JP3771281B2 - 特定の核酸の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の概要】
本発明は、サンプル中の少なくとも１つの特定の核酸配列の増幅及び検出のための方法に関するものであり、該サンプルは１つの核酸又は複数の核酸の混合物であってその少なくとも１つが前記特定の核酸配列を含有すると予想されるものであり、この方法は、
【０００２】
（ａ）検出されるべき核酸配列を鎖延長反応により増幅し、ここでこの鎖延長反応は、次の一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ｐｃ−Ｌ−Ｐｐ （Ｉ）
（式中、Ｐｐは、検出されるべき核酸配列の一方の鎖の一部分と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列であり、Ｐｃは前記配列Ｐｐに実質的に相補的な核酸配列であり、Ｌは配列ＰｃとＰｐのプライマー延長配列との間の効率的な折り返しを可能にしそして折り返し部分Ｐｃの増幅を回避するように選択された非−ヌクレオチドリンカー基であり、そしてＸはエネルギー供与体又は受容体である）
により表わされる第一オリゴヌクレオチドプライマー、及び検出されるべき核酸配列の他方の鎖の一部分と実質的に相補的な第二オリゴヌクレオチドプライマーを使用し；
【０００３】
（ｂ）最終増幅サイクルの後、プライマー延長生成物をその相補的配列から分離して単鎖分子を生成せしめ；
（ｃ）前記式（Ｉ）のプライマーを含有する前記単鎖分子を、次の一般式（II）：
Ｙ−Ｐｒ （II）
【０００４】
（式中、Ｙは、式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー供与体である場合にはエネルギー受容体であり、そして式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー受容体である場合にはエネルギー供与体であり、そしてＰｒは、式（Ｉ）のプライマーを含有する増幅された単鎖分子の一部分と相補的なオリゴヌクレオチドであって、配列Ｐｃの折り返し及び前記単鎖分子への配列Ｐｃのハイブリダイゼーションの後にエネルギーの移行が行われ得る程ＸとＹとの間の短い距離を保証するように選択されたものである）
により表わされるオリゴヌクレオチドプローブにより、折り返しによる配列Ｐｃ及びＰｒ配列の前記単鎖分子へのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で処理し；そして
【０００５】
（ｄ）エネルギー移行が行われるか否かを決定する；
ことを含んで成る。
本発明はさらに、１つの核酸又は複数の核酸の混合物であってその内の少なくとも１つが特定の核酸配列を含有すると予想されるものを含有するサンプル中の少なくとも１つの該特定の核酸配列を増幅し且つ検出するためのキットに関し、このキットは、前に定義した式（Ｉ）のプライマーを含有する容器、前に定義した式（II）のプローブを含有する容器、並びにポリメラーゼ連鎖反応による増幅及び検出のための手段及び試薬を含んで成る。
【０００６】
【具体的な説明】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡ又はＲＮＡストレッチの特異的増幅のために非常に強力な方法である。この方法は、ヨーロッパ特許出願公開No. ２０１，１８４、No. ２００，３６２、及びNo. ２５８，０１７に記載されている。この技法の１つの用途は、低コピー数で存在するＤＮＡを検出可能なレベルに上げるためのＤＮＡプローブ技法においてである。
【０００７】
この方法の多くの診断的及び科学的用途が、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（編集）によるＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，米国，１９８９、並びにＭ．Ａ．Ｉｎｉｓ（編集）によるＰＣＴ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，米国，１９９０に記載されている。
【０００８】
望ましい目標は、いわゆる均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）測定方式による時間のかかる分離又は移送段階を用いないで、増幅されたＤＮＡを直接検出することである。同時に、目的はまた、ＤＮＡ診断において今なお主として使用されている放射能ラベルの代りに非放射性のレポーター系を用いることにより、この技法の用途を拡大することである。挿入化学発光性アクリジンエステルを適用するこの様な均一検出系はＡｒｎｏｌｄらによりＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１５８８（１９８９）に報告されている。
【０００９】
均一ＤＮＡ検出測定のさらなる変法が、Ｂ．Ｓ．ＲｅｃｋｍａｎｎによりＮａｃｈｒ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｌａｂ．３７，６９２−７０２（１９８９）に総説として記載されている。
時間−分離（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光測定により高感度で測定され得る非放射性ラベル分子としてのバソフェナンスロリン（ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）−ＲｕII複合体の使用が、Ｗ．ＢａｎｎｗａｒｔｈらによりＨｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７１，２０８５−２０９９（１９８８）に記載されている。
【００１０】
これらの複合体は、適当な供与体（ｄｏｎｏｒ）分子からＲｕ複合体へのエネルギー移行を可能にするラベル分子の相互作用対の部分であり得る。エネルギー移行の効率は供与体と受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）との間の距離に大きく依存するので、この様な系は分子間相互作用の研究において適用され得る。Ｒｕ複合体のための供与体分子の適当なクラスとしてルマジン（ｌｕｍａｚｉｎｅ）発色団が同定されている。
【００１１】
均一測定での例えばＤＮＡ分子の検出におけるこの供与体／受容体対の適用可能性が、ヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６、並びにＷ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ及びＦ．ＭｕｅｌｌｅｒによるＨｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ７４，１９９１−１９９９（１９９１）及び７４，２０００−２００８（１９９１）に記載されている。
【００１２】
この様な組合せにより、５′−末端においてＲｕバソフェナンスロリン複合体によりラベルされておりそしてオリゴヌクレオチド内の該Ｒｕ複合体から異る距離にルマジン色原体を有する該オリゴデオキシヌクレオチド中でエネルギー移行が検出された。さらに、１つのプローブ配列が供与体を有しそして他方が受容体を有するハイブリダイゼーション法において標的ＤＮＡ配列を検出するために相互作用ラベルのこの対が使用され得ることが示された。
【００１３】
均一ＤＮＡ検出系においてエネルギー受容体としてテルビウム錯体を用いそしてエネルギー供与体としてサリチル酸塩を用いる他の方法が、Ａ．Ｏｓｅｒ及びＧ．ＶａｌｅｔによりＡｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １０２，１１９７−１２００（１９９０）に記載されている。
引き続く検出のためにエネルギー移行を用いる均一試験方式におけるオリゴヌクレオチドの検出のための既知の方法は、相補的ＤＮＡ配列に特異的に並んでハイブリダイズする少なくとも２個のラベルされたオリゴヌクレオチドを用い、これにより２個のラベルを相互に隣り合わせに位置させる。
【００１４】
本発明の基本原理は図１に要約されている。図１は、相互作用ラベル並びに一般式（Ｉ）の折り返しプライマー及び一般式（II）のプローブを用いる、増幅されたＤＮＡの測定に関与する段階を示す。二本鎖中の相補鎖は単純化のために省略されている。
【００１５】
本発明において、増幅は２つのプライマーの組合せを用いて行うことができ、その少なくとも一方は一般式（Ｉ）のプライマーであり、これは、その部分配列Ｐｃをプライマー部分Ｐｐに折返して短い二本鎖を形成する能力のために折返しプライマーとも称される。
【００１６】
第一オリゴヌクレオチドが好ましくは酵素（ポリメラーゼ）を用いる鎖延長反応におけるプライマーとしての使用のために意図される場合は特に、オリゴヌクレオチド中の自己相補的部分は第二オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの段階において問題を生じさせる場合があることが当業界において知られている。従って、明瞭な反応のためにこれらのプライマー及びさらにプローブを最適化して、それらが前記のごとき自己相補的部分含まないようにすることが通常推奨される。
【００１７】
今や意外にも、自己相補的領域を含有するオリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応及び検出段階において有利に使用し得ることが見出された。
式（Ｉ）のプライマーの場合、３′−末端から非ヌクレオチド性リンカー基までのプライマー部分Ｐｐが、検出されるべき標的ＤＮＡ配列の増幅のための標準的プライマーを代表する。変性及びそれに続くポリメラーゼの使用の温度において、折返しプライマーの少なくとも部分は開いた形で存在し、そしてそれ故に４種類のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ及びｄＣＴＴ）又はそれらの類似体の適当な量の存在下でその鋳型依存的延長を特異的に開始することができる。
【００１８】
既知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ又はそのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ4 ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、及びサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）からのＤＮＡポリメラーゼが含まれる。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ合成を触媒するための反応条件は当業界においてよく知られている。
【００１９】
増幅生成物中にプライマーＩを導入することを許容する、鎖延長反応に基くあらゆる増幅方法を用いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅はすでに述べられている。式（Ｉ）のプライマーはまた、増幅された標的配列を製造するための他の方法においても使用することができる。例えば、プライマー（Ｉ）を第二のオリゴヌクレオチドと一緒に使用することができ、ここで、これらの両者は１つのＤＮＡ鋳型に対して相補的でありそしてそれらの３′−末端及び５′−末端が相互に直接隣接する。
【００２０】
変性、プライマーアニーリング及び３′−末端と５′−末端との連結の反復により増幅が起こる。いわゆるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）又はリガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）はさらに、Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅによりＧｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０−５６９（１９８８）中に記載されている。次に、式（Ｉ）のラベルされたプライマーを含有する増幅生成物が、次に記載する折返し片Ｐｃの近くに式（II）のラベルされたプローブをハイブリダイズさせることにより検出される。ＰＣＲによる増幅が好ましい方法である。
【００２１】
変性温度は約９０℃〜１００℃であるが、ポリメラーゼ反応の温度は通常さらに低く、そして使用されるポリメラーゼに依存する。Ｔａｑポリメラーゼの場合、温度は７０℃〜８０℃の間であり、これは、プライマー活性を阻害するであろうプライマー（Ｉ）中のＰｐへの短い配列Ｐｃの完全な内部折返しを回避するのに十分に高い温度である。増幅後及び低温において、導入されたプライマー特にその部分Ｐｃは折返され得る。
【００２２】
その３′−末端に１又は複数のエネルギー供与体分子〔式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー受容体である場合〕又はエネルギー受容体分子〔式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー供与体分子である場合〕を有しそして増幅された領域にハイブリダイズする式（II）のプローブ（検出オリゴヌクレオチド）により、その様な状況下でエネルギーの移行を可能にする折返しプライマーの５′−末端における前記供与体又は受容体間の短い距離を折返しが保証する（図１、段階ｂ）。
【００２３】
標的配列が存在しない場合、そしてそれ故にプライマーＩによって増幅されていない場合、検出オリゴマーとハイブリダイズし得るプライマー延長生成物が存在しないから、前記エネルギーの移行は不可能である。従って、増幅された標的の存在とその不存在との間の明瞭な区別が可能である。こうして、分離段階を行う必要なく均一法での増幅の直ぐ後に試験を行うことができ、そしてエネルギーの移行が増幅された標的配列の存在を示す。
【００２４】
プライマー（Ｉ）は増幅及び検出のために適当な任意の長さであることができる。プライマー領域Ｐｐは約１０〜３０ヌクレオチドの長さであるが、しかし検出されるべき配列に依存してより短く又はより長くてもよい。ヌクレオチド塩基の個々の塩基対合の安定性を考慮して、配列及び温度特異的ＰＣＲプライマーを設計するためのパラメーターは当業界において知られている。
【００２５】
本発明において使用されるプライマー部分Ｐｐは、増幅されるべき各特定の配列に「実質的に」相補的であるように選択される。プライマー部分Ｐｐは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、重合の温度においてさえそれらの対応する鎖に選択的にハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。プライマー部分Ｐｐが、増幅されるべき鎖の一方の配列とハイブリダイズするのに十分なだけ該配列に対する相補性を維持しており、そしてそれにより重合試薬により延長され得る二本鎖構造を形成するのであれば、プライマー部分Ｐｐに非相補的塩基又はより長い配列を点在させることができる。プライマー部分Ｐｃは、各場合において、Ｐｐの配列に部分的に又は完全に相補的であるように適合されるであろう。好ましくは、プライマー部分Ｐｐは鋳型の相補的配列を反映する。
【００２６】
ラベルを伴う折返し部分Ｐｃの付加はプライマー機能にとって全く無害であることが見出された。Ｐｃの配列はＰｐに対して任意の長さを有することができる。好ましくは、ＰｃはＰｐに比較して数塩基短い。このことは、より長いプライマー部分Ｐｃの場合にこの部が増幅温度において鋳型の相補的配列にＰｐより密接に結合することを排除する。追加の供与体分子が３′−末端と５′−末端との間のギャップを補うことができ、このことは、折返しプライマーＩの５′−末端が終る所からプローブ（II）が正確に始まる必要のないことを意味する。
【００２７】
さらに、より低い温度においてプローブが折返されたプライマー（Ｉ）にその先行する延長を伴わないでハイブリダイズして誤った陽性結果をもたらすことがないように、プライマー部分ＰｐはＰｃとの関係で長過ぎてはならない。例えば、プライマー部分Ｐｐは１８塩基の長さを有し、そしてＰｃ部分の１０塩基により折返される。これはまた、配列中の塩基の組成に依存する。
【００２８】
他方の（相補的）核酸配列の同時増幅のために共通に使用される第二オリゴヌクレオチドプライマー（対向プライマー）もまたラベルされてもよく、そしてプライマー（Ｉ）と同じ量又は異る量で使用されることができる。両プライマーがラベルされる場合、増幅された配列中のほとんどすべてのオリゴヌクレオチドがラベルされ、そして増幅後に検出されなければならない核酸配列の少なくとも１つの折返し部分Ｐｃの近くへのハイブリダイゼーションを可能にする少なくとも１つの３′−ラベル化プローブIIを用いて検出され得る。本発明のプライマー及び記載されるプローブの他の変更又は組合せ、例えば異ってラベルされたプライマーの使用、ＤＮＡではなくＲＮＡ増幅又は単鎖増幅は、本発明の範囲内である。
【００２９】
別の方法として、図１段階ｃに示すように、折返しオリゴマーの５′−末端に１又は複数の供与体分子を置き、そして検出オリゴマーの３′−末端に受容体分子を置くことができる。好ましくは、プライマーは５′−末端においてエネルギー供与体によりラベルされる。これは、直接励起から生ずるエネルギー受容体のバックグラウンド蛍光のため有利である。ＰＣＲにおいて、プライマーは大過剰に適用される。従って、プライマーがエネルギー受容体（例えばＲｕ複合体）によりラベルされておれば、直接励起により生ずるこの蛍光が重要となるであろう。
【００３０】
蛍光測定による供与体と受容体との間のエネルギー移行の検出は当業界において知られている方法により行うことができる。時間−分離蛍光技法の方法は例えば独出願公開No. ２６２８１５８及びヨーロッパ特許出願公開No. １７８，４５０に記載されている。
【００３１】
相互作用分子がそれらの分子の光学的性質に影響することなくプライマー又はプローブに化学的に結合され又はそれらと複合体を形成し、そしてそれらがＤＮＡの存在下で検出可能であれば、本発明において任意の組合せで相互作用分子を用いることができる。適当な相互作用分子は、グルコールオキシダーゼ／パーオキシダーゼ、フルオレッセイン／ローダミン、及びサリチル酢塩／テルビウム錯体である。供与体／受容体の組合せとして、ルマジン色原体／バソフェナンスロリン−ルテニウムII複合体が好ましい。
【００３２】
折返しプライマーはまた非ヌクレオチド性基Ｌを含有し、このものはＰｃ及びＰｐ中の相補的塩基の塩基対合を可能にし、これによってループの形成を回避する。この非ヌクレオチド性質はまた増幅工程中にこの位置でのポリメラーゼ反応の停止を導く。
【００３３】
非ヌクレオチド基Ｌは、配列Ｐｐとその相補的配列Ｐｃとの間の折返しを可能にするように選択される。この基Ｌは、ループの形成を伴わないでＰｐへのＰｃの定義された折返しを可能にする任意の種類の非ヌクレオチド性リンカーから成ることができる。好ましくは、非ヌクレオチドリンカーはプロパンジオールに由来する。さらに好ましくは、リンカー基Ｌは、１個のホスフェート基により一緒に連結されており、そしてホスフェート基を介してオリゴヌクレオチド配列Ｐｃ及びＰｐに結合している２個のプロパンジオール基から成る。最も好ましいリンカー基Ｌは次の式：
-O-P(O)2 - -O-(CH2)3-O-P(O)2 - -O-(CH2)3-O-P(O)2 - -O-
を有する。
【００３４】
この非ヌクレオチド性リンカーは、意外にも、ＰｐへのＰｃの効率的な折返しを可能にし、そして折返し部分Ｐｃの増幅を回避することが見出された。
ポリメラーゼ反応において通常のプライマーとして機能するオリゴヌクレオチド又は修飾されたプライマーもしくはプローブの部分であるオリゴヌクレオチドは、当業界において知られている方法（Ｍ．Ｊ．Ｃａｉｔ編、ＤＮＡ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＩ−Ｐｒｅｓｓ，１９８４）により合成することができる。Ｎ．Ｄ．ＳｉｎｈａらによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，４５３９−４５５７（１９８４）に記載されているようなβ−シアノエチルホスホラミダイトを用いる固相合成が好ましい。
【００３５】
基Ｌは、プライマー部分Ｐｐの固相合成の過程でホスホラミダイト〔５〕又はその類似体を用いて挿入することができる。ホスホラミダイト〔５〕の合成はＦ．ＳｅｅｌａによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，３１１３（１９８７）に記載されている。
【００３６】
【化１】
【００３７】
２個のこれらのアミダイト〔５〕を合成の間にオリゴヌクレオチドＰｐに加えることにより最も好ましいリンカーが得られ、このリンカーは合成の間に、式（Ｉ）のプライマーの折返し部分Ｐｃを加えるために適当なヌクレオシドホスホラミダイトにより、さらに延される。
【００３８】
プライマー又はプローブの末端の３′−又は５′−ＯＨ基において連結するために選択されたラベルは、直接的に、又はこれらのヒドロキシ基の修飾の後に、当業界において知られている方法により、−ＮＨ2 ，−ＣＯＯＨ，−ＳＨ又は他の任意の適切な基に連結することができる。
【００３９】
ラベルの取付けは、オリゴヌクレオチドがなお支持体に結合している場合、又はすでに切り離されている場合のいずれにおいても行うことができる。ラベルはまた、プライマー又はプローブの１又は複数個のヌクレオチド塩基に、それらを成長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖に付加するに先立って、例えばヌクレオシドアミダイトの形で導入することができる。Ｒｕ複合体／ルマジンラベルの場合、６，７−ジメチルルマジン−２′−デオキシリボシドのホスホラミダイト〔７〕を用いて、折返しプライマーの５′−末端又はプローブの５′−／３′−末端に導入することができる。ホスフェート基の導入のために他のルマジン誘導体又はカップリング試薬を用いることもできる。
【００４０】
【化２】
【００４１】
ルマジン色原体を担持するこれらの分子の１又は複数個をオリゴヌクレオチドに導入することによりエネルギー移行を増強することができる。１〜４個の連続するルマジン色原体が好ましい。オリゴヌクレオチドの３′−又は５′−末端へのリマジンリボシドの導入はヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６に記載されている。
【００４２】
ヨーロッパ特許出願公開No. ３４０，６０５及びNo. １７８，４５０に記載されているように、エネルギー受容体としての種々のＲｕ複合体を、該複合体とＤＮＡ分子との間の種々のスペーサーと共に用いることができる。折返しプライマーの５′−末端にＲｕ複合体を取り付けるため、例えば構造〔６ａ〕のホスホラミダイト又は構造〔６ｂ〕の試薬を用いることができる。好ましくは、３′−末端への導入のために誘導体〔６ｂ〕が使用される。
【００４３】
【化３】
【００４４】
オリゴヌクレオチドの固相合成の過程での例えばヒドロキシ基又はアミノ基へのカップリングのため、さらなる修飾を伴わないで試薬〔６ａ〕を用いることができる。
３′−末端への試薬〔６ｂ〕のカップリングは、合成のために使用される固体支持体の幾らかの修飾の後に行うことができる。ＮｅｌｓｏｎらによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，７１７９（１９８９）に記載されている化合物〔８〕から出発する一般的スキーム（スキーム１）を下に記載する。修飾された支持体〔１０〕へのＲｕ複合体誘導体〔６ｂ〕の取り付けを含むさらなる詳細は実施例２を参照のこと。
【００４５】
【化４】
【００４６】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに例示するが、本発明の範囲をこれにより限定するものではない。
実施例１
ルマジン及びＲｕ複合体ホスホラミダイトの合成
６，７−ジメチル−ルマジン−２′−デオキシリボシドのホスホラミダイトをヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６（１９９１年７月３１日）に記載されているようにして調製した。Ｒｕ複合体のホスホラミダイト〔６ａ〕を、Ｗ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ及びＤ．ＳｃｈｍｉｄｔによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０，１５１３−１５１６（１９８９）により記載されているようにして調製した。
【００４７】
Ｒｕ複合体誘導体〔６ｂ〕は、ヨーロッパ特許出願公開No. ３４０，６０５に、又はＷ．ＢａｎｎｗａｒｔｈらによりＨｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ １７，２０８５−２０９９（１９８８）に記載されているようにしてＲｕ複合体と活性化されたＮ−ヒドロキシサクシンイミドとの連結により調製した。Ｎ，Ｎ，Ｎ′Ｎ′−テトラメチル（サクシンイミド）ウロニウムテトラヒドロボレート（ＴＳＴＵ）を活性化剤として使用した。
【００４８】
ＴＳＴＵの合成及び使用はＲ．ＫｎｏｒｒらによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０，１９２７−１９３０（１９８２）に、及びＷ．ＢａｎｎｗａｒｔｈによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｓ ３２，１１５７−１１６０（１９９１）に記載されている。
【００４９】
１−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシ−ホスフィン）−１，３−プロパンジオール〔５〕の合成
この試薬の調製は、Ｆ．Ｓｅｅｌｅ及びＫ．ＫａｉｓｅｒによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，３１１３−３１２９（１９８７）に記載されている２段階法により１，３−プロパンジオールから出発して行った。まず、この化合物を４，４′−ジメトキシトリチル基により保護した。次に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドの存在下、（β−シアノエトキシ）ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンによりホスフィニル化して化合物〔５〕を得た。
【００５０】
実施例２
３′−Ｒｕ複合体修飾ＤＮＡの合成
３′−修飾オリゴヌクレオチドの固相合成のための修飾されたＣＰＧ支持体の合成はスキーム１（前記）に記載したようにして行った。
化合物〔８〕は、ＮｅｌｓｏｎらによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，７１７９−７１８６及び７１８７−７１９４（１９８９）に記載されている方法に従って行った。
【００５１】
次の段階において、化合物〔８〕（１０mmol，６．１６ｇ）を無水ピリジンから３回蒸発させた。次に、これを６０mlの無水ピリジンに溶解し、そして２５mmol（２．５０ｇ）の無水コハク酸及び１０mmol（１．２２ｇ）の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加し、そしてアルゴンのもとで撹拌した。４時間後、反応を終えた（ＴＬＣ）。反応混合物を２００mlのジエチルエーテルに入れ、そして飽和食塩水により４回抽出した。
【００５２】
有機層をＮａ2 ＳＯ4 で乾燥し、そして蒸発させ、こうして６ｇの油状物を得た。１５０ｇのシリカゲル（０．００３〜０．０４０nm、メルク）上での、１０００mlの混合ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ／ピリジン（９４：５：１；ｖ／ｖ）、５００mlのＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ／ピリジン（９２：７：１）及び５００mlのＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ／ピリジン（８９：１０：１）を用いての短カラムクロマトグラフィー（ＣＣ）による精製を行った。純粋な画分を集め、そしてｎ−ペンタンから沈澱させて２．３ｇの純粋な化合物〔９〕を得た。
【００５３】
融点８７〜８９℃。分析：Ｃ43Ｈ41ＮＯ9 ・０．２ｎ−ペンタンの計算値：Ｃ７２．３７，Ｈ ５．９９，Ｎ １．９２；測定値：Ｃ ７２．６０，Ｈ ６．１４，Ｎ １．９４。 1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：２．６４（ｓ，ＯＣＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯ）；３．０３−３．５０（２ｍ，ＣＨ2 −ＣＨ−ＣＨ2 ）；３．５０−３．６５（ｍ，ＣＨ2 −ＣＨ−ＣＨ2 ）；３．７４（ｓ，２ＯＣＨ3 ）；４．１９（ｔ，ＣＨ2 −ＣＨ）；４．３４（ｄ，ＣＨ2 −ＣＨ）；６．８１（ｄ，４ａｒｏｍ．Ｈ，Ｃ6 Ｈ4 ）；７．１５−７．３７（ｍ，９ａｒｏｍ．Ｈ，Ｃ6 Ｈ5 ，Ｃ6 Ｈ4 ）；７．３９（ｔ，フルオレニル）；７．５１（ｄ，フルオレニル）；７．７６（ｄ，フルオレニル）。
【００５４】
官能化された支持体〔１０〕の調製：ＣＰＧ−支持体（Ｐｉｅｒｃｅ）を無水ピリジンから蒸発させた。次にこれを１０mlの無水ピリジンに溶解し、そして０．６０mmol（４３０mg）の〔９〕並びに３mmol（８８０mg）の１−（メシチレン−２−スルホニル１−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）及び０．３mlのＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）を加え、そしてこの懸濁液を室温にて時々撹拌しながら反応させた。
【００５５】
２時間後、それを濾過し、そしてピリジン、ＤＭＦ及びエーテルにより次々と洗浄した。この支持体に、１％ ＤＭＡＰを含有するＡｃ2 Ｏ／ピリジン（１／１０；ｖ／ｖ）の混合物１０mlを加えた。１時間後、それを濾過し、そして支持体をピリジン、ＤＭＦ、エタノール及びエーテルで洗浄した。〔１０〕の官能化の程度を、ジメトキシトリチル陽イオンの光学測定により（３０．５mmol／ｇ）そしてフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基の開裂及びそれに続く３００nmでの光学測定（３０．１mmol／ｇ）により決定した。
【００５６】
支持体〔１０〕上３′−アミノ修飾ＤＮＡの調製：１．５mmolの支持体〔１０〕から始めて合成機上で合成を行った。各サイクルの間に、１０倍過剰量の対応するホスホラミダイトを適用した。合成の後、支持体をアセトニトリル及びエーテルで洗浄し、そして乾燥させた。次に、２０mgの支持体を、密閉したエッペンドルフ管内で７００μｌの濃アンモニアにより６７℃にて１．５時間処理した。
【００５７】
懸濁液を濾過し、そして濾液を乾燥させた。得られたペレットを３００μｌの８０％酢酸に溶解し、そして２時間後７００μｌのエーテルを加えてＤＮＡを沈澱させた。遠心分離の後、ペレットを水に溶解し、そして５００mmolのＫＣｌの添加の後、これを２ｌの水に対して透析した（分子量１０００排除）。ＵＶ吸収は５３ODユニットのアミノ修飾ＤＮＡの収量を示し、これをそのまま、Ｒｕ複合体への結合のために用いた。
【００５８】
アミノ修飾ＤＮＡへの〔６ｂ〕の結合：エッペンドルフ管内で、２７．５ODユニットの３′−アミノ修飾ＤＮＡ及び４mmol（３mg）の〔６ｂ〕を、２００μｌのＤＭＦ、２００μｌのジオキサン、２００μｌの水及び５μｌのヒューニッヒ（Ｈｕｅｎｉｇ）塩基の混合物中で反応させた。この混合物を暗所で振とうしながら１６時間反応させた。スピード真空濃縮器中で乾燥させ、そして５００μｌの水に溶解した。この溶液を５００μｌのＣＨＣｌ3 で３回抽出して過剰のＲｕ複合体を除去した。ポリアクリルアミド電気泳動及びそれに続く電気溶出により沈澱を行った。
【００５９】
実施例３
非ヌクレオチド性リンカー及び／又は３′−もしくは５′−修飾を有するオリゴヌクレオチドの合成
修飾を伴わないオリゴヌクレオチドを、調節された孔のガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ，Ｐｉｅｒｃｅ）上で、そして適切なビルディングブロックのβ−シアノエチルホスホラミダイトを適用して調製した。
【００６０】
３′−ルマジン修飾オリゴヌクレオチドを、ヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６に記載されているようにして、ルマジン−２′−デオキシリボシド修飾ＣＰＧ−支持体の延長により調製した。この出願はまた、５′−ルマジン及び５′−Ｒｕ複合体−修飾オリゴヌクレオチドの合成において使用するための方法及び試薬も記載している。
【００６１】
ホスフェート基により分離された２個のプロパンジオール基から成る非ヌクレオチド性リンカー基を、固相合成の間に、対応するホスホラミダイト〔５〕により挿入した。このアミダイトの結合を、１０倍過剰量及び３分間の結合時間を用いて、活性化剤としてのテトラゾールと共に２回行った。
３′−末端へのＲｕ複合体の付加は、実施例２に記載したオリゴヌクレオチドの合成及び脱保護の後にＲｕ複合体誘導体〔６ｂ〕を用いて行った。
【００６２】
実施例４
一般式（Ｉ）のプライマーを用いてのポリメラーゼ連鎖反応
幾つかのオリゴヌクレオチドを合成し、そしてホリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして作用するそれらの能力について試験した。増幅のために選択されたＤＮＡ断片はＨＩＶ−１のｇａｇ領域の一部分である。５′−末端にＲｕ複合体を有する〔１６〕か又は有しない〔１４，１５〕常用のプライマー並びに一般式（Ｉ）の修飾プライマー〔１７，１８〕を、すでに記載されている方法により合成した。
プライマーは次の特異的配列を有していた。
【００６３】
【化５】
【００６４】
各場合において、相補鎖の同時増幅のために使用した第二プライマー又は対向プライマーは次の配列を有していた。
【００６５】
【化６】
【００６６】
これらのオリゴヌクレオチドは、Ｃ．Ｈ．Ｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，２９５−２９７（１９８８）の表２にすでに記載されているプライマー及びプローブ配列に由来した。
増幅反応当り１０００コピーのＨＩＶプラスミドＤＮＡが適用された。プライマーは１００pMで過剰に使用した。〔１９〕の場合、５０pMが適用された。ＨＩＶ ＤＮＡを２連で増幅し、そしてＰＣＲ陰性対照を導入した。プライマー〔１４〕及び〔１９〕を用いての増幅を陽性対照として用いた。
【００６７】
反応混合物当り１００μｌの全体積のため、５０μｌのマスター混合物に５０μｌのＨＩＶ ＤＮＡを加えた。
マスター混合物：
蒸留水 ２７．５μｌ
１０×Ｔａｑ緩衝液 １０．０μｌ
８mM ｄＮＴＰ １０．０μｌ
１００mMプライマー（１４−１８） ３．０μｌ
５０mMプライマー１９ ３．０μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌ
【００６８】
増幅されたＤＮＡの効率及び均一性を、サザンハイブリダイゼーション（Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９８，５０３，１９７５）により、放射性ラベルされたプローブ５′−ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＴＡ Ｃ−３′を用いて試験した。ハイブリダイゼーションは、リン酸緩衝液（１０mM無機リン酸：１Ｍ ＮａＣｌ，pH７．０）中で、等モル量のオリゴヌクレオチドを用いてよく行われた。５′−末端にＲｕ複合体を有する最も短い折返しプライマーさえ、効率において標準的非修飾プライマーに匹敵する特異的増幅を導いた。
【００６９】
実施例５
ハイブリダイゼーション及びエネルギー移行を介しての延長された折返しプライマーの検出
一般式（Ｉ）の折返しプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応におけるその延長後に、一般式（II）のオリゴヌクレオチドプライマーによる引き続く検出のための鋳型として機能し得るか否かが決定された。５′−Ｒｕ−複合体−ラベル化オリゴヌクレオチド〔１〕は、３′−ルマジン−ラベル化プローブ〔２ａ〕，〔２ｂ〕及び〔２ｄ〕並びに陰性プローブ〔２ｃ〕のための鋳型として機能する構造（Ｉ）の延長されたプライマーのための合成モドル化合物として役立つ。
【００７０】
【化７】
【００７１】
ハイブリダイゼーションは、リン酸緩衝液（１０mM無機リン酸塩；１Ｍ ＮａＣｌ，pH７．０）中で等モル比のオリゴヌクレオチドを用いてよく行われた。
蛍光測定を、ＳＬＭ Ｍｏｄｅｌ ４０４８Ｓ蛍光分光計において行った。励起波長及び放射波長はそれぞれ３３７nm及び６２０nmであった。ハイブリドの濃度はサンプル体積４００μｌのために１．３×１０-6Ｍであった。
【００７２】
表１はエネルギー移行測定の結果を示す。予想通り、プローブ〔２ａ〕及び〔２ｂ〕の場合結果は陽性であり、そしてプローブ〔２ｃ〕及び〔２ｄ〕の場合陰性であった。
【００７３】
エネルギー移行から蛍光（ＩＦ3 ）は、６２０nmにおける測定された蛍光（ＩＦ）から直接励起によるＲｕ複合体の蛍光及び６２０nmにおけるルマジン色原体の蛍光（ＩＦ1 ）（無視することができる）を差し引いた差として定義された。従って、エネルギー移行の強度についての式はＩＦ3 ＝ＩＦ−ＩＦ2 となる。単純化のため、表１には、直接励起によるＲｕ複合体の蛍光強度（ＩＦ2 ）に対する６２０nmでの測定された蛍光強度ＩＦの比率を示す。
５′−リマジン−ラベルプライマー及び３′−Ｒｕ複合体−ラベルプローブを用いる逆エネルギー移行系を化合物〔１１〕，〔１２〕及び〔１３〕を用いて研究した。
【００７４】
【化８】
【００７５】
プライマー／プローブ系〔１１〕／〔１２〕（エネルギー移行を示す）及びエネルギー移行を伴わない陰性対照としての〔１３〕／〔１２〕を用いて得た結果は、エネルギー移行の効率はやや低かった（データーは示してない）が、この組合せの有用性を確認した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の測定の原理を示す。ａ）は変性及び増幅段階を示し、ｂ）及びｃ）検出段階を示す。
【発明の概要】
本発明は、サンプル中の少なくとも１つの特定の核酸配列の増幅及び検出のための方法に関するものであり、該サンプルは１つの核酸又は複数の核酸の混合物であってその少なくとも１つが前記特定の核酸配列を含有すると予想されるものであり、この方法は、
【０００２】
（ａ）検出されるべき核酸配列を鎖延長反応により増幅し、ここでこの鎖延長反応は、次の一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ｐｃ−Ｌ−Ｐｐ （Ｉ）
（式中、Ｐｐは、検出されるべき核酸配列の一方の鎖の一部分と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列であり、Ｐｃは前記配列Ｐｐに実質的に相補的な核酸配列であり、Ｌは配列ＰｃとＰｐのプライマー延長配列との間の効率的な折り返しを可能にしそして折り返し部分Ｐｃの増幅を回避するように選択された非−ヌクレオチドリンカー基であり、そしてＸはエネルギー供与体又は受容体である）
により表わされる第一オリゴヌクレオチドプライマー、及び検出されるべき核酸配列の他方の鎖の一部分と実質的に相補的な第二オリゴヌクレオチドプライマーを使用し；
【０００３】
（ｂ）最終増幅サイクルの後、プライマー延長生成物をその相補的配列から分離して単鎖分子を生成せしめ；
（ｃ）前記式（Ｉ）のプライマーを含有する前記単鎖分子を、次の一般式（II）：
Ｙ−Ｐｒ （II）
【０００４】
（式中、Ｙは、式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー供与体である場合にはエネルギー受容体であり、そして式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー受容体である場合にはエネルギー供与体であり、そしてＰｒは、式（Ｉ）のプライマーを含有する増幅された単鎖分子の一部分と相補的なオリゴヌクレオチドであって、配列Ｐｃの折り返し及び前記単鎖分子への配列Ｐｃのハイブリダイゼーションの後にエネルギーの移行が行われ得る程ＸとＹとの間の短い距離を保証するように選択されたものである）
により表わされるオリゴヌクレオチドプローブにより、折り返しによる配列Ｐｃ及びＰｒ配列の前記単鎖分子へのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で処理し；そして
【０００５】
（ｄ）エネルギー移行が行われるか否かを決定する；
ことを含んで成る。
本発明はさらに、１つの核酸又は複数の核酸の混合物であってその内の少なくとも１つが特定の核酸配列を含有すると予想されるものを含有するサンプル中の少なくとも１つの該特定の核酸配列を増幅し且つ検出するためのキットに関し、このキットは、前に定義した式（Ｉ）のプライマーを含有する容器、前に定義した式（II）のプローブを含有する容器、並びにポリメラーゼ連鎖反応による増幅及び検出のための手段及び試薬を含んで成る。
【０００６】
【具体的な説明】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡ又はＲＮＡストレッチの特異的増幅のために非常に強力な方法である。この方法は、ヨーロッパ特許出願公開No. ２０１，１８４、No. ２００，３６２、及びNo. ２５８，０１７に記載されている。この技法の１つの用途は、低コピー数で存在するＤＮＡを検出可能なレベルに上げるためのＤＮＡプローブ技法においてである。
【０００７】
この方法の多くの診断的及び科学的用途が、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（編集）によるＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，米国，１９８９、並びにＭ．Ａ．Ｉｎｉｓ（編集）によるＰＣＴ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，米国，１９９０に記載されている。
【０００８】
望ましい目標は、いわゆる均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）測定方式による時間のかかる分離又は移送段階を用いないで、増幅されたＤＮＡを直接検出することである。同時に、目的はまた、ＤＮＡ診断において今なお主として使用されている放射能ラベルの代りに非放射性のレポーター系を用いることにより、この技法の用途を拡大することである。挿入化学発光性アクリジンエステルを適用するこの様な均一検出系はＡｒｎｏｌｄらによりＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１５８８（１９８９）に報告されている。
【０００９】
均一ＤＮＡ検出測定のさらなる変法が、Ｂ．Ｓ．ＲｅｃｋｍａｎｎによりＮａｃｈｒ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｌａｂ．３７，６９２−７０２（１９８９）に総説として記載されている。
時間−分離（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光測定により高感度で測定され得る非放射性ラベル分子としてのバソフェナンスロリン（ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）−ＲｕII複合体の使用が、Ｗ．ＢａｎｎｗａｒｔｈらによりＨｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７１，２０８５−２０９９（１９８８）に記載されている。
【００１０】
これらの複合体は、適当な供与体（ｄｏｎｏｒ）分子からＲｕ複合体へのエネルギー移行を可能にするラベル分子の相互作用対の部分であり得る。エネルギー移行の効率は供与体と受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）との間の距離に大きく依存するので、この様な系は分子間相互作用の研究において適用され得る。Ｒｕ複合体のための供与体分子の適当なクラスとしてルマジン（ｌｕｍａｚｉｎｅ）発色団が同定されている。
【００１１】
均一測定での例えばＤＮＡ分子の検出におけるこの供与体／受容体対の適用可能性が、ヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６、並びにＷ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ及びＦ．ＭｕｅｌｌｅｒによるＨｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ７４，１９９１−１９９９（１９９１）及び７４，２０００−２００８（１９９１）に記載されている。
【００１２】
この様な組合せにより、５′−末端においてＲｕバソフェナンスロリン複合体によりラベルされておりそしてオリゴヌクレオチド内の該Ｒｕ複合体から異る距離にルマジン色原体を有する該オリゴデオキシヌクレオチド中でエネルギー移行が検出された。さらに、１つのプローブ配列が供与体を有しそして他方が受容体を有するハイブリダイゼーション法において標的ＤＮＡ配列を検出するために相互作用ラベルのこの対が使用され得ることが示された。
【００１３】
均一ＤＮＡ検出系においてエネルギー受容体としてテルビウム錯体を用いそしてエネルギー供与体としてサリチル酸塩を用いる他の方法が、Ａ．Ｏｓｅｒ及びＧ．ＶａｌｅｔによりＡｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １０２，１１９７−１２００（１９９０）に記載されている。
引き続く検出のためにエネルギー移行を用いる均一試験方式におけるオリゴヌクレオチドの検出のための既知の方法は、相補的ＤＮＡ配列に特異的に並んでハイブリダイズする少なくとも２個のラベルされたオリゴヌクレオチドを用い、これにより２個のラベルを相互に隣り合わせに位置させる。
【００１４】
本発明の基本原理は図１に要約されている。図１は、相互作用ラベル並びに一般式（Ｉ）の折り返しプライマー及び一般式（II）のプローブを用いる、増幅されたＤＮＡの測定に関与する段階を示す。二本鎖中の相補鎖は単純化のために省略されている。
【００１５】
本発明において、増幅は２つのプライマーの組合せを用いて行うことができ、その少なくとも一方は一般式（Ｉ）のプライマーであり、これは、その部分配列Ｐｃをプライマー部分Ｐｐに折返して短い二本鎖を形成する能力のために折返しプライマーとも称される。
【００１６】
第一オリゴヌクレオチドが好ましくは酵素（ポリメラーゼ）を用いる鎖延長反応におけるプライマーとしての使用のために意図される場合は特に、オリゴヌクレオチド中の自己相補的部分は第二オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの段階において問題を生じさせる場合があることが当業界において知られている。従って、明瞭な反応のためにこれらのプライマー及びさらにプローブを最適化して、それらが前記のごとき自己相補的部分含まないようにすることが通常推奨される。
【００１７】
今や意外にも、自己相補的領域を含有するオリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応及び検出段階において有利に使用し得ることが見出された。
式（Ｉ）のプライマーの場合、３′−末端から非ヌクレオチド性リンカー基までのプライマー部分Ｐｐが、検出されるべき標的ＤＮＡ配列の増幅のための標準的プライマーを代表する。変性及びそれに続くポリメラーゼの使用の温度において、折返しプライマーの少なくとも部分は開いた形で存在し、そしてそれ故に４種類のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ及びｄＣＴＴ）又はそれらの類似体の適当な量の存在下でその鋳型依存的延長を特異的に開始することができる。
【００１８】
既知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ又はそのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ4 ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、及びサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）からのＤＮＡポリメラーゼが含まれる。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ合成を触媒するための反応条件は当業界においてよく知られている。
【００１９】
増幅生成物中にプライマーＩを導入することを許容する、鎖延長反応に基くあらゆる増幅方法を用いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅はすでに述べられている。式（Ｉ）のプライマーはまた、増幅された標的配列を製造するための他の方法においても使用することができる。例えば、プライマー（Ｉ）を第二のオリゴヌクレオチドと一緒に使用することができ、ここで、これらの両者は１つのＤＮＡ鋳型に対して相補的でありそしてそれらの３′−末端及び５′−末端が相互に直接隣接する。
【００２０】
変性、プライマーアニーリング及び３′−末端と５′−末端との連結の反復により増幅が起こる。いわゆるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）又はリガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）はさらに、Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅによりＧｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０−５６９（１９８８）中に記載されている。次に、式（Ｉ）のラベルされたプライマーを含有する増幅生成物が、次に記載する折返し片Ｐｃの近くに式（II）のラベルされたプローブをハイブリダイズさせることにより検出される。ＰＣＲによる増幅が好ましい方法である。
【００２１】
変性温度は約９０℃〜１００℃であるが、ポリメラーゼ反応の温度は通常さらに低く、そして使用されるポリメラーゼに依存する。Ｔａｑポリメラーゼの場合、温度は７０℃〜８０℃の間であり、これは、プライマー活性を阻害するであろうプライマー（Ｉ）中のＰｐへの短い配列Ｐｃの完全な内部折返しを回避するのに十分に高い温度である。増幅後及び低温において、導入されたプライマー特にその部分Ｐｃは折返され得る。
【００２２】
その３′−末端に１又は複数のエネルギー供与体分子〔式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー受容体である場合〕又はエネルギー受容体分子〔式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー供与体分子である場合〕を有しそして増幅された領域にハイブリダイズする式（II）のプローブ（検出オリゴヌクレオチド）により、その様な状況下でエネルギーの移行を可能にする折返しプライマーの５′−末端における前記供与体又は受容体間の短い距離を折返しが保証する（図１、段階ｂ）。
【００２３】
標的配列が存在しない場合、そしてそれ故にプライマーＩによって増幅されていない場合、検出オリゴマーとハイブリダイズし得るプライマー延長生成物が存在しないから、前記エネルギーの移行は不可能である。従って、増幅された標的の存在とその不存在との間の明瞭な区別が可能である。こうして、分離段階を行う必要なく均一法での増幅の直ぐ後に試験を行うことができ、そしてエネルギーの移行が増幅された標的配列の存在を示す。
【００２４】
プライマー（Ｉ）は増幅及び検出のために適当な任意の長さであることができる。プライマー領域Ｐｐは約１０〜３０ヌクレオチドの長さであるが、しかし検出されるべき配列に依存してより短く又はより長くてもよい。ヌクレオチド塩基の個々の塩基対合の安定性を考慮して、配列及び温度特異的ＰＣＲプライマーを設計するためのパラメーターは当業界において知られている。
【００２５】
本発明において使用されるプライマー部分Ｐｐは、増幅されるべき各特定の配列に「実質的に」相補的であるように選択される。プライマー部分Ｐｐは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、重合の温度においてさえそれらの対応する鎖に選択的にハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。プライマー部分Ｐｐが、増幅されるべき鎖の一方の配列とハイブリダイズするのに十分なだけ該配列に対する相補性を維持しており、そしてそれにより重合試薬により延長され得る二本鎖構造を形成するのであれば、プライマー部分Ｐｐに非相補的塩基又はより長い配列を点在させることができる。プライマー部分Ｐｃは、各場合において、Ｐｐの配列に部分的に又は完全に相補的であるように適合されるであろう。好ましくは、プライマー部分Ｐｐは鋳型の相補的配列を反映する。
【００２６】
ラベルを伴う折返し部分Ｐｃの付加はプライマー機能にとって全く無害であることが見出された。Ｐｃの配列はＰｐに対して任意の長さを有することができる。好ましくは、ＰｃはＰｐに比較して数塩基短い。このことは、より長いプライマー部分Ｐｃの場合にこの部が増幅温度において鋳型の相補的配列にＰｐより密接に結合することを排除する。追加の供与体分子が３′−末端と５′−末端との間のギャップを補うことができ、このことは、折返しプライマーＩの５′−末端が終る所からプローブ（II）が正確に始まる必要のないことを意味する。
【００２７】
さらに、より低い温度においてプローブが折返されたプライマー（Ｉ）にその先行する延長を伴わないでハイブリダイズして誤った陽性結果をもたらすことがないように、プライマー部分ＰｐはＰｃとの関係で長過ぎてはならない。例えば、プライマー部分Ｐｐは１８塩基の長さを有し、そしてＰｃ部分の１０塩基により折返される。これはまた、配列中の塩基の組成に依存する。
【００２８】
他方の（相補的）核酸配列の同時増幅のために共通に使用される第二オリゴヌクレオチドプライマー（対向プライマー）もまたラベルされてもよく、そしてプライマー（Ｉ）と同じ量又は異る量で使用されることができる。両プライマーがラベルされる場合、増幅された配列中のほとんどすべてのオリゴヌクレオチドがラベルされ、そして増幅後に検出されなければならない核酸配列の少なくとも１つの折返し部分Ｐｃの近くへのハイブリダイゼーションを可能にする少なくとも１つの３′−ラベル化プローブIIを用いて検出され得る。本発明のプライマー及び記載されるプローブの他の変更又は組合せ、例えば異ってラベルされたプライマーの使用、ＤＮＡではなくＲＮＡ増幅又は単鎖増幅は、本発明の範囲内である。
【００２９】
別の方法として、図１段階ｃに示すように、折返しオリゴマーの５′−末端に１又は複数の供与体分子を置き、そして検出オリゴマーの３′−末端に受容体分子を置くことができる。好ましくは、プライマーは５′−末端においてエネルギー供与体によりラベルされる。これは、直接励起から生ずるエネルギー受容体のバックグラウンド蛍光のため有利である。ＰＣＲにおいて、プライマーは大過剰に適用される。従って、プライマーがエネルギー受容体（例えばＲｕ複合体）によりラベルされておれば、直接励起により生ずるこの蛍光が重要となるであろう。
【００３０】
蛍光測定による供与体と受容体との間のエネルギー移行の検出は当業界において知られている方法により行うことができる。時間−分離蛍光技法の方法は例えば独出願公開No. ２６２８１５８及びヨーロッパ特許出願公開No. １７８，４５０に記載されている。
【００３１】
相互作用分子がそれらの分子の光学的性質に影響することなくプライマー又はプローブに化学的に結合され又はそれらと複合体を形成し、そしてそれらがＤＮＡの存在下で検出可能であれば、本発明において任意の組合せで相互作用分子を用いることができる。適当な相互作用分子は、グルコールオキシダーゼ／パーオキシダーゼ、フルオレッセイン／ローダミン、及びサリチル酢塩／テルビウム錯体である。供与体／受容体の組合せとして、ルマジン色原体／バソフェナンスロリン−ルテニウムII複合体が好ましい。
【００３２】
折返しプライマーはまた非ヌクレオチド性基Ｌを含有し、このものはＰｃ及びＰｐ中の相補的塩基の塩基対合を可能にし、これによってループの形成を回避する。この非ヌクレオチド性質はまた増幅工程中にこの位置でのポリメラーゼ反応の停止を導く。
【００３３】
非ヌクレオチド基Ｌは、配列Ｐｐとその相補的配列Ｐｃとの間の折返しを可能にするように選択される。この基Ｌは、ループの形成を伴わないでＰｐへのＰｃの定義された折返しを可能にする任意の種類の非ヌクレオチド性リンカーから成ることができる。好ましくは、非ヌクレオチドリンカーはプロパンジオールに由来する。さらに好ましくは、リンカー基Ｌは、１個のホスフェート基により一緒に連結されており、そしてホスフェート基を介してオリゴヌクレオチド配列Ｐｃ及びＰｐに結合している２個のプロパンジオール基から成る。最も好ましいリンカー基Ｌは次の式：
-O-P(O)2 - -O-(CH2)3-O-P(O)2 - -O-(CH2)3-O-P(O)2 - -O-
を有する。
【００３４】
この非ヌクレオチド性リンカーは、意外にも、ＰｐへのＰｃの効率的な折返しを可能にし、そして折返し部分Ｐｃの増幅を回避することが見出された。
ポリメラーゼ反応において通常のプライマーとして機能するオリゴヌクレオチド又は修飾されたプライマーもしくはプローブの部分であるオリゴヌクレオチドは、当業界において知られている方法（Ｍ．Ｊ．Ｃａｉｔ編、ＤＮＡ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＩ−Ｐｒｅｓｓ，１９８４）により合成することができる。Ｎ．Ｄ．ＳｉｎｈａらによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，４５３９−４５５７（１９８４）に記載されているようなβ−シアノエチルホスホラミダイトを用いる固相合成が好ましい。
【００３５】
基Ｌは、プライマー部分Ｐｐの固相合成の過程でホスホラミダイト〔５〕又はその類似体を用いて挿入することができる。ホスホラミダイト〔５〕の合成はＦ．ＳｅｅｌａによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，３１１３（１９８７）に記載されている。
【００３６】
【化１】
２個のこれらのアミダイト〔５〕を合成の間にオリゴヌクレオチドＰｐに加えることにより最も好ましいリンカーが得られ、このリンカーは合成の間に、式（Ｉ）のプライマーの折返し部分Ｐｃを加えるために適当なヌクレオシドホスホラミダイトにより、さらに延される。
【００３８】
プライマー又はプローブの末端の３′−又は５′−ＯＨ基において連結するために選択されたラベルは、直接的に、又はこれらのヒドロキシ基の修飾の後に、当業界において知られている方法により、−ＮＨ2 ，−ＣＯＯＨ，−ＳＨ又は他の任意の適切な基に連結することができる。
【００３９】
ラベルの取付けは、オリゴヌクレオチドがなお支持体に結合している場合、又はすでに切り離されている場合のいずれにおいても行うことができる。ラベルはまた、プライマー又はプローブの１又は複数個のヌクレオチド塩基に、それらを成長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖に付加するに先立って、例えばヌクレオシドアミダイトの形で導入することができる。Ｒｕ複合体／ルマジンラベルの場合、６，７−ジメチルルマジン−２′−デオキシリボシドのホスホラミダイト〔７〕を用いて、折返しプライマーの５′−末端又はプローブの５′−／３′−末端に導入することができる。ホスフェート基の導入のために他のルマジン誘導体又はカップリング試薬を用いることもできる。
【００４０】
【化２】
ルマジン色原体を担持するこれらの分子の１又は複数個をオリゴヌクレオチドに導入することによりエネルギー移行を増強することができる。１〜４個の連続するルマジン色原体が好ましい。オリゴヌクレオチドの３′−又は５′−末端へのリマジンリボシドの導入はヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６に記載されている。
【００４２】
ヨーロッパ特許出願公開No. ３４０，６０５及びNo. １７８，４５０に記載されているように、エネルギー受容体としての種々のＲｕ複合体を、該複合体とＤＮＡ分子との間の種々のスペーサーと共に用いることができる。折返しプライマーの５′−末端にＲｕ複合体を取り付けるため、例えば構造〔６ａ〕のホスホラミダイト又は構造〔６ｂ〕の試薬を用いることができる。好ましくは、３′−末端への導入のために誘導体〔６ｂ〕が使用される。
【００４３】
【化３】
オリゴヌクレオチドの固相合成の過程での例えばヒドロキシ基又はアミノ基へのカップリングのため、さらなる修飾を伴わないで試薬〔６ａ〕を用いることができる。
３′−末端への試薬〔６ｂ〕のカップリングは、合成のために使用される固体支持体の幾らかの修飾の後に行うことができる。ＮｅｌｓｏｎらによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，７１７９（１９８９）に記載されている化合物〔８〕から出発する一般的スキーム（スキーム１）を下に記載する。修飾された支持体〔１０〕へのＲｕ複合体誘導体〔６ｂ〕の取り付けを含むさらなる詳細は実施例２を参照のこと。
【００４５】
【化４】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに例示するが、本発明の範囲をこれにより限定するものではない。
実施例１
ルマジン及びＲｕ複合体ホスホラミダイトの合成
６，７−ジメチル−ルマジン−２′−デオキシリボシドのホスホラミダイトをヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６（１９９１年７月３１日）に記載されているようにして調製した。Ｒｕ複合体のホスホラミダイト〔６ａ〕を、Ｗ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ及びＤ．ＳｃｈｍｉｄｔによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０，１５１３−１５１６（１９８９）により記載されているようにして調製した。
【００４７】
Ｒｕ複合体誘導体〔６ｂ〕は、ヨーロッパ特許出願公開No. ３４０，６０５に、又はＷ．ＢａｎｎｗａｒｔｈらによりＨｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ １７，２０８５−２０９９（１９８８）に記載されているようにしてＲｕ複合体と活性化されたＮ−ヒドロキシサクシンイミドとの連結により調製した。Ｎ，Ｎ，Ｎ′Ｎ′−テトラメチル（サクシンイミド）ウロニウムテトラヒドロボレート（ＴＳＴＵ）を活性化剤として使用した。
【００４８】
ＴＳＴＵの合成及び使用はＲ．ＫｎｏｒｒらによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０，１９２７−１９３０（１９８２）に、及びＷ．ＢａｎｎｗａｒｔｈによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｓ ３２，１１５７−１１６０（１９９１）に記載されている。
【００４９】
１−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシ−ホスフィン）−１，３−プロパンジオール〔５〕の合成
この試薬の調製は、Ｆ．Ｓｅｅｌｅ及びＫ．ＫａｉｓｅｒによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，３１１３−３１２９（１９８７）に記載されている２段階法により１，３−プロパンジオールから出発して行った。まず、この化合物を４，４′−ジメトキシトリチル基により保護した。次に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドの存在下、（β−シアノエトキシ）ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンによりホスフィニル化して化合物〔５〕を得た。
【００５０】
実施例２
３′−Ｒｕ複合体修飾ＤＮＡの合成
３′−修飾オリゴヌクレオチドの固相合成のための修飾されたＣＰＧ支持体の合成はスキーム１（前記）に記載したようにして行った。
化合物〔８〕は、ＮｅｌｓｏｎらによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，７１７９−７１８６及び７１８７−７１９４（１９８９）に記載されている方法に従って行った。
【００５１】
次の段階において、化合物〔８〕（１０mmol，６．１６ｇ）を無水ピリジンから３回蒸発させた。次に、これを６０mlの無水ピリジンに溶解し、そして２５mmol（２．５０ｇ）の無水コハク酸及び１０mmol（１．２２ｇ）の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加し、そしてアルゴンのもとで撹拌した。４時間後、反応を終えた（ＴＬＣ）。反応混合物を２００mlのジエチルエーテルに入れ、そして飽和食塩水により４回抽出した。
【００５２】
有機層をＮａ2 ＳＯ4 で乾燥し、そして蒸発させ、こうして６ｇの油状物を得た。１５０ｇのシリカゲル（０．００３〜０．０４０nm、メルク）上での、１０００mlの混合ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ／ピリジン（９４：５：１；ｖ／ｖ）、５００mlのＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ／ピリジン（９２：７：１）及び５００mlのＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ／ピリジン（８９：１０：１）を用いての短カラムクロマトグラフィー（ＣＣ）による精製を行った。純粋な画分を集め、そしてｎ−ペンタンから沈澱させて２．３ｇの純粋な化合物〔９〕を得た。
【００５３】
融点８７〜８９℃。分析：Ｃ43Ｈ41ＮＯ9 ・０．２ｎ−ペンタンの計算値：Ｃ７２．３７，Ｈ ５．９９，Ｎ １．９２；測定値：Ｃ ７２．６０，Ｈ ６．１４，Ｎ １．９４。 1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：２．６４（ｓ，ＯＣＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯ）；３．０３−３．５０（２ｍ，ＣＨ2 −ＣＨ−ＣＨ2 ）；３．５０−３．６５（ｍ，ＣＨ2 −ＣＨ−ＣＨ2 ）；３．７４（ｓ，２ＯＣＨ3 ）；４．１９（ｔ，ＣＨ2 −ＣＨ）；４．３４（ｄ，ＣＨ2 −ＣＨ）；６．８１（ｄ，４ａｒｏｍ．Ｈ，Ｃ6 Ｈ4 ）；７．１５−７．３７（ｍ，９ａｒｏｍ．Ｈ，Ｃ6 Ｈ5 ，Ｃ6 Ｈ4 ）；７．３９（ｔ，フルオレニル）；７．５１（ｄ，フルオレニル）；７．７６（ｄ，フルオレニル）。
【００５４】
官能化された支持体〔１０〕の調製：ＣＰＧ−支持体（Ｐｉｅｒｃｅ）を無水ピリジンから蒸発させた。次にこれを１０mlの無水ピリジンに溶解し、そして０．６０mmol（４３０mg）の〔９〕並びに３mmol（８８０mg）の１−（メシチレン−２−スルホニル１−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）及び０．３mlのＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）を加え、そしてこの懸濁液を室温にて時々撹拌しながら反応させた。
【００５５】
２時間後、それを濾過し、そしてピリジン、ＤＭＦ及びエーテルにより次々と洗浄した。この支持体に、１％ ＤＭＡＰを含有するＡｃ2 Ｏ／ピリジン（１／１０；ｖ／ｖ）の混合物１０mlを加えた。１時間後、それを濾過し、そして支持体をピリジン、ＤＭＦ、エタノール及びエーテルで洗浄した。〔１０〕の官能化の程度を、ジメトキシトリチル陽イオンの光学測定により（３０．５mmol／ｇ）そしてフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基の開裂及びそれに続く３００nmでの光学測定（３０．１mmol／ｇ）により決定した。
【００５６】
支持体〔１０〕上３′−アミノ修飾ＤＮＡの調製：１．５mmolの支持体〔１０〕から始めて合成機上で合成を行った。各サイクルの間に、１０倍過剰量の対応するホスホラミダイトを適用した。合成の後、支持体をアセトニトリル及びエーテルで洗浄し、そして乾燥させた。次に、２０mgの支持体を、密閉したエッペンドルフ管内で７００μｌの濃アンモニアにより６７℃にて１．５時間処理した。
【００５７】
懸濁液を濾過し、そして濾液を乾燥させた。得られたペレットを３００μｌの８０％酢酸に溶解し、そして２時間後７００μｌのエーテルを加えてＤＮＡを沈澱させた。遠心分離の後、ペレットを水に溶解し、そして５００mmolのＫＣｌの添加の後、これを２ｌの水に対して透析した（分子量１０００排除）。ＵＶ吸収は５３ODユニットのアミノ修飾ＤＮＡの収量を示し、これをそのまま、Ｒｕ複合体への結合のために用いた。
【００５８】
アミノ修飾ＤＮＡへの〔６ｂ〕の結合：エッペンドルフ管内で、２７．５ODユニットの３′−アミノ修飾ＤＮＡ及び４mmol（３mg）の〔６ｂ〕を、２００μｌのＤＭＦ、２００μｌのジオキサン、２００μｌの水及び５μｌのヒューニッヒ（Ｈｕｅｎｉｇ）塩基の混合物中で反応させた。この混合物を暗所で振とうしながら１６時間反応させた。スピード真空濃縮器中で乾燥させ、そして５００μｌの水に溶解した。この溶液を５００μｌのＣＨＣｌ3 で３回抽出して過剰のＲｕ複合体を除去した。ポリアクリルアミド電気泳動及びそれに続く電気溶出により沈澱を行った。
【００５９】
実施例３
非ヌクレオチド性リンカー及び／又は３′−もしくは５′−修飾を有するオリゴヌクレオチドの合成
修飾を伴わないオリゴヌクレオチドを、調節された孔のガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ，Ｐｉｅｒｃｅ）上で、そして適切なビルディングブロックのβ−シアノエチルホスホラミダイトを適用して調製した。
【００６０】
３′−ルマジン修飾オリゴヌクレオチドを、ヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６に記載されているようにして、ルマジン−２′−デオキシリボシド修飾ＣＰＧ−支持体の延長により調製した。この出願はまた、５′−ルマジン及び５′−Ｒｕ複合体−修飾オリゴヌクレオチドの合成において使用するための方法及び試薬も記載している。
【００６１】
ホスフェート基により分離された２個のプロパンジオール基から成る非ヌクレオチド性リンカー基を、固相合成の間に、対応するホスホラミダイト〔５〕により挿入した。このアミダイトの結合を、１０倍過剰量及び３分間の結合時間を用いて、活性化剤としてのテトラゾールと共に２回行った。
３′−末端へのＲｕ複合体の付加は、実施例２に記載したオリゴヌクレオチドの合成及び脱保護の後にＲｕ複合体誘導体〔６ｂ〕を用いて行った。
【００６２】
実施例４
一般式（Ｉ）のプライマーを用いてのポリメラーゼ連鎖反応
幾つかのオリゴヌクレオチドを合成し、そしてホリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして作用するそれらの能力について試験した。増幅のために選択されたＤＮＡ断片はＨＩＶ−１のｇａｇ領域の一部分である。５′−末端にＲｕ複合体を有する〔１６〕か又は有しない〔１４，１５〕常用のプライマー並びに一般式（Ｉ）の修飾プライマー〔１７，１８〕を、すでに記載されている方法により合成した。
プライマーは次の特異的配列を有していた。
【００６３】
【化５】
各場合において、相補鎖の同時増幅のために使用した第二プライマー又は対向プライマーは次の配列を有していた。
【００６５】
【化６】
これらのオリゴヌクレオチドは、Ｃ．Ｈ．Ｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，２９５−２９７（１９８８）の表２にすでに記載されているプライマー及びプローブ配列に由来した。
増幅反応当り１０００コピーのＨＩＶプラスミドＤＮＡが適用された。プライマーは１００pMで過剰に使用した。〔１９〕の場合、５０pMが適用された。ＨＩＶ ＤＮＡを２連で増幅し、そしてＰＣＲ陰性対照を導入した。プライマー〔１４〕及び〔１９〕を用いての増幅を陽性対照として用いた。
【００６７】
反応混合物当り１００μｌの全体積のため、５０μｌのマスター混合物に５０μｌのＨＩＶ ＤＮＡを加えた。
マスター混合物：
蒸留水 ２７．５μｌ
１０×Ｔａｑ緩衝液 １０．０μｌ
８mM ｄＮＴＰ １０．０μｌ
１００mMプライマー（１４−１８） ３．０μｌ
５０mMプライマー１９ ３．０μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌ
【００６８】
増幅されたＤＮＡの効率及び均一性を、サザンハイブリダイゼーション（Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９８，５０３，１９７５）により、放射性ラベルされたプローブ５′−ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＴＡ Ｃ−３′を用いて試験した。ハイブリダイゼーションは、リン酸緩衝液（１０mM無機リン酸：１Ｍ ＮａＣｌ，pH７．０）中で、等モル量のオリゴヌクレオチドを用いてよく行われた。５′−末端にＲｕ複合体を有する最も短い折返しプライマーさえ、効率において標準的非修飾プライマーに匹敵する特異的増幅を導いた。
【００６９】
実施例５
ハイブリダイゼーション及びエネルギー移行を介しての延長された折返しプライマーの検出
一般式（Ｉ）の折返しプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応におけるその延長後に、一般式（II）のオリゴヌクレオチドプライマーによる引き続く検出のための鋳型として機能し得るか否かが決定された。５′−Ｒｕ−複合体−ラベル化オリゴヌクレオチド〔１〕は、３′−ルマジン−ラベル化プローブ〔２ａ〕，〔２ｂ〕及び〔２ｄ〕並びに陰性プローブ〔２ｃ〕のための鋳型として機能する構造（Ｉ）の延長されたプライマーのための合成モドル化合物として役立つ。
【００７０】
【化７】
ハイブリダイゼーションは、リン酸緩衝液（１０mM無機リン酸塩；１Ｍ ＮａＣｌ，pH７．０）中で等モル比のオリゴヌクレオチドを用いてよく行われた。
蛍光測定を、ＳＬＭ Ｍｏｄｅｌ ４０４８Ｓ蛍光分光計において行った。励起波長及び放射波長はそれぞれ３３７nm及び６２０nmであった。ハイブリドの濃度はサンプル体積４００μｌのために１．３×１０-6Ｍであった。
【００７２】
表１はエネルギー移行測定の結果を示す。予想通り、プローブ〔２ａ〕及び〔２ｂ〕の場合結果は陽性であり、そしてプローブ〔２ｃ〕及び〔２ｄ〕の場合陰性であった。
エネルギー移行から蛍光（ＩＦ3 ）は、６２０nmにおける測定された蛍光（ＩＦ）から直接励起によるＲｕ複合体の蛍光及び６２０nmにおけるルマジン色原体の蛍光（ＩＦ1 ）（無視することができる）を差し引いた差として定義された。従って、エネルギー移行の強度についての式はＩＦ3 ＝ＩＦ−ＩＦ2 となる。単純化のため、表１には、直接励起によるＲｕ複合体の蛍光強度（ＩＦ2 ）に対する６２０nmでの測定された蛍光強度ＩＦの比率を示す。
５′−リマジン−ラベルプライマー及び３′−Ｒｕ複合体−ラベルプローブを用いる逆エネルギー移行系を化合物〔１１〕，〔１２〕及び〔１３〕を用いて研究した。
【００７４】
【化８】
プライマー／プローブ系〔１１〕／〔１２〕（エネルギー移行を示す）及びエネルギー移行を伴わない陰性対照としての〔１３〕／〔１２〕を用いて得た結果は、エネルギー移行の効率はやや低かった（データーは示してない）が、この組合せの有用性を確認した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の測定の原理を示す。ａ）は変性及び増幅段階を示し、ｂ）及びｃ）検出段階を示す。
Claims (13)
- サンプル中の少なくとも１つの特定の核酸配列の増幅及び検出のための方法であって、該サンプルは１つの核酸又は複数の核酸の混合物であってその少なくとも１つが前記特定の核酸配列を含有すると予想されるものであり、この方法は、
（ａ）検出されるべき核酸配列を鎖延長反応により増幅し、ここでこの鎖延長反応は、次の一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ｐｃ−Ｌ−Ｐｐ （Ｉ）
（式中、Ｐｐは、検出されるべき核酸配列の一方の鎖の一部分と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列であり、Ｐｃは該配列Ｐｐに実質的に相補的な核酸配列であり、Ｌは配列ＰｃとＰｐのプライマー延長配列との間の効率的な折り返しを可能にしそして折り返し部分Ｐｃの増幅を回避するように選択された非−ヌクレオチドリンカー基であり、そしてＸはエネルギー供与体又は受容体である）により表わされる第一オリゴヌクレオチドプライマー、及び検出されるべき核酸配列の他方の鎖の一部分と実質的に相補的な第二オリゴヌクレオチドプライマーを使用し；
（ｂ）最終増幅サイクルの後、プライマー延長生成物をその相補的配列から分離して単鎖分子を生成せしめ；
（ｃ）前記式（Ｉ）のプライマーを含有する前記単鎖分子を、次の一般式（II）：
Ｙ−Ｐｒ （II）
（式中、Ｙは、式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー供与体である場合にはエネルギー受容体であり、そして式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー受容体である場合にはエネルギー供与体であり、そしてＰｒは、式（Ｉ）のプライマーを含有する増幅された単鎖分子の一部分と相補的なオリゴヌクレオチドであって、配列Ｐｃの折り返し及び前記単鎖分子への配列Ｐｃのハイブリダイゼーションの後にエネルギーの移行が行われ得る程ＸとＹとの間の短い距離を保証するように選択されたものである）
により表わされるオリゴヌクレオチドプローブにより、折り返しによる配列Ｐｃ及びＰｒ配列の前記単鎖分子へのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で処理し；そして
（ｄ）エネルギー移行が行われるか否かを決定する；
ことを含んで成る方法。 - Ｘがエネルギー供与体であり、そしてＹがエネルギー受容体である、請求項１に記載の方法。
- Ｘがエネルギー受容体であり、そしてＹがエネルギー供与体である請求項１に記載の方法。
- 前記エネルギー供与体がルマジン発色団であり、そして前記エネルギー受容体がバソフェナンスロリン−ルテニウム−II−複合体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- Ｌが、１個のホスフェート基により一緒に連結されそしてオリゴヌクレオチドＰｃ及びＰｐにホスフェート基を介して結合されている２個のプロパンジオールユニットから成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記鎖延長反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 次の一般式（Ｉ）
Ｘ−Ｐｃ−Ｌ−Ｐｐ （Ｉ）
（式中、Ｐｐは、検出されるべき核酸配列の一方の鎖の一部分と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列であり、Ｐｃは該配列Ｐｐに実質的に相補的な核酸配列であり、Ｌは配列ＰｃとＰｐのプライマー延長配列との間の効率的な折り返しを可能にしそして折り返し部分Ｐｃの増幅を回避するように選択された非−ヌクレオチドリンカー基であり、そしてＸはエネルギー供与体又は受容体である）により表わされるオリゴヌクレオチドプライマー。 - Ｘがエネルギー供与体である、請求項７に記載のプライマー。
- Ｘがエネルギー受容体である、請求項７に記載のプライマー。
- Ｘがルマジン発色団である請求項７又は８に記載のプライマー。
- Ｘがバソフェナンスロリン−ルテニウム−II−複合体である、請求項７又は９に記載のプライマー。
- Ｌが、１個のホスフェート基により一緒に連結されそしてオリゴヌクレオチド配列Ｐｃ及びＰｐにホスフェート基を介して結合されている２個のプロパンジオールユニットから成る、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のプライマー。
- １つの核酸又は複数の核酸の混合物であってその内の少なくとも１つが特定の核酸配列を含有すると予想されるものを含有するサンプル中の少なくとも１つの該特定の核酸配列を増幅し且つ検出するためのキットであって、請求項７〜１２のいずれか１項において定義した式（Ｉ）のプライマーを含有する容器、請求項１において定義した式（II）のプローブを含有する容器、並びにポリメラーゼ連鎖反応による増幅及び検出のための手段及び試薬を含んで成るキット。
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