JP2014531908A - 構造アッセンブリによる配列決定 - Google Patents
構造アッセンブリによる配列決定 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014531908A JP2014531908A JP2014535900A JP2014535900A JP2014531908A JP 2014531908 A JP2014531908 A JP 2014531908A JP 2014535900 A JP2014535900 A JP 2014535900A JP 2014535900 A JP2014535900 A JP 2014535900A JP 2014531908 A JP2014531908 A JP 2014531908A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- oligonucleotide probe
- template
- probe
- nucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
Abstract
ライゲーションによる配列決定および/またはハイブリダイゼーションによる配列決定を使用する核酸配列決定法が提供される。【選択図】
Description
政府の利益に関する宣言
本発明は、NIH助成金番号5P50HG005550−02の支援の下になされたものである。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、NIH助成金番号5P50HG005550−02の支援の下になされたものである。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、核酸を配列決定する方法に関する。
配列決定法は、公知である。例えば、以下の文献を参照されたい:Shendure et al.,Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome,Science,vol.309,p.1728−32.2005;Drmanac et al.,Human genome sequencing using unchained base reads on self−assembling DNA nanoarrays,Science,vol.327,p.78−81.2009;McKernan et al.,Sequence and structural variation in a human genome uncovered by short−read,massively parallel ligation sequencing using two−base encoding,Genome Res.,vol.19,p.1527−41.2009;Rodrigue et al.,Unlocking short read sequencing for metagenomics,PLoS One,vol.28,e11840.2010;Rothberg et al.,An integrated semiconductor device enabling non−optical genome sequencing,Nature,vol.475,p.348−352.2011;Margulies et al.,Genome sequencing in microfabricated high−density picolitre reactors,Nature,vol.437,p.376−380.2005;Rasko et al.Origins of the E.coli strain causing an outbreak of hemolytic−uremic syndrome in Germany,N.Engl.J.Med.,Epub.2011;Hutter et al.,Labeled nucleoside triphosphates with reversibly terminating aminoalkoxyl groups,Nucleos.Nucleot.Nucl.,vol.92,p.879−895.2010;Seo et al.,Four−color DNA sequencing by synthesis on a chip using photocleavable fluorescent nucleotides,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Vol.102,P.5926−5931(2005);Olejnik et al.;Photocleavable biotin derivatives:a versatile approach for the isolation of biomolecules,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,vol.92,p.7590−7594.1995;米国特許第5,750,34号;米国特許出願公開第2009/0062129号、および米国特許出願公開第2009/0191553号。
本開示の実施形態は、ライゲーションによる配列決定および/またはハイブリダイゼーションによる配列決定を使用して、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法に関する。ある態様は、二本鎖伸長において核酸テンプレートにハイブリダイズおよび/またはライゲーションされるオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドの1つまたは複数または全ての検出を容易にするプローブを使用して、一本鎖核酸テンプレート等の核酸テンプレートに沿った二本鎖伸長のサイクルを繰り返すことを含む。1つの態様によると、オリゴヌクレオチドプローブにある複数のヌクレオチド、および核酸テンプレートにあるそれらの相補的ヌクレオチドを、単一のライゲーションサイクルの結果として識別することができる。本開示のあるオリゴヌクレオチドプローブは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を含む。すなわち、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、テンプレート核酸配列にハイブリダイズしない。テンプレート非ハイブリダイズ核酸は、オリゴヌクレオチドプローブの既知ヌクレオチドに対応する検出可能部分を含んでいてもよい。検出可能部分が、検出される。テンプレート非ハイブリダイズ核酸は、オリゴヌクレオチドプローブの既知ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよい。その後、検出可能部分を有するプローブが、プローブハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズされ、検出可能部分が検出される。ある態様によると、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドは、対応する検出可能部分を検出することにより識別され、したがって、テンプレート核酸の相補的ヌクレオチドが識別される。
更なるある態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸は、オリゴヌクレオチドプローブから取り除くことができ、その後、テンプレート非ハイブリダイズ核酸を有する更なるオリゴヌクレオチドプローブがライゲーションされてもよく、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドは、検出可能部分を検出することにより識別される。更なる態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションに好適なオリゴヌクレオチドプローブをいずれかの側に隣接させたテンプレート非ハイブリダイズ核酸を含んでいてもよい。
本開示によると、ライゲーションおよび検出のサイクルは、5’から3’方向または3’から5’方向のいずれかで、テンプレート核酸の長さ方向に沿って実施してもよい。その後、上記プロセスを、再び5’または3’方向のいずれかから開始して繰り返し、テンプレート核酸の更なるヌクレオチドを識別してもよい。上記プロセスは、必要に応じて、テンプレート核酸のヌクレオチドの幾つか、複数、または全てが識別されるまで繰り返してもよい。更なる態様によると、ライゲーションおよび検出のサイクルは、5’から3’方向および3’から5’方向の両方で並行して実施してもよい。1つの態様によると、ヌクレオチドは、5’末端でのライゲーションの結果として、または3’末端でのライゲーションの結果として、またはその両方の結果として識別されてもよい。本明細書に述べられている本開示のある実施形態では、異なる検出可能部分が、異なるオリゴヌクレオチドを区別することが可能であるため、2つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを同時に識別することが可能な異なる検出可能部分が使用される。一例として、検出可能部分は、区別可能なほど十分に異なる波長を有していてもよい。この態様によると、区別可能な検出可能部分の数だけ、オリゴヌクレオチドを識別することができるだろう。
1つの態様によると、配列決定用プライマーは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズされる。オリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズされ、配列決定用プライマーにライゲーションされて、伸長ハイブリダイズ配列を形成する。本開示の1つの態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造の1つの特徴は、単一のサイクルでは単一のライゲーションが生じるように、オリゴヌクレオチドプローブの複数ライゲーションを阻害または阻止することができるということである。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造の別の特徴は、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、オリゴヌクレオチドプローブに直接結合されているヌクレオチドを含み、当該ヌクレオチドは、テンプレート核酸にハイブリダイズしないため、オリゴヌクレオチドプローブの完全に一致したハイブリダイゼーションを促進するということである。したがって、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造の更なる特徴は、オリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズしないがオリゴヌクレオチドプローブは一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接に隣接および/または結合されていてもよいということである。オリゴヌクレオチドプローブとテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造とのそのような組み合わせは、テンプレート核酸にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドの数が一定であり、幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドが、更なるライゲーションのために伸長可能である限り、バイアスを低減する。
テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、オリゴヌクレオチドプローブの1つまたは複数の既知ヌクレオチドに対応する1つまたは複数の検出可能部分を含む。1つのそのようなヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドである。この例示的な態様によると、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、A、C、G、またはTの1つに対応する異なる検出可能部分を有する末端ハイブリダイズヌクレオチドとして、A、C、G、またはTを含む。検出可能部分は、既知ヌクレオチドに対応するため、検出可能部分を検出することにより、上記セット内からの特定のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションおよび/またはライゲーション、およびオリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドの同定が確認される。この手法は、オリゴヌクレオチドプローブ内の任意のヌクレオチドに使用することができ、末端ハイブリダイズヌクレオチドに限定されない。
幾つかの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドに隣接および/または結合されている必要はないことが理解されるべきである。例示的な実施形態は、オリゴヌクレオチドプローブ内のヌクレオチドの1つに隣接および/または結合されているテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含み、特定の検出可能部分は、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が結合されているハイブリダイズヌクレオチドの既知の特定のA、C、G、またはTに関連しているため、検出可能部分を検出することにより、上記セット内からの特定のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションおよび/またはライゲーション、およびテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が結合されているオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズヌクレオチドの同定が確認されるようにされる。
更なる例示的な実施形態によると、検出可能部分を含むテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、それが同定することになるヌクレオチドに隣接および/または結合されている必要はない。例えば、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、末端ハイブリダイズヌクレオチドに隣接および/または結合されていてもよいが、検出可能部分は、ハイブリダイズされたおよび/またはライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブ内の既知位置にある既知のA、C、G、またはTを示す。この態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブに沿って特定の位置にある特定のヌクレオチドを示す特定の検出可能部分を用いて設計されている。例示的な態様として、N個のヌクレオチドの1つに隣接および/または結合され、オリゴヌクレオチドプローブ内の特定の位置にあるN個のヌクレオチドの1つを示すテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む、N個のヌクレオチドを有する1セットのオリゴヌクレオチドプローブが調製される。この態様によると、オリゴヌクレオチドプローブ内のいずれにあってもよい所望のヌクレオチドは、検出可能部分のハイブリダイゼーションおよび/またはライゲーション及び検出の所与のサイクルで同定される。更なる態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブのN個のヌクレオチドの各1つのために異なる検出可能部分を含んでいてもよい。この態様によると、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションおよび/またはライゲーションは、オリゴヌクレオチドプローブの単一のハイブリダイゼーションおよび/またはライゲーションの結果として、オリゴヌクレオチドプローブのN個のヌクレオチドの各々の検出を可能にする。
テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、プローブハイブリダイゼーション部位を有する検出可能部分を含むプローブとハイブリダイズするための1つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよく、各プローブハイブリダイゼーション部位は、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドに対応する。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの既知の末端ハイブリダイズヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含んでいてもよい。検出可能部分を有するプローブを、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造にあるプローブハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせること、および検出可能部分を検出することにより、末端ハイブリダイズヌクレオチド、およびテンプレート核酸にある対応する相補的ヌクレオチドが同定される。
テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよく、各プローブハイブリダイゼーション部位は、オリゴヌクレオチドプローブの特定の位置にある特定のヌクレオチドに対応する。この態様によると、N個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの場合、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、N個のプローブハイブリダイゼーション部位を有していてもよく、各プローブハイブリダイゼーション部位は、オリゴヌクレオチドプローブに沿って特定の位置にある特定のヌクレオチドに対応する。更なる態様によると、N個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの場合、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、N個以下のプローブハイブリダイゼーション部位を有していてもよく、各プローブハイブリダイゼーション部位は、オリゴヌクレオチドプローブに沿って特定の位置にある特定のヌクレオチドに対応する。この態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、1、2、3、4、5、もしくは6個等の、または最大N個のプローブハイブリダイゼーション部位を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含んでいてもよく、オリゴヌクレオチドプローブを使用して、1個のヌクレオチド、N個のヌクレオチド、またはN個未満のヌクレオチドを検出することができる。本開示の実施形態は、単一のライゲーションステップまたはサイクルの結果として、オリゴヌクレオチドプローブの複数のヌクレオチドを検出および同定するための、本明細書に記載のプローブの使用を含む。
本開示の1つの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、オリゴヌクレオチドプローブに切断可能に結合されている。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている切断可能なヌクレオチドを有する。この態様によると、そのような組み合わせは、所望の切断部位で切断して、既知の長さの正確なオリゴヌクレオチドプローブの生成を容易にし、それによりバイアスを低減させる。更なる態様によると、切断可能なヌクレオチドを切断することによりテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去し、伸長可能な末端を伸長ハイブリダイズ配列に生成する随意のステップが提供される。1つの態様によると、切断ステップは、ライゲーションに使用可能な伸長可能な末端を生成することができる。別の態様によると、オリゴヌクレオチドプローブの延長不能な末端を修飾して、ライゲーションに使用可能な伸長可能な末端にすることができる。この態様によると、その後、各ライゲーション後に、更なるオリゴヌクレオチドプローブを、一本鎖核酸テンプレートに沿って順に繰り返してハイブリダイズ及びライゲーションし、ハイブリダイズおよびライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドの1つまたは複数または全てが同定され、テンプレート核酸の相補的ヌクレオチドの1つまたは複数または全てが同定される。
テンプレート核酸テンプレートの各ヌクレオチドを配列決定するために、本明細書に記載のライゲーションおよび/またはハイブリダイゼーション法を、テンプレート核酸テンプレートの長さに沿って繰り返し、その後、以前に実施した配列決定と比較して、1つまたは複数のヌクレオチド分を変えて、テンプレート核酸の長さに沿って本方法を繰り返してもよい。このようにして、単一のヌクレオチドが、N個のヌクレオチド(一例として)のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して同定され、ライゲーションおよび/またはハイブリダイゼーションが、ヌクレオチド1個分だけ変えてN−1回繰り返される。言い換えれば、各連続配列決定法の開始ヌクレオチドは、ヌクレオチド1個分だけが変わっており、それによりテンプレート核酸の連続ヌクレオチドの同定が可能になる。
本開示の方法の更なる態様によると、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造、および第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む二重プローブが提供される。1つの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、第1のオリゴヌクレオチドプローブと第2のオリゴヌクレオチドプローブとの間にあり、第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは、その間にあるテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造と共に核酸テンプレートにハイブリダイズしてもよい。
配列決定用プライマーは、核酸テンプレートにハイブリダイズされる。二重プローブの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは各々、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、第1のオリゴヌクレオチドプローブは、配列決定用プライマーにライゲーションされて、伸長ハイブリダイズ配列を形成する。1つの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、上述のように、第1のオリゴヌクレオチドプローブまたは第2のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかのヌクレオチドに対応する検出可能部分を含む。更なる態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、上述のように、第1のオリゴヌクレオチドプローブまたは第2のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかのヌクレオチドに対応する検出可能部分を含むプローブとハイブリダイズするためのプローブハイブリダイゼーション部位を含む。ある態様によると、第1のオリゴヌクレオチドプローブまたは第2のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかのヌクレオチドは、上述のように、対応する検出可能部分を検出することにより同定され、したがって、一本鎖核酸の相補的ヌクレオチドが同定される。1つの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、第1のオリゴヌクレオチドプローブまたは第2のオリゴヌクレオチドプローブまたはその両方の各ヌクレオチドのプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよい。この態様によると、第1のオリゴヌクレオチドプローブまたは第2のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかまたはその両方の配列全体を、単一のライゲーションサイクルで決定することができる。更なる態様によると、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーションに使用可能な伸長可能な末端を含む。或いは、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーションに使用可能な伸長可能な末端を含むように修飾することができる。この態様によると、その後、更なる二重プローブを、一本鎖核酸テンプレートに沿って順に繰り返してハイブリダイズおよびライゲーションさせ、各ライゲーション後に、第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかのヌクレオチドが同定され、またはそれに加えて、第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかまたはその両方のヌクレオチドの各々が、各ライゲーションサイクルで同定される。
本発明の先述のおよび他の特徴および利点は、例示的な実施形態の以下の詳細な説明を添付の図面と共に参照すると、更によく理解されるだろう。
本開示の1つの態様によるDNAテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
本開示の別の態様によるDNAテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
本開示の別の態様によるDNAテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
本開示の別の態様によるDNAテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
本開示の別の態様によるDNAテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
本開示の別の態様によるDNAテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
本開示の別の態様によるDNAテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
本開示の別の態様によるDNAテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
本開示の別の態様によるDNAテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
オリゴヌクレオチドプローブのある位置にあるヌクレオチドおよびテンプレートDNAにあるその相補的ヌクレオチドを同定するための、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列および検出可能部分を有するオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す模式図である。
オリゴヌクレオチドプローブのある位置にあるヌクレオチドおよびテンプレートDNAにあるその相補的ヌクレオチドを同定するための、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列および検出可能部分を有するバーコードプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す模式図である。
実施例Iに記載の通り配列決定したRolonyの三色画像のグレイスケール写真である。ssDNAテンプレートの配列決定用プライマー部位下流の3番目の位置(左の画像)および9番目の位置(右の画像)の調査。凡例に示されている幾何学的形状は両画像で共通であり、Rolonyを示す。2つの位置間の塩基の変化は、形状の変化により観察することができる。オリジナル画像の一部のみが、16倍に拡大されて示されている。
実施例Iに記載の通り配列決定したRolonyの三色画像のグレイスケール写真である。ssDNAテンプレートの配列決定用プライマー部位下流の9番目の位置(左の画像)および15番目の位置(右の画像)の調査。凡例に示されている幾何学的形状は両画像で共通であり、Rolonyを示す。2つの位置間の塩基の変化は、形状の変化により観察することができる。オリジナル画像の一部のみが、16倍に拡大されて示されている。
実施例Iに記載の通り配列決定されたRolonyから3番目と9番目の位置間の塩基転移の割合を比較するヒストグラムである。例として、実施例Iで使用したテンプレートに基づくと、大半のA(配列決定用プライマーから3位)がG(9位)に変化することが予想されるだろう。
実施例Iに記載の通り配列決定されたRolonyから9番目と15番目の位置間の塩基転移の割合を比較するヒストグラムである。例として、実施例Iで使用したテンプレートに基づくと、大半のG(配列決定用プライマーから9位)がA(15位)に変化することが予想されるだろう。
オリゴヌクレオチドプローブのある位置にあるヌクレオチドおよびテンプレートDNAにあるその相補的ヌクレオチドを同定するための、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列および検出可能部分を有するオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す模式図である。
オリゴヌクレオチドプローブのある位置にあるヌクレオチドおよびテンプレートDNAにあるその相補的ヌクレオチドを同定するための、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列およびバーコードプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す模式図である。
本発明の原理は、オリゴヌクレオチド配列の同一性を決定するために特に有利に応用することができる。本明細書で使用されている核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当技術分野の標準的専門書および教科書の記載に従うものとする:例えば、Komberg and Baker,DNA Replication,Second Edition(W.H.Freeman,New York,1992);Lehninger,Biochemistry,Second Edition(Worth Publishers,New York,1975);Strachan and Read,Human Molecular Genetics,Second Edition(Wiley−Liss,New York,1999);Eckstein,editor,Oligonucleotides and Analogs:A Practical Approach(Oxford University Press,New York,1991);Gait,editor,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach (IRL Press,Oxford,1984)。
図1には、本明細書に記載の方法およびプローブのある実施形態の態様が示されている。図1によると、核酸テンプレートが提供されている。核酸テンプレートは、図1のDNAテンプレートにより示されているような一本鎖DNAテンプレート等の一本鎖核酸テンプレートを含んでいてもよい。図1に示されているように、配列決定用プライマーP1が、配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位PS1にハイブリダイズされている。核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位に隣接しているのは、第1のテンプレートヌクレオチドNT1であり、その後ろにテンプレートヌクレオチドNT2〜NT6がある。図1に示されているように、オリゴヌクレオチドプローブL1は、核酸テンプレートにハイブリダイズされており、それぞれNT1〜NT6にハイブリダイズするヌクレオチドN1〜N6を含む。ヌクレオチドN1は、配列決定用プライマーの末端ヌクレオチドにライゲーションされる。N6は、N1および配列決定用プライマーP1から最も遠位にあるヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプローブL1に接続されているのは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHである。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHは、切断可能なヌクレオチドC1を介して、オリゴヌクレオチドプローブL1のヌクレオチドN6に接続されている。切断可能なヌクレオチドC1は、オリゴヌクレオチドプローブL1から除去されるため、カット部位または切断部位と呼ばれる場合もある。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHは、バーコードが、オリゴヌクレオチドプローブの特定の位置にある特定のヌクレオチドに対応するかまたはそれを識別する限り、バーコード部位とも呼ばれるプローブハイブリダイゼーション部位B1を含む。バーコードプローブBP1は、バーコード部位またはプローブハイブリダイゼーション部位B1とハイブリダイズする。バーコードプローブBP1は、検出可能部分または標識またはリポーターR1を含む。図1の実施形態によると、バーコード部位B1は、意図的に既知のヌクレオチドN1〜N6の1つに対応する。このようにして、バーコード部位B1がバーコードプローブBP1にハイブリダイズし、検出可能部分または標識またはリポーターR1が検出されると、オリゴヌクレオチドプローブL1のヌクレオチドが同定される。バーコードプローブB1のハイブリダイゼーションおよび検出可能部分R1の検出は、バーコードが対応するヌクレオチド、したがって該ヌクレオチドがハイブリダイズされる相補的ヌクレオチドを同定する。
図1Aは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHが、バーコード部位とも呼ばれるプローブハイブリダイゼーション部位B1〜B6を含む、本開示の例示的な実施形態である。B1〜B6の各々は、オリゴヌクレオチドプローブL1の意図的に既知のヌクレオチドN1〜N6の1つに対応する。1つの態様によると、バーコード部位B1は既知ヌクレオチドN1に対応し、バーコード部位B2は既知ヌクレオチドN2に対応し、バーコード部位B3は既知ヌクレオチドN3に対応し、バーコード部位B4は既知ヌクレオチドN4に対応し、バーコード部位B5は既知ヌクレオチドN5に対応し、バーコードB6は既知ヌクレオチドN6に対応する。バーコード部位B1〜B6は、図1Aに示されているように、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHに沿って順に配置されていてもよく、またはテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHに沿って無作為に配置されていてもよい。必要なのは、バーコード部位が、オリゴヌクレオチドプローブL1の特定の既知位置にある特定の既知ヌクレオチドに対応することであり、検出可能な標識が検出されると、バーコード部位とハイブリダイゼーションプローブおよび検出可能な標識とのハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドおよびその位置が同定され、したがってテンプレート核酸の相補的ヌクレオチドも同定される。
図2は、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHが、プローブハイブリダイゼーション部位PHSを含む、本開示の例示的な実施形態である。プローブハイブリダイゼーション部位PHSにハイブリダイズされるのは、バーコード部位B1を含むハイブリダイゼーションプローブである。図1と同様に、バーコードプローブBP1は、バーコード部位B1とハイブリダイズする。バーコードプローブBP1は、検出可能部分または標識またはリポーターR1を含む。図2の実施形態によると、バーコード部位B1は、ヌクレオチドN1〜N6の1つに対応する。バーコードプローブB1のハイブリダイゼーションおよび検出可能な部分R1の検出により、バーコードが対応するヌクレオチドが同定される。
図2Aは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHが、プローブハイブリダイゼーション部位PHSを含む、本開示の例示的な実施形態である。プローブハイブリダイゼーション部位PHSにハイブリダイズされるのは、複数のバーコード部位B1〜B6を含むハイブリダイゼーションプローブである。図1Aと同様に、B1〜B6の各々は、オリゴヌクレオチドプローブL1のヌクレオチドN1〜N6の1つに対応する。1つの態様によると、バーコード部位B1はヌクレオチドN1に対応し、バーコード部位B2はヌクレオチドN2に対応し、バーコード部位B3はヌクレオチドN3に対応し、バーコード部位B4はヌクレオチドN4に対応し、バーコード部位B5はヌクレオチドN5に対応し、バーコードB6はヌクレオチドN6に対応する。バーコード部位B1〜B6は、図1Bに示されているように、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHに沿って順に配置されていてもよく、またはテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHに沿って無作為に配置されていてもよい。必要なのは、バーコード部位が、オリゴヌクレオチドプローブL1の特定の既知位置にある特定の既知ヌクレオチドに対応することであり、検出可能な標識が検出されると、バーコード部位とハイブリダイゼーションプローブおよび検出可能な標識とのハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドおよびその位置が同定され、したがってテンプレート核酸の相補的ヌクレオチドも同定される。
図3は、ハイブリダイズされた部分または二本鎖、および非ハイブリダイズ部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHを含む、本開示の例示的な実施形態である。非ハイブリダイズ部分は、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHのハイブリダイズされた部分を形成するハイブリダイズされた二本鎖に結合されたひと続きの1つまたは複数の非対合ヌクレオチドであることを特徴とする。1つの態様によると、ハイブリダイズされた部分および非ハイブリダイズ部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHは、一本鎖核酸により形成されていてもよく、一本鎖核酸の末端部分は、それらがハイブリダイズするように相補性である。一本鎖核酸の中間部分は、非対合ヌクレオチドを含む。この態様によると、ステムおよびループまたはヘアピンと呼ばれる構造が提供されており、図3にはSLとして示されている。ステム部分Sは、ハイブリダイズされた構造を含み、ループ部分Lは一本鎖核酸を含み、一本鎖核酸ループ部分Lの各末端は、鎖のヌクレオチドが対合するステムSに接続されている。ステムおよびループSLは、ハイブリダイズされた部分および中間の非ハイブリダイズ部分を有していればよいだけであることが理解されるべきである。そのような構造は、当業者に知られているバルジ、ミスマッチ、エルボー、非対合セクション、ジャンクション、およびスタック等の種々の二次構造を示す場合がある。図3に示されているように、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHのステムは、切断可能なヌクレオチドC1により、オリゴヌクレオチドプローブL1のヌクレオチドN6に接続されている。切断可能なヌクレオチドC1は、オリゴヌクレオチドプローブL1から除去されるため、カット部位または切断部位と呼ばれる場合もある。ステムおよびループSLの構成であるテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHは、検出可能部分または標識またはリポーターR1を含む。検出可能部分または標識またはリポーターR1は、ステムまたはループSL構造の任意の位置にあってよい。1つの例示的な位置は、図3に示されるように、ステム部分の末端ヌクレオチドにある。検出可能部分または標識またはリポーターR1は、オリゴヌクレオチドプローブL1のヌクレオチドN1〜N6の1つに対応する。1つの態様によると、検出可能部分または標識またはリポーターR1は、オリゴヌクレオチドプローブL1の末端ハイブリダイズヌクレオチドであるヌクレオチドN6に対応する。したがって、検出可能部分または標識またはリポーターR1の検出により、オリゴヌクレオチドプローブL1のN6等の対応するヌクレオチドが同定される。本開示の1つの態様によると、ステムおよびループSL構造は、オリゴヌクレオチドプローブL1以外でのハイブリダイゼーションを防止する。このようにして、オリゴヌクレオチドプローブの長さは厳密である。
図4は、図3について述べたような、ステム等のハイブリダイズされた部分、およびループ等のハイブリダイズされていない部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHを含む、本開示の例示的な実施形態である。図4に示されているように、一本鎖核酸ループ部分Lは、バーコード部位とも呼ばれるプローブハイブリダイゼーション部位B1を含む。バーコードプローブBP1は、バーコード部位またはプローブハイブリダイゼーション部位B1とハイブリダイズする。バーコードプローブBP1は、検出可能部分または標識またはリポーターR1を含む。図4の実施形態によると、バーコード部位B1は、ヌクレオチドN1〜N6の1つに対応する。バーコードプローブBP1のハイブリダイゼーションおよび検出可能な部分R1の検出により、バーコードが対応するヌクレオチドが同定される。
図4Aは、図4について述べたような、ステム等のハイブリダイズされた部分、およびループ等のハイブリダイズされていない部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHを含む、本開示の例示的な実施形態である。図4Aに示されているように、一本鎖核酸ループ部分Lは、バーコード部位とも呼ばれるプローブハイブリダイゼーション部位B1〜B6を含む。B1〜B6の各々は、オリゴヌクレオチドプローブL1のヌクレオチドN1〜N6の1つに対応する。1つの態様によると、バーコード部位B1はヌクレオチドN1に対応し、バーコード部位B2はヌクレオチドN2に対応し、バーコード部位B3はヌクレオチドN3に対応し、バーコード部位B4はヌクレオチドN4に対応し、バーコード部位B5はヌクレオチドN5に対応し、バーコードB6はヌクレオチドN6に対応する。バーコード部位B1〜B6は、図4Aに示されているように、一本鎖核酸ループ部分Lに沿って順に配置されていてもよく、または一本鎖核酸ループ部分Lに沿って無作為に配置されていてもよい。必要なのは、バーコード部位が、オリゴヌクレオチドプローブL1の特定の既知位置にある特定の既知ヌクレオチドに対応することであり、検出可能な標識が検出されると、バーコード部位とハイブリダイゼーションプローブおよび検出可能な標識とのハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドおよびその位置が同定され、したがってテンプレート核酸の相補的ヌクレオチドも同定される。
図5は、図4について述べたような、ステム等のハイブリダイズされた部分、およびループ等のハイブリダイズされていない部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHを含む、本開示の例示的な実施形態である。図5に示されているように、末端ハイブリダイズ遠位鎖THDSは、ステムおよびループ構造SLが、オリゴヌクレオチドプローブL1と末端ハイブリダイズ遠位鎖THDSとの間に存在するように、ステムSに結合されている。
図5Aは、図4Aについて述べたような、ステム等のハイブリダイズされた部分、およびループ等のハイブリダイズされていない部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHを含む、本開示の例示的な実施形態である。図5Aに示されているように、末端ハイブリダイズ遠位鎖THDSは、ステムおよびループ構造SLが、オリゴヌクレオチドプローブL1と末端ハイブリダイズ遠位鎖THDSとの間に存在するように、ステムSに結合されている。
図6は、核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズした配列決定用プライマーP1が示されている、本開示の例示的な実施形態である。オリゴヌクレオチドプローブには、核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーP1にライゲーションするための既知ヌクレオチドがN6位に導入されている。図6の例示的な実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、ステム位置の末端ヌクレオチドに結合されている検出可能部分を有するステムおよびループ構造の形態であるテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。検出可能部分は、ステム位置の「U−T」塩基対に結合されていることを示している。「U−T」塩基対は、オリゴヌクレオチドプローブに結合されている。特定のヌクレオチドが示されているが、これらは模式的に例示されているものに過ぎず、当業者であれば、本開示に基づくステムおよびループ構造を形成する任意の特定の核酸配列を設計する方法を理解するだろう。各オリゴヌクレオチドプローブにおいて、N6位のヌクレオチドは既知であり、検出可能部分は、N6位の既知ヌクレオチドに対応する。図6に示されているように、異なる検出可能部分が、オリゴヌクレオチドプローブのN6位のA、C、T、およびGの各々に対応する。図6では、CY5は、あるプローブではAに対応し、TRは、異なるプローブではCに対応し、FITCは異なるプローブではTに対応し、CY3は異なるプローブではGに対応する。核酸テンプレートにハイブリダイズし、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブは、その後、検出可能部分で検出することができる。例えば、図6では、CY3の検出は、N6位にGを有するオリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションしたことを示す。したがって、N6位のGに相補性であるCが、核酸テンプレートのNT6位にあることが同定される。
図7は、核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズした配列決定用プライマーP1が示されている、本開示の例示的な実施形態である。オリゴヌクレオチドプローブには、核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーP1にライゲーションするための既知ヌクレオチドがN6位に導入されている。図7の例示的な実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能部分を含むバーコードプローブとハイブリダイズすることができるプローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位を有する、一本鎖核酸ループ部分を有するステムおよびループ構造の形態のテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。ステム位置は、オリゴヌクレオチドプローブに接続されている「U−T」塩基対を含む。特定のヌクレオチドが示されているが、これらは模式的に例示されているものに過ぎず、当業者であれば、本開示に基づいて、ステムおよびループ構造を形成し、1つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位を含む、任意の特定の核酸配列を設計する方法を理解するだろう。各オリゴヌクレオチドプローブでは、N6位のヌクレオチドは既知であり、バーコードプローブの検出可能部分は、N6位の既知ヌクレオチドに対応する。図7に示されているように、異なる検出可能部分が、オリゴヌクレオチドプローブのN6位のA、C、T、およびGの各々に対応する。図7では、バーコードプローブのCY5は、1つのプローブでAに対応し、バーコードプローブのTRは、別のプローブでCに対応し、バーコードプローブのFITCは、別のプローブでTに対応し、バーコードプローブのCY3は、別のプローブではGに対応する。核酸テンプレートにハイブリダイズし、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブは、その後、プローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位にハイブリダイズするバーコードプローブの検出可能部分で検出することができる。例えば、図7では、CY3の検出は、N6位にGを有するオリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションしたことを示す。したがって、N6位のGに相補性であるCが、核酸テンプレートのNT6位にあることが同定される。
図10は、核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズした配列決定用プライマーP1が示されている、本開示の例示的な実施形態である。オリゴヌクレオチドプローブには、核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーP1にライゲーションするための既知ヌクレオチドがN6位に導入されている。図10の例示的な実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、末端ヌクレオチドのステム位置に結合されている検出可能部分を有するステムおよびループ構造の形態のテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。検出可能部分は、ステム位置の「U−A」塩基対に結合されていることを示す。「U−A」塩基対は、オリゴヌクレオチドプローブに結合されている。特定のヌクレオチドが示されているが、これらは模式的に例示されているものに過ぎず、当業者であれば、本開示に基づいてステムおよびループ構造を形成する任意の特定の核酸配列を設計する方法を理解するだろう。各オリゴヌクレオチドプローブでは、N6位のヌクレオチドは既知であり、検出可能部分は、N6位の既知ヌクレオチドに対応する。図10に示されているように、異なる検出可能部分が、オリゴヌクレオチドプローブのN6位のA、C、T、およびGの各々に対応する。図10では、CY5は、1つのプローブでAに対応し、TRは、別のプローブでCに対応し、FITCは、別のプローブでTに対応し、CY3は、別のプローブでGに対応する。核酸テンプレートにハイブリダイズし、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブは、その後、検出可能部分で検出することができる。例えば、図10では、CY3の検出は、N6位にGを有するオリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションしたことを示す。したがって、N6位のGに相補性であるCが、核酸テンプレートのNT6位にあることが同定される。
図11は、核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズした配列決定用プライマーP1が示されている、本開示の例示的な実施形態である。オリゴヌクレオチドプローブには、核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーP1にライゲーションするための既知ヌクレオチドがN6位に導入されている。図11の例示的な実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能部分を含むバーコードプローブとハイブリダイズすることができるプローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位を有する、一本鎖核酸ループ部分を有するステムおよびループ構造の形態のテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。ステム位置は、オリゴヌクレオチドプローブに接続されている「U−A」塩基対を含む。特定のヌクレオチドが示されているが、これらは模式的に例示されているものに過ぎず、当業者であれば、本開示に基づいてステムおよびループ構造を形成し、1つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位を含む任意の特定の核酸配列を設計する方法を理解するだろう。各オリゴヌクレオチドプローブでは、N6位のヌクレオチドは既知であり、バーコードプローブの検出可能部分は、N6位の既知ヌクレオチドに対応する。図11に示されているように、異なる検出可能部分が、オリゴヌクレオチドプローブのN6位のA、C、T、およびGの各々に対応する。図11では、バーコードプローブのCY5は、1つのプローブでAに対応し、バーコードプローブのTRは、別のプローブでCに対応し、バーコードプローブのFITCは、別のプローブでTに対応し、バーコードプローブのCY3は、別のプローブでGに対応する。核酸テンプレートにハイブリダイズし、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブは、その後、プローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位にハイブリダイズするバーコードプローブの検出可能部分で検出することができる。例えば、図11では、CY3の検出は、N6位にGを有するオリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションしたことを示す。したがって、N6位のGに相補性であるCが、核酸テンプレートのNT6位にあることが同定される。
標的ポリヌクレオチド
オリゴヌクレオチドまたはテンプレートオリゴヌクレオチドとも呼ばれる、本明細書に記載の方法により配列決定される標的ポリヌクレオチドは、当業者に知られている様々な方法で調製することができる。1つの態様によると、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖核酸である。標的ポリヌクレオチドの長さは、様々であってよい。ある態様によると、標的ポリヌクレオチドの長さは、約1ヌクレオチド〜約250,000のヌクレオチドの長さであってもよい。例示的な標的ポリヌクレオチドは、長さが約1ヌクレオチド〜約100,000ヌクレオチド、長さが約1ヌクレオチド〜約10,000ヌクレオチド、長さが約1ヌクレオチド〜約5,000ヌクレオチド、長さが約4ヌクレオチド〜約2,000ヌクレオチド、長さが約6ヌクレオチド〜約2,000ヌクレオチド、長さが約10ヌクレオチド〜約1,000ヌクレオチド、長さが約20ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドであってもよく、重複の有無は問わず、その間の任意の範囲または値であってもよい。
オリゴヌクレオチドまたはテンプレートオリゴヌクレオチドとも呼ばれる、本明細書に記載の方法により配列決定される標的ポリヌクレオチドは、当業者に知られている様々な方法で調製することができる。1つの態様によると、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖核酸である。標的ポリヌクレオチドの長さは、様々であってよい。ある態様によると、標的ポリヌクレオチドの長さは、約1ヌクレオチド〜約250,000のヌクレオチドの長さであってもよい。例示的な標的ポリヌクレオチドは、長さが約1ヌクレオチド〜約100,000ヌクレオチド、長さが約1ヌクレオチド〜約10,000ヌクレオチド、長さが約1ヌクレオチド〜約5,000ヌクレオチド、長さが約4ヌクレオチド〜約2,000ヌクレオチド、長さが約6ヌクレオチド〜約2,000ヌクレオチド、長さが約10ヌクレオチド〜約1,000ヌクレオチド、長さが約20ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドであってもよく、重複の有無は問わず、その間の任意の範囲または値であってもよい。
配列決定用のテンプレートは、dsDNA、ssDNA、cDNA、RNA、および合成または天然オリゴヌクレオチド等の、ポリヌクレオチドの幾つかの線形または環状供給源から調製することができる。
例示的テンプレートは、5’−PO4−GTT CCT CAT TCT CTG AAG ANN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NAC TTC AGC TGC CCC GG−3’−OHの形態の合成オリゴヌクレオチドであり、N部分は、同定するssDNAテンプレートを表わし、GTT CCT CAT TCT CTG AAG A及びAC TTC AGC TGC CCC GGは、配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位(PS1)として使用されることになるアダプターを表わす。本開示の態様によると、配列決定は、5’から3’方向または3’から5’方向のいずれか、または両方向から同時に達成することができる。ある態様によると、テンプレート核酸の複数コピーが、当業者に知られている方法を使用して調製される。1つの態様によると、ssDNA Circligase II(Epicentre社 #CL9025K)またはCircligase I(Epicentre社 #CL4115K)等の他のssDNAリガーゼを使用して、またはdsDNAリガーゼ(例えば(T3、T4、T7、および他のdsDNAリガーゼ)とブリッジオリゴ(5’−ATGAGGAACCCGGGGCAG−3’−PO4)との組み合わせを使用するテンプレート特異的ライゲーションにより、ssDNAテンプレートを環状化することができる。化学ライゲーション法も記載されている(Dolinnaya et al.,1993;Kumar et al.,2007)。
1つの態様によると、10pmolのssDNAテンプレートを、Circligase IIを使用し、製造業者の推奨に従って環状化する。環状化の後、20ユニットのエキソヌクレアーゼI(Enzymatics社 #X801L)および100ユニットのエキソヌクレアーゼIII(Enzymatics社 #X802L)を反応に添加して、全ての残留線形テンプレートを消化する。次に、高い処理能力、強い置換活性、および低いエラー率を有するDNAポリメラーゼを使用して、環状ssDNAテンプレートに対してローリングサークル増幅法(RCA)を実施する。ローリングサークル増幅法は、当業者に知られており、それらには、Drmanac et al.,Human genome sequencing using unchained base reads on self−assembling DNA nanoarrays,Science,vol.327,p.78−81(2009)が含まれる。1つの態様によると、1pmolの環状化テンプレートを、20ユニットのphi29DNAポリメラーゼ(Enzymatics社 #P702L)と共に使用する。また、dNTP(典型的には、1mM)およびRCAプライマー(典型的には、1pmol)が必要である。例示的なRCAプライマーは、5’−AATGAGGAACCCGGGGCA*G*Cの形態を有するはずであり、*は、ホスホロチオエート結合を表わし、それにより、最後の3’ヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を保持し、RCAがphi29 3’−>5’エキソヌクレアーゼ活性の影響を受けにくくなることが示されている。しかしながら、特に、使用したポリメラーゼが、3’−>5’エキソヌクレアーゼ活性を有してしない場合、例示的なRCAプライマーは、そのようなホスホロチオエート結合を含んでいなくともよい。或いは、例示的なRCAプライマーは、5’−A*A*TGAGGAACCCGGGGCAGC等、RCAプライマーの5’側にホスホロチオエート結合を有していてもよい。phi29を添加する前に、アニーリング反応を実施して、RCA効率を増加させることが多い(95℃で1分間、その後2分間4℃に冷却する)。その後、反応物を、30℃で1時間インキュベートする(15分から6時間のインキュベーション時間としてもよい)。phi29は、4℃〜40℃で活性であるため(90%活性低下)、他の温度を使用することができる。その後、反応物を4℃に冷却し、RCA産物(Rolonyと呼ぶ)が、冷却PBSに回収され、必要になるまで4℃で保管することができる。この方法で調製したローリングサークル増幅産物は、数か月の間安定しており、配列決定技術アッセイのテンプレートとして使用することができる。
また、テンプレートは、生物学的供給源に由来するdsDNAを使用して調製することができる。まず、ゲノムDNAを、この目的のために市販されている幾つかの抽出キットの1つを使用して、抽出することになるだろう。その後、機械的(Covaris社製の集束電気音響、ネブライザー、超音波処理、ボルテックス)または酵素的(例えば、Fragmentase)断片化を使用して、dsDNAは任意の長さまたは特定の長さに断片化されるだろう。100〜1000ヌクレオチドの断片サイズを維持することが実際的であるが、任意のサイズを使用することができる。製造業者の指示書に従って、T4 DNAポリメラーゼおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Enzymatics社 #Y914−HC−L)の混合物を使用して、断片化されたdsDNAの末端を1段階で修復およびリン酸化する。3’−>5’エキソヌクレアーゼ活性を有しており、鎖置換活性が低いかまたは活性がない他のDNAポリメラーゼを使用することができる。DNAリガーゼ、典型的にはT3(Enzymatics社 #L601L)またはT4 DNAリガーゼ(Enzymatics社 #L603−HC−L)を使用して、dsDNAオリゴヌクレオチドから構成されるアダプターをdsDNAに付加する。反応は、製造業者指示書に従って、室温で20分間実施する。アダプターは、Ad1 5’−GTTCCTCATTCTCTGAAGA、Ad2 5’−TCTTCAGAGAATGAG、Ad3 5’−CCGGGGCAGCTGAAGT、およびAd4 5’−ACTTCAGCTGCCの形態であってもよく、ライゲーションする前に、Ad1−Ad2が共にアニーリングされ、Ad3−Ad4が共にアニーリングされる。ライゲーションの後、Bst DNAポリメラーゼ大型断片(NEB #M0275L)等と共にDNAポリメラーゼを使用して、5’突出末端を付加する。次に、5’−PO4−GTTCCTCATTCTCTGAAGAおよび5’−ビオチン−CCGGGGCAGCTGAAGTの形態のPCRプライマーを使用して制限PCR(典型的には、6〜8回のサイクル)を実施し、複数コピーを生成する。その後、5’ビオチンを、dsDNAの一方の末端でストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(Invitrogen社 #65305)に結合させ、テンプレートがビーズに結合されている以外、上述のようにCircligase II反応を実施することにより、他方の末端が回収されることを可能にする。これは、反応物を65℃で2時間インキュベートすることにより実施され、それにより5’−PO4を有するDNA鎖の脱アニーリングおよび環状化が可能になるだろう。エキソヌクレアーゼ消化の後、環状ssDNAテンプレートは、上記で考察したようなローリングサークル増幅法(RCA)用に準備が整う。また、アダプターは、Ad5 5’−GAAGTCTTCTTACTCCTTGGGCCCCGTCAGACTTCおよびAd6 5’−GTTCCGAGATTTCCTCCGTTGTTGTTAATCGGAACの形態であってもよく、Ad5およびAd6は各々、ライゲーションされるこヘアピン構造をdsDNAの各側に形成し、事実上、RCA用に準備が整っている環状ssDNA産物を作成する。プルダウンアッセイを使用して、各ヘアピンの1つを保持するが、各ヘアピンの2つは保持していないテンプレートを選択することができる。この場合、5’−ビオチン−TAACAACAACGGAGGAAA−C3spの形態の1つのループに相補的なオリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに結合することになる。次に、上述のように、RCAプライマー(5’−ACGGGGCCCAAGGAGTA*A*G)を使用して、RCAを実施することができる。
他の増幅方法を使用することができる。一般的に、「増幅」は、プライマーを使用した酵素的合成のラウンドを繰り返すことにより、アレイの核酸分子またはビーズに結合された核酸分子のコピーを産生することを含む。「In situ」増幅は、増幅が、溶液中ではなく支持体またはビーズに配置されているテンプレート核酸分子で起こることを示していた。In situ増幅法は、米国特許第6,432,360号に記載されている。
ポリメラーゼの選択は、温度、鎖置換、およびプルーフリーディング等の様々な特性に応じて様々なものがある。増幅は、上述のように等温性であってもよく、以下の文献に記載されている多重置換増幅(MDA)等の類似の応用であってもよい:Dean et al.,Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,vol.99,p.5261−5266.2002;更にDean et al.,Rapid amplification of plasmid and phage DNA using phi29 DNA polymerase and multiply−primed rolling circle amplification,Genome Res.,vol.11,p.1095−1099.2001;更にAviel−Ronen et al.,Large fragment Bst DNA polymerase for whole genome amplification of DNA formalin−fixed paraffin−embedded tissues,BMC Genomics,vol.7,p.312.2006。また、増幅は、以下の文献により広く使用されることになった従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)等、異なる温度群によるサイクルで実施することができる:Mullis et al.,Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,vole 51,p.263−273.1986。ゲノム増幅に、より応用可能なバリエーションは、以下の文献に記載されている;Zhang et al.,Whole genome amplification from a single cell:implications for genetic analysis,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,vol.89,p.5847−5851.1992;およびTelenius et al.,Degenerate oligonucleotide−primed PCR:general amplification of target DNA by a single degenerate primer,Genomics,vol.13,p.718−725.1992。他の方法には、以下のものが含まれる:Mitra and Church,In situ localized amplification and contact replication of many individual DNA molecules,Nuc.Acid.Res.,vole 27,pages e34.1999に記載されているポロニーPCR;Shendure et al.,Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome,Science,vol.309,p.1728−32.2005;およびWilliams et al.,Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR,Nat.Methods,vol.3,p.545−550.2006に記載のエマルジョンPCR(ePCR)。任意の増幅法を逆転写ステップと組み合わせて、RNAの増幅は演繹的に可能になる。ある態様によると、増幅は絶対に必要だとは限らない。というのは、十分な感受性を有するプローブ、リポーター、および検出系を使用すれば、上述のテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を使用する単一分子の検出が可能であるからである。ある系の感受性を調節する方法には、励起供給源(例えば、照明)および検出(例えば、光検出器、光電子増倍管)を選択することが含まれる。シグナルレベルを調節する方法には、リポーターのスタッキングを可能にするプローブが含まれ、高光度リポーター(例えば、量子ドット)を使用することもできる。
本開示に有用な増幅法は、核酸を、ハイブリダイゼーションおよび鎖延長を促進する条件下で核酸に特異的にハイブリダイズする1つまたは複数のプライマーと、接触させることを含んでいてもよい。核酸を増幅する例示的な方法には、以下のものが含まれる:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、以下の文献を参照:Mullis et al.(1986)Cold Spring Harb. Symp.Quant.Biol.51 Pt 1:263およびCleary et al.(2004)Nature Methods 1:241;および米国特許第4,683,195号および第4,683,202号)、アンカーPCR、RACE PCR、ライゲーション連鎖反応(LCR)(例えば、以下の文献を参照:Landegran et al.(1988)Science 241:1077−1080;およびNakazawa et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:360−364)、自家持続配列複製法(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1874)、転写増幅系(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:1173)、Q−ベータレプリカーゼ(Lizardi et al.(1988)BioTechnology 6:1197)、再帰的PCR(recursive PCR)(Jaffe et al.(2000)J.Biol.Chem.275:2619;およびWilliams et al.(2002)J.Biol.Chem.277:7790)、米国特許第6,391,544号、第6,365,375号、第6,294,323号、第6,261,797号、第6,124,090号、および第5,612,199号に記載の増幅法、または当業者に周知の技術を使用した任意の他の核酸増幅法。例示的な実施形態では、本明細書に開示されている方法は、PCR増幅法を使用する。
ある例示的な実施形態では、核酸配列を増幅するための方法が提供される。核酸を増幅するための例示的な方法には、以下のものが含まれる:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Mullis et al.(1986)Cold Spring Harb. Symp.Quant.Biol.51 Pt 1:263およびCleary et al.(2004)Nature Methods 1:241;および米国特許第4,683,195号および第4,683,202号)、アンカーPCR、RACE PCR、ライゲーション連鎖反応(LCR)(例えば、以下の文献を参照:Landegran et al.(1988)Science 241:1077−1080;およびNakazawa et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:360−364)、自家持続配列複製法(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1874)、転写増幅系(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:1173)、Q−ベータレプリカーゼ(Lizardi et al.(1988)BioTechnology 6:1197)、再帰的PCR(Jaffe et al.(2000)J.Biol.Chem.275:2619;およびWilliams et al.(2002)J.Biol.Chem.277:7790)、米国特許第6,391,544号、第6,365,375号、第6,294,323号、第6,261,797号、第6,124,090号、および第5,612,199号に記載の増幅法、等温増幅法(例えば、ローリングサークル増幅法(RCA)、超分岐ローリングサークル増幅法(HRCA)、鎖置換増幅法(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅法(HDA)、PWGA)、または当業者に周知の技術を使用した任意の他の核酸増幅法。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、DNAの相補鎖の同時プライマー伸長により、特定のDNA配列をin vitro増幅するための反応を指す。言いかえれば、PCRは、プライマー結合部位により隣接された標的核酸の複数のコピーまたは複製を製作するための反応であり、そのような反応は、下記ステップの1つまたは複数を繰り返すことを含む:(i)標的核酸を変性させるステップ、(ii)プライマーをプライマー結合部位にアニーリングさせるステップ、および(iii)ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長させるステップ。通常、上記反応は、サーマルサイクラー機器にて、各ステップに最適化された異なる温度で繰り返される。各ステップの特定の温度、継続期間、およびステップ間の変化率は、当業者に周知の多くの要因に依存する。例えば、以下の文献に例示されている:McPherson et al.,editors,PCR:A Practical Approach and PCR2:A Practical Approach(IRL Press、オックスフォード、それぞれ1991年および1995年)。例えば、Taq DNAポリメラーゼを使用する従来のPCRでは、二本鎖標的核酸は、90℃を超える温度で変性され、プライマーは、50〜75℃の範囲の温度でアニーリングされ、プライマーは、68〜78℃の範囲の温度で伸長されてもよい。
用語「PCR」は、RT−PCR、リアルタイムPCR、ネステッドPCR、定量PCR、多重PCR、およびアセンブリPCR等を含む、上記反応の派生形態を包含するが、これらに限定されない。反応容積は、数百ナノリットル、例えば200nL〜数百マイクロリットルの範囲であり、例えば200μLである。「逆転写PCR」または「RT−PCR」は、標的RNAを相補的一本鎖DNAに変換する逆転写反応がまず実施され、その後それが増幅されるPCRを意味する。例えば、Tecottらの米国特許第5,168,038号を参照されたい。「リアルタイムPCR」は、反応が進行すると共に、反応生成物、つまりアンプリコンの量がモニターされるPCRを意味する。リアルタイムPCRには、主に反応生成物のモニターに使用される検出化学が異なる多くの形態がある。例えば、Gelfandらの米国特許第5,210,015号(「Taqman」);Wittwerらの米国特許第6,174,670号および第6,569,627号(挿入色素);Tyagiら(米国特許第5,925,517号(分子ビーコン)。リアルタイムPCRの検出化学は、Mackay et al.,Nucleic Acids Research,30:1292−1305(2002)に概説されている。「ネステッドPCR」は、第1のPCRのアンプリコンが、少なくとも1つが第1のアンプリコンの内部位置に結合する新しいセットのプライマーを使用する第2のPCRの試料となる2段階PCRを意味する。本明細書で使用される場合、ネステッド増幅反応に関する「初期プライマー」は、第1のアンプリコンの生成に使用されるプライマーを意味し、「第2のプライマー」は、第2のまたはネステッドアンプリコンの生成に使用される1つまたは複数のプライマーを意味する。「多重PCR」は、複数の標的配列(または単一の標的配列と1つまたは複数の基準配列)が、同じ反応混合物中で同時に実施されるPCRを意味する。例えば、Bernard et al.(1999)Anal.Biochem.,273:221−228(2色リアルタイムPCR)。通常、増幅される配列毎に異なるセットのプライマーが使用される。「定量PCR」は、試料または標本中の1つまたは複数の特定の標的配列の含有量を測定するためのPCRを意味する。定量PCRの技術は、以下の文献に例示されているように当業者に周知である:Freeman et al.,Biotechniques,26:112−126(1999);Becker−Andre et al.,Nucleic Acids Research,17:9437−9447(1989);Zimmerman et al.,Biotechniques,21:268−279(1996);Diviacco et al.,Gene,122:3013−3020(1992);およびBecker−Andre et al.,Nucleic Acids Research,17:9437−9446(1989)等。
一般的に、本明細書に記載の標的ポリヌクレオチド、テンプレートヌクレオチド、テンプレート非ハイブリダイズ核酸またはプローブは、用語「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」を含み、同義的に使用され、これらに限定されないが、種々の長さ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を有していてもよいヌクレオチドのポリマー形態を含むことが意図されている。異なるポリヌクレオチドは、異なる三次元構造を有する場合があり、既知または未知の種々の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、以下のものが含まれる:遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、遺伝子間DNA(限定ではないが、ヘテロクロマチンDNAを含む)、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離DNA配列、単離RNA配列、核酸プローブ、およびプライマー。本明細書に記載の方法に有用なオリゴヌクレオチドは、天然核酸配列およびその変異体、人工核酸配列、またはそのような配列の組み合わせを含んでいてもよい。
ポリヌクレオチドは、典型的には、4つのヌクレオチド塩基の特定の配列からなる:アデニン(A);シトシン(C);グアニン(G);およびチミン(T)(ポリヌクレオチドがRNAである場合は、チミン(T)の代わりにウラシル(U))。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。或いは、この用語は、ポリヌクレオチド分子自体に適用されてもよい。このアルファベット表記は、機能性ゲノム科学および相同性探索等のバイオインフォマティクス応用に使用される、中央処理装置を有するコンピューターのデータベースに入力することができる。任意に、ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の非標準的ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および/または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
修飾ヌクレオチドの例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:ジアミノプリン、S2T、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−D−ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、ベータ−D−マンノシルキューオシン、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−D46−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ウィブトシン(wybutoxosine)、シュードウラシル、キューオシン(queosine)、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピルウラシル、(acp3)w、および2,6−ジアミノプリン等。また、核酸分子は、塩基部分(例えば、典型的には相補的ヌクレオチドと水素結合を形成するために使用可能な1つまたは複数の原子、および/または非典型的には相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することが不能な1つまたは複数の原子にて)、糖部分、またはリン酸塩骨格が修飾されていてもよい。また、核酸分子は、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)等のアミン反応性部分の共有結合による結合を可能にするために、アミノアリル−dUTP(aa−dUTP)およびアミノヘキシルアクリルアミド−dCTP(aha−dCTP)等のアミン修飾基を含んでいてもよい。
オリゴヌクレオチド配列は、天然供給源から単離されてもよく、または商業的供給者から購入してもよい。ある例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、ホスホラミダイトリンカーの1つまたは複数を使用して、および/または当業者に知られているライゲーション法による配列決定により調製することができる。また、オリゴヌクレオチド配列は、任意の好適な方法で調製することができる:例えば、本明細書の下記に記載のものならびにBeaucage and Carruthers((1981)Tetrahedron Lett.22:1859)に記載のもの等の標準的ホスホラミダイト法、またはMatteucci et al.(1981)J.Am.Chem.Soc.103:3185)によるトリエステル法により、または当技術分野で知られている市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置またはハイスループット高密度アレイ法のいずれかを使用する他の化学的方法により(米国特許第5,602,244号、第5,574,146号、第5,554,744号、第5,428,148号、第5,264,566号、第5,141,813号、第5,959,463号、第4,861,571号、および第4,659,774号を参照。これらの文献は、あらゆる目的のため、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。また、あらかじめ合成されているオリゴヌクレオチドを、様々な業者から商業的に取得してもよい。
ある例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、当技術分野で知られている様々なマイクロアレイ技術を使用して調製することができる。あらかじめ合成されたオリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチド配列を、支持体に結合させてもよく、または以下の文献に示されている、光に基づく方法、フローチャネルおよびスポッティング法、インクジェット法、ピンに基づく方法、およびビーズに基づく方法を使用してin situで合成してもよい:McGall et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:13555;Synthetic DNA Arrays In Genetic Engineering,Vol.20:111,Plenum Press (1998);Duggan et al.(1999)Nat.Genet.S21:10;Microarrays:Making Them and Using Them In Microarray Bioinformatics,Cambridge University Press,2003;米国特許出願公開第2003/0068633号および第2002/0081582号;米国特許第6,833,450号、第6,830,890号、第6,824,866号、第6,800,439号、第6,375,903号、および第5,700,637号;ならびに国際公開第04/031399号、国際公開第04/031351号、国際公開第04/029586号、国際公開第03/100012号、国際公開第03/066212号、国際公開第03/065038号、国際公開第03/064699号、国際公開第03/064027号、国際公開第03/064026号、国際公開第03/046223号、国際公開第03/040410号、および国際公開第02/24597号。
固相支持体
ある例示的な実施形態では、本明細書に記載の1つまたは複数のテンプレート核酸配列、つまりオリゴヌクレオチド配列は、支持体に固定されている(例えば、固体および/または半固体支持体)。ある態様では、オリゴヌクレオチド配列は、本明細書に記載のホスホラミダイトリンカーの1つまたは複数を使用して支持体に結合させることができる。好適な支持体には、これらに限定されないが、スライド、ビーズ、チップ、粒子、ストランド、ゲル、シート、チューブ、球体、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、およびプレート等が含まれる。種々の実施形態では、固体支持体は、生物学的、非生物学的、有機的、無機的、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。実質的に平坦な支持体を使用する場合、支持体は、例えば、トレンチ、溝、ウエル、または化学的障壁(例えば、疎水性コーティング等)を有する領域に物理的に分離されていてもよい。
ある例示的な実施形態では、本明細書に記載の1つまたは複数のテンプレート核酸配列、つまりオリゴヌクレオチド配列は、支持体に固定されている(例えば、固体および/または半固体支持体)。ある態様では、オリゴヌクレオチド配列は、本明細書に記載のホスホラミダイトリンカーの1つまたは複数を使用して支持体に結合させることができる。好適な支持体には、これらに限定されないが、スライド、ビーズ、チップ、粒子、ストランド、ゲル、シート、チューブ、球体、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、およびプレート等が含まれる。種々の実施形態では、固体支持体は、生物学的、非生物学的、有機的、無機的、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。実質的に平坦な支持体を使用する場合、支持体は、例えば、トレンチ、溝、ウエル、または化学的障壁(例えば、疎水性コーティング等)を有する領域に物理的に分離されていてもよい。
ある例示的な実施形態では、支持体はマイクロアレイである。本明細書で使用される場合、用語「マイクロアレイ」は、1つの実施形態では、固定されたハイブリダイゼーションプローブを各々含有する空間的に規定されている重複しない領域または部位のアレイが存在する実質的に平坦な表面を有する固相支持体を含む一種のアッセイを指す。「実質的に平坦な」は、プローブ部位等の、表面にある目的の特徴または物体が、表面の上または下に伸長し、その寸法が表面の寸法と比べて小さい容積を占めていてもよいことを意味する。例えば、光ファイバー束の面に配置されているビーズは、プローブ部位の実質的に平坦な表面を生成し、または多孔性の平坦な基材に配置または合成されているオリゴヌクレオチドは、実質的に平坦な表面を生成する。更に、空間的に規定されている部位は、その位置の固定されているプローブの位置および同一性が既知であるかまたは決定可能であるという点で、「アドレス可能」であってもよい。
マイクロアレイに固定されたオリゴヌクレオチドには、アッセイ反応にてまたはアッセイ反応から生成される核酸が含まれる。典型的には、マイクロアレイのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖であり、通常は5’末端または3’末端により固相支持体に共有結合で結合されている。ある例示的な実施形態では、プローブは、本明細書に記載の切断可能なリンカーの1つまたは複数を介して固定されている。マイクロアレイの核酸を含有する非重複領域の密度は、典型的には1cm2当たり100個超、より典型的には1cm2当たり1000個超である。核酸プローブに関するマイクロアレイ技術は、以下の例示的な文献に概説されている:Schena,Editor,Microarrays:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,2000);Southern,Current Opin.Chem.Biol.,2:404−410(1998);Nature Genetics Supplement,21:1−60(1999);ならびにFodorらの米国特許第5,424,186号;第5,445,934号;および第5,744,305号。
オリゴヌクレオチドを支持体に固定するための方法は、当技術分野で公知である(ビーズ:Dressman et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817,Brenner et al.(2000)Nat.Biotech.18:630,Albretsen et al.(1990)Anal.Biochem.189:40、およびLang et al.Nucleic Acids Res.(1988)16:10861;ニトロセルロース:Ranki et al.(1983)Gene 21:77;セルロース:Goldkorn(1986)Nucleic Acids Res.14:9171;ポリスチレン:Ruth et al.(1987)Conference of Therapeutic and Diagnostic Applications of Synthetic Nucleic Acids,Cambridge U.K.;テフロン−アクリルアミド:Duncan et al.(1988)Anal.Biochem.169:104;ポリプロピレン:Polsky−Cynkin et al.(1985)Clin. Chem.31:1438;ナイロン:Van Ness et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:3345;アガロース:Polsky−Cynkin et al.,Clin.Chem.(1985)31:1438;およびセファクリル:Langdale et al.(1985)Gene 36:201;ラテックス:Wolf et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:2911)。
本明細書で使用される場合、用語「結合させる」は、共有結合相互作用および非共有相互作用を両方とも指す。共有結合相互作用は、1対の電子(つまり、単結合)、2対の電子(つまり、二重結合)または3対の電子(つまり、三重結合)を共有することにより形成される2つの原子またはラジカル間の化学的連結である。共有結合相互作用は、当技術分野では、電子対相互作用または電子対結合としても知られている。非共有相互作用には、これらに限定されないが、ファンデルワールス相互作用、水素結合、弱い化学結合(つまり、近距離非共有結合力による)、疎水的相互作用、およびイオン結合等が含まれる。非共有相互作用の概説は、Alberts et al.,in Molecular Biology of the Cell,3d edition,Garland Publishing,1994に見出すことができる。
配列決定用プライマー
本開示による配列決定用プライマーは、標的ポリヌクレオチドの既知結合領域に結合可能であり、本開示のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションを促進可能なものである。配列決定用プライマーは、例えば、DNAWorksまたはGene2Oligo等のコンピュータープログラムの助力を用いて設計することができる。結合領域は、長さが様々であってもよいが、配列決定用プライマーとハイブリダイズするのに十分な長さであるべきである。標的ポリヌクレオチドは、複数の異なる結合領域を有していてもよく、それにより標的ポリヌクレオチドの異なる区画の配列決定が可能になる。配列決定用プライマーは、ライゲーションの連続サイクル中にハイブリダイズを維持するように、非常に安定した二本鎖を形成するように選択されている。配列決定用プライマーは、ライゲーションが、5’から3’方向に、または3’から5’方向に、または両方向に進行することができるように選択することができる。配列決定用プライマーは、それらのハイブリダイゼーション効率を増強するために、またはそれらの安定性を向上させるために、または一方の末端もしくは他方の末端からの伸長を防止するために、修飾されたヌクレオチドまたは結合を含有していてもよい。
本開示による配列決定用プライマーは、標的ポリヌクレオチドの既知結合領域に結合可能であり、本開示のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションを促進可能なものである。配列決定用プライマーは、例えば、DNAWorksまたはGene2Oligo等のコンピュータープログラムの助力を用いて設計することができる。結合領域は、長さが様々であってもよいが、配列決定用プライマーとハイブリダイズするのに十分な長さであるべきである。標的ポリヌクレオチドは、複数の異なる結合領域を有していてもよく、それにより標的ポリヌクレオチドの異なる区画の配列決定が可能になる。配列決定用プライマーは、ライゲーションの連続サイクル中にハイブリダイズを維持するように、非常に安定した二本鎖を形成するように選択されている。配列決定用プライマーは、ライゲーションが、5’から3’方向に、または3’から5’方向に、または両方向に進行することができるように選択することができる。配列決定用プライマーは、それらのハイブリダイゼーション効率を増強するために、またはそれらの安定性を向上させるために、または一方の末端もしくは他方の末端からの伸長を防止するために、修飾されたヌクレオチドまたは結合を含有していてもよい。
1つの態様によると、一本鎖DNAテンプレート(ssDNA)は、上述のようなRCAにより調製され、配列決定用プライマーと共に使用される。或いは、一本鎖テンプレートは、エマルジョン中のビーズまたはナノ粒子に結合されており、ePCRにより増幅される。結果は、単一の増幅されたssDNAテンプレートを有するクローンビーズである。
幾つかのテンプレートヌクレオチド配列を並行して同定するためには、テンプレートを、PBS緩衝液pH7.4で希釈し、ビオチン−ストレプトアビジン、アジド−アルキン(例えば、クリック化学)、NHS−エステル、またはシリル化(例えば、アルデヒド−、エポキシ−、アミノ−シラン)等の種々の結合方法を使用して、パターン化基材または非パターン化基材のいずれかに結合させる。1つの態様によると、rolonyを、SiO2固体表面等のパターン化表面に結合させ、1%アミノシラン(容積/容積)で処理し、ある期間(典型的には、5分〜2時間)相互作用させる。その後、あらゆる未結合テンプレートを、洗浄1緩衝液を使用して洗い流す。
次に、配列決定用プライマー(P1)を調製し、配列決定用プライマーハイブリダイズ部位PS1にハイブリダイズさせる。ある態様によると、テンプレートの既知配列にハイブリダイズすることができる配列決定用プライマーを調製することができる。或いは、テンプレート調製中に、既知核酸配列を有するアダプターを、当業者に知られている方法および本明細書に記載の方法に従って、ライゲーション、増幅、転位、または組換えにより未知核酸配列に付加する。更に、或いは、あるレベルの縮重を有する配列決定用プライマーを使用して、テンプレートに沿ってある複数の位置にハイブリダイズさせることができる。1つの態様によると、プライマー縮重を使用して、プライマーがテンプレートに沿って半無作為にハイブリダイズさせることができる。プライマー縮重は、プライマーがテンプレートの長さに沿ってある間隔でハイブリダイズすることを容易にするように、当業者に知られている統計的手法に基づいて選択される。この態様によると、100塩基毎、200塩基毎、2000塩基毎、100,000塩基毎等のN塩基毎の結合を容易にするある縮重を有するプライマーを設計することができる。テンプレートの長さに沿ったプライマーの結合は、プライマーのデザイン、およびプライマーデザインがテンプレートの長さに沿ってN塩基毎に結合する統計的可能性に基づく。配列決定用プライマーP1は、ライゲーションにより伸長されることになるため、配列決定用プライマーP1の末端基は、DNAリガーゼによりオリゴヌクレオチドプローブ(L1)に共有結合で結合される準備が整っているように典型的には合成される。ライゲーションが、配列決定用プライマーP1の5’末端とオリゴヌクレオチドプローブL1の3’末端の間で生じる場合、リン酸基(5’−PO4)は、配列決定用プライマーP1に存在しなければならなず、ヒドロキシル基(3’−OH)は、オリゴヌクレオチドプローブL1に存在しなければならない。その逆もまた同様である。配列決定用プライマーP1を配列決定用プライマーハイブリダイズ部位PS1にハイブリダイズするために、5×SSPE緩衝液で希釈した1uMの配列決定用プライマーP1が使用される。その後、混合物を、室温を超える温度で数分間インキュベートして、適切なアニーリングを促進する(典型的には、25〜55℃の温度で1〜5分間)。
オリゴヌクレオチドプローブ
本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、約1ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドを有するものである。例示的なオリゴヌクレオチドプローブは、約1ヌクレオチド〜約20ヌクレオチド、約3ヌクレオチド〜約15ヌクレオチド、約5ヌクレオチド〜約12ヌクレオチド、または約6ヌクレオチド〜約10ヌクレオチドを含む。例示的なオリゴヌクレオチドプローブは、約6ヌクレオチドを含む。1つの態様によると、本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズすることが可能であるべきである。更なる態様によると、本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーまたは伸長二本鎖にライゲーションして、次のライゲーションサイクルのための伸長二本鎖を生成することが可能であるべきである。また更なる態様によると、第1のプローブが、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーまたは伸長二本鎖にライゲーションして、次のライゲーションサイクルのための伸長二本鎖を生成することが可能であり、第2のプローブが、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズ可能である、オリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを使用することができる。本開示によるプローブは、検出可能部分を含んでいてもよく、または検出可能にすることが可能であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、DNAWorksまたはGene2Oligo等のコンピュータープログラムの助力を用いて設計してもよい。
本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、約1ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドを有するものである。例示的なオリゴヌクレオチドプローブは、約1ヌクレオチド〜約20ヌクレオチド、約3ヌクレオチド〜約15ヌクレオチド、約5ヌクレオチド〜約12ヌクレオチド、または約6ヌクレオチド〜約10ヌクレオチドを含む。例示的なオリゴヌクレオチドプローブは、約6ヌクレオチドを含む。1つの態様によると、本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズすることが可能であるべきである。更なる態様によると、本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーまたは伸長二本鎖にライゲーションして、次のライゲーションサイクルのための伸長二本鎖を生成することが可能であるべきである。また更なる態様によると、第1のプローブが、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーまたは伸長二本鎖にライゲーションして、次のライゲーションサイクルのための伸長二本鎖を生成することが可能であり、第2のプローブが、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズ可能である、オリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを使用することができる。本開示によるプローブは、検出可能部分を含んでいてもよく、または検出可能にすることが可能であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、DNAWorksまたはGene2Oligo等のコンピュータープログラムの助力を用いて設計してもよい。
本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、単一ライゲーションサイクルでの複数ライゲーションを防止する末端部分を含んでいてもよい。また、本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、伸長可能な末端がまだ存在していない場合、更なるライゲーション用の伸長可能な末端を生成または含むように修飾が可能であるべきである。本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートと完全に一致した二本鎖を形成する必要はないが、完全な一致した二本鎖が好例である。その代わり、オリゴヌクレオチドプローブは、プローブのヌクレオチドと本明細書に記載の方法により同定される相補的ヌクレオチドとの間に完全な一致を有する必要があるのみである。
オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションおよびライゲーション
オリゴヌクレオチドプローブを一本鎖テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションするための方法は、当業者に公知である。「ハイブリダイゼーション」は、2つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合で結合して、安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。また、用語「ハイブリダイゼーション」は、3本鎖ハイブリダイゼーションを指す場合がある。その結果生じる(通常は)二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「二本鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」には、典型的には、約1M未満の、より通常は約500mM未満の、更により通常は約200mM未満の塩濃度が含まれるだろう。ハイブリダイゼーション温度は、5℃と低い場合があるが、典型的には22℃超、より典型的には約30℃超、多くの場合は約37℃を超える。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下、つまりプローブがその標的部分配列にハイブリダイズする条件下で実施される。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、環境によって異なる。より長い断片の場合、特異的ハイブリダイゼーションには、より高いハイブリダイゼーション温度が必要となる場合がある。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があるため、パラメーターの組み合わせは、いずれか1つのみの絶対的な手段よりも重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおいて、特異的配列のTmよりも約5℃低くなるように選択される。例示的なストリンジェントな条件には、pH7.0〜8.3および少なくとも25℃の温度、少なくとも0.01M〜1M未満のNaイオン濃度(または他の塩)の塩濃度、が含まれる。例えば、5×SSPE(750mM NaCl、50mM Naリン酸塩、5mM EDTA、pH7.4)および25〜30℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに好適である。ストリンジェントな条件については、例えば、Sambrook,Fritsche and Maniatis,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.Cold Spring Harbor Press (1989)およびAnderson Nucleic Acid Hybridization,1st Ed.,BIOS Scientific Publishers Limited(1999)を参照されたい。「特異的に〜にハイブリダイズする」または「〜に特異的にハイブリダイズする」または類似表現は、その配列が複雑な混合(例えば、全細胞)DNAまたはRNA中に存在する場合、分子がストリンジェント条件下で1つまたは複数の特定のヌクレオチド配列に実質的に、またはそれにのみ結合、二本鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
オリゴヌクレオチドプローブを一本鎖テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションするための方法は、当業者に公知である。「ハイブリダイゼーション」は、2つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合で結合して、安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。また、用語「ハイブリダイゼーション」は、3本鎖ハイブリダイゼーションを指す場合がある。その結果生じる(通常は)二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「二本鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」には、典型的には、約1M未満の、より通常は約500mM未満の、更により通常は約200mM未満の塩濃度が含まれるだろう。ハイブリダイゼーション温度は、5℃と低い場合があるが、典型的には22℃超、より典型的には約30℃超、多くの場合は約37℃を超える。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下、つまりプローブがその標的部分配列にハイブリダイズする条件下で実施される。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、環境によって異なる。より長い断片の場合、特異的ハイブリダイゼーションには、より高いハイブリダイゼーション温度が必要となる場合がある。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があるため、パラメーターの組み合わせは、いずれか1つのみの絶対的な手段よりも重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおいて、特異的配列のTmよりも約5℃低くなるように選択される。例示的なストリンジェントな条件には、pH7.0〜8.3および少なくとも25℃の温度、少なくとも0.01M〜1M未満のNaイオン濃度(または他の塩)の塩濃度、が含まれる。例えば、5×SSPE(750mM NaCl、50mM Naリン酸塩、5mM EDTA、pH7.4)および25〜30℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに好適である。ストリンジェントな条件については、例えば、Sambrook,Fritsche and Maniatis,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.Cold Spring Harbor Press (1989)およびAnderson Nucleic Acid Hybridization,1st Ed.,BIOS Scientific Publishers Limited(1999)を参照されたい。「特異的に〜にハイブリダイズする」または「〜に特異的にハイブリダイズする」または類似表現は、その配列が複雑な混合(例えば、全細胞)DNAまたはRNA中に存在する場合、分子がストリンジェント条件下で1つまたは複数の特定のヌクレオチド配列に実質的に、またはそれにのみ結合、二本鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
ライゲーションは、酵素的または化学的のいずれかで達成することができる。「ライゲーション」は、テンプレートで進む反応において、2つ以上の核酸、例えばオリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドの末端間に共有結合または連結を形成することを意味する。結合または連結の性質は、幅広く様々であってもよく、ライゲーションは、酵素的にまたは化学的に実施することができる。本明細書で使用される場合、ライゲーションは、通常は酵素的に実施され、1つのオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの5’炭素と、別のオリゴヌクレオチドの3’炭素と間にリン酸ジエステル結合が形成される。様々なテンプレートで進むライゲーション反応が、以下の文献に記載されている:Whitelyらの米国特許第4,883,750号;Letsingerらの米国特許第5,476,930号;Fungらの米国特許第5,593,826号;Koolの米国特許第5,426,180号;Landegrenらの米国特許第5,871,921号;Xu and Kool(1999)Nucl.Acids Res.27:875;Higgins et al.,Meth.in Enzymol.(1979)68:50;Engler et al.(1982)The Enzymes,15:3(1982);およびNamsaraevの米国特許出願公開第2004/0110213号。
化学ライゲーション法は、以下の文献に開示されている:Ferris et al.,Nucleosides&Nucleotides,8:407−414(1989)およびShabarova et al.,Nucleic Acids research,19:4247−4251(1991)。酵素ライゲーション法では、リガーゼが使用される。多数のリガーゼが当業者に知られており、以下の文献に参照されている:Lehman,Science,186:790−797(1974);Engler et al.,DNA ligases,pages 3−30 in Boyer,editor,The Enzymes,Vol.15B(Academic Press,New York,1982)等。例示的なリガーゼには、T4 DNAリガーゼ、T7 DNAリガーゼ,大腸菌DNAリガーゼ、Taqリガーゼ、およびPfuリガーゼ等が含まれる。リガーゼを使用するためのあるプロトコールは、製造業者により開示されており、更に以下の文献に開示されている:Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory manual,2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989);barany,PCR Methods and Applications,1:5−16(1991);Marsh et al.,Strategies,5:73−76(1992)。
ライゲーションが100%の効率でない場合、ライゲーションしなかった伸長二本鎖が更なるライゲーションステップに関与しないように、それらをキャッピングすることが望ましい場合がある。ある態様によると、キャッピングは、アルカリホスファターゼを使用して、5’リン酸(5’PO)を除去することにより実施することができる。例としては、配列決定用のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション後、その反応緩衝液100μL中10ユニットの仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ(NEB社、#M0393L)等の溶液中に、アルカリホスファターゼを添加することにより未反応5’POを除去する。反応物を室温で15分間インキュベートする。他のアルカリホスファターゼは好適である。また、キャッピングは、エキソヌクレアーゼ活性を欠損するポリメラーゼを使用して、5’−>3’方向に末端ヌクレオチドを付加する(したがって、プライマーの3’末端をキャッピングする)ことにより実施することができる。末端ヌクレオチドは様々であるが、ジデオキシヌクレオチド(ddNTP)およびアシクロヌクレオチド(acyNTP)が最も多く用いられる。また、非テンプレートヌクレオチドを、末端ヌクレオチドとして使用することができる。ポリメラーゼ伸長によるキャッピングは、反応に通常使用されるdNTPが、DNAポリメラーゼまたは末端トランスフェラーゼ(TdT)が複数のヌクレオチドを付加することを防止する末端NTP(例えば、ddNTP)により置き換えられていること以外は記載のように実施し、DNAポリメラーゼを使用してポリヌクレオチド配列を増幅する。例としては、配列決定用のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション後、1mM ddNTPおよびその反応緩衝液100μL中20ユニットの末端トランスフェラーゼ(NEB社 #M0315L)を含むキャッピング混合物を添加する。反応物を室温で15分間インキュベートする。或いは、キャッピングは、理想的には長さが6〜9merのオリゴヌクレオチドをキャッピング末端とライゲーションさせることにより実施することができる。キャッピングは、5’POの代わりに5’ヒドロキシル(5’OH)、反対側では3’OHの代わりに3’PO、末端NTP(ddNTP、逆方向ddNTP、acyNTP)、または末端炭素スペーサ(例えば、C3スペーサ)を有するオリゴの形態であってもよい。この方法は、キャッピングしようとするポリヌクレオチド配列の5’末端または3’末端のキャッピングにも同様に有効であろう。ライゲーションによるキャッピングは、オリゴヌクレオチドプローブのライゲーションについて記載されているように実施される。例としては、配列決定用のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション後、100μL反応容積当たり1200ユニットのT4 DNAリガーゼを有するライゲーション緩衝液に添加された1uMの5’または3’がキャップされたオリゴヌクレオチドを含むキャッピング混合物が添加される。反応物を室温で15分間インキュベートする。
本開示によると、特定のセットのオリゴヌクレオチドプローブL1を使用して、ssDNAテンプレートとハイブリダイズさせ、DNAリガーゼにより配列決定用プライマーP1と共有結合で結合される。オリゴヌクレオチドプローブL1を、ライゲーション緩衝液で調製し(典型的には、1uM)、100μL反応容積当たり6000ユニットのT3 DNAリガーゼ(Enzymatics社 #L601L)または1200ユニットのT4 DNAリガーゼ(Enzymatics社 #L603−HC−L)を使用してライゲーションする。反応物を、室温で数分〜数時間インキュベートする(典型的には、15℃〜35℃の温度で、5分〜2時間)。その後、酵素およびあらゆる未ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブL1を洗浄1緩衝液で洗い流す。
ハイブリダイゼーション条件
ある例示的な実施形態では、用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、安定した二本鎖の形成を意味する。1つの態様では、安定した二本鎖とは、二本鎖の鎖Tmより約5℃低い温度または約5度高い温度のいずれかの温度、および低一価塩濃度、例えば0.2M未満または0.1Mまたは当業者に知られている塩濃度未満の条件下でストリンジェントに洗浄しても、二本鎖構造が破壊されないことを意味する。用語「完全に一致する」は、二本鎖に関して使用される場合、二本鎖を構成するポリヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド鎖が、互いに二本鎖構造を形成し、各鎖の全てのヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドとワトソン‐クリック型塩基対合することを意味する。用語「二本鎖」は、これらに限定されないが、デオキシイノシン、2−アミノプリン塩基を有するヌクレオシド、およびPNA等のヌクレオシド類似体の対合が使用される場合があることを含む。2つのオリゴヌクレオチド間の二本鎖の「ミスマッチ」は、二本鎖中の1対のヌクレオチドが、ワトソン−クリック結合で対合しないことを意味する。
ある例示的な実施形態では、用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、安定した二本鎖の形成を意味する。1つの態様では、安定した二本鎖とは、二本鎖の鎖Tmより約5℃低い温度または約5度高い温度のいずれかの温度、および低一価塩濃度、例えば0.2M未満または0.1Mまたは当業者に知られている塩濃度未満の条件下でストリンジェントに洗浄しても、二本鎖構造が破壊されないことを意味する。用語「完全に一致する」は、二本鎖に関して使用される場合、二本鎖を構成するポリヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド鎖が、互いに二本鎖構造を形成し、各鎖の全てのヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドとワトソン‐クリック型塩基対合することを意味する。用語「二本鎖」は、これらに限定されないが、デオキシイノシン、2−アミノプリン塩基を有するヌクレオシド、およびPNA等のヌクレオシド類似体の対合が使用される場合があることを含む。2つのオリゴヌクレオチド間の二本鎖の「ミスマッチ」は、二本鎖中の1対のヌクレオチドが、ワトソン−クリック結合で対合しないことを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、約1M未満の、より通常は約500mM未満の、更により通常は約200mM未満の塩濃度を含むだろう。ハイブリダイゼーション温度は、5℃と低くもできるが、典型的には22℃超、より典型的には約30℃超、多くの場合は約37℃を超える。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下、つまりプローブがその標的部分配列に特異的にハイブリダイズする条件下で実施される。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、環境によって異なる。より長い断片の場合、特異的ハイブリダイゼーションには、より高いハイブリダイゼーション温度が必要となる場合がある。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があるため、パラメーターの組み合わせは、いずれか1つのみの絶対的な手段よりも重要である。
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおける特定の配列のTmよりも約5℃低くなるように選択される。例示的なストリンジェントな条件には、pH7.0〜8.3および少なくとも25℃の温度にて、少なくとも0.01M〜1M未満のNaイオン濃度(または他の塩)の塩濃度が含まれる。例えば、5×SSPE(750mM NaCl、50mM Naリン酸塩、5mM EDTA、pH7.4)および25〜30℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに好適である。ストリンジェントな条件については、例えば、Sambrook,Fritsche and Maniatis,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.Cold Spring Harbor Press (1989)およびAnderson Nucleic Acid Hybridization,1st Ed.,BIOS Scientific Publishers Limited(1999)を参照されたい。本明細書で使用される場合、用語「特異的に〜にハイブリダイズする」または「〜に特異的にハイブリダイズする」または類似の用語は、ある分子が、ストリンジェントな条件下で1つまたは複数の特定のヌクレオチド配列に実質的に結合、二本鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列
本開示のある態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、オリゴヌクレオチドプローブに結合されている。テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでいてもよい。テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを有するプローブとハイブリダイズするためのプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよい。テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、直鎖核酸配列であってもよく、またはテンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、ステムおよびループ構造であってもよい。
本開示のある態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、オリゴヌクレオチドプローブに結合されている。テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでいてもよい。テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを有するプローブとハイブリダイズするためのプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよい。テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、直鎖核酸配列であってもよく、またはテンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、ステムおよびループ構造であってもよい。
直鎖核酸配列を製作する方法は、当業者に知られている。直鎖核酸配列は、核酸配列との1つまたは複数のまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含むように設計されており、プローブハイブリダイゼーション部位は、プローブ核酸配列に相補的であるように選択されているため、プローブとプローブハイブリダイゼーション部位とのハイブリダイゼーションがもたらされる。1つの態様によると、直鎖核酸配列は、ヌクレオチドの配列を選択し、その後、以下の文献に記載されている方法およびアルゴリズム等を使用して、ワトソン‐クリック型塩基対合を決定することにより設計することができる:Zuker et al.,Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary structure Prediction:A Practical Guide,RNA Biochemistry and Biotechnology,p.11−43,J.Barciszewski and B.F.C.Clark,eds.,NATO ASI Series,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,NL(1999)。塩基対合を形成する可能性が高い配列の場合、ヌクレオチドを変更することができる。プローブは、検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでおり、したがって、プローブが、対応するプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズすると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを含むことになるだろう。
ステムおよびループ型核酸構造を製作する方法は、当業者に知られている。ループ構造は、核酸配列との1つまたは複数のまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含むように設計されており、プローブハイブリダイゼーション部位は、プローブ核酸配列に相補的であるように選択されいるため、それによりプローブとプローブハイブリダイゼーション部位とのハイブリダイゼーションがもたらされる。1つの態様によると、ステムおよびループ構造は、ヌクレオチドの配列を選択し、その後、以下の文献に記載されている方法およびアルゴリズム等を使用して、ワトソン‐クリック型塩基対合を決定することにより設計することができる:Zuker et al.,Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary structure Prediction:A Practical Guide,RNA Biochemistry and Biotechnology,p.11−43,J.Barciszewski and B.F.C.Clark,eds.,NATO ASI Series,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,NL(1999)。塩基対合を形成する可能性が高い配列の場合、ヌクレオチドを変更することができる。プローブは、検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでおり、したがって、プローブが、対応するプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズすると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを含むことになるだろう。
プローブは、検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでおり、したがって、プローブが、対応するプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズすれば、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを含むことになるだろう。ステムおよびループ構造は、ステムおよびループ構造に直接結合されている検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでいてもよい。検出可能部分、標識、またはリポーターを核酸配列に結合する方法は、当業者に公知である。
検出可能部分
ある例示的な実施形態では、検出可能部分、標識、またはリポーターは、本明細書に記載の1つまたは複数のヌクレオチドを検出するために用いることができる。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、蛍光部分および発色部分等の検出可能部分を直接的または間接的に結合させることを含む様々な方法で標識することができる。当業者であれば、標識DNAに関する文献を参照することができる。検出可能部分の例には、以下のものが含まれる:種々の放射性部分、酵素、補欠分子団、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、金属粒子、タンパク質−タンパク質結合対、およびタンパク質−抗体結合対等。蛍光部分の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:黄色蛍光タンパク質(YFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(CFP)、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、シアニン、ダンシルクロリド、フィコシアニン、およびフィコエリトリン等。生物発光マーカーの例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:ルシフェラーゼ(例えば、細菌性、ホタル、およびコメツキムシ等)、ルシフェリン、およびエクオリン等。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素系の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ(glucorinidase)、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびコリンエステラーゼ等。また、識別可能なマーカーには、125I、35S、14C、または3H等の放射性化合物が含まれる。識別可能なマーカーは、様々な業者から市販されている。
ある例示的な実施形態では、検出可能部分、標識、またはリポーターは、本明細書に記載の1つまたは複数のヌクレオチドを検出するために用いることができる。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、蛍光部分および発色部分等の検出可能部分を直接的または間接的に結合させることを含む様々な方法で標識することができる。当業者であれば、標識DNAに関する文献を参照することができる。検出可能部分の例には、以下のものが含まれる:種々の放射性部分、酵素、補欠分子団、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、金属粒子、タンパク質−タンパク質結合対、およびタンパク質−抗体結合対等。蛍光部分の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:黄色蛍光タンパク質(YFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(CFP)、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、シアニン、ダンシルクロリド、フィコシアニン、およびフィコエリトリン等。生物発光マーカーの例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:ルシフェラーゼ(例えば、細菌性、ホタル、およびコメツキムシ等)、ルシフェリン、およびエクオリン等。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素系の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ(glucorinidase)、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびコリンエステラーゼ等。また、識別可能なマーカーには、125I、35S、14C、または3H等の放射性化合物が含まれる。識別可能なマーカーは、様々な業者から市販されている。
蛍光標識、ならびにそれらのヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドとの結合は、以下の文献を含む多数の概説に記載されている:Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Ninth Edition(Molecular Probes,Inc.,Eugene,2002);Keller and Manak,DNA Probes,2nd Edition(Stockton Press,New York,1993);Eckstein,editor,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach (IRL Press,Oxford,1991);およびWetmur,Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,26:227−259(1991)。本発明に適用可能な特定の方法は、以下の例示的な文献に開示されている:米国特許第4,757,141号、第5,151,507号、および第5,091,519号。1つの態様では、例えば、以下の文献に開示されているもの等の、1つまたは複数の蛍光色素が、標識標的配列の標識として使用される:米国特許第5,188,934号(4,7−ジクロロフルオレセイン色素);第5,366,860号(スペクトル的に分析可能なローダミン色素);第5,847,162号(4,7−ジクロロローダミン色素);第4,318,846号(エーテル置換フルオレセイン色素);第5,800,996号(エネルギー移動色素);Leeらの第5,066,580号(キサンチン色素);および第5,688,648号(エネルギー移動色素)等。また、標識は、以下の特許および特許広報に開示されるように、量子ドットを用いて実施することができる:米国特許第6,322,901号、第6,576,291号、第6,423,551号、第6,251,303号、第6,319,426号、第6,426,513号、第6,444,143号、第5,990,479号、第6,207,392号、第2002/0045045号、および第2003/0017264号。本明細書で使用される場合、用語「蛍光標識」は、1つまたは複数の分子の蛍光吸収および/または発光特性により情報を伝達するシグナル伝達部分を含む。そのような蛍光特性には、蛍光強度、蛍光寿命、発光スペクトル特徴、およびエネルギー移動等が含まれる。
ヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド配列に容易に組み込まれる市販の蛍光性ヌクレオチド類似体には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:Cy3−dCTP、Cy3−dUTP、Cy5−dCTP、Cy5−dUTP(Amersham Biosciences社、ピスカタウエイ、ニュージャージー州)、フルオレセイン−12−dUTP、テトラメチルローダミン−6−dUTP、TEXAS RED(商標)−5−dUTP、CASCADE BLUE(商標)−7−dUTP、BODIPY TMFL−14−dUTP、BODIPY TMR−14−dUTP、BODIPY TMTR−14−dUTP、RHODAMINE GREEN(商標)−5−dUTP、OREGON GREENR(商標)488−5−dUTP、TEXAS RED(商標)−12−dUTP、BODIPY TM 630/650−14−dUTP、BODIPY TM 650/665−14−dUTP、ALEXA FLUOR(商標)488−5−dUTP、ALEXA FLUOR(商標)532−5−dUTP、ALEXA FLUOR(商標)568−5−dUTP、ALEXA FLUOR(商標)594−5−dUTP、ALEXA FLUOR(商標)546−14−dUTP、フルオレセイン−12−UTP、テトラメチルローダミン−6−UTP、TEXAS RED(商標)−5−UTP、mCherry、CASCADE BLUE(商標)−7−UTP、BODIPY TM FL−14−UTP、BODIPY TMR−14−UTP、BODIPY TM TR−14−UTP、RHODAMINE GREEN(商標)−5−UTP、ALEXA FLUOR(商標)488−5−UTP、ALEXA FLUOR(商標)546−14−UTP(Molecular Probes,Inc社、ユージーン、オレゴン州)等。或いは、上記のフルオロフォアおよび本明細書で言及されているものは、例えば、ホスホロアミダイト(phosphoroamidite)またはNHS化学を使用して、オリゴヌクレオチド合成中に付加することができる。他のフルオロフォアを有するヌクレオチドをカスタム合成するためのプロトコールは、当技術分野で公知である(Henegariu et al.(2000)Nature Biotechnol.18:345を参照)。2−アミノプリンは、合成中にオリゴヌクレオチド配列に直接組み込むことができる蛍光性塩基である。核酸は、DAPI、YOYO−1、臭化エチジウム、およびシアニン色素(例えば、SYBRグリーン)等の挿入色素で、事後的に染色することもできる。
合成後結合に使用可能な他のフルオロフォアには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:ALEXA FLUOR(商標)350、ALEXA FLUOR(商標)405、ALEXA FLUOR(商標)430、ALEXA FLUOR(商標)532、ALEXA FLUOR(商標)546、ALEXA FLUOR(商標)568、ALEXA FLUOR(商標)594、ALEXA FLUOR(商標)647、BODIPY493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY530/550、BODIPY TMR、BODIPY558/568、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY TR、BODIPY630/650、BODIPY650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、ダンシル,リサミンローダミンB、Marina Blue、Oregon Green488,Oregon Green514、Pacific Blue、Pacific Orange、ローダミン6G、rhodamine green、rhodamine red、テトラメチルローダミン、Texas Red(Molecular Probes,Inc社、ユージーン、オレゴン州)から入手可能)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、およびCy7(Amersham Biosciences社、ピスカタウエイ、ニュージャージー州)等。また、これらに限定されないが、以下のものを含むFRETタンデムフルオロフォアを使用することができる:PerCP−Cy5.5、PE−Cy5、PE−Cy5.5、PE−Cy7、PE−Texas Red、APC−Cy7、PE−Alexa色素(610、647、680)、およびAPC−Alexa色素等。
金属銀または金粒子を使用して、蛍光標識ヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド配列からのシグナルを増強してもよい(Lakowicz et al.(2003)BioTechniques 34:62)。
また、ビオチンまたはその誘導体を、ヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド配列の標識として使用し、その後、検出可能に標識されたアビジン/ストレプトアビジン誘導体(例えば、フィコエリトリン結合ストレプトアビジン)または検出可能に標識された抗ビオチン抗体と結合させてもよい。ジゴキシゲニンを標識として組み込み、その後、検出可能に標識された抗ジゴキシゲニン抗体(例えば、フルオレセイン化抗ジゴキシゲニン)と結合させてもよい。アミノアリル−dUTPまたはアミノヘキシルアクリルアミド−dCTP残基を、オリゴヌクレオチド配列に組み込み、その後、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)誘導体化蛍光色素と結合させてもよい。一般的に、検出可能に標識された結合パートナーが結合して、検出が可能になる限り、任意の種類の結合対を検出オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。本明細書で使用される場合、抗体という用語は、あらゆるクラスの抗体分子、またはFab等の、そのあらゆる部分断片を指す。
オリゴヌクレオチド配列に好適な他の標識には、以下のものが含まれ得る:フルオレセイン(FAM、FITC)、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール(DNP)、ダンシル、ビオチン、ブロモデオキシウリジン(BrdU)、ヘキサヒスチジン(6×His)、およびリン光体アミノ酸(例えば、P−tyr、P−ser、P−thr)等。1つの実施形態では、抗体の各々が検出可能な標識で誘導体化されている以下のハプテン/抗体対が検出に使用される:ビオチン/α−ビオチン、ジゴキシゲニン/α−ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール(DNP)/α−DNP、5−カルボキシフルオレスセイン(FAM)/α−FAM。
ある例示的な実施形態では、ヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド配列は、例えば、特に以下の文献に記載されているような捕捉剤とその後結合するハプテンを用いて間接的に標識されていてもよい:米国特許第5,344,757号、第5,702,888号、第5,354,657号、第5,198,537号、および4,849,336号、ならびに国際公開第91/17160号等。様々なハプテン−捕捉剤対が使用可能である。例示的なハプテンには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:ビオチン、des−ビオチンおよび他の誘導体、ジニトロフェノール、ダンシル、フルオレセイン、CY5、ならびにジゴキシゲニン等。ビオチンの場合、捕捉剤は、アビジン、ストレプトアビジン、または抗体であってもよい。抗体は、他のハプテンの捕捉剤として使用してもよい(多数の色素−抗体対が市販されている。例えば、Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州)。
ある態様によると、本明細書に記載の検出可能な部分は、スペクトル的に分析可能である。複数の蛍光標識に関して「スペクトル的に分析可能な」とは、標識の蛍光発光バンドが、十分に分離しており、つまり十分に非重複性であり、それぞれの標識に結合されている分子タグが、それぞれの標識で発生する蛍光シグナルに基づき、標準的な光検出システムで、例えば、以下の文献に記載のシステムにより例示されているバンドパスフィルターおよび光電増倍管のシステム等を使用することにより、識別することができることを意味する:米国特許第4,230,558号;もしくは第4,811,218等、またはWheeless et al.,pgs.21−76,in Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis(Academic Press,New York,1985)。1つの態様では、フルオレセインおよびローダミン等のスペクトル的に分析可能な有機色素は、最大発光波長が、少なくとも20nm離れて分離されており、別の態様では少なくとも40nm離れて分離されていることを意味する。別の態様では、スペクトル的に分析可能なキレートランタニド化合物および量子ドット等は、最大発光波長が、少なくとも10nm離れて分離されており、更なる態様では少なくとも15nm離れて分離されていることを意味する。
切断可能部分
本開示のある態様によると、切断可能なヌクレオチド部分は、切断可能な連結とも呼ばれ、オリゴヌクレオチドプローブをテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造から分離するために使用される。切断可能部分は当業者に知られており、化学薬品で処理することにより、または酸化環境または還元環境に置くことにより切断することができる化学的に切断容易なヌクレオシド間連結を含む。そのような切断可能部分には、硝酸銀の溶液等の種々の金属イオンにより切断することができるホスホロチオアート、ホスホロチオラートが含まれる。そのような切断可能部分には、酢酸を含む溶液等の酸性状態で切断することができるホスホロアミダートが含まれる。連結を切断することができる好適な化学薬品には、架橋ホスホロチオアート連結を切断することができ、ヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドからホスホラミダイトリンカーを除去し、切断部位のヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドにフリーなリン酸基を残すことができる化学薬品が含まれる。好適な化学薬品には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:AgNO3、AgCH3COO、AgBrO3、Ag2SO4、またはAg2+、HgCl2、I2、Br2、I−、およびBr−等をもたらす任意の化合物。
本開示のある態様によると、切断可能なヌクレオチド部分は、切断可能な連結とも呼ばれ、オリゴヌクレオチドプローブをテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造から分離するために使用される。切断可能部分は当業者に知られており、化学薬品で処理することにより、または酸化環境または還元環境に置くことにより切断することができる化学的に切断容易なヌクレオシド間連結を含む。そのような切断可能部分には、硝酸銀の溶液等の種々の金属イオンにより切断することができるホスホロチオアート、ホスホロチオラートが含まれる。そのような切断可能部分には、酢酸を含む溶液等の酸性状態で切断することができるホスホロアミダートが含まれる。連結を切断することができる好適な化学薬品には、架橋ホスホロチオアート連結を切断することができ、ヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドからホスホラミダイトリンカーを除去し、切断部位のヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドにフリーなリン酸基を残すことができる化学薬品が含まれる。好適な化学薬品には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:AgNO3、AgCH3COO、AgBrO3、Ag2SO4、またはAg2+、HgCl2、I2、Br2、I−、およびBr−等をもたらす任意の化合物。
また、切断可能部分には、当業者に知られているヌクレアーゼにより切断することができるものが含まれる。そのようなヌクレアーゼには、以下のものが含まれる:I型、II型、III型、およびIV型等の制限エンドヌクレアーゼ;エンドヌクレアーゼI〜VIII等のエンドヌクレアーゼ;リボヌクレアーゼ;ならびにAPエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、APリアーゼ活性を有する酵素、およびウラシルDNAグリコシラーゼ等のグリコシラーゼ活性を有する酵素等の他のヌクレアーゼ。
また、切断可能部分には、ある波長の光により切断することが可能なものが含まれる。そのような切断可能部分は、光感受性連結と呼ばれ、Olejnik et al.,Photocleavable biotin derivatives:a versatile approach for the isolation of biomolecules,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.,vol.92,p.7590−7594(1995)に開示されている。そのような光感受性リンカーは、約275〜約375nmの波長のUVを、約1分間等、数秒〜30分間の期間照射することにより切断することができる。例示的な波長には、約300nm〜約350nmが含まれる。
また、dGTP、dCTP、およびdTTP等のあるヌクレオチドは、切断可能な連結として使用するために組み込む前に反応させて、ヌクレアーゼまたは化学薬品による更なる切断に対して特異的に感受性にすることができる。1つの態様によると、所与のテンプレート非ハイブリダイズ核酸の1つまたは複数のデオキシグアノシンは、配列決定反応に追加される前に、2−ニトロプロパンにより8−オキソ−デオキシグアノシンに酸化させることができ、その後、8−オキソグアニンDNAグリコシラーゼ(例えば、Fpg、hOGG1)を使用して切断することができる。同様に、デオキシシトシンは、亜硫酸水素塩または亜硝酸を使用して事前に反応させて、5−ヒドロキシシトシンを形成することができ、それは、その後、hNEIL1等のあるDNAグリコシラーゼにより処理することができる。切断することができる他のヌクレオチドには、ウラシル、デオキシウリジン、イノシン、およびデオキシイノシンが含まれる。
更なる実施形態には、ヌクレオチドを修飾して、より切断感受性にする第1のステップおよびその後ヌクレオチドが切断される第2のステップによる等の、2段階法で切断することができるヌクレオチドが含まれる。そのような系には、他のエンドヌクレアーゼを使用することができるが、典型的にはUDGおよびエンドヌクレアーゼVIIIの組み合わせである、Enzymatics社(#Y918L)またはNew England Biolabs社(#M5505L)から市販されているUSERシステムが含まれる。酵素UDGおよびエンドヌクレアーゼは、市販されている。また、修飾ヌクレオチドは、結合等のヌクレオチドの特徴が、切断を容易にするように修飾されている切断可能なヌクレオチドであってもよい。例には、脱塩基性塩基、脱ピリミジン性塩基、脱プリン塩基性塩基、ホスホロチオアート、ホスホロチオラート、および8−オキソ−デオキシグアノシンに酸化させることができるデオキシグアノシン等の酸化塩基が含まれる。
したがって、ヌクレオチド間結合は、化学薬品、熱による切断であってもよく、または光に基づく切断であってもよい。本明細書に記載の方法で使用される例示的な化学的に切断可能なヌクレオチド間連結には以下のものが含まれる:例えば、β−シアノエーテル、5’−デオキシ−5’−アミノカルバマート、3’デオキシ−3’−アミノカルバマート、尿素、2’シアノ−3’,5’−ホスホジエステル、3’−(S)−ホスホロチオアート、5’−(S)−ホスホロチオアート、3’−(N)−ホスホロアミダート、5’−(N)−ホスホロアミダート、α−アミノアミド、隣接ジオール、リボヌクレオシド挿入、2’−アミノ−3’,5’−リン酸ジエステル、アリルスルホキシド、エステル、シリルエーテル、ジチオアセタール、5’−チオ−フルマール、α−ヒドロキシ−メチル−ホスホン酸ビスアミド、アセタール、3’−チオ−フルマール、メチルホスホナート、およびホスホトリエステル。トリアルキルシリルエーテルおよびジアルコキシシラン等のヌクレオシド間シリル基は、フッ化物イオンを用いた処理により切断される。塩基により切断可能な部位には、β−シアノエーテル、5’−デオキシ−5’−アミノカルバマート、3’−デオキシ−3’−アミノカルバマート、尿素、2’−シアノ−3’,5’−ホスホジエステル、2’−アミノ−3’,5’−ホスホジエステル、エステル、およびリボースが含まれる。3’−(S)−ホスホロチオアートおよび5’−(S)−ホスホロチオアート等のチオ含有ヌクレオチド間結合は、硝酸銀または塩化第二水銀を用いた処理により切断される。酸により切断可能な部位には、3’−(N)−ホスホロアミダート、5’−(N)−ホスホロアミダート、ジチオアセタール、アセタール、およびホスホン酸ビスアミドが含まれる。α−アミノアミドヌクレオシド間結合は、イソチオシアナートを用いた処理により切断可能であり、チタンを使用して、2’−アミノ−3’,5’−ホスホジエステル−O−オルト−ベンジルヌクレオシド間結合を切断してもよい。隣接ジオール結合は、過ヨウ素酸塩を用いた処理により切断可能である。熱により切断可能な基には、アリルスルホキシドおよびシクロヘキセンが含まれ、光感受性連結には、ニトロベンジルエーテルおよびチミジン2量体が含まれる。化学的に切断可能な基、熱により切断可能な基、および光感受性基を含有する核酸を合成および切断する方法は、例えば、米国特許第5,700,642号に記載されている。
このように、ヌクレオチド間結合は、酵素的切断を使用して切断することができる。本明細書に記載の核酸配列は、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むように設計することができる。核酸を制限エンドヌクレアーゼと接触させて、切断をもたらすことができる。特異的結合および/または切断部位を有する多種多様な制限エンドヌクレアーゼが、例えばNew England Biolabs社(イプスウィッチ、マサチューセッツ州)から市販されている。種々の実施形態では、3’突出、5’突出、または平滑末端を生成する制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。突出を生成する制限エンドヌクレアーゼを使用する場合、エキソヌクレアーゼ(例えば、RecJf、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT、S1ヌクレアーゼ、P1ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、CEL Iヌクレアーゼ等)を使用して平滑末端を生成してもよい。例示的な実施形態では、IIS型制限エンドヌクレアーゼの結合部位および/または切断部位を含有する直交性プライマー/プライマー結合部位を使用して、一時的直交性プライマー結合部位を除去してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ認識部位」は、これらに限定されないが、1つまたは複数の制限酵素が結合し、制限エンドヌクレアーゼ認識配列自体または制限エンドヌクレアーゼ認識配列の遠位にある配列のいずれかでDNA分子の切断をもたらす特定の核酸配列を含むことが意図されている。制限酵素には、これらに限定されないが、I型酵素、II型酵素、IIS型酵素、III型酵素、およびIV型酵素が含まれる。REBASEデータベースは、制限酵素、DNAメチルトランスフェラーゼ、および制限修飾に関与する関連タンパク質に関する情報の総合的データベースを提供する。REBASEデータベースは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位および制限エンドヌクレアーゼ切断部位、イソシゾマー、商業的入手可能性、結晶構造、および配列データに関する情報の発表および未発表研究を両方とも含有している(Roberts et al.(2005)Nucl.Acids Res.33:D230を参照。この文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
ある態様では、本発明のプライマーは、IIS型酵素が、制限エンドヌクレアーゼ認識配列に対して数個塩基対分3’方向の所で核酸を切断することを可能にする1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。本明細書で使用される場合、用語「IIS型」は、その認識配列から離れた部位を切断する制限酵素を指す。IIS型酵素は、それらの認識部位から0〜20塩基対の範囲だけ離れた所で切断することが知られている。IIs型エンドヌクレアーゼの例には、以下のものが含まれる:例えば、BsrI、BsmI、BstF5I、BsrDI、BtsI、MnlI、BciVI、HphI、MboII、EciI、AcuI、BpmI、MmeI、BsaXI、BcgI、BaeI、BfiI、TspDTI、TspGWI、TaqII、Eco57I、Eco57MI、GsuI、PpiI、およびPsrI等の3’突出を生成する酵素;例えば、BsmAI、PleI、FauI、SapI、BspMI、SfaNI、HgaI、BvbI、FokI、BceAI、BsmFI、Ksp632I、Eco31I、Esp3I、AarI等の5’突出を生成する酵素;ならびに、例えば、MlyIおよびBtrI等の平滑末端を生成する酵素。IIs型エンドヌクレアーゼは、市販されており、当技術分野で周知である(New England Biolabs社、ビバリー、マサチューセッツ州)。IIs型エンドヌクレアーゼを使用する認識部位、切断部位、および消化の条件に関する情報は、例えば、ウェブサイト:neb.com/nebecomm/enzymefindersearch bytypeIIs.aspに見出すことができる。制限エンドヌクレアーゼ配列および制限酵素は当技術分野で周知であり、制限酵素は市販されている(New England Biolabs社、イプスウィッチ、マサチューセッツ州)。
ある態様によると、切断可能部分は、オリゴヌクレオチド内にあってもよく、in situ合成中に導入されてもよい。幅広く様々な切断可能部分が、固相合成およびマイクロアレイオリゴヌクレオチド合成の技術分野で使用可能である(例えば、Pon,R.,Methods Mol.Biol.20:465−496(1993);Verma et al.,Ann.Rev.Biochem.67:99−134(1998);米国特許第5,739,386号、第5,700,642号、および第5,830,655号;ならびに米国特許出願公開第2003/0186226号および第2004/0106728号を参照)。
切断可能部位は、オリゴヌクレオチド骨格に沿って、例えば、リボース、ジアルコキシシラン、ホスホロチオアート、およびホスホロアミダートヌクレオチド間結合等のホスホジエステル基の1つの代わりに、修飾3’−5’ヌクレオチド間結合に位置していてもよい。また、切断可能なオリゴヌクレオチド類似体は、7−デアザグアノシン、5−メチルシトシン、イノシン、およびウリジン等の塩基または糖の1つに置換基またはその置換を含んでいてもよい。
1つの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド内に含有されている切断可能部位は、ジアルコキシシラン、3’−(S)−ホスホロチオアート、5’−(S)−ホスホロチオアート、3’−(N)−ホスホロアミダート、5’−(N)ホスホロアミダート、およびリボース等の化学的に切断可能な基を含んでいてもよい。化学的に切断可能なオリゴヌクレオチドの合成および切断条件は、米国特許第5,700,642号および第5,830,655号に記載されている。例えば、導入される切断可能部位の選択に応じて、まず、機能化ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシド2量体のいずれかを調製し、その後、オリゴヌクレオチド合成過程中に、伸長中のオリゴヌクレオチド断片に選択的に導入してもよい。ジアルコキシシランの選択的な切断は、フッ化物イオンを用いた処理により行ってもよい。ホスホロチオアートヌクレオチド間結合は、穏やかな酸化条件下で選択的に切断してもよい。ホスホロアミダート結合の選択的な切断は、80%酢酸等の穏やかな酸性条件下で実施してもよい。リボースの選択的な切断は、希釈水酸化アンモニウムを用いた処理により実施してもよい。
別の実施形態では、切断不能なヒドロキシルリンカーは、米国特許出願公開第2003/0186226号に記載のように、ホスホラミダイトまたはH−ホスホナートオリゴヌクレオチド合成前に、特殊なホスホラミダイトをヒドロキシル基に結合させることにより、切断可能なリンカーに変換することができる。オリゴヌクレオチド合成の完了時の化学的リン酸化剤の切断は、3’末端にホスファート基を保持するオリゴヌクレオチドを産出する。3’−リン酸末端は、化学薬品またはアルカリホスファターゼ等の酵素を用いた処理により3’ヒドロキシル末端に変換することができる。これは当業者により日常的に実施されている。
別の実施形態では、切断可能な連結部分は、TOPS(合成毎に2オリゴヌクレオチド、two oligonucleotides per synthesis)リンカーであってもよい(例えば、国際公開第93/20092号)。例えば、TOPSホスホラミダイトを使用して、固体支持体上で切断不能なヒドロキシル基を切断可能なリンカーに変換してもよい。TOPS試薬の好ましい実施形態は、ユニバーサルTOPS(商標)ホスホラミダイトである。ユニバーサルTOPS(商標)ホスホラミダイト調製、結合、および切断の条件は、例えば、Hardy et al.Nucleic Acids Research 22(15):2998−3004(1994)に詳細に記載されている。ユニバーサルTOPS(商標)ホスホラミダイトは、長期間のアンモニアおよび/またはアンモニア/メチルアミン処理等の塩基性条件下で除去され、天然3’ヒドロキシオリゴヌクレオチドを生成する環式3’リン酸を生成する。
別の実施形態では、切断可能な連結部分は、アミノリンカーであってもよい。ホスホラミダイト連結を介してリンカーに結合されたその結果生じたオリゴヌクレオチドは、80%酢酸で切断して、3’リン酸化オリゴヌクレオチドを産出することができる。
別の実施形態では、切断可能な連結部分は、オルト−ニトロベンジル光感受性リンカー等の光感受性リンカーであってもよい。固体支持体での光感受性オリゴヌクレオチドの合成および切断条件は、例えば、以下の文献に記載されている:Venkatesan et al.,J.Org.Chem.61:525−529(1996)、Kahl et al.,J.Org.Chem.64:507−510(1999)、Kahl et al.,J.Org.Chem.63:4870−4871(1998)、Greenberg et al.,J.Org.Chem.59:746−753(1994)、Holmes et al.,J.Org.Chem.62:2370−2380(1997)、および米国特許第5,739,386号。また、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、およびFmoc−アミノエチルカルボン酸リンカー等のオルト−ニトロベンジルに基づくリンカーは、商業的に取得することができる。
ある実施形態1
図1A、2A、4A、および5Aを参照すると、オリゴヌクレオチドL1は、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーP1にライゲーションされるヘキサマーからなる。このヘキサマーは、Nヌクレオチドからなり、ヌクレオチドN1は、配列決定用プライマーP1に最も近位にあり、ヌクレオチドN6は最も遠位にある。ヌクレオチドN6は、切断可能部分C1を介してテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHに結合されている。ヘキサマーオリゴヌクレオチドプローブL1が使用される1つの態様によると、4096個のヘキサマーオリゴヌクレオチドプローブ(4^6=4096)は、全てのヌクレオチド(A、C、G、またはT)があらゆる可能な組み合わせのN位置の各々が既知であるように調製される。、。図1A、2A、4A、および5Aでは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、相補的オリゴバーコードプローブBP1〜BP6がハイブリダイズする6つのバーコード認識部位B1〜B6を有する。これは、ヌクレオチドN1〜N6全ての同定に関する情報を提供する。本開示のこの態様は、ヘキサマーの全てのヌクレオチドNの同定を可能にし、この情報を、一本鎖核酸テンプレートの相補的に対合したヌクレオチドと関連させること可能にする。
図1A、2A、4A、および5Aを参照すると、オリゴヌクレオチドL1は、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーP1にライゲーションされるヘキサマーからなる。このヘキサマーは、Nヌクレオチドからなり、ヌクレオチドN1は、配列決定用プライマーP1に最も近位にあり、ヌクレオチドN6は最も遠位にある。ヌクレオチドN6は、切断可能部分C1を介してテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHに結合されている。ヘキサマーオリゴヌクレオチドプローブL1が使用される1つの態様によると、4096個のヘキサマーオリゴヌクレオチドプローブ(4^6=4096)は、全てのヌクレオチド(A、C、G、またはT)があらゆる可能な組み合わせのN位置の各々が既知であるように調製される。、。図1A、2A、4A、および5Aでは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、相補的オリゴバーコードプローブBP1〜BP6がハイブリダイズする6つのバーコード認識部位B1〜B6を有する。これは、ヌクレオチドN1〜N6全ての同定に関する情報を提供する。本開示のこの態様は、ヘキサマーの全てのヌクレオチドNの同定を可能にし、この情報を、一本鎖核酸テンプレートの相補的に対合したヌクレオチドと関連させること可能にする。
図3および6を参照すると、オリゴヌクレオチドプローブ」L1は、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーP1にライゲーションされるヘキサマーからなる。このヘキサマーは、Nヌクレオチドからなり、ヌクレオチドN1は、配列決定用プライマーP1に最も近位にあり、ヌクレオチドN6は最も遠位にある。ヌクレオチドN6は、切断部分C1を介してテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHに結合されている。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHは、リポーター部分R1を含む。本開示のこの態様によると、合計24個のオリゴヌクレオチドプローブが配列決定に必要である。既知ヌクレオチドA、C、G、またはTをN1位に有し、残るヌクレオチドN2〜N6が未知である4つのプローブが設計される。検出可能部分または標識またはリポーターR1は、各プローブが、N1位の既知ヌクレオチドを同定するように選択されている。既知ヌクレオチドA、C、G、またはTをN2位に有し、残るヌクレオチドN1およびN3〜N6が未知である4つのプローブが設計される。検出可能部分または標識またはリポーターR1は、各プローブが、N2位の既知ヌクレオチドを同定するように選択されている。このプローブ設計をN3〜N6の各々について繰り返し、合計24個のオリゴヌクレオチドプローブL1を得る。つまり4つのオリゴの6セット、つまりN1〜N6の各位置について1セットである。この態様は、ヘキサマーの各ヌクレオチドの同定を可能にし、この情報を、一本鎖核酸テンプレートの相補的に対合したヌクレオチドと関連させること可能にする。
図1、2、4、5、7、および11を参照すると、オリゴヌクレオチドプローブL1は、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーP1にライゲーションされるヘキサマーからなる。このヘキサマーは、Nヌクレオチドからなり、ヌクレオチドN1は、配列決定用プライマーP1に最も近位にあり、ヌクレオチドN6は最も遠位にある。ヌクレオチドN6は、切断部分C1を介してテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHに結合されている。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHは、バーコード認識部位B1を含む。合計24個のオリゴヌクレオチドプローブL1が、配列決定に必要である。つまり、図3のように4つのオリゴの6セットで、各セットは、バーコード認識配列により特定のヌクレオチドN位に対応する(つまり、バーコードB1は、所与のセットのN1に対応し、バーコードB2は、第2のセットのN2に対応する等である)。24個のオリゴヌクレオチドプローブL1の各々1つのヘキサマーは、ヌクレオチドの1つが(A、C、G、またはT)、所定のN位で既知であるように設計されており、したがってオリゴヌクレオチドプローブL1は、1セットの24個オリゴヌクレオチドプローブ(4*6=24)からなる。この態様は、ヘキサマーの全てのNの同定を可能にし、この情報を、一本鎖核酸テンプレートの相補的に対合したヌクレオチドと関連させること可能にする。
図5および5Aを参照すると、遠位ハイブリダイズ鎖は、複数のオリゴヌクレオチドプローブL1をテンプレートに直接アッセンブリするためのライゲーション部位としての役目を果たす。1つの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブL1鎖は、標識バーコードプローブを使用してハイブリダイゼーションにより配列決定する前に、テンプレートでライゲーションのサイクルを繰り返すにより形成される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブL1鎖は、配列決定の前に、結合したテンプレートにて形成される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブL1鎖は、各配列決定ステップ後に形成される。1つの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブL1鎖は、自己アッセンブリすることができ、つまり、5’−PO4を有する最大4096個のオリゴヌクレオチドプローブL1の等モル混合物が、DNAリガーゼの存在下でまたは化学ライゲーションでテンプレートにハイブリダイズされる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブL1鎖は、連続的に、つまり、所与のオリゴヌクレオチドプローブL1を配列決定用プライマーP1にハイブリダイズおよびライゲーションさせ、その後、洗浄およびリン酸化または脱保護を行い、第2のオリゴヌクレオチドプローブL1を、ライゲーションされたP1−L1複合体にライゲーションすること等により形成される。
図3、6、および10を参照すると、オリゴヌクレオチドプローブL1は、一本鎖DNA(ssDNA)テンプレートにハイブリダイズされ、DNAリガーゼにより配列決定用プライマーに共有結合で連結される。合計24個のオリゴヌクレオチドプローブL1が、ヘキサマーの6つのヌクレオチドの各々を配列決定するのに必要である。所与のN位の各ヌクレオチドの場合、検出可能部分または標識またはリポーターは、4つのフルオロフォアの1つであり、各セットは、電磁スペクトルの4つの異なる色で検出されるように、後に各ヌクレオチドの1つと関連づけられる(例えば、Aは緑色、Cはオレンジ色、Gは青色、またはTは赤色)。
各セットのオリゴヌクレオチドプローブL1は、使用前に、等モル比になるように混合される(例えば、各25μM)。テンプレートは、連続的に調査されるが(つまり、N1からN6まで)、そうである必要はない。既知のヌクレオチドN1を有するオリゴヌクレオチドプローブL1のセットは、ssDNAにハイブリダイズされ、DNAリガーゼによってP1に共有結合で結合される。検出時に、各色は、N1位のヌクレオチド(A、C、G、またはT)に関連づけられる。例として、所与のテンプレートで緑色のスペクトラムが検出される場合、N1では核酸Aが同定され、一本鎖核酸テンプレートでは、相補的対合塩基Tが同定される。
検出後、標識テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造TNHは、C1でそのヘキサマーから分離され、第2のラウンドのライゲーション中に共有結合で連結される準備が整った末端基が生成される。第2のラウンドのライゲーションでは、上述の、第1のラウンドで使用した同じセットのオリセットゴヌクレオチドプローブL1が使用される。それにより、ssDNAテンプレートのNT7を識別することが可能になる。切断およびライゲーションの連続を必要なだけ繰り返すことができ、第3の連続後にはNT13が識別され、第4の連続後にはNT19が識別される等が可能になる。
その後、既に伸長されている配列決定用プライマーP1を、変性条件を使用してテンプレートから剥離させる。これは、NaOH、尿素、グアニジウムチオシアナート、ホルムアミド、またはジメチルスルホキシド等の変性剤を使用してまたは使用せずに、温度を増加させることにより達成することができる。典型的には、65%ホルムアミドのTE溶液が室温で使用され、1〜2分間インキュベートされる。その後、ホルムアミドおよび伸長されたプライマーを、洗浄1緩衝液で洗い流す。
テンプレートヌクレオチド2(NT2)を同定するには、配列決定用プライマーP1をテンプレート核酸にハイブリダイズさせる。ヌクレオチドN2が既知である第2のセットのオリゴヌクレオチドプローブL1をライゲーションさせる。その後、一連の検出、切断、およびライゲーションを、同じセットのオリゴヌクレオチドプローブL1を使用して繰り返して、テンプレートヌクレオチド8(NT8)を同定する。これは、必要なだけ繰り返すことができ、第3の連続後にはNT14が識別され、第4の連続後にはNT20が識別される等が可能になる。
剥離およびプロービングを繰り返して、残りのN3〜N6全ておよびssDNAテンプレートのそれらの対応するヌクレオチドを連続的に同定する。
ある実施形態2
図1、2、4、5,7および11を参照すると、オリゴヌクレオチドL1の部分が、ssDNAテンプレートにハイブリダイズされ、DNAリガーゼにより配列決定用プライマーに共有結合で連結される。合計24個のオリゴヌクレオチドプローブL1が、配列決定に必要である。更に、所与のセットのためのリポーターR1は、4つのフルオロフォアの1つであり、各セットは、電磁スペクトルの4つの異なる色で検出され、後に各ヌクレオチドの1つと関連づけられる(例えば、Aは緑色、Cはオレンジ色、Gは青色、またはTは赤色)。
図1、2、4、5,7および11を参照すると、オリゴヌクレオチドL1の部分が、ssDNAテンプレートにハイブリダイズされ、DNAリガーゼにより配列決定用プライマーに共有結合で連結される。合計24個のオリゴヌクレオチドプローブL1が、配列決定に必要である。更に、所与のセットのためのリポーターR1は、4つのフルオロフォアの1つであり、各セットは、電磁スペクトルの4つの異なる色で検出され、後に各ヌクレオチドの1つと関連づけられる(例えば、Aは緑色、Cはオレンジ色、Gは青色、またはTは赤色)。
各オリゴヌクレオチドプローブセットは、使用前に、等モル比になるように調製される(例えば、各1μM)。テンプレートは、連続的に調査してもよいが(つまり、N1からN6まで)、そうである必要はない。上記セットは、ssDNAにハイブリダイズされ、DNAリガーゼにより配列決定用プライマーP1に共有結合で結合される。
その後、4つのR1標識プローブ(BP1)のセットを添加して、プローブハイブリダイゼーション部位B1とハイブリダイズさせる。各BPのセットは、ヌクレオチドNの1つの同定と特異的に関連するように設計されており、BP1は、ヌクレオチドN1を同定するために使用される4つのR1標識12merのオリゴヌクレオチドを含み、BP2は、ヌクレオチドN2を同定するために使用される4つのR1標識12merオリゴヌクレオチドを含む等である。
バーコードプローブBP1のプローブハイブリダイゼーション部位B1へのハイブリダイゼーションは、任意の好適な緩衝液中で実施することができる。洗浄1緩衝液を使用することができるが、よりイオン性の緩衝液、特にNa+(例えば、PBS、5×SSPE、結合および洗浄用)またはMg2+(折り畳み用緩衝液)が好ましい。1つの例では、5×SSPE中1uMの標識プローブを、数秒から数分間(典型的には、1分または2分間)テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造とハイブリダイズさせる。その後、未ハイブリダイズ標識プローブを、5×SSPEを使用して洗い流し、残部を検出する。
検出時に、各色は、N1位のヌクレオチド(A、C、G、またはT)に関連づけられる。例として、所与のテンプレートで緑色のスペクトラムが検出される場合、N1ではAが同定され、それに対応して、NT1では相補的対合塩基Tが同定される。
検出後、上記セットのBP1を、TE緩衝液を使用して洗い流す。
その後、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を、C1においてオリゴヌクレオチドヘキサマープローブL1から分離する。
第2のラウンドのライゲーションでは、上述の、第1のラウンドで使用した同じセットの4つのL1が使用される。また、それを、上述の同じセットの4つのBP1で調査する。それにより、ssDNAテンプレートのNT7を同定することが可能になる。切断、ライゲーション、およびハイブリダイゼーションの連続を必要なだけ繰り返して、第3の連続後にはNT13が識別され、第4の連続後にはNT19が識別される等が可能である。
その後、この伸長された配列決定用プライマーP1を、テンプレートから剥離する。
テンプレートヌクレオチド2(NT2)を同定するには、配列決定用プライマーP1をテンプレート核酸にハイブリダイズさせる。異なるセットの4つのオリゴヌクレオチドプローブL1をライゲーションさせる。例えば、上記セットのL1は、N2を識別するように設計されている。その後、第1のセットL1と共に使用した4つのBP1のセットを、上述のようにハイブリダイズさせる。上述にように、同定を実施する。これにより、NT2の同定が可能になる。その後、切断、ライゲーション、ハイブリダイゼーション、および検出の連続を、この同じセットのL1を使用して繰り返して、テンプレートのNT8を識別する。これは、必要なだけ繰り返すことができ、第3の連続後にはNT14が識別され、第4の連続後にはNT20が識別される等が可能になる。
剥離およびプロービングを繰り返して、ヘキサマーの残りのN3〜N6位、およびssDNAテンプレートのそれらの対応するヌクレオチドを連続的に同定する。
ある実施形態3
図1A、2A、4A、および5Aを参照すると、オリゴヌクレオチドプローブL1の部分が、ssDNAテンプレートにハイブリダイズされ、実施例IVに記載のように、DNAリガーゼにより配列決定用プライマーに共有結合で連結される。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、プローブハイブリダイゼーション部位を含む。合計4096個のオリゴヌクレオチドプローブL1が、配列決定に必要である。更に、所与の各4つのオリゴヌクレオチドプローブのセットのリポーターR1は、4つのフルオロフォアの1つであり、各セットは、電磁スペクトルの4つの異なる色で検出され、後に各ヌクレオチドの1つと関連づけられる(例えば、Aは緑色、Cはオレンジ色、Gは青色、またはTは赤色)。
図1A、2A、4A、および5Aを参照すると、オリゴヌクレオチドプローブL1の部分が、ssDNAテンプレートにハイブリダイズされ、実施例IVに記載のように、DNAリガーゼにより配列決定用プライマーに共有結合で連結される。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、プローブハイブリダイゼーション部位を含む。合計4096個のオリゴヌクレオチドプローブL1が、配列決定に必要である。更に、所与の各4つのオリゴヌクレオチドプローブのセットのリポーターR1は、4つのフルオロフォアの1つであり、各セットは、電磁スペクトルの4つの異なる色で検出され、後に各ヌクレオチドの1つと関連づけられる(例えば、Aは緑色、Cはオレンジ色、Gは青色、またはTは赤色)。
L1セットは、使用前に、等モル比になるように混合される(例えば、各0.2μM)。テンプレートは、連続的に調査されるが(つまり、N1からN6まで)、そうである必要はない。上記セットは、終濃度は0.1uMでssDNAにハイブリダイズされ、DNAリガーゼによりP1に共有結合で結合さる。
その後、6セットの4つの標識バーコードプローブ(BP1〜BP6)を順次添加して、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造のB1〜B6をハイブリダイズさせる(合計24個の標識BP)。各セットは、Nの1つの識別と特異的に関連するように設計されており、BP1は、ヌクレオチドN1を同定するために使用される4つのR1標識12merオリゴヌクレオチドからなり、BP2は、ヌクレオチドN2を同定するために使用される4つのR1標識12merオリゴヌクレオチドからなる等である。
BP1とB1とのハイブリダイゼーションは、任意の好適な緩衝液中で実施することができる。洗浄1緩衝液を使用することができるが、よりイオン性の緩衝液、特にNa+(例えば、PBS、5×SSPE、結合および洗浄用)またはMg2+(折り畳み用緩衝液)が好ましい。1つの例では、5×SSPE中1μMのBP1の等モル混合物を、数秒から数分間(典型的には、1分または2分間)テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造とハイブリダイズさせる。その後、未ハイブリダイズBP1を、5×SSPEを使用して洗い流す。
検出時に、各色は、N1位のヌクレオチド(A、C、G、またはT)に関連づけられる。例として、所与のテンプレートで緑色のスペクトラムが検出される場合、N1ではAが同定され、それに対応して、NT1では相補的対合塩基Tが同定される。
検出後、BP1のセットを、TE緩衝液を使用して洗い流す。その後、BP2をB2にハイブリダイズさせ、検出する。同じテンプレートで、Gに対応する青色スペクトラムが検出される場合、以前にNT1で同定されたAに続いて、NT2ではCが同定される。洗浄、ハイブリダイゼーション、および検出ステップの連続を、残りのN3〜N6位について繰り返す。このようにして、本発明者らは、NT1〜NT6のヌクレオチドを同定する。
その後、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を、C1にといてオリゴヌクレオチドヘキサマープローブL1から分離する。
第2のラウンドのライゲーションでは、上述の、第1のラウンドで使用した同じ4096セットのL1が使用される。また、これを、6セットのBP1〜BP6を連続的に使用して調査する。これにより、NT7〜NT12の同定が可能になるだろう。これは、必要なだけ繰り返すことができ、3連続の切断、ライゲーション、ハイブリダイゼーション、および検出が実施される場合、合計18個のヌクレオチド、6連続が実施される場合、24個のヌクレオチド、10連続が実施される場合、60個のヌクレオチドを同定すること等が可能である。
緩衝液
緩衝液は全て、別様の指定がない限り、蒸留水または脱イオン水(DI水)で調製し、pHは、必要に応じてNaOH、KOH、またはHClを使用して室温で調整し、その後フィルター(0.22〜0.45μMメッシュ)でまたはオートクレーブで滅菌する。1%アミノシラン(容積/容積):1容積の3−アミノプロピルトリエトキシシラン(Pierce社 #80370またはSigma社 #A3648)を99容積のDI水またはアセトンに添加する。滅菌はしない。直ちに使用すること。結合および洗浄緩衝液:5mM Tris−HCl pH7.5、0.5mM EDTA ph8.0、1.0M NaCl。折り畳み用緩衝液1:5mM Tris−HCl、pH7.5、0.5mM EDTA、12.5mM MgCl2。折り畳み用緩衝液2:20mMTris塩基、10mM酢酸、0.5mM EDTA、12.5mM酢酸マグネシウム。ライゲーション緩衝液:50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、5mMジチオトレイトール、1mM ATP、pH7.6。PBS緩衝液pH7.4:137mM NaCl、2.68mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4。5×SSPE緩衝液:750mM NaCl、50mM Na2HPO4、5mM EDTA、pH7.4。TE緩衝液:10mM Tris−HCl pH8.0、0.1mM EDTA pH8.0。洗浄1緩衝液:10mM Tris・Cl pH7.5、50mM KCl、2mM EDTA pH8.0、0.01% TritonX−100(容積/容積)。
緩衝液は全て、別様の指定がない限り、蒸留水または脱イオン水(DI水)で調製し、pHは、必要に応じてNaOH、KOH、またはHClを使用して室温で調整し、その後フィルター(0.22〜0.45μMメッシュ)でまたはオートクレーブで滅菌する。1%アミノシラン(容積/容積):1容積の3−アミノプロピルトリエトキシシラン(Pierce社 #80370またはSigma社 #A3648)を99容積のDI水またはアセトンに添加する。滅菌はしない。直ちに使用すること。結合および洗浄緩衝液:5mM Tris−HCl pH7.5、0.5mM EDTA ph8.0、1.0M NaCl。折り畳み用緩衝液1:5mM Tris−HCl、pH7.5、0.5mM EDTA、12.5mM MgCl2。折り畳み用緩衝液2:20mMTris塩基、10mM酢酸、0.5mM EDTA、12.5mM酢酸マグネシウム。ライゲーション緩衝液:50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、5mMジチオトレイトール、1mM ATP、pH7.6。PBS緩衝液pH7.4:137mM NaCl、2.68mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4。5×SSPE緩衝液:750mM NaCl、50mM Na2HPO4、5mM EDTA、pH7.4。TE緩衝液:10mM Tris−HCl pH8.0、0.1mM EDTA pH8.0。洗浄1緩衝液:10mM Tris・Cl pH7.5、50mM KCl、2mM EDTA pH8.0、0.01% TritonX−100(容積/容積)。
実施例I
配列決定するRolonyテンプレートは、IDT社に注文した合成テンプレートを使用して調製し、TEに再懸濁して100μMにした。合成ssDNA配列は、以下の通りだった:3pA、/5PHOS/GTT CCT CAT TCT CTG AAG A NNA NNC NNG NNT NNA NNC CNN ANN TNN GNN CNN ANN ACT TCA GCT GCC CCG G;3pC、/5PHOS/GTT CCT CAT TCT CTG AAG A NNC NNG NNT NNA NNC NNG GNN CNN ANN TNN GNN ANN ACT TCA GCT GCC CCG G;3pG、/5PHOS/GTT CCT CAT TCT CTG AAG A NNG NNT NNA NNC NNG NNT TNN GNN CNN ANN TNN ANN ACT TCA GCT GCC CCG G;3pT、/5PHOS/GTT CCT CAT TCT CTG AAG A NNT NNA NNC NNG NNT NNA ANN TNN GNN CNN ANN ANN ACT TCA GCT GCC CCG G。
配列決定するRolonyテンプレートは、IDT社に注文した合成テンプレートを使用して調製し、TEに再懸濁して100μMにした。合成ssDNA配列は、以下の通りだった:3pA、/5PHOS/GTT CCT CAT TCT CTG AAG A NNA NNC NNG NNT NNA NNC CNN ANN TNN GNN CNN ANN ACT TCA GCT GCC CCG G;3pC、/5PHOS/GTT CCT CAT TCT CTG AAG A NNC NNG NNT NNA NNC NNG GNN CNN ANN TNN GNN ANN ACT TCA GCT GCC CCG G;3pG、/5PHOS/GTT CCT CAT TCT CTG AAG A NNG NNT NNA NNC NNG NNT TNN GNN CNN ANN TNN ANN ACT TCA GCT GCC CCG G;3pT、/5PHOS/GTT CCT CAT TCT CTG AAG A NNT NNA NNC NNG NNT NNA ANN TNN GNN CNN ANN ANN ACT TCA GCT GCC CCG G。
これらのssDNAテンプレートを、別々に、Epicentre社製Circligase IIキット、#CL9025Kを使用して環状化した。10UのCircligase II酵素を、10pmolのテンプレートを含有する20μLの総反応容積に添加し、60℃で1時間インキュベートした。80℃で10分間インキュベートすることにより、反応を終了させた。未環状化産物は、存在したとしても、20UのエキソヌクレアーゼI(Enzymatics社 #X801L)および100UのエキソヌクレアーゼIII(Enzymatics III)を添加することにより消化し、37℃で45分間インキュベートし、80℃で15分間インキュベートすることにより終了させた。環状産物を、MinElute PCR精製カラムおよび試薬(QIAgen社 #28004)を使用して精製した。
これらの環状化ssDNAテンプレートを、別々に、phi29 DNAポリメラーゼキット(Enzymatics社 #P702L)を使用してRCAで増幅した。10Uのphi29 DNAポリメラーゼを、およそ1pmolの環状化テンプレートおよび1pmolのRCAプライマー(IDT社:AAT GAG GAA CCC GGG GCA*G*C)を含有する50μLの総反応容積中で使用し、30℃で2時間インキュベートした。450μLの1×PBSを添加して反応を停止させた。Rolonyは、必要になるまで4℃に維持した。
5×2cmのシリコン片を、シリコンウエハ(SVM社)から切り出し、その後、1容積/容積%の3−アミノプロピルトリエトキシシラン(Sigma社 #A3648)を含有する溶液に30分間浸漬した。このアミノシラン処理シリコンを、蒸留水ですすぎ、圧搾空気を使用して乾燥した。2片の両面テープ(3M Scotch社)を、およそ1cm離して互いに平行に配置し、顕微鏡カバーガラス(VWR社 #16004−344)をテープの上に載せて、直線フローセルを製作した。
4つのRolonyテンプレートを混合し、1×PBSで1:10に更に希釈した。およそ60μLを、フローセルにロードし、30分間結合させた。その後、未結合Rolonyを、500μLの洗浄1で洗浄した。
100uLの配列決定用プライマー混合物[5×SSPE中2μMの配列決定用プライマー(IDT社:/5PHOS/ACT TCA GCT GCC CCG GGT)]をフローセルにロードし、その後、50℃で1分間インキュベートし、室温で5分間冷却した。
4つの標識オリゴヌクレオチドヘアピンプローブのセットを使用した。N3は既知であり、テンプレートのNT3、NT9、およびNT15を調査するために使用した:Hrp−M3A、/5TYE563/AC GCT GGA ACA GCG/ideoxyU/NNN ANN);Hrp−M3C、/5TEX615/AC GCT GGA ACA GCG/ideoxyU/NNN CNN;Hrp−M3G、/56−FAM/AC GCT GGA ACA GCG/ideoxyU/NNN GNN;Hrp−M3T、/5TYE665/AC GCT GGA ACA GCG/ideoxyU/NNN TNN。
オリゴプローブは、等モル比で混合した。100μLのライゲーション混合物[50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、5mMジチオトレイトール、1mM ATP、4uMのオリゴプローブミックス、および1200UのT4 DNAリガーゼ(Enzymatics社 #L603−HC−L)]をフローセルにロードし、室温で30分間インキュベーションした。未ライゲーションオリゴプローブを、500μLの洗浄1を使用して洗浄した。
フローセルを、Polonator G.007(Dover社、Danaher社系列)で画像化して、NT3を識別した。
画像化した後、5’リン酸化配列決定用プライマーからなる未ライゲーション部位を、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(NEB社 #M0290L)を使用してキャッピングした。100μLのホスファターゼ混合物[50mM Tris−HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール、および50Uアルカリホスファターゼ]をフローセルにロードし、室温で30分間インキュベートした。その後、酵素を、500μLの洗浄1で洗い流した。
キャッピングした後、ヘアピン構造のデオキシウリジンを、10×Uracil Cleavage System(Enzymatics社 #Y918L)を使用して切断した。100μLのウラシル切断混合物[50mM Tris−HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール、40UのUDG、および200UのEndo VIII]をフローセルにロードし、室温で30分間インキュベートした。その後、フローセルを500μLの洗浄1で洗浄した。
ライゲーション、画像化、キャッピング、および切断を、同じセットのオリゴプローブを用いて、更に2回、上述のように繰り返して、NT9およびNT15を連続して識別した。結果は、図8A、8B、9A、および9Bに示されている。
図8Aは、実施例Iに記載のように配列決定したRolonyの三色画像のグレイスケール写真である。ssDNAテンプレートの配列決定用プライマー部位下流の3番目の位置(左の画像)および9番目の位置(右の画像)の調査。凡例に示されている幾何学的形状はRolonyを示し、両画像で共通である。2つの位置間の塩基の変化は、形状の変化により観察することができる。オリジナル画像の一部のみが、16倍に拡大されて示されている。
図8Bは、実施例Iに記載のように配列決定したRolonyの三色画像のグレイスケール写真である。ssDNAテンプレートの配列決定用プライマー部位下流の9番目の位置(左の画像)および15番目の位置(右の画像)の調査。凡例に示されている幾何学的形状はRolonyを示し、両画像で共通である。2つの位置間の塩基の変化は、形状の変化により観察することができる。オリジナル画像の一部のみが、16倍に拡大されて示されている。
図9Aは、実施例Iに記載のように配列決定されたRolonyから3番目と9番目の位置間の塩基転移の割合を比較するヒストグラムである。例としては、実施例Iで使用したテンプレートに基づくと、大半のA(配列決定用プライマーから3位)がG(9位)に変化することが予想されるだろう。
図9Bは、実施例Iに記載のように配列決定されたRolonyから9番目と15番目の位置間の塩基転移の割合を比較するヒストグラムである。例としては、実施例Iで使用したテンプレートに基づくと、大半のG(配列決定用プライマーから9位)がA(15位)に変化することが予想されるだろう。
Claims (36)
- 標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、
(a)配列決定用プライマーを、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズさせること、
(b)オリゴヌクレオチドプローブを前記一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズさせ、前記オリゴヌクレオチドプローブを前記配列決定用プライマーにライゲーションして、伸長ハイブリダイズ配列を形成すること、ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブがそれに切断可能に結合されているテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含み、前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている切断可能なヌクレオチドを有する、
(d)前記オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドを同定し、前記一本鎖核酸中の相補的ヌクレオチドを同定すること、および随意に、
(e)前記切断可能なヌクレオチドを切断することにより前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去すること、および、前記伸長ハイブリダイズ配列に伸長可能な末端を生成すること、とを含む方法。 - 前記オリゴヌクレオチドプローブが、約1〜約100のハイブリダイズ可能なヌクレオチドを有する核酸配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドに対応する検出可能な標識を含み、前記ヌクレオチドを同定するステップが、前記標識を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドである、請求項3に記載の方法。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、切断剤の認識部位を含み、前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去するステップが、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている前記切断可能な部分を、前記切断剤により切断することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記切断可能なヌクレオチドが、化学的に切断される連結であり、前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去するステップが、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている前記切断可能な部分を、化学反応剤により切断することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記切断可能なヌクレオチドが、光感受性連結であり、前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去するステップが、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている前記切断可能なヌクレオチドを、光を当てることにより切断することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、ステムおよびループ核酸構造である、請求項1に記載の方法。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、直鎖核酸構造である、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸テンプレートに沿ってオリゴヌクレオチドプローブを逐次繰り返しハイブリダイズおよびライゲーションすることをさらに含み、各ライゲーション後に、前記ハイブリダイズおよびライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドが同定され、前記一本鎖核酸中の相補的ヌクレオチドが同定される、請求項1に記載の方法。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの1つまたは複数のヌクレオチドに対応する1つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記1つまたは複数のヌクレオチドを同定することが、1つまたは複数の標識プローブを、前記オリゴヌクレオチドプローブの1つまたは複数のヌクレオチドに対応する1つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせ、前記1つまたは複数のヌクレオチドの存在を示す前記1つまたは複数の標識プローブを検出することを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドを同定するステップが、各プローブハイブリダイゼーション部位を、対応する標識プローブとハイブリダイズさせ、前記ヌクレオチドの存在を示す前記標識プローブを検出することを含む、請求項13に記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、
(a)配列決定用プライマーを、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズさせること、
(b)第1のオリゴヌクレオチドプローブ、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造、および第2のオリゴヌクレオチドプローブとを含む二重プローブ構造を、前記一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズさせ、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブを、前記配列決定用プライマーにライゲーションして、伸長ハイブリダイズ配列を形成すること、および
(c)前記第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドを同定し、前記一本鎖核酸中の相補的ヌクレオチドを同定すること、とを含む方法。 - 前記第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブが、約1〜約100のハイブリダイズ可能なヌクレオチドを有する核酸配列である、請求項15に記載の方法。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、ステムおよびループ核酸構造である、請求項15に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸テンプレートに沿って二重プローブ構造を逐次繰り返しハイブリダイズおよびライゲーションさせることをさらに含み、各ライゲーション後に、前記ハイブリダイズおよびライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドが同定され、前記一本鎖核酸中の相補的ヌクレオチドが同定される、請求項1に記載の方法。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブの1つまたは複数のヌクレオチドに対応する1つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記1つまたは複数のヌクレオチドを同定することが、1つまたは複数の標識プローブを、前記第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブの1つまたは複数のヌクレオチドに対応する1つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせ、前記1つまたは複数のヌクレオチドの存在を示す前記1つまたは複数の標識プローブを検出することを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドを同定することが、各プローブハイブリダイゼーション部位を、対応する標識プローブとハイブリダイズさせ、前記ヌクレオチドの存在を示す前記標識プローブを検出することを含む、請求項21に記載の方法。
- テンプレートハイブリダイズ核酸構造、およびオリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズ可能ヌクレオチドに直接結合されている切断可能なヌクレオチドにより前記テンプレートハイブリダイズ核酸構造に結合されているテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、標識を含む、請求項23に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの1つまたは複数のヌクレオチドに対応する1つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項23に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項23に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレートハイブリダイズ核酸構造が、約1〜約100ヌクレオチドを含む、請求項23に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレートハイブリダイズ核酸構造が、6ヌクレオチドを含む、請求項23に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、ステムおよびループ核酸構造である、請求項23に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、直鎖核酸構造である、請求項23に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 第1のオリゴヌクレオチドプローブ、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造、および第2のオリゴヌクレオチドプローブとを含む二重オリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブの1つまたは複数のヌクレオチドに対応する1つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項31に記載の二重オリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項31に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブが、約1〜約100のヌクレオチドを含む、請求項31に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブが、6ヌクレオチドを含む、請求項31に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、ステムおよびループ型核酸構造である、請求項31に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161547138P | 2011-10-14 | 2011-10-14 | |
US61/547,138 | 2011-10-14 | ||
US201261609990P | 2012-03-13 | 2012-03-13 | |
US61/609,990 | 2012-03-13 | ||
PCT/US2012/059873 WO2013055995A2 (en) | 2011-10-14 | 2012-10-12 | Sequencing by structure assembly |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014531908A true JP2014531908A (ja) | 2014-12-04 |
Family
ID=47116428
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014535900A Pending JP2014531908A (ja) | 2011-10-14 | 2012-10-12 | 構造アッセンブリによる配列決定 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10501791B2 (ja) |
EP (2) | EP3604555A1 (ja) |
JP (1) | JP2014531908A (ja) |
CA (1) | CA2850509C (ja) |
WO (1) | WO2013055995A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020500514A (ja) * | 2016-11-21 | 2020-01-16 | ナノストリング テクノロジーズ,インコーポレイティド | 化学組成物とそれを利用する方法 |
Families Citing this family (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
US10501791B2 (en) | 2011-10-14 | 2019-12-10 | President And Fellows Of Harvard College | Sequencing by structure assembly |
ES2953308T3 (es) | 2011-12-22 | 2023-11-10 | Harvard College | Composiciones y métodos para la detección de analitos |
US11021737B2 (en) | 2011-12-22 | 2021-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for analyte detection |
JP6172640B2 (ja) * | 2012-04-12 | 2017-08-02 | 国立大学法人 東京大学 | 核酸の定量方法、検出プローブ、検出プローブセット、及び核酸の検出方法 |
WO2013184754A2 (en) * | 2012-06-05 | 2013-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes |
US10138509B2 (en) | 2013-03-12 | 2018-11-27 | President And Fellows Of Harvard College | Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
WO2014197568A2 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-11 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guideded transcriptional regulation |
EP3013984B1 (en) | 2013-06-25 | 2023-03-22 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
US10246501B2 (en) | 2014-01-08 | 2019-04-02 | Prosit Sole Biotechnology (Beijing) Co, Ltd | Fusion polypeptides and methods of use |
US10179932B2 (en) | 2014-07-11 | 2019-01-15 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy |
EP3174993B1 (en) | 2014-07-30 | 2023-12-06 | President and Fellows of Harvard College | Probe library construction |
AU2015349870B2 (en) * | 2014-11-21 | 2019-09-26 | Nanostring Technologies, Inc. | Enzyme- and amplification-free sequencing |
EP3901282B1 (en) | 2015-04-10 | 2023-06-28 | Spatial Transcriptomics AB | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
CN108474022A (zh) | 2015-11-03 | 2018-08-31 | 哈佛学院董事及会员团体 | 用于包含三维核酸的基质容积成像的设备和方法 |
EP3411496A1 (en) | 2016-02-05 | 2018-12-12 | Ludwig-Maximilians-Universität München | Molecular identification with sub-nanometer localization accuracy |
CA3022290A1 (en) | 2016-04-25 | 2017-11-02 | President And Fellows Of Harvard College | Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection |
AU2017268257B2 (en) * | 2016-05-16 | 2023-09-07 | Nanostring Technologies, Inc. | Methods for detecting target nucleic acids in a sample |
US11352667B2 (en) | 2016-06-21 | 2022-06-07 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid sequencing |
WO2018045186A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of combining the detection of biomolecules into a single assay using fluorescent in situ sequencing |
EP3507364A4 (en) | 2016-08-31 | 2020-05-20 | President and Fellows of Harvard College | METHODS OF GENERATING NUCLEIC ACID SEQUENCE LIBRARIES FOR IN SITU FLUORESCENT SEQUENCING DETECTION |
US11185568B2 (en) | 2017-04-14 | 2021-11-30 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generation of cell-derived microfilament network |
US11788123B2 (en) | 2017-05-26 | 2023-10-17 | President And Fellows Of Harvard College | Systems and methods for high-throughput image-based screening |
CN111263819A (zh) | 2017-10-06 | 2020-06-09 | 卡特阿纳公司 | Rna模板化连接 |
JP2021523723A (ja) | 2018-05-14 | 2021-09-09 | ナノストリング テクノロジーズ,インコーポレイティド | 化学的組成物とそれを利用する方法 |
SG11202101934SA (en) | 2018-07-30 | 2021-03-30 | Readcoor Llc | Methods and systems for sample processing or analysis |
SG11202105824RA (en) | 2018-12-10 | 2021-06-29 | 10X Genomics Inc | Imaging system hardware |
US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
WO2020236939A2 (en) | 2019-05-23 | 2020-11-26 | Paradigm Diagnostics | Tissue preparation using nuclease |
EP3976820A1 (en) | 2019-05-30 | 2022-04-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
WO2020240025A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | Cartana Ab | Method of detecting target nucleic acid molecules |
EP4025711A2 (en) | 2019-11-08 | 2022-07-13 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
EP4065707A4 (en) * | 2019-11-26 | 2024-01-03 | Harvard College | COMPOSITIONS, SETS AND PROCEDURES RELATED TO A TARGET ANALYSIS |
EP3891300B1 (en) | 2019-12-23 | 2023-03-29 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rna-templated ligation |
US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
WO2021216708A1 (en) | 2020-04-22 | 2021-10-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using targeted rna depletion |
EP4153775A1 (en) | 2020-05-22 | 2023-03-29 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
EP4153776A1 (en) | 2020-05-22 | 2023-03-29 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
WO2021252499A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
WO2021263111A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-30 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of dna methylation |
US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
US20220042097A1 (en) * | 2020-08-04 | 2022-02-10 | The Broad Institute, Inc. | In-situ spatial transcriptomics and proteomics |
US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
WO2022140028A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
EP4196605A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-06-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
WO2023183796A2 (en) * | 2022-03-23 | 2023-09-28 | The Rockefeller University | Compositions and methods for improved dna-encoded library preparation |
WO2024020124A1 (en) * | 2022-07-20 | 2024-01-25 | President And Fellows Of Harvard College | Engineering dynamic dna nano-devices to amplify signal |
Family Cites Families (246)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US575034A (en) | 1897-01-12 | Charles nicolas leroy | ||
US4123610A (en) | 1977-03-09 | 1978-10-31 | The United States Government | Nucleic acid crosslinking agent and affinity inactivation of nucleic acids therewith |
US4230558A (en) | 1978-10-02 | 1980-10-28 | Coulter Electronics, Inc. | Single drop separator |
US4318846A (en) | 1979-09-07 | 1982-03-09 | Syva Company | Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers |
US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
US4883750A (en) | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4757141A (en) | 1985-08-26 | 1988-07-12 | Applied Biosystems, Incorporated | Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof |
JPH0672011B2 (ja) | 1985-09-20 | 1994-09-14 | 東ソー株式会社 | 合成モルデナイト成形体の製造方法 |
US4959463A (en) | 1985-10-15 | 1990-09-25 | Genentech, Inc. | Intermediates |
US4659774A (en) | 1985-11-01 | 1987-04-21 | American Hoechst Corporation | Support for solid-phase oligonucleotide synthesis |
US5091519A (en) | 1986-05-01 | 1992-02-25 | Amoco Corporation | Nucleotide compositions with linking groups |
US4811218A (en) | 1986-06-02 | 1989-03-07 | Applied Biosystems, Inc. | Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing |
US5151507A (en) | 1986-07-02 | 1992-09-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Alkynylamino-nucleotides |
US5525464A (en) | 1987-04-01 | 1996-06-11 | Hyseq, Inc. | Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes |
US4981985A (en) | 1987-10-20 | 1991-01-01 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Synthesis of photolabile chelators for multivalent cations |
US4886741A (en) | 1987-12-09 | 1989-12-12 | Microprobe Corporation | Use of volume exclusion agents for the enhancement of in situ hybridization |
DE3813278A1 (de) | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von nukleinsaeuren |
US5354657A (en) | 1988-01-12 | 1994-10-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the highly specific detection of nucleic acids in solid |
US4844617A (en) | 1988-01-20 | 1989-07-04 | Tencor Instruments | Confocal measuring microscope with automatic focusing |
US5700637A (en) | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
US5602244A (en) | 1988-05-26 | 1997-02-11 | Competitive Technologies, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioate compounds |
US5168038A (en) | 1988-06-17 | 1992-12-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | In situ transcription in cells and tissues |
US5066580A (en) | 1988-08-31 | 1991-11-19 | Becton Dickinson And Company | Xanthene dyes that emit to the red of fluorescein |
DE3836656A1 (de) | 1988-10-27 | 1990-05-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung |
ATE142272T1 (de) | 1989-01-19 | 1996-09-15 | Behringwerke Ag | Nukleinsäure-amplifikation unter verwendung eines einzelprimers |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
US5141813A (en) | 1989-08-28 | 1992-08-25 | Clontech Laboratories, Inc. | Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis |
US5366860A (en) | 1989-09-29 | 1994-11-22 | Applied Biosystems, Inc. | Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination |
US5188934A (en) | 1989-11-14 | 1993-02-23 | Applied Biosystems, Inc. | 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes |
US5073562A (en) | 1990-05-10 | 1991-12-17 | G. D. Searle & Co. | Alkoxy-substituted dihydrobenzopyran-2-carboxylic acids and derivatives thereof |
US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
US5151189A (en) | 1990-09-17 | 1992-09-29 | Gelman Sciences, Inc. | Cationic charge modified microporous membrane |
JPH04268359A (ja) | 1991-02-22 | 1992-09-24 | Taiho Yakuhin Kogyo Kk | 刺激応答性ヒドロゲル及びその製造方法 |
US5426180A (en) | 1991-03-27 | 1995-06-20 | Research Corporation Technologies, Inc. | Methods of making single-stranded circular oligonucleotides |
US5612199A (en) | 1991-10-11 | 1997-03-18 | Behringwerke Ag | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification |
AU3664693A (en) | 1992-02-13 | 1993-09-03 | Bio-Metric Systems, Inc. | Immobilization of chemical species in crosslinked matrices |
GB9207381D0 (en) | 1992-04-03 | 1992-05-13 | Ici Plc | Synthesis of oligonucleotides |
US5428148A (en) | 1992-04-24 | 1995-06-27 | Beckman Instruments, Inc. | N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis |
US5593826A (en) | 1993-03-22 | 1997-01-14 | Perkin-Elmer Corporation, Applied Biosystems, Inc. | Enzymatic ligation of 3'amino-substituted oligonucleotides |
ES2204913T3 (es) | 1993-04-12 | 2004-05-01 | Northwestern University | Metodo para formacion de oligonucleotidos. |
US6294323B1 (en) | 1993-04-14 | 2001-09-25 | Behringwerke Ag | Self initiating single primer amplification of nucleic acids |
WO1994028424A1 (en) | 1993-05-28 | 1994-12-08 | Chiron Corporation | Method for selection of biologically active peptide sequences |
US5594235A (en) | 1993-06-17 | 1997-01-14 | Ultrapointe Corporation | Automated surface acquisition for a confocal microscope |
US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
US5654419A (en) | 1994-02-01 | 1997-08-05 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent labels and their use in separations |
US5578832A (en) | 1994-09-02 | 1996-11-26 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for imaging a sample on a device |
SE9400522D0 (sv) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | Ulf Landegren | Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences |
JPH10507160A (ja) | 1994-06-23 | 1998-07-14 | アフィマックス テクノロジーズ エヌ.ブイ. | 光活性化合物およびその使用方法 |
US5574146A (en) | 1994-08-30 | 1996-11-12 | Beckman Instruments, Inc. | Oligonucleotide synthesis with substituted aryl carboxylic acids as activators |
US5554744A (en) | 1994-09-23 | 1996-09-10 | Hybridon, Inc. | Method for loading solid supports for nucleic acid synthesis |
US5556752A (en) | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
US5750341A (en) | 1995-04-17 | 1998-05-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions |
US5830655A (en) | 1995-05-22 | 1998-11-03 | Sri International | Oligonucleotide sizing using cleavable primers |
US5700642A (en) | 1995-05-22 | 1997-12-23 | Sri International | Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers |
US5830708A (en) | 1995-06-06 | 1998-11-03 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Methods for production of a naturally secreted extracellular matrix |
US6284284B1 (en) | 1995-06-06 | 2001-09-04 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Compositions and methods for production and use of an injectable naturally secreted extracellular matrix |
US6261797B1 (en) | 1996-01-29 | 2001-07-17 | Stratagene | Primer-mediated polynucleotide synthesis and manipulation techniques |
US5800996A (en) | 1996-05-03 | 1998-09-01 | The Perkin Elmer Corporation | Energy transfer dyes with enchanced fluorescence |
US5847162A (en) | 1996-06-27 | 1998-12-08 | The Perkin Elmer Corporation | 4, 7-Dichlororhodamine dyes |
ATE295427T1 (de) | 1996-06-04 | 2005-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
JP4124377B2 (ja) | 1996-06-06 | 2008-07-23 | ソレクサ・インコーポレイテッド | コードアダプターの連結による配列決定 |
JP4532608B2 (ja) | 1997-02-07 | 2010-08-25 | オリンパス株式会社 | 走査型プローブ顕微鏡を用いた核酸検出方法 |
JPH10253701A (ja) | 1997-03-10 | 1998-09-25 | Mitsubishi Electric Corp | 半導体試験装置 |
US5948617A (en) | 1997-06-13 | 1999-09-07 | Biospeparations, Inc. | Methods of in situ hybridization |
US6432360B1 (en) | 1997-10-10 | 2002-08-13 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
US6322901B1 (en) | 1997-11-13 | 2001-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Highly luminescent color-selective nano-crystalline materials |
US5990479A (en) | 1997-11-25 | 1999-11-23 | Regents Of The University Of California | Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes |
US6207392B1 (en) | 1997-11-25 | 2001-03-27 | The Regents Of The University Of California | Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes |
US6083726A (en) | 1998-02-03 | 2000-07-04 | Lucent Technologies, Inc. | Methods for polynucleotide synthesis and articles for polynucleotide hybridization |
WO1999041007A2 (en) | 1998-02-11 | 1999-08-19 | University Of Houston | Method and apparatus for chemical and biochemical reactions using photo-generated reagents |
ES2656439T3 (es) | 1998-02-23 | 2018-02-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Aparato para síntesis de matrices de sondas de ADN |
DE19813317A1 (de) | 1998-03-26 | 1999-09-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Verbessertes Verfahren zur Primer Extension Präamplifikations-PCR |
US6068979A (en) | 1998-04-22 | 2000-05-30 | Lumigen, Inc. | Simplified sequential chemiluminescent detection |
US6391544B1 (en) | 1998-05-15 | 2002-05-21 | Abbott Laboratories | Method for using unequal primer concentrations for generating nucleic acid amplification products |
EP1632496A1 (en) | 1998-06-22 | 2006-03-08 | Affymetrix, Inc. | Reagents and methods for solid phase synthesis and display |
CA2335951C (en) | 1998-06-24 | 2013-07-30 | Mark S. Chee | Decoding of array sensors with microspheres |
ATE327345T1 (de) | 1998-08-07 | 2006-06-15 | Cellay Llc | Gel mikrotropfen für die genetische analyse |
US6251303B1 (en) | 1998-09-18 | 2001-06-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Water-soluble fluorescent nanocrystals |
US6426513B1 (en) | 1998-09-18 | 2002-07-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Water-soluble thiol-capped nanocrystals |
ATE469699T1 (de) | 1999-02-23 | 2010-06-15 | Caliper Life Sciences Inc | Manipulation von mikroteilchen in mikrofluiden systemen |
WO2000053617A1 (en) | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Protogene Laboratories, Inc. | Methods and compositions for economically synthesizing and assembling long dna sequences |
US6824866B1 (en) | 1999-04-08 | 2004-11-30 | Affymetrix, Inc. | Porous silica substrates for polymer synthesis and assays |
JP2002542793A (ja) | 1999-04-22 | 2002-12-17 | ザ アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン オブ イエシバ ユニバーシティ | 多蛍光fishによる遺伝子発現パターンのアッセイ法 |
US20020015952A1 (en) | 1999-07-30 | 2002-02-07 | Anderson Norman G. | Microarrays and their manufacture by slicing |
CA2386151A1 (en) | 1999-10-12 | 2001-04-19 | Marc Madou | Reactive polymeric valve, dispensing devices and methods using same |
AU1774501A (en) | 1999-11-17 | 2001-05-30 | Research Foundation Of State University Of New York, The | Three dimensional data storage device and method for reading |
US6800439B1 (en) | 2000-01-06 | 2004-10-05 | Affymetrix, Inc. | Methods for improved array preparation |
EP1263773A4 (en) | 2000-03-14 | 2005-08-31 | Active Motif | OLIGONUCLEOTIDE ANALOGUES, METHODS OF SYNTHESIS AND METHODS OF IMPLEMENTATION |
US6833450B1 (en) | 2000-03-17 | 2004-12-21 | Affymetrix, Inc. | Phosphite ester oxidation in nucleic acid array preparation |
US7033758B2 (en) | 2000-06-02 | 2006-04-25 | Bayer Corporation | Highly sensitive gene detection and localization using in situ branched-DNA hybridization |
US7613571B2 (en) | 2000-07-28 | 2009-11-03 | Doyle Michael D | Method and system for the multidimensional morphological reconstruction of genome expression activity |
US6966945B1 (en) | 2000-09-20 | 2005-11-22 | Goodrich Corporation | Inorganic matrix compositions, composites and process of making the same |
US6649138B2 (en) | 2000-10-13 | 2003-11-18 | Quantum Dot Corporation | Surface-modified semiconductive and metallic nanoparticles having enhanced dispersibility in aqueous media |
EP1368369A4 (en) | 2000-11-15 | 2006-02-22 | Hoffmann La Roche | METHOD AND REAGENTS FOR IDENTIFYING RARE FOETAL CELLS IN THE MATERIAL CIRCUIT |
US6576291B2 (en) | 2000-12-08 | 2003-06-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Preparation of nanocrystallites |
JP2004537263A (ja) | 2000-12-14 | 2004-12-16 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | ポリヌクレオチドの会合速度を増強するための方法およびキット |
EP1370690B1 (en) | 2001-03-16 | 2012-03-14 | Kalim Mir | Arrays and methods of use |
DE60227943D1 (de) | 2001-05-18 | 2008-09-11 | Wisconsin Alumni Res Found | Verfahren zur synthese von dna-sequenzen die photolabile linker verwenden |
US7473767B2 (en) | 2001-07-03 | 2009-01-06 | The Institute For Systems Biology | Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures |
JP4567436B2 (ja) | 2001-07-20 | 2010-10-20 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 発光ナノ粒子およびそれらの調製方法 |
US20060248349A1 (en) | 2001-09-24 | 2006-11-02 | Rathjen Alicemarie G | Method for preparing and using personal and genetic profiles |
WO2003031591A2 (en) | 2001-10-10 | 2003-04-17 | Superarray Bioscience Corporation | Detecting targets by unique identifier nucleotide tags |
US20030087298A1 (en) | 2001-11-02 | 2003-05-08 | Roland Green | Detection of hybridization on oligonucleotide microarray through covalently labeling microarray probe |
GB2382137A (en) | 2001-11-20 | 2003-05-21 | Mats Gullberg | Nucleic acid enrichment |
AU2002353713A1 (en) | 2001-11-23 | 2003-06-10 | Simon Fredriksson | Method and kit for proximity probing with multivalent proximity probes |
US20030099952A1 (en) | 2001-11-26 | 2003-05-29 | Roland Green | Microarrays with visible pattern detection |
US20040126757A1 (en) | 2002-01-31 | 2004-07-01 | Francesco Cerrina | Method and apparatus for synthesis of arrays of DNA probes |
US7157229B2 (en) | 2002-01-31 | 2007-01-02 | Nimblegen Systems, Inc. | Prepatterned substrate for optical synthesis of DNA probes |
US7422851B2 (en) | 2002-01-31 | 2008-09-09 | Nimblegen Systems, Inc. | Correction for illumination non-uniformity during the synthesis of arrays of oligomers |
US7037659B2 (en) | 2002-01-31 | 2006-05-02 | Nimblegen Systems Inc. | Apparatus for constructing DNA probes having a prismatic and kaleidoscopic light homogenizer |
US7083975B2 (en) | 2002-02-01 | 2006-08-01 | Roland Green | Microarray synthesis instrument and method |
CA2487093A1 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Nimblegen Systems, Inc. | Microarrays and method for running hybridization reaction for multiple samples on a single microarray |
US7498176B2 (en) | 2002-09-27 | 2009-03-03 | Roche Nimblegen, Inc. | Microarray with hydrophobic barriers |
US7482170B2 (en) | 2002-09-30 | 2009-01-27 | Roche Nimblegen, Inc. | Parallel loading of arrays |
JP2006500959A (ja) | 2002-09-30 | 2006-01-12 | パラレル バイオサイエンス, インコーポレイテッド | 動的サンプリング結合によるポリヌクレオチド合成および標識化 |
GB2409454B (en) | 2002-10-01 | 2007-05-23 | Nimblegen Systems Inc | Microarrays having multiple oligonucleotides in single array features |
US20090246879A1 (en) | 2002-12-20 | 2009-10-01 | Callida Genomics | Materials and Methods Relating to Nano-Tags and Nano-Brands |
EP2159285B1 (en) | 2003-01-29 | 2012-09-26 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
US8105771B2 (en) | 2003-02-26 | 2012-01-31 | Callida Genomics, Inc. | Random array DNA analysis by hybridization |
US7385043B1 (en) | 2003-04-30 | 2008-06-10 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Homogeneous multiplex screening assays and kits |
US7394592B2 (en) | 2003-05-20 | 2008-07-01 | Lucid, Inc. | Confocal microscope for imaging of selected locations of the body of a patient |
US7255994B2 (en) | 2003-06-10 | 2007-08-14 | Applera Corporation | Ligation assay |
CN1580283A (zh) | 2003-08-13 | 2005-02-16 | 清华大学 | 一种检测核酸分子的方法 |
US7193054B2 (en) | 2003-08-26 | 2007-03-20 | University Of Rochester | Nanofabrication using actin filaments |
EP1697535A2 (en) | 2003-11-14 | 2006-09-06 | University of Utah Research Foundation | Methods, articles, and compositions for identifying oligonucleotides |
US7381529B2 (en) | 2003-12-31 | 2008-06-03 | Intel Corporation | Methods and compositions for detecting nucleic acids using scanning probe microscopy and nanocodes |
JP2007526772A (ja) | 2004-02-27 | 2007-09-20 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | インサイチュー配列決定用ポロニー蛍光ビーズ |
US20050191687A1 (en) | 2004-02-27 | 2005-09-01 | Tianxin Wang | Method for multiplexed analyte detection |
US7427479B2 (en) | 2004-04-30 | 2008-09-23 | Applera Corporation | Methods and kits for identifying target nucleotides in mixed populations |
US20060024711A1 (en) | 2004-07-02 | 2006-02-02 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for nucleic acid amplification and sequence determination |
US7253947B2 (en) | 2004-10-07 | 2007-08-07 | New York University | Portable automated confocal microscope |
EP2233581A1 (en) | 2005-02-01 | 2010-09-29 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension |
US7393665B2 (en) | 2005-02-10 | 2008-07-01 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
ITRM20050068A1 (it) | 2005-02-17 | 2006-08-18 | Istituto Naz Per Le Malattie I | Metodo per la rivelazione di acidi nucleici di agenti patogeni batterici o di parassiti nelle urine. |
US7727721B2 (en) | 2005-03-08 | 2010-06-01 | California Institute Of Technology | Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging |
US20060234261A1 (en) | 2005-03-08 | 2006-10-19 | Pierce Niles A | Colorimetric readout of hybridization chain reaction |
JP2008537739A (ja) | 2005-03-21 | 2008-09-25 | ザ トラスティース オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク | 新規神経疼痛経路 |
US20070020650A1 (en) | 2005-04-01 | 2007-01-25 | Avak Kahvejian | Methods for detecting proteins |
AU2006336403A1 (en) | 2005-04-08 | 2007-08-02 | Mycosol, Inc. | Stilbazium research assays |
US11561951B2 (en) | 2005-05-16 | 2023-01-24 | Panvia Future Technologies, Inc. | Multidimensional associative memory and data searching |
WO2007145612A1 (en) * | 2005-06-06 | 2007-12-21 | 454 Life Sciences Corporation | Paired end sequencing |
US7842793B2 (en) | 2005-06-14 | 2010-11-30 | The California Institute Of Technology | Methods of making nucleic acid nanostructures |
DK2463386T3 (en) | 2005-06-15 | 2017-07-31 | Complete Genomics Inc | Nucleic acid analysis using random mixtures of non-overlapping fragments |
US7709198B2 (en) | 2005-06-20 | 2010-05-04 | Advanced Cell Diagnostics, Inc. | Multiplex detection of nucleic acids |
EP1919930B1 (en) | 2005-07-01 | 2016-09-14 | Dako Denmark A/S | New nucleic acid base pairs |
US8486621B2 (en) | 2005-08-11 | 2013-07-16 | Cornell Research Foundation, Inc. | Nucleic acid-based matrixes |
CN1959384A (zh) | 2005-11-01 | 2007-05-09 | 河南省生物工程技术研究中心 | 一种三维网格检测技术 |
JP5700911B2 (ja) | 2005-12-23 | 2015-04-15 | ナノストリング テクノロジーズ,インコーポレーテッド | 配向され、固定化された巨大分子を含む組成物とその製造法 |
ES2374788T3 (es) | 2005-12-23 | 2012-02-22 | Nanostring Technologies, Inc. | Nanoinformadores y métodos para su producción y uso. |
US7864996B2 (en) | 2006-02-17 | 2011-01-04 | Lucid, Inc. | System for macroscopic and confocal imaging of tissue |
US20090220968A1 (en) | 2006-03-10 | 2009-09-03 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and Apparatus for Near Field Irradiation |
GB0605584D0 (en) | 2006-03-20 | 2006-04-26 | Olink Ab | Method for analyte detection using proximity probes |
US20070231823A1 (en) | 2006-03-23 | 2007-10-04 | Mckernan Kevin J | Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing |
US8975216B2 (en) | 2006-03-30 | 2015-03-10 | Pacific Biosciences Of California | Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same |
CN101460953B (zh) | 2006-03-31 | 2012-05-30 | 索雷克萨公司 | 用于合成分析的序列的系统和装置 |
CA2649725A1 (en) * | 2006-04-19 | 2007-10-25 | Applera Corporation | Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing |
AU2007268027B2 (en) | 2006-05-22 | 2012-08-09 | Nanostring Technologies, Inc. | Systems and methods for analyzing nanoreporters |
US7964347B2 (en) | 2006-06-15 | 2011-06-21 | Krassen Dimitrov | Labels for electronic detection of individual molecules and methods for their detection |
US20080038163A1 (en) | 2006-06-23 | 2008-02-14 | Applera Corporation | Systems and Methods for Cooling in Biological Analysis Instruments |
US7745129B1 (en) * | 2006-07-12 | 2010-06-29 | Kenneth David Schatz | Methods for sequencing of a necleic acid |
WO2008033848A2 (en) | 2006-09-11 | 2008-03-20 | The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Self-assembled combinatorial encoding nanoarrays for multiplexed biosensing |
US20090208965A1 (en) | 2006-10-25 | 2009-08-20 | Ikonisys, Inc. | Automated method for detecting cancers and high grade hyperplasias |
EP2674217B1 (en) | 2006-11-06 | 2019-07-10 | Alere Technologies GmbH | Device for assays using binding members |
US9201063B2 (en) | 2006-11-16 | 2015-12-01 | General Electric Company | Sequential analysis of biological samples |
GB2457402B (en) * | 2006-12-01 | 2011-10-19 | Univ Columbia | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
US20080269068A1 (en) | 2007-02-06 | 2008-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | Multiplex decoding of sequence tags in barcodes |
US8145677B2 (en) | 2007-03-27 | 2012-03-27 | Faleh Jassem Al-Shameri | Automated generation of metadata for mining image and text data |
JP5555157B2 (ja) | 2007-04-10 | 2014-07-23 | ナノストリング テクノロジーズ, インコーポレイテッド | ナノレポーターにおける使用のための標的特異的配列を同定するための方法およびコンピュータシステム |
EP2155770B1 (en) | 2007-05-16 | 2013-10-16 | California Institute of Technology | A versatile nucleic acid hairpin motif for programming biomolecular self-assembly pathways |
DK2171088T3 (en) * | 2007-06-19 | 2016-01-25 | Stratos Genomics Inc | Nucleic acid sequencing in a high yield by expansion |
US20110294135A1 (en) | 2007-08-02 | 2011-12-01 | BioDesic, LLC | Compositions and methods for analyte detection and quantitation |
US20090191553A1 (en) | 2007-10-01 | 2009-07-30 | Applied Biosystems Inc. | Chase Ligation Sequencing |
CN101889074A (zh) | 2007-10-04 | 2010-11-17 | 哈尔西恩莫尔丘勒公司 | 采用电子显微镜对核酸聚合物测序 |
US20090139311A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-06-04 | Applied Biosystems Inc. | Biological Analysis Systems, Devices, and Methods |
WO2009065093A2 (en) | 2007-11-17 | 2009-05-22 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Use of stem cells for wound healing |
CN101586150B (zh) * | 2008-05-23 | 2016-09-28 | 陕西佰美基因股份有限公司 | 检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途 |
CN102171234A (zh) | 2008-08-05 | 2011-08-31 | 康奈尔大学 | 光交联核酸水凝胶 |
US8519115B2 (en) | 2008-08-14 | 2013-08-27 | Nanostring Technologies, Inc. | Stable nanoreporters |
EP3133170B1 (en) | 2008-09-10 | 2020-03-18 | Rutgers, the State University of New Jersey | Imaging individual mrna molecules using multiple singly labeled probes |
US9156010B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-10-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based assay system |
US20100087325A1 (en) | 2008-10-07 | 2010-04-08 | Illumina, Inc. | Biological sample temperature control system and method |
US8309306B2 (en) | 2008-11-12 | 2012-11-13 | Nodality, Inc. | Detection composition |
US8748094B2 (en) * | 2008-12-19 | 2014-06-10 | President And Fellows Of Harvard College | Particle-assisted nucleic acid sequencing |
JP4528345B2 (ja) | 2009-01-28 | 2010-08-18 | シャープ株式会社 | 動画再生装置、動画再生方法、動画再生方法をコンピュータで実現するためのプログラム及びそのプログラムを記録した記録媒体 |
JP5277082B2 (ja) | 2009-06-15 | 2013-08-28 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 蛍光分析方法 |
FR2948475A1 (fr) | 2009-07-24 | 2011-01-28 | Bionext | Procede de caracterisation d'objets tridimensionnels |
US8431151B2 (en) | 2009-08-06 | 2013-04-30 | Syracuse University | Antimicrobial nanostructured hydrogel web containing silver |
EP2488876B1 (en) | 2009-10-13 | 2017-03-01 | Nanostring Technologies, Inc | Protein detection via nanoreporters |
CA2778249C (en) | 2009-11-03 | 2018-12-04 | Htg Molecular Diagnostics, Inc. | Quantitative nuclease protection sequencing (qnps) |
WO2011075516A2 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Active scaffolds for on-demand drug and cell delivery |
US8632976B2 (en) | 2010-01-19 | 2014-01-21 | Agdia | Amplification of TRP1 for specific detection of Phytophthora ramorum |
US9714446B2 (en) | 2010-02-11 | 2017-07-25 | Nanostring Technologies, Inc. | Compositions and methods for the detection of small RNAs |
WO2011100617A2 (en) | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid, biomolecule and polymer identifier codes |
US10267808B2 (en) | 2010-03-08 | 2019-04-23 | California Institute Of Technology | Molecular indicia of cellular constituents and resolving the same by super-resolution technologies in single cells |
GB201004292D0 (en) | 2010-03-15 | 2010-04-28 | Olink Ab | Assay for localised detection of analytes |
CA2794522C (en) | 2010-04-05 | 2019-11-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
US20130059741A1 (en) | 2010-05-13 | 2013-03-07 | Illumina, Inc. | Binding assays for markers |
PL2591125T3 (pl) | 2010-07-09 | 2018-09-28 | Cergentis B.V. | Strategie sekwencjonowania będącego przedmiotem zainteresowania genomowego regionu 3-d |
EP3034625B1 (en) | 2010-10-21 | 2017-10-04 | Advanced Cell Diagnostics, Inc. | An ultra sensitive method for in situ detection of nucleic acids |
WO2012056440A1 (en) | 2010-10-28 | 2012-05-03 | Nanodoc Ltd. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING EXPRESSION BY A SPECIFIC ENDOGENOUS miRNA |
EP2633080B1 (en) | 2010-10-29 | 2018-12-05 | President and Fellows of Harvard College | Method of detecting targets using fluorescently labelled nucleic acid nanotube probes |
EP2633081B1 (en) | 2010-10-29 | 2017-01-11 | Olink Bioscience AB | Proximity ligation technology for western blot applications |
US8859201B2 (en) | 2010-11-16 | 2014-10-14 | Nabsys, Inc. | Methods for sequencing a biomolecule by detecting relative positions of hybridized probes |
CA2827497C (en) | 2011-02-15 | 2014-12-02 | Leica Biosystems Newcastle Ltd. | Method for localized in situ detection of mrna |
JP5687514B2 (ja) | 2011-02-17 | 2015-03-18 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸配列解析装置 |
EP2500436B1 (en) | 2011-03-17 | 2016-05-25 | Institut Pasteur | Method, probe and kit for DNA in situ hybridation and use thereof |
US20120252686A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Good Start Genetics | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction |
GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
US8946389B2 (en) | 2011-04-25 | 2015-02-03 | University Of Washington | Compositions and methods for multiplex biomarker profiling |
EP2705161A1 (de) | 2011-05-04 | 2014-03-12 | Genovoxx GmbH | Nukleosid-triphosphat-konjugate und methoden zu deren anwendung |
GB201108678D0 (en) | 2011-05-24 | 2011-07-06 | Olink Ab | Multiplexed proximity ligation assay |
WO2012166425A2 (en) | 2011-05-27 | 2012-12-06 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of amplifying whole genome of a single cell |
PL222511B1 (pl) | 2011-06-08 | 2016-08-31 | Międzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komórkowej W Warszawie | Endorybonukleazy dsRNA |
US10501791B2 (en) * | 2011-10-14 | 2019-12-10 | President And Fellows Of Harvard College | Sequencing by structure assembly |
ES2953308T3 (es) | 2011-12-22 | 2023-11-10 | Harvard College | Composiciones y métodos para la detección de analitos |
US11021737B2 (en) | 2011-12-22 | 2021-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for analyte detection |
ES2663234T3 (es) | 2012-02-27 | 2018-04-11 | Cellular Research, Inc | Composiciones y kits para recuento molecular |
EP2878671B1 (en) | 2012-07-20 | 2020-06-03 | LSI Medience Corporation | Photocoupling method using probe containing photoresponsive nucleic acids |
JP6228205B2 (ja) | 2012-08-09 | 2017-11-08 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 顕微分析のための生体標本を調製するための方法および組成物 |
WO2014028538A2 (en) | 2012-08-13 | 2014-02-20 | William Marsh Rice University | Multiplexed in situ molecular analyses and programmable molecular probes for regulated signal amplification |
EP2885670B1 (en) | 2012-08-15 | 2021-01-27 | Lucid, Inc. | Systems and methods for imaging tissue |
CN102908119A (zh) | 2012-09-26 | 2013-02-06 | 温州医学院眼视光研究院 | 一种共焦扫描成像系统及其像差控制方法 |
US9411930B2 (en) | 2013-02-01 | 2016-08-09 | The Regents Of The University Of California | Methods for genome assembly and haplotype phasing |
US10138509B2 (en) | 2013-03-12 | 2018-11-27 | President And Fellows Of Harvard College | Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
US9330295B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-03 | Brown University | Spatial sequencing/gene expression camera |
CA2907493A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-13 | California Institute Of Technology | Multiplex labeling of molecules by sequential hybridization barcoding |
US10510435B2 (en) | 2013-04-30 | 2019-12-17 | California Institute Of Technology | Error correction of multiplex imaging analysis by sequential hybridization |
EP3058091B1 (en) | 2013-10-18 | 2020-03-25 | The Broad Institute, Inc. | Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing |
GB201401885D0 (en) | 2014-02-04 | 2014-03-19 | Olink Ab | Proximity assay with detection based on hybridisation chain reaction (HCR) |
US10309879B2 (en) | 2014-02-21 | 2019-06-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Expansion microscopy |
AU2015349870B2 (en) * | 2014-11-21 | 2019-09-26 | Nanostring Technologies, Inc. | Enzyme- and amplification-free sequencing |
CA2969038C (en) | 2014-12-03 | 2023-07-04 | Ventana Medical Systems, Inc. | Methods, systems, and apparatuses for quantitative analysis of heterogeneous biomarker distribution |
US9727810B2 (en) | 2015-02-27 | 2017-08-08 | Cellular Research, Inc. | Spatially addressable molecular barcoding |
CN107406888A (zh) | 2015-03-30 | 2017-11-28 | 赛卢拉研究公司 | 用于组合条形编码的方法和组合物 |
US9607375B2 (en) | 2015-06-03 | 2017-03-28 | Eileen B. Gallagher | Biological data annotation and visualization |
WO2017024138A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Arc Bio, Llc | Systems and methods for genomic analysis |
CN108474022A (zh) | 2015-11-03 | 2018-08-31 | 哈佛学院董事及会员团体 | 用于包含三维核酸的基质容积成像的设备和方法 |
US10386300B2 (en) | 2015-12-21 | 2019-08-20 | Verily Life Sciences Llc | Spectrally and spatially multiplexed fluorescent probes for in situ cell labeling |
WO2017161251A1 (en) | 2016-03-17 | 2017-09-21 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for detecting and identifying genomic nucleic acids |
ES2908919T3 (es) | 2016-07-05 | 2022-05-04 | California Inst Of Techn | Reacción en cadena de hibridación de iniciador fraccionario |
CN116064727A (zh) | 2016-07-27 | 2023-05-05 | 斯坦福大学托管董事会 | 高度复用荧光成像 |
EP3601339A4 (en) | 2017-03-31 | 2020-11-04 | Ultivue, Inc. | DNA ANTIGEN EXCHANGE AND AMPLIFICATION |
-
2012
- 2012-10-12 US US14/350,975 patent/US10501791B2/en active Active
- 2012-10-12 WO PCT/US2012/059873 patent/WO2013055995A2/en active Application Filing
- 2012-10-12 EP EP19180827.8A patent/EP3604555A1/en active Pending
- 2012-10-12 CA CA2850509A patent/CA2850509C/en active Active
- 2012-10-12 EP EP12780609.9A patent/EP2766498B1/en active Active
- 2012-10-12 JP JP2014535900A patent/JP2014531908A/ja active Pending
-
2019
- 2019-11-25 US US16/693,611 patent/US11312992B2/en active Active
-
2022
- 2022-04-08 US US17/716,016 patent/US20220251642A1/en active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020500514A (ja) * | 2016-11-21 | 2020-01-16 | ナノストリング テクノロジーズ,インコーポレイティド | 化学組成物とそれを利用する方法 |
JP2021000085A (ja) * | 2016-11-21 | 2021-01-07 | ナノストリング テクノロジーズ,インコーポレイティド | 化学組成物とそれを利用する方法 |
JP7137595B2 (ja) | 2016-11-21 | 2022-09-14 | ナノストリング テクノロジーズ,インコーポレイティド | 化学組成物とそれを利用する方法 |
US11821026B2 (en) | 2016-11-21 | 2023-11-21 | Nanostring Technologies, Inc. | Chemical compositions and methods of using same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20140349294A1 (en) | 2014-11-27 |
US10501791B2 (en) | 2019-12-10 |
CA2850509A1 (en) | 2013-04-18 |
WO2013055995A2 (en) | 2013-04-18 |
WO2013055995A3 (en) | 2013-08-15 |
EP2766498B1 (en) | 2019-06-19 |
CA2850509C (en) | 2023-08-01 |
US11312992B2 (en) | 2022-04-26 |
US20220251642A1 (en) | 2022-08-11 |
EP2766498A2 (en) | 2014-08-20 |
US20200080144A1 (en) | 2020-03-12 |
EP3604555A1 (en) | 2020-02-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11312992B2 (en) | Sequencing by structure assembly | |
US11473139B2 (en) | Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes | |
US20210087611A1 (en) | Methods for Making Nucleotide Probes for Sequencing and Synthesis | |
US10370702B2 (en) | Methods of making oligonucleotide probes | |
US11697843B2 (en) | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing | |
US8741564B2 (en) | Quantitative nuclease protection assay (QNPA) and sequencing (QNPS) improvements | |
US20100062494A1 (en) | Enzymatic oligonucleotide pre-adenylation | |
US20050100939A1 (en) | System and methods for enhancing signal-to-noise ratios of microarray-based measurements | |
US20060019304A1 (en) | Simultaneous analysis of multiple genomes | |
US20070087362A1 (en) | Polony fluorescent in situ sequencing beads | |
US20110039304A1 (en) | Methods to Generate Oligonucleotide Pools and Enrich Target Nucleic Acid Sequences | |
EP2580378A2 (en) | Methods and composition for multiplex sequencing | |
CN113528628A (zh) | 用于基因组应用和治疗应用的核酸分子的克隆复制和扩增的系统和方法 | |
WO2012004203A1 (en) | Method for nucleic acid sequencing | |
WO2023035110A1 (zh) | 一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法 |