei R eine niedere Alkylgruppe mit ein bis vier Kohlenstoffatomen ist; W¹ und W² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Methylen, Oxyethylen und Oxypropylen ausgewählt sind; n und m jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 12 sind, mit der Bedingung, daß n und m nicht gleich sind, wenn W¹ und W² gleich sind; und (b) eine Anordnung verschiedener Polymere auf dem modifizierten Substrat erstellt.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem P¹ eine photolabile Schutzgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem P¹ eine photolabile Schutzgruppe ist, W¹ und W² beide Methylen sind, und X¹ und X² beide -O- sind.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem P¹ eine photolabile Schutzgruppe ist, X¹ und X² beide -O- sind, und n und m jeweils ganze Zahlen von 2 bis 8 sind.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem P¹ DMT ist, X¹ und X² beide -O- sind, W¹ und W² beide Methylen sind, und n und m jeweils ganze Zahlen von 2 bis 8 sind.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, bei dem n 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Polymere Peptide sind.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Polymere Polynukleotide sind.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Erstellen einer Anordnung Schritte umfasst, bei denen man: (i) die Schutzgruppen des modifizierten Substrats gegebenenfalls entfernt, um ein modifiziertes Substrat mit Synthese-Startorten bereitzustellen; und (ii) Monomere an die Synthese-Startorte auf dem modifizierten Substrat koppelt, um ein modifiziertes Substrat mit einer Anordnung von verschiedenen Polymeren herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die ausgewählten Bereiche des modifizierten Trägers mit Licht aktiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 6, dass ferner die Freisetzung der Polymere von dem modifizierten Träger umfasst.