ES2204913T3 - Metodo para formacion de oligonucleotidos. - Google Patents
Metodo para formacion de oligonucleotidos.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN METODO PARA LA FORMACION DE UN OLIGONUCLEOTIDO, CUYO METODO CONSISTE EN COLOCAR EN SOLUCION AL MENOS DOS OLIGONUCLEOTIDOS EN SOLUCION ACUOSA EN DONDE UNO DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS INCLUYE UN GRUPO {AL}-HALOACILO Y EL OTRO DE LOS NUCLEOTIDOS INCLUYE UN GRUPO FOSFOTIOATO Y ENLAZAR COVALENTEMENTE LOS OLIGONUCLEOTIDOS ENTRE SI A TRAVES DEL GRUPO {AL}-HALOACILO Y EL GRUPO FOSFOTIOATO FORMANDO ESPONTANEAMENTE UN GRUPO TIOFOSFORILACETILAMINO ENTRE ELLOS.
Description
Método de formación de oligonucleótidos.
La presente invención se refiere a un método de
formación de oligonucleótidos y más específicamente a métodos que
tienen utilidad como métodos terapéuticos nuevos potenciales para
tratar virosis, cáncer, trastornos genéticos y otros, así como
aplicaciones diagnósticas de oligonucleótidos.
Los oligonucleótidos antisentido han demostrado
un potencial como tipos nuevos de agentes terapéuticos para tratar
enfermedades y trastornos tales como virosis, cáncer, trastornos
genéticos, así como otras enfermedades y trastornos^{1}. Se ha
llevado a cabo una amplia investigación y la misma continúa en
laboratorios industriales y académicos para explorar este
potencial^{2}.
Un problema que se ha observado con el
planteamiento de la utilización de oligonucleótidos antisentido como
agentes terapéuticos está relacionado con la selectividad de los
agentes in vivo. A la vista de las bajas concentraciones
objetivo de polinucleótidos intracelulares y las bajas
concentraciones de oligonucleótidos terapéuticos que se pueden
introducir en células, se reconoce que existe una necesidad de
oligonucleótidos con altas afinidades de unión. La afinidad de
unión está relacionada con la longitud de los oligonucleótidos,
preferentemente 20 meros y mayor. Aunque, en el caso de
oligonucleótidos largos, una desadaptación en el apareamiento de
bases es menos desestabilizador que en el caso de un
oligonucleótido corto. Por lo tanto, el efecto desestabilizador
deseado se reduce con el uso de oligonucleótidos más largos mientras
que la selectividad aumenta.
Expertos han indicado que una "especificidad de
secuencia alta" y una "afinidad alta" son demandas
contradic-
torias^{3}. Además se ha concluido que basándose en el nivel al que los oligonucleótidos antisentido pueden provocar disociación de ARNs en lugares objetivo adaptados de forma imperfecta, en sistemas que se probaron, probablemente no fue posible obtener una disociación específico de un ARN objetivo deseado sin provocar también por lo menos la destrucción parcial de muchos ARNs que no eran objetivo^{4}. Por ello, expertos en el sector, basándose en la investigación realizada, han concluido que los requisitos en conflicto de especificidad y afinidad son obstáculos importantes a superar.
torias^{3}. Además se ha concluido que basándose en el nivel al que los oligonucleótidos antisentido pueden provocar disociación de ARNs en lugares objetivo adaptados de forma imperfecta, en sistemas que se probaron, probablemente no fue posible obtener una disociación específico de un ARN objetivo deseado sin provocar también por lo menos la destrucción parcial de muchos ARNs que no eran objetivo^{4}. Por ello, expertos en el sector, basándose en la investigación realizada, han concluido que los requisitos en conflicto de especificidad y afinidad son obstáculos importantes a superar.
Se ha informado sobre varios métodos para unir
mediante enlaces covalentes bloques de oligonucleótidos en medios
acuosos^{5a-1}. Todos estos métodos requieren que
un agente químico adicional genere un producto ligado estable.
Dependiendo del planteamiento, el reactivo añadido puede ser un
"agente activador" tal como carbodiimida soluble en agua o
cianoimidazol^{5a-k} o puede ser un agente
reductor tal como cianoborohidruro de sodio^{51}. En cualquiera
de los casos, la necesidad del tercer reactivo impide una ligazón
química in vivo ya que dichos compuestos son tóxicos,
reaccionan con agua, y no se podrían introducir en sistemas vivos
en cantidades suficientes como para provocar la reacción de
acoplamiento deseada.
La presente invención proporciona un método
novedoso para unir mediante enlaces covalentes bloques de
oligonucleótidos presentes en bajas concentraciones en un medio
acuoso sin la necesidad de un reactivo adicional de condensación o
estabilización. De este modo se crean expectativas de una ligazón
química in situ en sistemas vivos. Como las reacciones se
aceleran fuertemente en presencia de una secuencia de
oligonucleótidos complementarios, en principio se deberían poder
formar cadenas largas de oligonucleótidos selectivamente in
vivo cuando hay presente un polinucleótido objetivo (por
ejemplo, m-ARN o ADN de una célula viral o
cancerosa) que contiene secuencias consecutivas de nucleótidos
complementarios con las cadenas de oligonucleótidos individuales.
Por esta razón, las cadenas largas de oligonucleótidos, que se
enlazan con una alta afinidad, se generarían in situ a
partir de cadenas más cortas que se enlazan con una afinidad menor,
cuando está presente el polinucleótido objetivo. De este modo la
presente invención podría resolver el problema del conflicto de
conseguir una alta afinidad así como una alta especificidad, en
aplicaciones terapéuticas y también diagnósticas.
Según la presente invención se proporciona un
método de formación de un oligonucleótido uniendo de forma
irreversible mediante enlaces covalentes por lo menos dos
oligómeros que están unidos entre sí de forma reversible mediante
enlaces de hidrógeno en posiciones contiguas en un polinucleótido
objetivo que contiene una secuencia de bases de nucleósidos
complementaria con las secuencias del par de oligómeros, en donde
uno de los oligonucleótidos incluye un nucleótido que tiene un
primer grupo reactivo que comprende un bromoacetilamino contiguo a
un nucleótido del otro oligómero que incluye un segundo grupo
reactivo que comprende fosforotioato capaz de formar espontáneamente
un enlace de tiofosforilacetilamino covalente con el primer grupo
reactivo. Los oligonucleótidos están unidos juntos por enlaces
covalentes a través del primer y el segundo grupos reactivos que se
han aproximado entre sí al unir los oligonucleótidos en el
polinucleótido.
La presente invención proporciona además el uso
de por lo menos un primer y un segundo oligonucleótidos para
preparar un medicamento o una sonda de oligonucleótidos, para
terapia o diagnosis, caracterizada porque:
dicho primer oligonucleótido comprende una
pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un primer grupo
reactivo que comprende un bromoacetilamino terminal 3' o 5', siendo
dichas unidades base de nucleótidos de dicho primer oligonucleótido
sustancialmente complementarias con respecto a una primera secuencia
de unidades base de un oligonucleótido o polinucleótido
objetivo;
dicho segundo oligonucleótido comprende una
pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un segundo grupo
reactivo que comprende un fosforotioato terminal 5' o 3', siendo
dichas unidades base de nucleótidos de dicho segundo oligonucleótido
sustancialmente complementarias con respecto a una segunda secuencia
de unidades base del oligonucleótido o polinucleótido objetivo, en
donde dichas primera y segunda secuencias de bases están en
posiciones contiguas del oligonucleótido o polinucleótido
objetivo;
de tal manera que dichos primer y segundo
oligonucleótidos se pueden unir de forma reversible a dichas
posiciones contiguas de dicho oligonucleótido o polinucleótido
objetivo, con lo cual dicho primer y segundo grupos reactivos se
aproximan entre sí de manera que se puede formar espontáneamente un
enlace de tiofosforilacetilamino covalente entre dicho
bromoacetilamino 3' o 5' de dicho primer oligonucleótido, y dicho
fosforotioato 5' o 3' de dicho segundo oligonucleótido, en ausencia
de un reactivo añadido.
Se apreciarán fácilmente otras ventajas de la
presente invención a medida que la misma se comprenda mejor
haciendo referencia a la siguiente descripción detallada cuando se
considere en relación con los dibujos adjuntos en los cuales:
la Figura 1 muestra el acoplamiento de dos
oligómeros cortos según la presente invención utilizando un molde
objetivo;
la Figura 2 muestra la sencilla reacción de un
fosforotioato de oligonucleótidos con un derivado de un
oligonucleótido de \alpha-haloacilo según la
presente invención;
la Figura 3 muestra los resultados de una
cromatografía líquida de alta resolución con intercambio iónico (IE
HPLC) de productos del experimento 1 en la que: A, después de 2
horas en disolución a 0ºC; B, después de 2 días a 0ºC; y C, después
de la etapa final en la que la disolución se congeló y se almacenó
a -18ºC durante 5 días, los picos a aproximadamente 17, 21 y 24
minutos se corresponden respectivamente con los compuestos 1, 2, y
3.
La Figura 4 muestra la IE HPLC de productos de un
segundo experimento (con congelación, siempre a -18ºC) en la que: A,
después de 2 horas en disolución a 0ºC; B, después de 2 días a 0ºC;
y C, después de: A, 5 horas; B, 2 días; y C, 5 días,
correspondiéndose los picos a aproximadamente 17, 21 y 24 minutos
con los compuestos 1, 2, y 3, y correspondiéndose el pico a 27
minutos con el derivado dimérico del compuesto 2 producido por
oxidación por aire; y
la Figura 5 muestra lo siguiente: A, IE HPLC de
productos de la reacción de los compuestos 1 y 2 en presencia del
molde 4 a 0ºC después de 2 horas, correspondiéndose las picos
principales con el producto 3 de acoplamiento y el molde 4,
observándose que el compuesto 1 (pico a 17 minutos) se ha consumido
casi completamente; B, los mismos productos después de un
tratamiento con KI_{3} seguido por Ditiotreitol (DTT);
observándose que el compuesto 3 ha sido sustituido por dos productos
de disociación de oligonucleótidos, que surgen a los 18 y 22
minutos.
Según la presente invención se proporciona un
método de formación de un oligonucleótido en general mediante las
etapas de disposición de por lo menos dos oligonucleótidos en
disolución acuosa en la que uno de los oligonucleótidos incluye un
grupo bromoacetilamino y el otro de los nucleótidos incluye un grupo
fosforotioato y a continuación la unión mediante enlaces covalentes
de los oligonucleótidos juntos a través del grupo y los grupos
fosfotioato formando espontáneamente un grupo tiofosforilacetilamino
entre ellos.
Este método aprovecha el hecho de que la reacción
de acoplamiento descrita en el presente documento es muy lenta en
disoluciones acuosas diluidas aunque es rápida en presencia de un
polinucleótido molde. Es decir, la reacción se acelera en presencia
de un polinucleótido objetivo que posee la sección de secuencia
complementaria con respecto a los oligómeros sonda. La presente
invención utiliza como agente terapéutico dos oligómeros cortos
(por ejemplo, de 8 a 20 meros) que se unirán juntos espontáneamente
mediante enlaces covalentes después de la unión en posiciones
contiguas en el polinucleótido objetivo. Con este sistema, se
produce una aproximación a las propiedades de afinidad de unión y
de reconocimiento de una sonda de oligómeros más larga tal como
entre 16 y 40 meros, aunque se mantienen las características de
dependencia y de apareamiento de bases de las sondas más cortas (de
8 a 20 meros). En otras palabras, la presente invención proporciona
la especificidad de polinucleótidos más cortos aunque posee el
efecto de polinucleótidos más largos.
Es inherente a la presente invención la necesidad
y el uso de polinucleótidos que incluyen grupos reactivos que
reaccionarán espontáneamente para formar un enlace covalente entre
ellos cuando los grupos estén en proximidad espacial mutua.
Específicamente, la presente invención utiliza por lo menos dos
oligonucleótidos en los que un conjunto de oligonucleótidos incluye
el primer grupo reactivo y el segundo conjunto de oligonucleótidos
incluye el segundo grupo reactivo de tal manera que al aproximarse
entre ellos, los grupos reaccionarán espontáneamente para formar un
enlace covalente estable. La presente invención utiliza un grupo
bromoacetilamino y un grupo tiofosforilo, que forman un puente
tiofosforilacetilamino de forma eficaz, selectiva e irreversible en
medios acuosos diluidos. Tal como se demuestra posteriormente, los
productos son estables en agua y se hibridan bien con
polinucleótidos complementarios.
A concentraciones oligoméricas bajas, tales como
menores de 1 \muM, y en ausencia de un molde complementario las
reacciones son muy lentas aunque se pueden llevar a cabo con una
conversión elevada en pocos días congelando la disolución. Las
técnicas de congelamiento se describen de forma detallada
posteriormente. El acoplamiento es bastante rápido (una conversión
mayor del 90% en 20 minutos) cuando se lleva a cabo en disolución
en presencia de un oligonucleótido complementario que sirve como
molde, tal como se muestra posteriormente en la sección de
Ejemplos.
La selectividad también es una preocupación
importante en aplicaciones diagnósticas de la presente invención y
en general en el uso de oligonucleótidos. Las mismas
características de la presente invención que hacen que la química
novedosa de la presente invención resulte atractiva para
aplicaciones terapéuticas también la hacen atractiva para usos
diagnósticos. Por ejemplo, la presente invención se podría utilizar
en un sistema diagnóstico de la manera siguiente.
Haciendo referencia a la Figura 1, A es un
oligómero que consiste en, por ejemplo, un elemento de 10 meros que
porta un marcador (*) en la cadena y un grupo bromoacetilamino en el
terminal 3'. B es otro oligómero corto con un grupo
tiofosforilo en el extremo 5'. C es una secuencia de
oligonucleótidos objetivo con una secuencia complementaria con
respecto a A + B. Si en disolución diluida el
acoplamiento de A y B es suficientemente lento en
ausencia del molde, con respecto al acoplamiento en presencia del
molde, únicamente será significativo el acoplamiento en el molde. De
este modo este sistema de ligazón química se podría utilizar en
amplificación y detección de forma análoga al sistema de ligazón
enzimática (Reacción en Cadena de la Ligasa, o LCR). Tiene el
potencial para ser superior ya que algún acoplamiento no específico
introduce una fuente de error en el esquema enzimático. El hecho de
que a concentraciones muy bajas de oligonucleótidos (es decir, en
la gama de interés en aplicaciones diagnósticas) la velocidad de la
ligazón química en ausencia de molde resulte extremadamente lenta
indica que el acoplamiento no referido a un molde podría tener poca
importancia en este caso.
Tal como se muestra en la Figura 2, la ligazón
indicada en la ecuación 1 para los oligómeros 1 y 2 aprovecha la
reacción sencilla de un fosforotioato con un derivado del
\alpha-haloacilo.
Específicamente, el compuesto 1 (Sec. ID 1) en la
Figura 2 tiene una unidad
3'-(bromoacetilamino)-3'-deoxitimidina
en el terminal 3'. Para la preparación del compuesto 1, a 4,9
unidades A_{260} del precursor del
3'-aminodeoxirribo -oligonucleótido,
ACACCCAATT-NH_{2}, se le añadieron 15 \muL de
bromoacetato de N-succinimidilo acuoso 0,4 M
(obtenido de Calbiochem). El método de preparación está descrito por
Gryaznov et al., 1992^{6}. La reacción se llevó a cabo en 10
\muL de tampón de borato de sodio 0,2 M a temperatura ambiente.
Después de 35 minutos, la mezcla se diluyó con 0,5 mL de agua, se
desaló mediante filtración por gel en una columna
NAP-5 (producida por Pharmacia), y se purificó por
cromatografía líquida de alta presión RP HPLC y se desaló
nuevamente, obteniéndose 4 unidades A_{260} del compuesto 1. Los
tiempos de elución son los siguientes: RP HPLC, 17,4 minutos; IE
HPLC, 17,4 minutos.
La IE HPLC llevada a cabo anteriormente y todos
los procedimientos similares llevados a cabo posteriormente se
realizaron en una columna Dionex Omni Pak NA100 de 4x250 mm con un
pH 12 (hidróxido sódico 10 mM) con un gradiente del 2% por minuto
de cloruro sódico 1,0 M en hidróxido sódico 10 M. Para la RP HPLC,
se utilizó una columna Hypersil ODS (4,6x200 mm) con un gradiente
del 1% por minuto de acetonitrilo en un tampón de acetato de
trietilamonio 0,03 M con un pH 7,0.
El compuesto 2 (Sec. ID 2) se sintetizó a una
escala de 1 \mumoles en un Sintetizador de ADN Milligen/Biosearch
Cyclone utilizando
5'-dimetoxitritil-N
-isobutilrildeoxi-guanosina soportada por LCAA CPG.
Se utilizó la química de la fosforamidita de cianoetilo estándar.
Cuando se completó el alargamiento de la cadena, el grupo
5'-hidroxilo terminal se fosfitiló (5 minutos) con
150 \muL de una disolución 0,1 M del reactivo "Phosphate
ON^{TM}" (de Cruachem) en acetonitrilo y 150 \muL de tetrazol
0,5 M en acetonitrilo. El fosfito resultante se sulfuró por
tratamiento con una disolución al 5% de azufre en
piridina/disulfuro de carbono (1:1, v/v, 45 minutos a temperatura
ambiente). Después de la disociación del grupo DMT (DCA al 3% en
diclorometano, 1,5 minutos) se obtuvo el polímero soportado como en
el caso del compuesto 1.
En la preparación de los conjugados
colorante-oligonucleótido se ha utilizado la
reacción de un oligonucleótido de tiofosforilo con un derivado
haloacetilaminoaromático en DMS^{0} y agua^{7}.
Dependiendo del uso de la invención y de la
cinética deseada, el acoplamiento de los oligonucleótidos se puede
llevar a cabo bien en disolución acuosa, en un estado congelado en
hielo, o bien en una disolución acuosa en presencia de un molde,
tal como se ha descrito anteriormente y tal como se ejemplifica
posteriormente.
En un experimento inicial, se preparó y se
mantuvo a 0ºC durante 5 días 1,0 mL de una disolución (pH 7,05,
fosfato 15 mM, NaCl 85 mM) que contenía los compuestos 1 (0,39
unidades A_{260}, 4 \muM) y 2 (0,41 unidades A_{260}, 4
\muM). La disolución se calentó a 50ºC durante 2,5 horas, y
finalmente se congeló y almacenó a -18ºC durante 5 días
adicionales. Un análisis por IE HPLC de muestras después de 2 horas
y 48 horas mostró la formación de un producto con una elución más
lenta, el oligómero 3 (Figura 2), con rendimientos de
aproximadamente el 25% y el 80%, respectivamente. No se observó
ningún cambio significativo después de los 3 días adicionales a 0ºC
o el calentamiento a 50ºC. No obstante, la reacción prosiguió
adicionalmente en el estado congelado, consiguiendo una conversión
elevada en el compuesto 3 (Sec. ID 3) en 5 días tal como se muestra
en la Figura 3. El alcance mejorado de la reacción en la matriz de
hielo se puede atribuir a la alta concentración local de los
reactantes de los oligonucleótidos dentro de las cavidades en el
hielo. Se han llevado a cabo otras reacciones de forma similar en
una matriz de hielo^{8}.
A la vista de este resultado, se congeló
directamente y se mantuvo a -18ºC una mezcla equimolar de los
compuestos 1 y 2 (2 \muM cada uno) en el mismo tampón. Los
perfiles HPLC obtenidos de las muestras después de 5 horas y
diariamente después de esta última muestran una progresión para
proporcionar un alto rendimiento de 3 en 5 días, mostrando la
Figura 4 datos representativos.
En la Figura 5 se presentan datos
correspondientes al acoplamiento de los compuestos 1 y 2 en
disolución en presencia de un molde oligonucleótido complementario
(CCATTTTCAGAATTGGGTGT, compuesto 4 (Sec. ID 4)). El sistema era el
mismo que en el primer experimento excepto que también estaba
presente el molde 4 (4 \muM). En este caso la reacción prosiguió
hasta finalizar >90% en 20 minutos y se completo esencialmente
en 2 horas.
La estructura asignada al compuesto 3 está
apoyada por las propiedades de un compuesto modelo
(T-NHC(O)CH_{2}-SP(O)(O^{-})O-T,
preparado en disolución a una escala mayor que la utilizada para el
compuesto 3), por la movilidad del compuesto 3 en electroforesis en
gel (Rm 0,58, en comparación con Rm 0,89, 0,95, y 0,61 para los
compuestos 1, 2, y 4, respectivamente), y por la estabilidad del
complejo formado con el oligonucleótido complementario, 4.
Referencias anteriores, tiempo de retención, RP HPLC 10,5 minutos;
espectro de masas FAB^{+}, M+H^{+} 620, M+Na^{+} 642;
^{31}P NMR, 8 en D_{2}O, 18,7 ppm, han dado a conocer
características para el grupo alquiltiofosfato^{9}.
Los valores Rm son relativos al azul de
bromofenol en un gel 20% poliacrilamida/5% bis acrilamida. El valor
Tm, 56ºC en NaCl 0,1 M, se aproxima al del complejo formado a
partir del elemento de 20 meros totalmente de fosfodiéster y el
compuesto 4 (60ºC)^{10} y difiere de forma significativa
con respecto a los valores de los complejos formados a partir de
los compuestos 1 ó 2 con el compuesto 4 (37ºC y 31ºC).
Adicionalmente, al producirse la oxidación con el KI_{3}^{9}
(Figura 5) se observó que el enlace del internucleótido
-NH(CO)CH_{2}SP(O)(O^{-})- se disociaba
selectivamente. Más específicamente, el elemento dúplex que
contenía los compuestos 3 y 4 (cada uno 0,3 unidades A_{260}) en
100 \muL de agua se trató con 100 \muL de KI_{3} acuoso 0,2 M
durante 15 minutos a 50ºC. A continuación, a la disolución se le
añadieron 10 \muL de DTT acuoso 1 M. Después de 5 minutos la
mezcla se desaló en una columna NAP-5 y fue
analizada por IE HPLC. La experimentación mencionada proporciona
pruebas de que la presente invención presenta una química novedosa
que proporciona unos medios adecuados para acoplar de forma
selectiva e irreversible oligonucleótidos en disolución acuosa en la
gama de una concentración oligomérica 4 \muM o mayor. Los
productos han demostrado que son estables en disolución neutra y
durante unas pocas horas incluso con un pH 12 a temperatura
ambiente. Con concentraciones inferiores a 1 \muM, la velocidad en
la fase líquida resulta extremadamente lenta. No obstante, las
reacciones se pueden realizar hasta completarse casi totalmente en
el estado congelado. La velocidad de acoplamiento se ve acelerada
notablemente por la presencia de un molde oligonucleótido
complementario. Estas propiedades proporcionan un potencial en el
diseño de sistemas de amplificación química y ligazón in
situ en aplicaciones antisentido así como en la construcción de
estructuras complejas a partir de bloques de oligonucleótidos sobre
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10. Letsinger, R.L.; Zhang, G.;
Sun, D.K.; Ikeuchi, T.; Sarin, P.S. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86,
6553-6556.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Letsinger, Robert L.
\hskip3,2cmGryaznov, Sergei M.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO DE FORMACIÓN DE OLIGONUCLEÓTIDOS
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Reising, Ethingthon, Barnard, Perry & Milton
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Apdo. de correos 4390
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Troy
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Michigan
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 48099
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disco floppy
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/046,032
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 12-ABR-1993
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Kohn, Kenneth I.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.955
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: NU9310
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (313) 689-3554
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (313) 689-4071
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº DE ID:1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_difference
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: replace(1..11, '''')
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "N es un grupo bromoacetilamino"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº DE ID:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACCCAATT N
\hfill11
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº DE ID:2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico.
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_difference
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: replace(1..2, '''')
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "N es un grupo tiofosforilo"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº DE ID:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipNCTGAAAATG G
\hfill11
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº DE ID:3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_difference
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: replace(11..12, '''')
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "NN es un grupo tiofosforilacetilamino"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº DE ID:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACCCAATT NNCTGAAAAT GG
\hfill22
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº DE ID:4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..20
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "Complementaria con respecto a la Sec. 3 sin NN"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº DE ID:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCATTTTCAG AATTGGGTGT
\hfill20
Claims (13)
1. Uso de por lo menos un primer y un segundo
oligonucleótidos para preparar un medicamento o una sonda de
oligonucleótidos, para terapia o diagnosis, caracterizada
porque:
dicho primer oligonucleótido comprende una
pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un primer grupo
reactivo que comprende un bromoacetilamino terminal 3' o 5', siendo
dichas unidades base de nucleótidos de dicho primer oligonucleótido
sustancialmente complementarias con respecto a una primera secuencia
de unidades base de un oligonucleótido o polinucleótido
objetivo;
dicho segundo oligonucleótido comprende una
pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un segundo grupo
reactivo que comprende un fosforotioato terminal 5' o 3', siendo
dichas unidades base de nucleótidos de dicho segundo oligonucleótido
sustancialmente complementarias con respecto a una segunda secuencia
de unidades base del oligonucleótido o polinucleótido objetivo, en
donde dichas primera y segunda secuencias de bases están en
posiciones contiguas del oligonucleótido o polinucleótido
objetivo;
de tal manera que dichos primer y segundo
oligonucleótidos se pueden unir de forma reversible a dichas
posiciones contiguas de dicho oligonucleótido o polinucleótido
objetivo, con lo cual dichos primer y segundo grupos reactivos se
aproximan entre sí de manera que se puede formar espontáneamente un
enlace de tiofosforilacetilamino covalente entre dicho
bromoacetilamino 3' o 5' de dicho primer oligonucleótido y dicho
fosforotioato 5' o 3' de dicho segundo oligonucleótido, en ausencia
de un reactivo añadido.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que cada
uno de dichos primer y segundo oligonucleótidos consta
esencialmente de 8 a 20 bases de nucleótidos.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que
dicho bromoacetilamino se proporciona en el terminal 3' de dicho
primer oligonucleótido y dicho fosforotioato se proporciona en el
terminal 5' de dicho segundo oligonucleótido.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que dicho
primer oligonucleótido es ACACCCAATT - NHC(=O)CH_{2}Br y
dicho segundo oligonucleótido es SPO_{3} - CTGAAAATGG.
5. Producto que comprende por lo menos un primer
y un segundo oligonucleótidos para ser utilizado como medicamento o
sonda de oligonucleótidos, caracterizado porque:
dicho primer oligonucleótido comprende una
pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un primer grupo
reactivo que comprende un bromoacetilamino terminal 3' o 5', siendo
dichas unidades base de nucleótidos de dicho primer oligonucleótido
sustancialmente complementarias con respecto a una primera secuencia
de unidades base de un oligonucleótido o polinucleótido
objetivo;
dicho segundo oligonucleótido comprende una
pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un segundo grupo
reactivo que comprende un fosforotioato terminal 5' o 3', siendo
dichas unidades base de nucleótidos de dicho segundo oligonucleótido
sustancialmente complementarias con respecto a una segunda secuencia
de unidades base del oligonucleótido o polinucleótido objetivo, en
donde dichas primera y segunda secuencias de bases están en
posiciones contiguas del oligonucleótido o polinucleótido
objetivo;
de tal manera que dichos primer y segundo
oligonucleótidos se pueden unir de forma reversible a dichas
posiciones contiguas de dicho oligonucleótido o polinucleótido
objetivo, con lo cual dicho primer y segundo grupos reactivos se
aproximan entre sí de manera que se puede formar espontáneamente un
enlace de tiofosforilacetilamino covalente entre dicho
bromoacetilamino 3' o 5' de dicho primer oligonucleótido, y dicho
fosforotioato 5' o 3' de dicho segundo oligonucleótido, en ausencia
de un reactivo añadido.
6. Producto según la reivindicación 5, en el que
cada uno de dichos primer y segundo oligonucleótidos consta
esencialmente de 8 a 20 bases de nucleótidos.
7. Producto según la reivindicación 5 ó 6, en el
que dicho bromoacetilamino se proporciona en el terminal 3' de
dicho primer oligonucleótido y dicho fosforotioato se proporciona
en el terminal 5' de dicho segundo oligonucleótido.
8. Producto según la reivindicación 7, en el que
dicho primer oligonucleótido es ACACCCAATT -
NHC(=O)CH_{2}Br y dicho segundo oligonucleótido es
SPO_{3} - CTGAAAATGG.
9. Método de formación, in vitro, de una
sonda diagnóstica de oligonucleótidos, comprendiendo dicho
método:
- (a)
- la unión reversible de por lo menos un primer y un segundo oligonucleótidos a posiciones contiguas de un oligonucleótido o polinucleótido objetivo, en el que
- dicho primer oligonucleótido comprende una pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un primer grupo reactivo que comprende un bromoacetilamino terminal 3' o 5', siendo dichas unidades base de nucleótidos de dicho primer oligonucleótido sustancialmente complementarias con respecto a una primera secuencia de unidades base de dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo, y
- dicho segundo oligonucleótido comprende una pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un segundo grupo reactivo que comprende un fosforotioato terminal 5' o 3', siendo dichas unidades base de nucleótidos de dicho segundo oligonucleótido sustancialmente complementarias con respecto a una segunda secuencia de unidades base de dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo, en donde dichas primera y segunda secuencias de bases están en posiciones contiguas de dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo;
- (b)
- la unión por medio de enlaces covalentes de dichos primer y segundo oligonucleótidos juntos a través de la aproximación mutua del primer y el segundo grupos reactivos al unirse dichos oligonucleótidos a dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo para formar espontáneamente un enlace de tiofosforilacetilamino, en ausencia de un reactivo añadido.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
las etapas (a) y (b) se producen en disolución acuosa.
11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el
que cada uno de dichos primer y segundo oligonucleótidos consta
esencialmente de 8 a 20 bases de nucleótidos.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho bromoacetilamino se
proporciona en el terminal 3' de dicho primer oligonucleótido y
dicho fosforotioato se proporciona en el terminal 5' de dicho
segundo oligonucleótido.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
dicho primer oligonucleótido es ACACCCAATT -
NHC(=O)CH_{2}Br y dicho segundo oligonucleótido es
SPO_{3} - CTGAAAATGG.
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