JPH03210197A - 蛍光標識ｄｎａの調製方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、蛍光標識されたＤＮＡの調製方法及びそのキ
ットに関する。

〔従来の技術〕

従来、目的とするＤＮＡ断片を多量に獲得するためには
、組換えＤＮＡを取込ませた宿主細胞を増殖させること
によって、組換えＤＮＡを多量に生成させる手法が用い
られていた。

ところが、近年、サイキ（Ｓａｉｋｉ）らが開発したＰ
ＣＲ（ポリメラーゼ　チェーン　リアクション）法によ
り、微量の細胞ＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域だけを
２〜３時間の自動処理で約１００万倍に増幅することが
可能となった〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２３９
巻、第４８７〜４９１頁（１９８８）］。

ＰＣＲ法は、増幅させるＤＮＡ領域を挟んでプラス鎮、
マイナス鎖に対するＤＮＡブライマー（２０〜３０ヌク
レオチド）を合成し、熱変性による一重鎖ＤＮＡとのア
ニーリングの後、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば耐熱性タ
ックポリメラーゼ）によるＤＮＡ相補相補台成を繰返し
行うことで、１サイクルごとにＤＮＡは２倍に増幅され
、ｎサイクル後には２°倍に増幅される。

これを用いて増幅させたＤＮＡ領域内の塩基配列や塩基
変異は、次に、特異的な合成オリゴヌクレオチドを標識
し、これをプローブとじて用いて同定できる。なお、Ｄ
ＮＡの標識法としては高感度を必要とするため放射性同
位元素を用いた標識法が一般的である。

このように、ＰＣＲ法は、極微量の試料より特定のＤＮ
Ａを検出する方法として、近年、脚光を浴びている。

〔発明が解決しようとする課題〕

プローブとして合成オリゴヌクレオチドを放射性同位元
素で標識した場合、高感度である反面、安全性、安定性
、設備をはじめ、使用後の廃棄処理の問題等に制約があ
るため、最近は放射性物質の代りに非放射性標識が注目
されるようになっている。

そこで非放射性物質でプライマーを標識する方法も開発
されたが（特開平１−２５２３００号）　この場合用い
るプライマーごとに標識化されたものを合成する必要が
ある。また、基質として用いるヌクレオチドにアミノヘ
キシル基を使用し、そのヌクレオチドを増幅されたＤＮ
Ａに取込ませた後、アミノヘキシル基を標識してＤＮＡ
への標識化を達成する方法もあるが〔アナリティカル・
バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ−ｉｃａｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１５７巻、第１９９〜２０７
頁（１９８６）］、この場場合幅されたＤＮＡを標識化
するという操作が煩雑である。

本発明の目的は、上記のような問題点のないＤＮＡの調
製方法及びそのキットを提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、増幅によ
るＤＮＡの調製において、基質として用いるヌクレオチ
ドに蛍光標識されたヌクレオチドを含むことを特徴とす
る蛍光標識ＤＮＡの調製方法に関する。また、本発明の
第２の発明は、蛍光標識された基質ヌクレオチドとそれ
以外の基質ヌクレオチドを含有することを特徴とする蛍
光標識ＤＮＡ調製用キットに関する。

本発明者らは、このため鋭意研究の結果、放射性同位元
素を必要としないＤＮＡの標識方法を見出し、本発明を
完成させた。

ＤＮＡを増幅させる方法としては、ＰＣＲ法が簡便であ
るので、以下、ＰＣＲ法を例にとって本発明を説明する
が、本発明はＰＣＲ法に限定されるものではなく、ＤＮ
Ａ増幅に用いられる方法であれば、何でも利用できる。

ＰＣＲ法において、４種の基質ヌクレオチド、ｄＡＴＰ
ＳｄＣＴＰ、ｄＧＴＰＳＴＴＰのうち、一種の基質につ
いて、蛍光標識されたヌクレオチド（好ましくは７〜７
５％）に置換し、他はタックポリメラーゼを含む遺伝子
増幅キット及び宝酒造■から市販されている自動遺伝子
増幅装置サーマル・サイクラ−を用い、特定のＤＮＡ領
域の増幅反応を行う。本発明では、ＰＣＲ法でのプライ
マーから相補的なりＮＡ鎮を合成する際に蛍光標識され
たヌクレオチドを取込ませることによって標識するので
、新規に５′末端蛍光標識されたプライマーを合成し、
使用することなく、蛍光標識ＤＮＡを調製できる。

また、ビオチン−アビジン系での標識のように抗体を介
する検出方法ではなく、対象とするＤＮＡを直接的に検
出し得るものである。

一般に増幅されたＤＮＡ断片の分析においては、電気泳
動法によるパターン解析又はサザンブロッティングある
いはドツトブロッティング法でフィルターやメンブレン
に固定して標識されたプローブでの検出を行うが、本発
明では増幅された断片が既に蛍光標識されていることか
ら、試料ＤＮＡを固定するのではなくプローブの側を何
らかの固相担体に固定してハイブリダイゼーションを行
い、洗浄後その蛍光を測定して対象とするＤＮＡを直接
検出し得るものである。固相担体としては例えばＥＩＡ
用マルチプレート、各種ビーズ、フィルター、ガラスプ
レート、サンプルチューブ、バイアル等がある。

固定化は適当なスペーサーを介した共有結合によるほか
、５′末端ビオチン化プローブとアビジン化固相担体と
の結合によっても調製できる。

本発明方法によれば試料ＤＮＡの固定化を省略できるだ
けでなく、プローブを固定することで洗浄後の回収が容
易となり、検出の簡略化、多数試料の一斉処理が可能と
なる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例をもって更に具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１　フルオレセイン標識ｄＵＴＰの合成ヌクレイ
ツク・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）第１５巻、第４８５７〜４８７６
頁（１９８７）を改変した方法に従い、５ヨードデオキ
シウリジン（ＩｄＵ：　　［１１）より５−（アミノプ
ロプ−１−イニル）−デオキシウリジンの保護誘導体〔
２〕を合成した。

次に、３’　−，５’−水酸基保護基を脱保護し〔３〕
、オキシ塩化リンとの反応によりモノリン酸誘導体〔４
〕を合成後、これをＮ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾー
ル（ＣＤＩ）にて活性化し、ピロリン酸と反応させ、ト
リリン酸誘導体〔５〕を合成した。最後に、アミノ基保
護基の脱保護後、アミノ基と容易に反応する蛍光化合物
フルオレセインイソチオシアネート　（ＦＩＴＣ）を添
加し、フルオレセイン標識ｄＵＴＰ　（ＦＴＣ−ＡＰ−
ｄＵＴＰ　：　　［６］　）を得た。

上記の反応工程の一例を第１図に工程図として示す。第
１図において、Ｔｏｌはトルオイル基、Ｔｆａ基はトリ
フルオロアセチル基を示す。

実施例２ ＰＣＲ法による蛍光標識ＤＮＡの調製 （２−１）　　蛍光標識ヌクレオチド存在下におけるＰ
ＣＲ増幅 １１００ｎのヒト胎盤由来ＤＮＡ　（クローンチック社
）を０．５−用チューブ（バイオビック社）に採り、９
５℃で１０分間加熱処理した後、シーンアンプＴＭキッ
ト　（Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　ＴＭ　Ｋｉｔ）　［宝酒造■
］中の１０μｌの１０倍濃度増幅用バッファー［１００
ｍＭ）リス−ＨＣｌ　、ｐＨ８，３，５００ｍＭ　ＫＣ
Ｉ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１％　（ｗ／ｖ）ゼラ
チン〕、１６μｌの第１表記載の蛍光標識ヌクレオチド
入りｄＮＴＰ混合液、１μｌの１００μＭｃ　−Ｋｉ−
ｒａｓ　／　６１フオワード　プライマー１μＡの１０
０　μＭ　ｃ　−Ｋｉ−ｒａｓ　／　６１リバースブラ
イマー（共に宝酒造）、０．５μｌの２．５ユニツト／
μｌタツクポリメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて、
１００μｌの溶液にした。

この反応液に１００μｌのミネラルオイル（シグマ社）
を重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サイクラ
−〔宝酒造■〕により増幅反応を行った。反応条件は、
９４℃で１分間（変性）→５５℃で２分間（プライマー
のアニーリング）→７２℃で１分間（合成反応）のサイ
クルを、４０サイクル行った。

反応後、上層のミネラルオイルを除去した後、反応液の
１０μｌを採り、３％ヌッシーブ（Ｎｕ−ｓｓｉｅｖｅ
）　Ｇ　Ｔ　Ｇアガロース・１％シーケム（ＳｅａＫｅ
ｍ）アガロース（ＦＭＣ社）ゲル電気泳動を行い、エチ
ジウム　ブロマイドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮ
Ａを解析した。その結果、１２８ｂｐの単一バンドを確
認した。

第１表 蛍光標識ヌクレオチド入りｄＮＴ Ｐ混合液の組成 １．２５ｍＭ　　　　　　　ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐｌ、２５ｍ
Ｍ　　　　　　　ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐｌ、２５ｍＭ　　　　
　　　ｄ　ＣＴ　Ｐｏ、６２５ｍＭ　　　　　　　Ｔ　
Ｔ　Ｐ（２−２）　　増幅ＤＮＡの蛍光強度検出ＴＴＰ
について、２０〜４０％をＦＴＣ−ＡＰ−ｄＵＴＰに置
換して反応を行った。各反応液９０μｌに、９μｌの３
Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，２を加え、更に、２００μ
ｌの冷エタノール、−２０℃を加えて混和した後、１時
間以上−２０℃で静置する。４℃で１２゜０００ｇ、５
分間遠心し、沈殿を乾燥させた後、滅菌水５０μｌに溶
解し、試料溶液とする。

１μｌの試料溶液を自動塩基配列決定装置（日立電子工
業社・）により解析した。泳動度として１２８ｂｐに相
当する位置に蛍光強度の存在を示すピークを確認した（
第２図）。なお、フルオレセイン標識ｄＵＴＰを含まな
い場合では全く蛍光強度は認められなかった。

第２図において、レーン１は分子量マーカーとして用い
たＭ１３ｍｐ１８の塩基配列ピークを示し、レーン２は
、ＦＴＣ−ＡＰ−ｄＵＴＰ標識増幅ＤＮＡを示す。そし
て横軸は泳動時間を示し、縦軸は蛍光の相対強度を示す
。

実施例３　固定化プローブによる増幅ＤＮＡ領域内の塩
基変異の検出 （３’＝１）　　蛍光用９６穴マルチプレートのアミノ
プロピル化 ４６μｌの３−アミノプロピルトリエトキシシランを５
ｍ１ｌ！の無水エタノールに溶解し、各ウェルに２００
μβずつ分注、シールして室温で一晩緩やかに振とうし
た。溶媒をピペッティングで除去した後、水洗３回メタ
ノール洗浄１回を行い、５０℃以下で乾燥させた。

（３−２）　　アミノプロピル化プレートへのプローブ
固定 ０．１　Ｍ　　ＮａＨＣＯ，，２ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　
Ａ溶液４００μｌにジスクシンイミジルスベレー）　２
１　ｍｇのジメチルホルムアミド溶液１−を混和し、各
ウェルに１００μβずつ分注後遮光し室温で１０分間静
置した。溶液をピペッティングで除去し、水洗を３回行
った後、５′末端にアミノスペーサーを付加したプロー
ブ〔宝酒造■製、点突然変異ｒａｓ遺伝子検出用オンコ
ジーン　プローブ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｐｒｏｂｅ）　
ｃ　−Ｋｉ■ｒａｓ／６１Ｇ１ｙＳＳｅｒ、Ｖａｌの３
タイプ〕各２５μｇを０．１　Ｍ　　ＮａＨ［’０．．
２ｍＭＥＤＴＡ溶液３００μｌに溶解し、ウェル当り５
０μｌを分注、シールして室温で一晩緩やかに振とうし
た。溶液をピペッティングで除去した後水洗を３回行い
風乾した。

（３−３）　　試料ＤＮＡのハイブリダイゼーション及
び検出 ウェル当り１０　ｍＭ　ｐＨ７，４のリン酸バッファー
（ＰＢＳ）に５％ＳＤＳを加えたもの３００μｌを添加
し、３７℃で３時間緩やかに振とう　（プレハイブリダ
イゼーション）、溶液を除去した後、（２−２）と同様
にエタノール沈殿、乾燥させたＰＣＲ反応物をプレハイ
ブリダイゼーション溶液３００μｌに溶解し、９５℃で
１０分間熱変性したものをそのまま各プローブを固定し
たウェル中に１００μβずつ分注した。

３７℃で一晩緩やかに振とうした後溶液を除去し、０．
５％ＳＤＳを加えたＰＢＳで洗浄（３７℃　１５分間　
５回）、次いでＰＢＳ洗浄を行い、最後にウェル当りＰ
ＢＳ　１００μｌを添加してフルオロスキャン■（タイ
ターチック社製）で蛍光強度を測定した（励起４８５ｎ
ｍ、測定５３８　ｎｍ）。

予想されるに６１　　ｃ１ｙタイプの位置にＳｅｒ、Ｖ
ａｌタイプとは明らかに有意差のある蛍光強度が確認さ
れた。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明により増幅方法、特
にＰＣＲ法において、蛍光基質を用いることにより直接
蛍光標識でき、更に、試料ＤＮＡの方を蛍光標識するこ
とにより、試料のＤＮＡフィルターの作製をせずにハイ
ブリダイゼーションを行うことができ、検出の簡略化を
提供することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、フルオレセイン標識ｄＵＴＰの合成の一例を
示す工程図、第２図は、ＦＴＣＡＰ−ｄＵＴＰｉ識り、
た増幅ＤＮＡ（７）蛍光強度検出を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、増幅によるＤＮＡの調製において、基質として用い
   るヌクレオチドに蛍光標識さたヌクレオチドを含むこと
   を特徴とする蛍光標識ＤＮＡの調製方法。 ２、少なくとも下記ａ及びｂを含有することを特徴とす
   る蛍光標識ＤＮＡ調製用キット。ａ、蛍光標識された基
   質ヌクレオチド ｂ、上記ａ以外の基質ヌクレオチド