JPH067199A - 特定の核酸の検出方法 - Google Patents

特定の核酸の検出方法

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JPH067199A JP5061538A JP6153893A JPH067199A JP H067199 A JPH067199 A JP H067199A JP 5061538 A JP5061538 A JP 5061538A JP 6153893 A JP6153893 A JP 6153893A JP H067199 A JPH067199 A JP H067199A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 鋳型依存的プライマー延長反応とエネルギー
移行とを組合わせた新規な核酸配列検出系を提供する。 【構成】 検出されるべき塩基配列に相補的な部分Ｐｐ
とＰｐに対して相補的部分Ｐｃとこれを折り返す部分と
から成るプライマー（Ｉ）と、対向プライマー（II）と
を用いて検出されるべき塩基配列を増幅し、プライマー
（Ｉ）に付加されたエネルギー供与体又は受容体と、プ
ローブに付加されたエネルギー受容体又は供与体との間
のエネルギー移行を検出することにより、提出されるべ
き塩基配列の存否を決定する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の概要】本発明は、サンプル中の少なくとも１つ
の特定の核酸配列の増幅及び検出のための方法に関する
ものであり、該サンプルは１つの核酸又は複数の核酸の
混合物であってその少なくとも１つが前記特定の核酸配
列を含有すると予想されるものであり、この方法は、
【０００２】（ａ）検出されるべき核酸配列を鎖延長反
応により増幅し、ここでこの鎖延長反応は、次の一般式
（Ｉ）： Ｘ−Ｐｃ−Ｌ−Ｐｐ （Ｉ） （式中、Ｐｐは、検出されるべき核酸配列の一方の鎖の
一部分と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列であ
り、Ｐｃは前記配列Ｐｐに実質的に相補的な核酸配列で
あり、Ｌは配列ＰｃとＰｐのプライマー延長配列との間
の効率的な折り返しを可能にしそして折り返し部分Ｐｃ
の増幅を回避するように選択された非−ヌクレオチドリ
ンカー基であり、そしてＸはエネルギー供与体又は受容
体である）により表わされる第一オリゴヌクレオチドプ
ライマー、及び検出されるべき核酸配列の他方の鎖の一
部分と実質的に相補的な第二オリゴヌクレオチドプライ
マーを使用し；
【０００３】（ｂ）最終増幅サイクルの後、プライマー
延長生成物をその相補的配列から分離して単鎖分子を生
成せしめ； （ｃ）前記式（Ｉ）のプライマーを含有する前記単鎖分
子を、次の一般式（II）： Ｙ−Ｐｒ （II）
【０００４】（式中、Ｙは、式（Ｉ）のプライマー中の
Ｘがエネルギー供与体である場合にはエネルギー受容体
であり、そして式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギ
ー受容体である場合にはエネルギー供与体であり、そし
てＰｒは、式（Ｉ）のプライマーを含有する増幅された
単鎖分子の一部分と相補的なオリゴヌクレオチドであっ
て、配列Ｐｃの折り返し及び前記単鎖分子への配列Ｐｃ
のハイブリダイゼーションの後にエネルギーの移行が行
われ得る程ＸとＹとの間の短い距離を保証するように選
択されたものである）により表わされるオリゴヌクレオ
チドプローブにより、折り返しによる配列Ｐｃ及びＰｒ
配列の前記単鎖分子へのハイブリダイゼーションを可能
にする条件下で処理し；そして
【０００５】（ｄ）エネルギー移行が行われるか否かを
決定する；ことを含んで成る。本発明はさらに、１つの
核酸又は複数の核酸の混合物であってその内の少なくと
も１つが特定の核酸配列を含有すると予想されるものを
含有するサンプル中の少なくとも１つの該特定の核酸配
列を増幅し且つ検出するためのキットに関し、このキッ
トは、前に定義した式（Ｉ）のプライマーを含有する容
器、前に定義した式（II）のプローブを含有する容器、
並びにポリメラーゼ連鎖反応による増幅及び検出のため
の手段及び試薬を含んで成る。
【０００６】
【具体的な説明】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤ
ＮＡ又はＲＮＡストレッチの特異的増幅のために非常に
強力な方法である。この方法は、ヨーロッパ特許出願公
開No. ２０１，１８４、No. ２００，３６２、及びNo.
２５８，０１７に記載されている。この技法の１つの用
途は、低コピー数で存在するＤＮＡを検出可能なレベル
に上げるためのＤＮＡプローブ技法においてである。
【０００７】この方法の多くの診断的及び科学的用途
が、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（編集）によるＰＣＲ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，米
国，１９８９、並びにＭ．Ａ．Ｉｎｉｓ（編集）による
ＰＣＴ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，米国，１９９０に記載さ
れている。
【０００８】望ましい目標は、いわゆる均一（ｈｏｍｏ
ｇｅｎｅｏｕｓ）測定方式による時間のかかる分離又は
移送段階を用いないで、増幅されたＤＮＡを直接検出す
ることである。同時に、目的はまた、ＤＮＡ診断におい
て今なお主として使用されている放射能ラベルの代りに
非放射性のレポーター系を用いることにより、この技法
の用途を拡大することである。挿入化学発光性アクリジ
ンエステルを適用するこの様な均一検出系はＡｒｎｏｌ
ｄらによりＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３
５，１５８８（１９８９）に報告されている。
【０００９】均一ＤＮＡ検出測定のさらなる変法が、
Ｂ．Ｓ．ＲｅｃｋｍａｎｎによりＮａｃｈｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｔｅｃｈ．Ｌａｂ．３７，６９２−７０２（１９８
９）に総説として記載されている。時間−分離（ｔｉｍ
ｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光測定により高感度で測定さ
れ得る非放射性ラベル分子としてのバソフェナンスロリ
ン（ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）−Ｒｕ
II複合体の使用が、Ｗ．ＢａｎｎｗａｒｔｈらによりＨ
ｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７１，２０８５−２０９
９（１９８８）に記載されている。
【００１０】これらの複合体は、適当な供与体（ｄｏｎ
ｏｒ）分子からＲｕ複合体へのエネルギー移行を可能に
するラベル分子の相互作用対の部分であり得る。エネル
ギー移行の効率は供与体と受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）
との間の距離に大きく依存するので、この様な系は分子
間相互作用の研究において適用され得る。Ｒｕ複合体の
ための供与体分子の適当なクラスとしてルマジン（ｌｕ
ｍａｚｉｎｅ）発色団が同定されている。
【００１１】均一測定での例えばＤＮＡ分子の検出にお
けるこの供与体／受容体対の適用可能性が、ヨーロッパ
特許出願公開No. ４３９，０３６、並びにＷ．Ｂａｎｎ
ｗａｒｔｈ及びＦ．ＭｕｅｌｌｅｒによるＨｅｌｖｅｔ
ｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ７４，１９９１−
１９９９（１９９１）及び７４，２０００−２００８
（１９９１）に記載されている。
【００１２】この様な組合せにより、５′−末端におい
てＲｕバソフェナンスロリン複合体によりラベルされて
おりそしてオリゴヌクレオチド内の該Ｒｕ複合体から異
る距離にルマジン色原体を有する該オリゴデオキシヌク
レオチド中でエネルギー移行が検出された。さらに、１
つのプローブ配列が供与体を有しそして他方が受容体を
有するハイブリダイゼーション法において標的ＤＮＡ配
列を検出するために相互作用ラベルのこの対が使用され
得ることが示された。
【００１３】均一ＤＮＡ検出系においてエネルギー受容
体としてテルビウム錯体を用いそしてエネルギー供与体
としてサリチル酸塩を用いる他の方法が、Ａ．Ｏｓｅｒ
及びＧ．ＶａｌｅｔによりＡｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈ
ｅｍｉｅ １０２，１１９７−１２００（１９９０）に
記載されている。引き続く検出のためにエネルギー移行
を用いる均一試験方式におけるオリゴヌクレオチドの検
出のための既知の方法は、相補的ＤＮＡ配列に特異的に
並んでハイブリダイズする少なくとも２個のラベルされ
たオリゴヌクレオチドを用い、これにより２個のラベル
を相互に隣り合わせに位置させる。
【００１４】本発明の基本原理は図１に要約されてい
る。図１は、相互作用ラベル並びに一般式（Ｉ）の折り
返しプライマー及び一般式（II）のプローブを用いる、
増幅されたＤＮＡの測定に関与する段階を示す。二本鎖
中の相補鎖は単純化のために省略されている。
【００１５】本発明において、増幅は２つのプライマー
の組合せを用いて行うことができ、その少なくとも一方
は一般式（Ｉ）のプライマーであり、これは、その部分
配列Ｐｃをプライマー部分Ｐｐに折返して短い二本鎖を
形成する能力のために折返しプライマーとも称される。
【００１６】第一オリゴヌクレオチドが好ましくは酵素
（ポリメラーゼ）を用いる鎖延長反応におけるプライマ
ーとしての使用のために意図される場合は特に、オリゴ
ヌクレオチド中の自己相補的部分は第二オリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションの段階において問題を
生じさせる場合があることが当業界において知られてい
る。従って、明瞭な反応のためにこれらのプライマー及
びさらにプローブを最適化して、それらが前記のごとき
自己相補的部分含まないようにすることが通常推奨され
る。
【００１７】今や意外にも、自己相補的領域を含有する
オリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応及び検出段
階において有利に使用し得ることが見出された。式
（Ｉ）のプライマーの場合、３′−末端から非ヌクレオ
チド性リンカー基までのプライマー部分Ｐｐが、検出さ
れるべき標的ＤＮＡ配列の増幅のための標準的プライマ
ーを代表する。変性及びそれに続くポリメラーゼの使用
の温度において、折返しプライマーの少なくとも部分は
開いた形で存在し、そしてそれ故に４種類のデオキシリ
ボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＡＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ及びｄＣＴＴ）又はそれらの類似体の適当
な量の存在下でその鋳型依存的延長を特異的に開始する
ことができる。
【００１８】既知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ又はその
Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔ4 ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、サームス・サーモフィルス（Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＴｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼ、及びサーモコッカス・リトラリ
ス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）
からのＤＮＡポリメラーゼが含まれる。これらのＤＮＡ
ポリメラーゼを用いてＤＮＡ合成を触媒するための反応
条件は当業界においてよく知られている。
【００１９】増幅生成物中にプライマーＩを導入するこ
とを許容する、鎖延長反応に基くあらゆる増幅方法を用
いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よる増幅はすでに述べられている。式（Ｉ）のプライマ
ーはまた、増幅された標的配列を製造するための他の方
法においても使用することができる。例えば、プライマ
ー（Ｉ）を第二のオリゴヌクレオチドと一緒に使用する
ことができ、ここで、これらの両者は１つのＤＮＡ鋳型
に対して相補的でありそしてそれらの３′−末端及び
５′−末端が相互に直接隣接する。
【００２０】変性、プライマーアニーリング及び３′−
末端と５′−末端との連結の反復により増幅が起こる。
いわゆるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）又はリガーゼ増幅
反応（ＬＡＲ）はさらに、Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅによ
りＧｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０−５６９（１９８８）
中に記載されている。次に、式（Ｉ）のラベルされたプ
ライマーを含有する増幅生成物が、次に記載する折返し
片Ｐｃの近くに式（II）のラベルされたプローブをハイ
ブリダイズさせることにより検出される。ＰＣＲによる
増幅が好ましい方法である。
【００２１】変性温度は約９０℃〜１００℃であるが、
ポリメラーゼ反応の温度は通常さらに低く、そして使用
されるポリメラーゼに依存する。Ｔａｑポリメラーゼの
場合、温度は７０℃〜８０℃の間であり、これは、プラ
イマー活性を阻害するであろうプライマー（Ｉ）中のＰ
ｐへの短い配列Ｐｃの完全な内部折返しを回避するのに
十分に高い温度である。増幅後及び低温において、導入
されたプライマー特にその部分Ｐｃは折返され得る。
【００２２】その３′−末端に１又は複数のエネルギー
供与体分子〔式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー
受容体である場合〕又はエネルギー受容体分子〔式
（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー供与体分子であ
る場合〕を有しそして増幅された領域にハイブリダイズ
する式（II）のプローブ（検出オリゴヌクレオチド）に
より、その様な状況下でエネルギーの移行を可能にする
折返しプライマーの５′−末端における前記供与体又は
受容体間の短い距離を折返しが保証する（図１、段階
ｂ）。
【００２３】標的配列が存在しない場合、そしてそれ故
にプライマーＩによって増幅されていない場合、検出オ
リゴマーとハイブリダイズし得るプライマー延長生成物
が存在しないから、前記エネルギーの移行は不可能であ
る。従って、増幅された標的の存在とその不存在との間
の明瞭な区別が可能である。こうして、分離段階を行う
必要なく均一法での増幅の直ぐ後に試験を行うことがで
き、そしてエネルギーの移行が増幅された標的配列の存
在を示す。
【００２４】プライマー（Ｉ）は増幅及び検出のために
適当な任意の長さであることができる。プライマー領域
Ｐｐは約１０〜３０ヌクレオチドの長さであるが、しか
し検出されるべき配列に依存してより短く又はより長く
てもよい。ヌクレオチド塩基の個々の塩基対合の安定性
を考慮して、配列及び温度特異的ＰＣＲプライマーを設
計するためのパラメーターは当業界において知られてい
る。
【００２５】本発明において使用されるプライマー部分
Ｐｐは、増幅されるべき各特定の配列に「実質的に」相
補的であるように選択される。プライマー部分Ｐｐは鋳
型の正確な配列を反映する必要はないが、重合の温度に
おいてさえそれらの対応する鎖に選択的にハイブリダイ
ズするために十分に相補的でなければならない。プライ
マー部分Ｐｐが、増幅されるべき鎖の一方の配列とハイ
ブリダイズするのに十分なだけ該配列に対する相補性を
維持しており、そしてそれにより重合試薬により延長さ
れ得る二本鎖構造を形成するのであれば、プライマー部
分Ｐｐに非相補的塩基又はより長い配列を点在させるこ
とができる。プライマー部分Ｐｃは、各場合において、
Ｐｐの配列に部分的に又は完全に相補的であるように適
合されるであろう。好ましくは、プライマー部分Ｐｐは
鋳型の相補的配列を反映する。
【００２６】ラベルを伴う折返し部分Ｐｃの付加はプラ
イマー機能にとって全く無害であることが見出された。
Ｐｃの配列はＰｐに対して任意の長さを有することがで
きる。好ましくは、ＰｃはＰｐに比較して数塩基短い。
このことは、より長いプライマー部分Ｐｃの場合にこの
部が増幅温度において鋳型の相補的配列にＰｐより密接
に結合することを排除する。追加の供与体分子が３′−
末端と５′−末端との間のギャップを補うことができ、
このことは、折返しプライマーＩの５′−末端が終る所
からプローブ（II）が正確に始まる必要のないことを意
味する。
【００２７】さらに、より低い温度においてプローブが
折返されたプライマー（Ｉ）にその先行する延長を伴わ
ないでハイブリダイズして誤った陽性結果をもたらすこ
とがないように、プライマー部分ＰｐはＰｃとの関係で
長過ぎてはならない。例えば、プライマー部分Ｐｐは１
８塩基の長さを有し、そしてＰｃ部分の１０塩基により
折返される。これはまた、配列中の塩基の組成に依存す
る。
【００２８】他方の（相補的）核酸配列の同時増幅のた
めに共通に使用される第二オリゴヌクレオチドプライマ
ー（対向プライマー）もまたラベルされてもよく、そし
てプライマー（Ｉ）と同じ量又は異る量で使用されるこ
とができる。両プライマーがラベルされる場合、増幅さ
れた配列中のほとんどすべてのオリゴヌクレオチドがラ
ベルされ、そして増幅後に検出されなければならない核
酸配列の少なくとも１つの折返し部分Ｐｃの近くへのハ
イブリダイゼーションを可能にする少なくとも１つの
３′−ラベル化プローブIIを用いて検出され得る。本発
明のプライマー及び記載されるプローブの他の変更又は
組合せ、例えば異ってラベルされたプライマーの使用、
ＤＮＡではなくＲＮＡ増幅又は単鎖増幅は、本発明の範
囲内である。
【００２９】別の方法として、図１段階ｃに示すよう
に、折返しオリゴマーの５′−末端に１又は複数の供与
体分子を置き、そして検出オリゴマーの３′−末端に受
容体分子を置くことができる。好ましくは、プライマー
は５′−末端においてエネルギー供与体によりラベルさ
れる。これは、直接励起から生ずるエネルギー受容体の
バックグラウンド蛍光のため有利である。ＰＣＲにおい
て、プライマーは大過剰に適用される。従って、プライ
マーがエネルギー受容体（例えばＲｕ複合体）によりラ
ベルされておれば、直接励起により生ずるこの蛍光が重
要となるであろう。
【００３０】蛍光測定による供与体と受容体との間のエ
ネルギー移行の検出は当業界において知られている方法
により行うことができる。時間−分離蛍光技法の方法は
例えば独出願公開No. ２６２８１５８及びヨーロッパ特
許出願公開No. １７８，４５０に記載されている。
【００３１】相互作用分子がそれらの分子の光学的性質
に影響することなくプライマー又はプローブに化学的に
結合され又はそれらと複合体を形成し、そしてそれらが
ＤＮＡの存在下で検出可能であれば、本発明において任
意の組合せで相互作用分子を用いることができる。適当
な相互作用分子は、グルコールオキシダーゼ／パーオキ
シダーゼ、フルオレッセイン／ローダミン、及びサリチ
ル酢塩／テルビウム錯体である。供与体／受容体の組合
せとして、ルマジン色原体／バソフェナンスロリン−ル
テニウムII複合体が好ましい。
【００３２】折返しプライマーはまた非ヌクレオチド性
基Ｌを含有し、このものはＰｃ及びＰｐ中の相補的塩基
の塩基対合を可能にし、これによってループの形成を回
避する。この非ヌクレオチド性質はまた増幅工程中にこ
の位置でのポリメラーゼ反応の停止を導く。
【００３３】非ヌクレオチド基Ｌは、配列Ｐｐとその相
補的配列Ｐｃとの間の折返しを可能にするように選択さ
れる。この基Ｌは、ループの形成を伴わないでＰｐへの
Ｐｃの定義された折返しを可能にする任意の種類の非ヌ
クレオチド性リンカーから成ることができる。好ましく
は、非ヌクレオチドリンカーはプロパンジオールに由来
する。さらに好ましくは、リンカー基Ｌは、１個のホス
フェート基により一緒に連結されており、そしてホスフ
ェート基を介してオリゴヌクレオチド配列Ｐｃ及びＰｐ
に結合している２個のプロパンジオール基から成る。最
も好ましいリンカー基Ｌは次の式： -O-P(O)2 - -O-(CH2)3-O-P(O)2 - -O-(CH2)3-O-P(O)2 - -O- を有する。
【００３４】この非ヌクレオチド性リンカーは、意外に
も、ＰｐへのＰｃの効率的な折返しを可能にし、そして
折返し部分Ｐｃの増幅を回避することが見出された。ポ
リメラーゼ反応において通常のプライマーとして機能す
るオリゴヌクレオチド又は修飾されたプライマーもしく
はプローブの部分であるオリゴヌクレオチドは、当業界
において知られている方法（Ｍ．Ｊ．Ｃａｉｔ編、ＤＮ
Ａ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ
ｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＩ−Ｐｒｅｓｓ，１９８４）によ
り合成することができる。Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａらにより
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １
２，４５３９−４５５７（１９８４）に記載されている
ようなβ−シアノエチルホスホラミダイトを用いる固相
合成が好ましい。
【００３５】基Ｌは、プライマー部分Ｐｐの固相合成の
過程でホスホラミダイト〔５〕又はその類似体を用いて
挿入することができる。ホスホラミダイト〔５〕の合成
はＦ．ＳｅｅｌａによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，３１１３（１９８７）に記載
されている。
【００３６】
【化１】
【００３７】２個のこれらのアミダイト〔５〕を合成の
間にオリゴヌクレオチドＰｐに加えることにより最も好
ましいリンカーが得られ、このリンカーは合成の間に、
式（Ｉ）のプライマーの折返し部分Ｐｃを加えるために
適当なヌクレオシドホスホラミダイトにより、さらに延
される。
【００３８】プライマー又はプローブの末端の３′−又
は５′−ＯＨ基において連結するために選択されたラベ
ルは、直接的に、又はこれらのヒドロキシ基の修飾の後
に、当業界において知られている方法により、−Ｎ
Ｈ2 ，−ＣＯＯＨ，−ＳＨ又は他の任意の適切な基に連
結することができる。
【００３９】ラベルの取付けは、オリゴヌクレオチドが
なお支持体に結合している場合、又はすでに切り離され
ている場合のいずれにおいても行うことができる。ラベ
ルはまた、プライマー又はプローブの１又は複数個のヌ
クレオチド塩基に、それらを成長しつつあるオリゴヌク
レオチド鎖に付加するに先立って、例えばヌクレオシド
アミダイトの形で導入することができる。Ｒｕ複合体／
ルマジンラベルの場合、６，７−ジメチルルマジン−
２′−デオキシリボシドのホスホラミダイト〔７〕を用
いて、折返しプライマーの５′−末端又はプローブの
５′−／３′−末端に導入することができる。ホスフェ
ート基の導入のために他のルマジン誘導体又はカップリ
ング試薬を用いることもできる。
【００４０】
【化２】
【００４１】ルマジン色原体を担持するこれらの分子の
１又は複数個をオリゴヌクレオチドに導入することによ
りエネルギー移行を増強することができる。１〜４個の
連続するルマジン色原体が好ましい。オリゴヌクレオチ
ドの３′−又は５′−末端へのリマジンリボシドの導入
はヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６に記載さ
れている。
【００４２】ヨーロッパ特許出願公開No. ３４０，６０
５及びNo. １７８，４５０に記載されているように、エ
ネルギー受容体としての種々のＲｕ複合体を、該複合体
とＤＮＡ分子との間の種々のスペーサーと共に用いるこ
とができる。折返しプライマーの５′−末端にＲｕ複合
体を取り付けるため、例えば構造〔６ａ〕のホスホラミ
ダイト又は構造〔６ｂ〕の試薬を用いることができる。
好ましくは、３′−末端への導入のために誘導体〔６
ｂ〕が使用される。
【００４３】
【化３】
【００４４】オリゴヌクレオチドの固相合成の過程での
例えばヒドロキシ基又はアミノ基へのカップリングのた
め、さらなる修飾を伴わないで試薬〔６ａ〕を用いるこ
とができる。３′−末端への試薬〔６ｂ〕のカップリン
グは、合成のために使用される固体支持体の幾らかの修
飾の後に行うことができる。ＮｅｌｓｏｎらによりＮｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，７
１７９（１９８９）に記載されている化合物〔８〕から
出発する一般的スキーム（スキーム１）を下に記載す
る。修飾された支持体〔１０〕へのＲｕ複合体誘導体
〔６ｂ〕の取り付けを含むさらなる詳細は実施例２を参
照のこと。
【００４５】
【化４】
【００４６】
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに例示する
が、本発明の範囲をこれにより限定するものではない。実施例１ ルマジン及びＲｕ複合体ホスホラミダイトの合成 ６，７−ジメチル−ルマジン−２′−デオキシリボシド
のホスホラミダイトをヨーロッパ特許出願公開No. ４３
９，０３６（１９９１年７月３１日）に記載されている
ようにして調製した。Ｒｕ複合体のホスホラミダイト
〔６ａ〕を、Ｗ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ及びＤ．Ｓｃｈｍ
ｉｄｔによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ
３０，１５１３−１５１６（１９８９）により記載さ
れているようにして調製した。
【００４７】Ｒｕ複合体誘導体〔６ｂ〕は、ヨーロッパ
特許出願公開No. ３４０，６０５に、又はＷ．Ｂａｎｎ
ｗａｒｔｈらによりＨｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃ
ａＡｃｔａ １７，２０８５−２０９９（１９８８）に
記載されているようにしてＲｕ複合体と活性化されたＮ
−ヒドロキシサクシンイミドとの連結により調製した。
Ｎ，Ｎ，Ｎ′Ｎ′−テトラメチル（サクシンイミド）ウ
ロニウムテトラヒドロボレート（ＴＳＴＵ）を活性化剤
として使用した。
【００４８】ＴＳＴＵの合成及び使用はＲ．Ｋｎｏｒｒ
らによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ ３
０，１９２７−１９３０（１９８２）に、及びＷ．Ｂａ
ｎｎｗａｒｔｈによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔｅｓ ３２，１１５７−１１６０（１９９１）に記載
されている。
【００４９】１−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチ
ル）−３−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−
β−シアノエトキシ−ホスフィン）−１，３−プロパン
ジオール〔５〕の合成 この試薬の調製は、Ｆ．Ｓｅｅｌｅ及びＫ．Ｋａｉｓｅ
ｒによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ １５，３１１３−３１２９（１９８７）に記載され
ている２段階法により１，３−プロパンジオールから出
発して行った。まず、この化合物を４，４′−ジメトキ
シトリチル基により保護した。次に、ジイソプロピルア
ンモニウムテトラゾリドの存在下、（β−シアノエトキ
シ）ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンによりホ
スフィニル化して化合物〔５〕を得た。
【００５０】実施例２ ３′−Ｒｕ複合体修飾ＤＮＡの合成 ３′−修飾オリゴヌクレオチドの固相合成のための修飾
されたＣＰＧ支持体の合成はスキーム１（前記）に記載
したようにして行った。化合物〔８〕は、Ｎｅｌｓｏｎ
らによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ １７，７１７９−７１８６及び７１８７−７１９４
（１９８９）に記載されている方法に従って行った。
【００５１】次の段階において、化合物〔８〕（１０mm
ol，６．１６ｇ）を無水ピリジンから３回蒸発させた。
次に、これを６０mlの無水ピリジンに溶解し、そして２
５mmol（２．５０ｇ）の無水コハク酸及び１０mmol
（１．２２ｇ）の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ
Ｐ）を添加し、そしてアルゴンのもとで撹拌した。４時
間後、反応を終えた（ＴＬＣ）。反応混合物を２００ml
のジエチルエーテルに入れ、そして飽和食塩水により４
回抽出した。
【００５２】有機層をＮａ2 ＳＯ4 で乾燥し、そして蒸
発させ、こうして６ｇの油状物を得た。１５０ｇのシリ
カゲル（０．００３〜０．０４０nm、メルク）上での、
１０００mlの混合ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ／ピリジン
（９４：５：１；ｖ／ｖ）、５００mlのＣＨ2 Ｃｌ2 ／
ＭｅＯＨ／ピリジン（９２：７：１）及び５００mlのＣ
Ｈ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ／ピリジン（８９：１０：１）を
用いての短カラムクロマトグラフィー（ＣＣ）による精
製を行った。純粋な画分を集め、そしてｎ−ペンタンか
ら沈澱させて２．３ｇの純粋な化合物
〔９〕を得た。
【００５３】融点８７〜８９℃。分析：Ｃ43Ｈ41ＮＯ9
・０．２ｎ−ペンタンの計算値：Ｃ７２．３７，Ｈ
５．９９，Ｎ １．９２；測定値：Ｃ ７２．６０，Ｈ
６．１４，Ｎ １．９４。 1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3 ）：２．６４（ｓ，ＯＣＣＨ 2 ＣＨ2 ＣＯ）；３．
０３−３．５０（２ｍ，ＣＨ2 −ＣＨ−ＣＨ2 ）；３．
５０−３．６５（ｍ，ＣＨ2 −ＣＨ−ＣＨ2 ）；３．７
４（ｓ，２ＯＣＨ3 ）；４．１９（ｔ，ＣＨ2 −Ｃ
Ｈ）；４．３４（ｄ，ＣＨ2 −ＣＨ）；６．８１（ｄ，
４ａｒｏｍ．Ｈ，Ｃ6 Ｈ4 ）；７．１５−７．３７
（ｍ，９ａｒｏｍ．Ｈ，Ｃ6Ｈ5 ，Ｃ6 Ｈ4 ）；７．３
９（ｔ，フルオレニル）；７．５１（ｄ，フルオレニ
ル）；７．７６（ｄ，フルオレニル）。
【００５４】官能化された支持体〔１０〕の調製：ＣＰ
Ｇ−支持体（Ｐｉｅｒｃｅ）を無水ピリジンから蒸発さ
せた。次にこれを１０mlの無水ピリジンに溶解し、そし
て０．６０mmol（４３０mg）の
〔９〕並びに３mmol（８
８０mg）の１−（メシチレン−２−スルホニル１−３−
ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）
及び０．３mlのＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）を加
え、そしてこの懸濁液を室温にて時々撹拌しながら反応
させた。
【００５５】２時間後、それを濾過し、そしてピリジ
ン、ＤＭＦ及びエーテルにより次々と洗浄した。この支
持体に、１％ ＤＭＡＰを含有するＡｃ2 Ｏ／ピリジン
（１／１０；ｖ／ｖ）の混合物１０mlを加えた。１時間
後、それを濾過し、そして支持体をピリジン、ＤＭＦ、
エタノール及びエーテルで洗浄した。〔１０〕の官能化
の程度を、ジメトキシトリチル陽イオンの光学測定によ
り（３０．５mmol／ｇ）そしてフルオレニルメトキシカ
ルボニル（Ｆｍｏｃ）基の開裂及びそれに続く３００nm
での光学測定（３０．１mmol／ｇ）により決定した。
【００５６】支持体〔１０〕上３′−アミノ修飾ＤＮＡ
の調製：１．５mmolの支持体〔１０〕から始めて合成機
上で合成を行った。各サイクルの間に、１０倍過剰量の
対応するホスホラミダイトを適用した。合成の後、支持
体をアセトニトリル及びエーテルで洗浄し、そして乾燥
させた。次に、２０mgの支持体を、密閉したエッペンド
ルフ管内で７００μｌの濃アンモニアにより６７℃にて
１．５時間処理した。
【００５７】懸濁液を濾過し、そして濾液を乾燥させ
た。得られたペレットを３００μｌの８０％酢酸に溶解
し、そして２時間後７００μｌのエーテルを加えてＤＮ
Ａを沈澱させた。遠心分離の後、ペレットを水に溶解
し、そして５００mmolのＫＣｌの添加の後、これを２ｌ
の水に対して透析した（分子量１０００排除）。ＵＶ吸
収は５３ODユニットのアミノ修飾ＤＮＡの収量を示し、
これをそのまま、Ｒｕ複合体への結合のために用いた。
【００５８】アミノ修飾ＤＮＡへの〔６ｂ〕の結合：エ
ッペンドルフ管内で、２７．５ODユニットの３′−アミ
ノ修飾ＤＮＡ及び４mmol（３mg）の〔６ｂ〕を、２００
μｌのＤＭＦ、２００μｌのジオキサン、２００μｌの
水及び５μｌのヒューニッヒ（Ｈｕｅｎｉｇ）塩基の混
合物中で反応させた。この混合物を暗所で振とうしなが
ら１６時間反応させた。スピード真空濃縮器中で乾燥さ
せ、そして５００μｌの水に溶解した。この溶液を５０
０μｌのＣＨＣｌ3 で３回抽出して過剰のＲｕ複合体を
除去した。ポリアクリルアミド電気泳動及びそれに続く
電気溶出により沈澱を行った。
【００５９】実施例３ 非ヌクレオチド性リンカー及び／又は３′−もしくは
５′−修飾を有するオリゴヌクレオチドの合成 修飾を伴わないオリゴヌクレオチドを、調節された孔の
ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓ
ｓ）（ＣＰＧ，Ｐｉｅｒｃｅ）上で、そして適切なビル
ディングブロックのβ−シアノエチルホスホラミダイト
を適用して調製した。
【００６０】３′−ルマジン修飾オリゴヌクレオチド
を、ヨーロッパ特許出願公開No. ４３９，０３６に記載
されているようにして、ルマジン−２′−デオキシリボ
シド修飾ＣＰＧ−支持体の延長により調製した。この出
願はまた、５′−ルマジン及び５′−Ｒｕ複合体−修飾
オリゴヌクレオチドの合成において使用するための方法
及び試薬も記載している。
【００６１】ホスフェート基により分離された２個のプ
ロパンジオール基から成る非ヌクレオチド性リンカー基
を、固相合成の間に、対応するホスホラミダイト〔５〕
により挿入した。このアミダイトの結合を、１０倍過剰
量及び３分間の結合時間を用いて、活性化剤としてのテ
トラゾールと共に２回行った。３′−末端へのＲｕ複合
体の付加は、実施例２に記載したオリゴヌクレオチドの
合成及び脱保護の後にＲｕ複合体誘導体〔６ｂ〕を用い
て行った。
【００６２】実施例４ 一般式（Ｉ）のプライマーを用いてのポリメラーゼ連鎖
反応 幾つかのオリゴヌクレオチドを合成し、そしてホリメラ
ーゼ連鎖反応においてプライマーとして作用するそれら
の能力について試験した。増幅のために選択されたＤＮ
Ａ断片はＨＩＶ−１のｇａｇ領域の一部分である。５′
−末端にＲｕ複合体を有する〔１６〕か又は有しない
〔１４，１５〕常用のプライマー並びに一般式（Ｉ）の
修飾プライマー〔１７，１８〕を、すでに記載されてい
る方法により合成した。プライマーは次の特異的配列を
有していた。
【００６３】
【化５】
【００６４】各場合において、相補鎖の同時増幅のため
に使用した第二プライマー又は対向プライマーは次の配
列を有していた。
【００６５】
【化６】
【００６６】これらのオリゴヌクレオチドは、Ｃ．Ｈ．
Ｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，２９５−２９７（１
９８８）の表２にすでに記載されているプライマー及び
プローブ配列に由来した。増幅反応当り１０００コピー
のＨＩＶプラスミドＤＮＡが適用された。プライマーは
１００pMで過剰に使用した。〔１９〕の場合、５０pMが
適用された。ＨＩＶ ＤＮＡを２連で増幅し、そしてＰ
ＣＲ陰性対照を導入した。プライマー〔１４〕及び〔１
９〕を用いての増幅を陽性対照として用いた。
【００６７】反応混合物当り１００μｌの全体積のた
め、５０μｌのマスター混合物に５０μｌのＨＩＶ Ｄ
ＮＡを加えた。 マスター混合物： 蒸留水 ２７．５μｌ １０×Ｔａｑ緩衝液 １０．０μｌ ８mM ｄＮＴＰ １０．０μｌ １００mMプライマー（１４−１８） ３．０μｌ ５０mMプライマー１９ ３．０μｌ Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌ
【００６８】増幅されたＤＮＡの効率及び均一性を、サ
ザンハイブリダイゼーション（Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ９８，５０３，１９７５）により、放射性
ラベルされたプローブ５′−ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ
ＴＴＡ Ｃ−３′を用いて試験した。ハイブリダイゼー
ションは、リン酸緩衝液（１０mM無機リン酸：１Ｍ Ｎ
ａＣｌ，pH７．０）中で、等モル量のオリゴヌクレオチ
ドを用いてよく行われた。５′−末端にＲｕ複合体を有
する最も短い折返しプライマーさえ、効率において標準
的非修飾プライマーに匹敵する特異的増幅を導いた。
【００６９】実施例５ ハイブリダイゼーション及びエネルギー移行を介しての
延長された折返しプライマーの検出 一般式（Ｉ）の折返しプライマーが、ポリメラーゼ連鎖
反応におけるその延長後に、一般式（II）のオリゴヌク
レオチドプライマーによる引き続く検出のための鋳型と
して機能し得るか否かが決定された。５′−Ｒｕ−複合
体−ラベル化オリゴヌクレオチド〔１〕は、３′−ルマ
ジン−ラベル化プローブ〔２ａ〕，〔２ｂ〕及び〔２
ｄ〕並びに陰性プローブ〔２ｃ〕のための鋳型として機
能する構造（Ｉ）の延長されたプライマーのための合成
モドル化合物として役立つ。
【００７０】
【化７】
【００７１】ハイブリダイゼーションは、リン酸緩衝液
（１０mM無機リン酸塩；１Ｍ ＮａＣｌ，pH７．０）中
で等モル比のオリゴヌクレオチドを用いてよく行われ
た。蛍光測定を、ＳＬＭ Ｍｏｄｅｌ ４０４８Ｓ蛍光
分光計において行った。励起波長及び放射波長はそれぞ
れ３３７nm及び６２０nmであった。ハイブリドの濃度は
サンプル体積４００μｌのために１．３×１０-6Ｍであ
った。
【００７２】表１はエネルギー移行測定の結果を示す。
予想通り、プローブ〔２ａ〕及び〔２ｂ〕の場合結果は
陽性であり、そしてプローブ〔２ｃ〕及び〔２ｄ〕の場
合陰性であった。
【００７３】エネルギー移行から蛍光（ＩＦ3 ）は、６
２０nmにおける測定された蛍光（ＩＦ）から直接励起に
よるＲｕ複合体の蛍光及び６２０nmにおけるルマジン色
原体の蛍光（ＩＦ1 ）（無視することができる）を差し
引いた差として定義された。従って、エネルギー移行の
強度についての式はＩＦ3 ＝ＩＦ−ＩＦ2 となる。単純
化のため、表１には、直接励起によるＲｕ複合体の蛍光
強度（ＩＦ2 ）に対する６２０nmでの測定された蛍光強
度ＩＦの比率を示す。５′−リマジン−ラベルプライマ
ー及び３′−Ｒｕ複合体−ラベルプローブを用いる逆エ
ネルギー移行系を化合物〔１１〕，〔１２〕及び〔１
３〕を用いて研究した。
【００７４】
【化８】
【００７５】プライマー／プローブ系〔１１〕／〔１
２〕（エネルギー移行を示す）及びエネルギー移行を伴
わない陰性対照としての〔１３〕／〔１２〕を用いて得
た結果は、エネルギー移行の効率はやや低かった（デー
ターは示してない）が、この組合せの有用性を確認し
た。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の測定の原理を示す。ａ）は変
性及び増幅段階を示し、ｂ）及びｃ）検出段階を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フランシス ミュラー スイス国，ツェーハー−4059 バーゼル, バイム バッサートゥルム 32

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプル中の少なくとも１つの特定の核
    酸配列の増幅及び検出のための方法であって、該サンプ
    ルは１つの核酸又は複数の核酸の混合物であってその少
    なくとも１つが前記特定の核酸配列を含有すると予想さ
    れるものであり、この方法は、 （ａ）検出されるべき核酸配列を鎖延長反応により増幅
    し、ここでこの鎖延長反応は、次の一般式（Ｉ）： Ｘ−Ｐｃ−Ｌ−Ｐｐ （Ｉ） （式中、Ｐｐは、検出されるべき核酸配列の一方の鎖の
    一部分と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列であ
    り、Ｐｃは該配列Ｐｐに実質的に相補的な核酸配列であ
    り、Ｌは配列ＰｃとＰｐのプライマー延長配列との間の
    効率的な折り返しを可能にしそして折り返し部分Ｐｃの
    増幅を回避するように選択された非−ヌクレオチドリン
    カー基であり、そしてＸはエネルギー供与体又は受容体
    である）により表わされる第一オリゴヌクレオチドプラ
    イマー、及び検出されるべき核酸配列の他方の鎖の一部
    分と実質的に相補的な第二オリゴヌクレオチドプライマ
    ーを使用し； （ｂ）最終増幅サイクルの後、プライマー延長生成物を
    その相補的配列から分離して単鎖分子を生成せしめ； （ｃ）前記式（Ｉ）のプライマーを含有する前記単鎖分
    子を、次の一般式（II）： Ｙ−Ｐｒ （II） （式中、Ｙは、式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギ
    ー供与体である場合にはエネルギー受容体であり、そし
    て式（Ｉ）のプライマー中のＸがエネルギー受容体であ
    る場合にはエネルギー供与体であり、そしてＰｒは、式
    （Ｉ）のプライマーを含有する増幅された単鎖分子の一
    部分と相補的なオリゴヌクレオチドであって、配列Ｐｃ
    の折り返し及び前記単鎖分子への配列Ｐｃのハイブリダ
    イゼーションの後にエネルギーの移行が行われ得る程Ｘ
    とＹとの間の短い距離を保証するように選択されたもの
    である）により表わされるオリゴヌクレオチドプローブ
    により、折り返しによる配列Ｐｃ及びＰｒ配列の前記単
    鎖分子へのハイブリダイゼーションを可能にする条件下
    で処理し；そして （ｄ）エネルギー移行が行われるか否かを決定する；こ
    とを含んで成る方法。
  2. 【請求項２】 Ｘがエネルギー供与体であり、そしてＹ
    がエネルギー受容体である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 Ｘがエネルギー受容体であり、そしてＹ
    がエネルギー供与体である請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記エネルギー供与体がルマジン色原体
    であり、そして前記エネルギー受容体がバソフェナンス
    ロリン−ルテニウム−II−複合体である、請求項１〜３
    のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 Ｌが、１個のホスフェート基により一緒
    に連結されそしてオリゴヌクレオチドＰｃ及びＰｐにホ
    スフェート基を介して結合されている２個のプロパンジ
    オールユニットから成る、請求項１〜４のいずれか１項
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記鎖延長反応がポリメラーゼ連鎖反応
    である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 次の一般式（Ｉ） Ｘ−Ｐｃ−Ｌ−Ｐｐ （Ｉ） （式中、Ｐｐは、検出されるべき核酸配列の一方の鎖の
    一部分と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列であ
    り、Ｐｃは該配列Ｐｐに実質的に相補的な核酸配列であ
    り、Ｌは配列ＰｃとＰｐのプライマー延長配列との間の
    効率的な折り返しを可能にしそして折り返し部分Ｐｃの
    増幅を回避するように選択された非−ヌクレオチドリン
    カー基であり、そしてＸはエネルギー供与体又は受容体
    である）により表わされるオリゴヌクレオチドプライマ
    ー。
  8. 【請求項８】 Ｘがエネルギー供与体である、請求項７
    に記載のプライマー。
  9. 【請求項９】 Ｘがエネルギー受容体である、請求項７
    に記載のプライマー。
  10. 【請求項１０】 Ｘがルマジン色原体である請求項７又
    は８に記載のプライマー。
  11. 【請求項１１】 Ｘがバソフェナンスロリン−ルテニウ
    ム−II−複合体である、請求項７又は９に記載のプライ
    マー。
  12. 【請求項１２】 Ｌが、１個のホスフェート基により一
    緒に連結されそしてオリゴヌクレオチド配列Ｐｃ及びＰ
    ｐにホスフェート基を介して結合されている２個のプロ
    パンジオールユニットから成る、請求項７〜１１のいず
    れか１項に記載のプライマー。
  13. 【請求項１３】 １つの核酸又は複数の核酸の混合物で
    あってその内の少なくとも１つが特定の核酸配列を含有
    すると予想されるものを含有するサンプル中の少なくと
    も１つの該特定の核酸配列を増幅し且つ検出するための
    キットであって、請求項７〜１２のいずれか１項におい
    て定義した式（Ｉ）のプライマーを含有する容器、請求
    項１において定義した式（II）のプローブを含有する容
    器、並びにポリメラーゼ連鎖反応による増幅及び検出の
    ための手段及び試薬を含んで成る診断用キット。
  14. 【請求項１４】 プロパンジオールに由来しそしてＰ
    （Ｏ）2 - を含有する非ヌクレオチド性リンカー基。
  15. 【請求項１５】 次の式： -O-P(O)2 - -O-(CH2)3-O-P(O)2 - -O-(CH2)3-O-P(O)2 - -O- により特徴付けられる、請求項１４に記載の非ヌクレオ
    チドリンカー基。
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