JP3291555B2 - プローブライブラリーの製造方法、該製造方法により得られたプローブライブラリー、該プローブライブラリーから他のｄｎａまたはｒｎａとハイブリッドするプローブを精製する方法 - Google Patents
プローブライブラリーの製造方法、該製造方法により得られたプローブライブラリー、該プローブライブラリーから他のｄｎａまたはｒｎａとハイブリッドするプローブを精製する方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、デオキシリボヌク
レオチド類似体を含むＤＮＡ（ポリデオキシリボヌクレ
オチド。以下同様。）プローブライブラリーの製造方
法、該方法によって得られたＤＮＡプローブライブラリ
ー、該ＤＮＡプローブライブラリーから他のＤＮＡまた
はＲＮＡとハイブリッドを形成するＤＮＡプローブの精
製方法、リボヌクレオチド類似体を含むＲＮＡプローブ
ライブラリーの製造方法、該方法によって得られたＲＮ
Ａプローブライブラリー、該ＲＮＡプローブライブラリ
ーから他のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリッドを形成す
るＲＮＡプローブの精製方法に関し、詳しくは蛋白質の
存在下において、鋳型およびプライマー複合体非依存的
にデオキシリボヌクレオチドとその類似体とを重合する
ことにより該類似体を含むＤＮＡを合成する方法に関す
る。
レオチド類似体を含むＤＮＡ（ポリデオキシリボヌクレ
オチド。以下同様。）プローブライブラリーの製造方
法、該方法によって得られたＤＮＡプローブライブラリ
ー、該ＤＮＡプローブライブラリーから他のＤＮＡまた
はＲＮＡとハイブリッドを形成するＤＮＡプローブの精
製方法、リボヌクレオチド類似体を含むＲＮＡプローブ
ライブラリーの製造方法、該方法によって得られたＲＮ
Ａプローブライブラリー、該ＲＮＡプローブライブラリ
ーから他のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリッドを形成す
るＲＮＡプローブの精製方法に関し、詳しくは蛋白質の
存在下において、鋳型およびプライマー複合体非依存的
にデオキシリボヌクレオチドとその類似体とを重合する
ことにより該類似体を含むＤＮＡを合成する方法に関す
る。
【０００２】本発明により合成されたＤＮＡまたはＲＮ
Ａ（以下の説明において、「ＤＮＡまたはＲＮＡ」を、
便宜上、「ポリヌクレオチド」と略称する。）は、医
学、薬学、発酵工学、農学、農芸化学、生化学などの分
野で有用な非放射性プローブを提供することを可能にす
る。
Ａ（以下の説明において、「ＤＮＡまたはＲＮＡ」を、
便宜上、「ポリヌクレオチド」と略称する。）は、医
学、薬学、発酵工学、農学、農芸化学、生化学などの分
野で有用な非放射性プローブを提供することを可能にす
る。
【０００３】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】近年、遺
伝子工学はめざましい発展を遂げている。医学、農学、
発酵工学等の分野では、この遺伝子工学を用いる手法が
数多く開発されている。例えば、医学分野においての遺
伝子診断や遺伝子治療等がその代表例である。
伝子工学はめざましい発展を遂げている。医学、農学、
発酵工学等の分野では、この遺伝子工学を用いる手法が
数多く開発されている。例えば、医学分野においての遺
伝子診断や遺伝子治療等がその代表例である。
【０００４】ここで遺伝子診断について述べる。現在用
いられている手法として、次のような手法がある。すな
わち、（１）検出したい遺伝子の塩基配列の一部に相補
的な塩基配列を持つ短いポリヌクレオチドである「プロ
ーブ」に対して、例えばビオチン等による化学修飾やフ
ルオレッセイン等による蛍光標識を行ない、例えば、蛍
光発光イン・サイチュー・ハイブリッド形成法（ＦＩＳ
Ｈ法、堀ら、ラボマニュアルヒトゲノムマッピング、丸
善、１９９１年発行）や、サザン・ブロット法（市野、
細胞工学実験プロトコール、秀潤社、１９９２年発行）
やノザン・ブロット法（市野、細胞工学実験プロトコー
ル、秀潤社、１９９２年発行）等により検出を行なう方
法。（２）検出したい遺伝子の上流側と下流側の塩基配
列に対してのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応
法［ＰＣＲ法、サイキら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、第２３９巻、第４８７〜４９１頁（１９８８
年）］により該遺伝子の塩基配列を増幅し、電気泳動を
行うことにより検出を行なう方法。
いられている手法として、次のような手法がある。すな
わち、（１）検出したい遺伝子の塩基配列の一部に相補
的な塩基配列を持つ短いポリヌクレオチドである「プロ
ーブ」に対して、例えばビオチン等による化学修飾やフ
ルオレッセイン等による蛍光標識を行ない、例えば、蛍
光発光イン・サイチュー・ハイブリッド形成法（ＦＩＳ
Ｈ法、堀ら、ラボマニュアルヒトゲノムマッピング、丸
善、１９９１年発行）や、サザン・ブロット法（市野、
細胞工学実験プロトコール、秀潤社、１９９２年発行）
やノザン・ブロット法（市野、細胞工学実験プロトコー
ル、秀潤社、１９９２年発行）等により検出を行なう方
法。（２）検出したい遺伝子の上流側と下流側の塩基配
列に対してのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応
法［ＰＣＲ法、サイキら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、第２３９巻、第４８７〜４９１頁（１９８８
年）］により該遺伝子の塩基配列を増幅し、電気泳動を
行うことにより検出を行なう方法。
【０００５】これらの手法を用いる遺伝子診断は、塩基
配列が既に決定されているものにしか用いることができ
なかった。つまり、遺伝子診断する前に必ず、検出した
い遺伝子の塩基配列を決定し、作業者がそれを認識して
おく必要があった。
配列が既に決定されているものにしか用いることができ
なかった。つまり、遺伝子診断する前に必ず、検出した
い遺伝子の塩基配列を決定し、作業者がそれを認識して
おく必要があった。
【０００６】そのために、病原体遺伝子の変異が少ない
感染症の遺伝子診断についてはそれほど問題とはならな
いが、例えば、ヒト免疫不全ウィルス（以下、「ＨＩ
Ｖ」と略称）のような変異の多いウィルスによる感染症
の遺伝子診断については、当該ウイルスに一旦変異が起
これば、もはや変異前のプローブやプライマーは使えな
くなるという問題点があった。塩基配列の決定には、一
般的に、多くの時間と大きなコストが必要であることか
ら、開発したプローブやプライマーが使えなくなること
は、大きな損失を招いた。
感染症の遺伝子診断についてはそれほど問題とはならな
いが、例えば、ヒト免疫不全ウィルス（以下、「ＨＩ
Ｖ」と略称）のような変異の多いウィルスによる感染症
の遺伝子診断については、当該ウイルスに一旦変異が起
これば、もはや変異前のプローブやプライマーは使えな
くなるという問題点があった。塩基配列の決定には、一
般的に、多くの時間と大きなコストが必要であることか
ら、開発したプローブやプライマーが使えなくなること
は、大きな損失を招いた。
【０００７】従って、ハイブリッド形成能力に多様性の
あるプローブやプライマーを開発して遺伝子の変異にも
充分対応できるようにすることが熱望されてはいるもの
の、残念ながら、従来の技術で合成されるポリヌクレオ
チドの塩基配列は、共存させた鋳型により一義的に決定
されることから、さまざまな塩基配列を有するポリヌク
レオチドの分子団を同時に生産すること（すなわち、多
様性を持つＤＮＡプローブライブラリー、ＲＮＡプロー
ブライブラリーを生産すること）は原理上、不可能であ
った。
あるプローブやプライマーを開発して遺伝子の変異にも
充分対応できるようにすることが熱望されてはいるもの
の、残念ながら、従来の技術で合成されるポリヌクレオ
チドの塩基配列は、共存させた鋳型により一義的に決定
されることから、さまざまな塩基配列を有するポリヌク
レオチドの分子団を同時に生産すること（すなわち、多
様性を持つＤＮＡプローブライブラリー、ＲＮＡプロー
ブライブラリーを生産すること）は原理上、不可能であ
った。
【０００８】以下、さらに説明を加える。すなわち、Ｄ
ＮＡはいうまでもなく、Ｄ−デオキシリボースの糖成分
とアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、
チシン（Ｔ）の塩基成分を持つヌクレオチドがホスホジ
エステル結合で一本の鎖状重合体を形成したポリヌクレ
オチドであり、このＤＮＡの生合成は、ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰという４種類のヌクレオチド
三燐酸を基質として、ＤＮＡやＲＮＡの鋳型依存的（鋳
型相補的）にＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素（同順）
により行われていた。また、これらの反応には必ず前も
って鋳型の一部に相補的に結合したオリゴヌクレオチド
である「プライマー」が必要であった。そして、従来の
方法により合成されるＤＮＡは、前述したように、用い
る鋳型により機械的にその塩基配列が決定されることに
なり、さまざまな塩基配列を持つ（多様性のある）ＤＮ
Ａプローブライブラリーを一度に得ることは到底できな
かった。
ＮＡはいうまでもなく、Ｄ−デオキシリボースの糖成分
とアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、
チシン（Ｔ）の塩基成分を持つヌクレオチドがホスホジ
エステル結合で一本の鎖状重合体を形成したポリヌクレ
オチドであり、このＤＮＡの生合成は、ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰという４種類のヌクレオチド
三燐酸を基質として、ＤＮＡやＲＮＡの鋳型依存的（鋳
型相補的）にＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素（同順）
により行われていた。また、これらの反応には必ず前も
って鋳型の一部に相補的に結合したオリゴヌクレオチド
である「プライマー」が必要であった。そして、従来の
方法により合成されるＤＮＡは、前述したように、用い
る鋳型により機械的にその塩基配列が決定されることに
なり、さまざまな塩基配列を持つ（多様性のある）ＤＮ
Ａプローブライブラリーを一度に得ることは到底できな
かった。
【０００９】ＲＮＡについても同様である。すなわち、
ＲＮＡは、Ｄ−リボースの糖成分とアデニン（Ａ）、グ
アニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）等の
塩基成分を持つヌクレオチドが、ホスホジエステル結合
で一本の鎖状重合体を形成したポリヌクレオチドであ
り、このＲＮＡの生合成は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、
ＵＴＰ等のヌクレオチド三燐酸を基質としてＤＮＡまた
はＲＮＡ依存的にＲＮＡポリメラーゼにより行われる。
その反応産物はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ト
ランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ
（ｒＲＮＡ）等であるが、いずれもＤＮＡまたはＲＮＡ
の鋳型を前もって必要とし、その反応産物は鋳型に相補
的なＲＮＡしか得られなかった。つまり、蛋白質のみの
情報に依存し、配列に多様性を持つＲＮＡを合成するこ
とは不可能であった。従って、多様性のあるＲＮＡプロ
ーブライブラリーを一度に得ることは、従来の技術では
不可能であった。
ＲＮＡは、Ｄ−リボースの糖成分とアデニン（Ａ）、グ
アニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）等の
塩基成分を持つヌクレオチドが、ホスホジエステル結合
で一本の鎖状重合体を形成したポリヌクレオチドであ
り、このＲＮＡの生合成は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、
ＵＴＰ等のヌクレオチド三燐酸を基質としてＤＮＡまた
はＲＮＡ依存的にＲＮＡポリメラーゼにより行われる。
その反応産物はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ト
ランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ
（ｒＲＮＡ）等であるが、いずれもＤＮＡまたはＲＮＡ
の鋳型を前もって必要とし、その反応産物は鋳型に相補
的なＲＮＡしか得られなかった。つまり、蛋白質のみの
情報に依存し、配列に多様性を持つＲＮＡを合成するこ
とは不可能であった。従って、多様性のあるＲＮＡプロ
ーブライブラリーを一度に得ることは、従来の技術では
不可能であった。
【００１０】［発明の目的］ 本発明は上記の実情に鑑みてなされたものであり、その
目的は、例えば、被検出体であるウイルスが変異を起こ
した場合でも充分対応できる多様性のあるポリヌクレオ
チドプローブライブラリー、及びその製造方法を提供す
るところにあり、また、前記ライブラリーから有用なポ
リヌクレオチドプローブを精製する方法を提供するとこ
ろにある。
目的は、例えば、被検出体であるウイルスが変異を起こ
した場合でも充分対応できる多様性のあるポリヌクレオ
チドプローブライブラリー、及びその製造方法を提供す
るところにあり、また、前記ライブラリーから有用なポ
リヌクレオチドプローブを精製する方法を提供するとこ
ろにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】請求項１記載のプローブ
ライブラリーの製造方法は、鋳型およびプライマー複合
体の不存在下、セルモコッカス・リトラリス由来の耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、デオキシリボヌクレ
オチド類似体を含むデオキシリボヌクレオチドを重合さ
せることを特徴とする方法である。
ライブラリーの製造方法は、鋳型およびプライマー複合
体の不存在下、セルモコッカス・リトラリス由来の耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、デオキシリボヌクレ
オチド類似体を含むデオキシリボヌクレオチドを重合さ
せることを特徴とする方法である。
【００１２】請求項２記載のプローブライブラリーの製
造方法は、鋳型およびプライマー複合体の不存在下、セ
ルモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼの存在下で、リボヌクレオチド類似体を含むリボヌ
クレオチドを重合させることを特徴とする方法である。
造方法は、鋳型およびプライマー複合体の不存在下、セ
ルモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼの存在下で、リボヌクレオチド類似体を含むリボヌ
クレオチドを重合させることを特徴とする方法である。
【００１３】請求項３記載のプローブライブラリーの製
造方法は、請求項１または２に記載の方法において、前
記した重合を約２０〜９０℃の温度下で行なうことを特
徴とする方法である。
造方法は、請求項１または２に記載の方法において、前
記した重合を約２０〜９０℃の温度下で行なうことを特
徴とする方法である。
【００１４】請求項４記載のプローブライブラリーの製
造方法は、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法にお
いて、前記した重合を中性〜弱アルカリ性（ｐＨ約７〜
１０）の条件下で行なうことを特徴とする方法である。
造方法は、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法にお
いて、前記した重合を中性〜弱アルカリ性（ｐＨ約７〜
１０）の条件下で行なうことを特徴とする方法である。
【００１５】請求項５記載のプローブライブラリーの製
造方法は、請求項１記載の方法において、前記デオキシ
リボヌクレオチド類似体が少なくともその塩基が異なる
類似体であることを特徴とする方法である。
造方法は、請求項１記載の方法において、前記デオキシ
リボヌクレオチド類似体が少なくともその塩基が異なる
類似体であることを特徴とする方法である。
【００１６】請求項６記載のプローブライブラリーの製
造方法は、請求項５記載の方法において、前記デオキシ
リボヌクレオチド類似体が、１，Ｎ６−エセノデオキシ
アデノシン−５’−三燐酸、フルオレセイン修飾デオキ
シウリジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾デオキシウリ
ジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾デオキシアデノシン
−５’−三燐酸、ジゴキシゲニン修飾デオキシウリジン
−５’−三燐酸、及びジニトロフェニル修飾デオキシウ
リジン−５’−三燐酸からなる群より選ばれた少なくと
も１種であることを特徴とする方法である。
造方法は、請求項５記載の方法において、前記デオキシ
リボヌクレオチド類似体が、１，Ｎ６−エセノデオキシ
アデノシン−５’−三燐酸、フルオレセイン修飾デオキ
シウリジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾デオキシウリ
ジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾デオキシアデノシン
−５’−三燐酸、ジゴキシゲニン修飾デオキシウリジン
−５’−三燐酸、及びジニトロフェニル修飾デオキシウ
リジン−５’−三燐酸からなる群より選ばれた少なくと
も１種であることを特徴とする方法である。
【００１７】請求項７記載のプローブライブラリーの製
造方法は、請求項２記載の方法において、前記リボヌク
レオチド類似体が、少なくともその塩基が異なる類似体
であることを特徴とする方法である。
造方法は、請求項２記載の方法において、前記リボヌク
レオチド類似体が、少なくともその塩基が異なる類似体
であることを特徴とする方法である。
【００１８】請求項８記載のプローブライブラリーの製
造方法は、請求項７記載の方法において、前記リボヌク
レオチド類似体が１，Ｎ６−エセノアデノシン−５’−
三燐酸、フルオレセイン修飾ウリジン−５’−三燐酸、
ビオチン修飾ウリジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾ア
デノシン−５’−三燐酸、ジゴキシゲニン修飾ウリジン
−５’−三燐酸、及びジニトロフェニル修飾ウリジン−
５’−三燐酸からなる群より選ばれた少なくとも１種で
あることを特徴とする方法である。
造方法は、請求項７記載の方法において、前記リボヌク
レオチド類似体が１，Ｎ６−エセノアデノシン−５’−
三燐酸、フルオレセイン修飾ウリジン−５’−三燐酸、
ビオチン修飾ウリジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾ア
デノシン−５’−三燐酸、ジゴキシゲニン修飾ウリジン
−５’−三燐酸、及びジニトロフェニル修飾ウリジン−
５’−三燐酸からなる群より選ばれた少なくとも１種で
あることを特徴とする方法である。
【００１９】請求項９記載のプローブライブラリーは、
請求項１〜８のいずれか１項記載の製造方法により得ら
れたものである。
請求項１〜８のいずれか１項記載の製造方法により得ら
れたものである。
【００２０】請求項１０記載のプローブの精製方法は、
請求項９記載のプローブライブラリーから他のＤＮＡま
たはＲＮＡとハイブリッドを形成する能力を有するプロ
ーブを精製する方法であって、前記した他のＤＮＡまた
はＲＮＡをリガンドとして共有結合したアフィニティー
クロマトグラフィーを用いることにより行なわれる方法
である。
請求項９記載のプローブライブラリーから他のＤＮＡま
たはＲＮＡとハイブリッドを形成する能力を有するプロ
ーブを精製する方法であって、前記した他のＤＮＡまた
はＲＮＡをリガンドとして共有結合したアフィニティー
クロマトグラフィーを用いることにより行なわれる方法
である。
【００２１】請求項１１記載のプローブの精製方法は、
請求項１０記載の方法において、他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａがウイルス由来であることを特徴とする方法である。
請求項１０記載の方法において、他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａがウイルス由来であることを特徴とする方法である。
【００２２】請求項１２記載のプローブの精製方法は、
請求項１１記載の方法において、前記ウィルスがヒト免
疫不全ウィルスであることを特徴とする方法である。
請求項１１記載の方法において、前記ウィルスがヒト免
疫不全ウィルスであることを特徴とする方法である。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明者等は、核酸塩基類似体を
含むポリヌクレオチド合成の研究において種々の発見を
した。すなわち、鋳型およびプライマー複合体が存在し
ない反応系において、蛋白質、例えば耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ、具体的には、セルモコッカス・リトラリス
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｒａｌｉｓ）のＤ
ＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｖｅｎｔ（ベント） ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ニューイングランド・バイオレイブ
ス、以下、「Ｔｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ」と略称）
をｐＨ約７または１０以下の弱アルカリ性条件下で、Ｄ
ＮＡ合成の場合にはデオキシリボヌクレオチド三燐酸
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）と核酸類
似体とを基質として、またＲＮＡ合成の場合にはリボヌ
クレオチド三燐酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）
と核酸類似体とを基質として、ポリメラーゼが失活しな
い約２０℃以上の昇温下で１時間以上反応させることに
より、鋳型およびプライマー複合体が存在しない反応系
でも核酸類似体を含むＤＮＡ（以下、「ＮＴＰＡ−ＤＮ
Ａ」と略称）あるいはＲＮＡ（以下、「ＮＴＰＡ−ＲＮ
Ａ」と略称）を合成することができることを見い出し
た。
含むポリヌクレオチド合成の研究において種々の発見を
した。すなわち、鋳型およびプライマー複合体が存在し
ない反応系において、蛋白質、例えば耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ、具体的には、セルモコッカス・リトラリス
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｒａｌｉｓ）のＤ
ＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｖｅｎｔ（ベント） ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ニューイングランド・バイオレイブ
ス、以下、「Ｔｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ」と略称）
をｐＨ約７または１０以下の弱アルカリ性条件下で、Ｄ
ＮＡ合成の場合にはデオキシリボヌクレオチド三燐酸
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）と核酸類
似体とを基質として、またＲＮＡ合成の場合にはリボヌ
クレオチド三燐酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）
と核酸類似体とを基質として、ポリメラーゼが失活しな
い約２０℃以上の昇温下で１時間以上反応させることに
より、鋳型およびプライマー複合体が存在しない反応系
でも核酸類似体を含むＤＮＡ（以下、「ＮＴＰＡ−ＤＮ
Ａ」と略称）あるいはＲＮＡ（以下、「ＮＴＰＡ−ＲＮ
Ａ」と略称）を合成することができることを見い出し
た。
【００２４】本発明により合成された「ＮＴＰＡ−ＤＮ
Ａ、又はＮＴＰＡ−ＲＮＡ」、すなわち「ＮＴＰＡ−ポ
リヌクレオチド」には、様々な塩基配列を持つポリヌク
レオチドが多数含まれている。これにより、前記ＮＴＰ
Ａ−ポリヌクレオチドは、そのハイブリダイズ形成能力
に富んでいるといえる。つまり、ハイブリダイズに多様
性を有しているといえる。このようなＮＴＰＡ−ポリヌ
クレオチドを用いることにより、例えばある種のウイル
スの検出を行なう場合、その操作を簡便にし得、所要時
間を飛躍的に短くすることができる。すなわち、従来、
あるウイルス感染細胞から、疑いのあるウイルスを検出
する場合は、まずそのウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡの
塩基配列を決定するところから始まった。この塩基配列
の決定には、煩雑な作業と多くのコストが掛かるが、め
でたく塩基配列が決定されると、次にこれにハイブリダ
イズするＤＮＡプローブを作成し、そして、このＤＮＡ
プローブを用いたウイルスの検出が行なわれた。
Ａ、又はＮＴＰＡ−ＲＮＡ」、すなわち「ＮＴＰＡ−ポ
リヌクレオチド」には、様々な塩基配列を持つポリヌク
レオチドが多数含まれている。これにより、前記ＮＴＰ
Ａ−ポリヌクレオチドは、そのハイブリダイズ形成能力
に富んでいるといえる。つまり、ハイブリダイズに多様
性を有しているといえる。このようなＮＴＰＡ−ポリヌ
クレオチドを用いることにより、例えばある種のウイル
スの検出を行なう場合、その操作を簡便にし得、所要時
間を飛躍的に短くすることができる。すなわち、従来、
あるウイルス感染細胞から、疑いのあるウイルスを検出
する場合は、まずそのウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡの
塩基配列を決定するところから始まった。この塩基配列
の決定には、煩雑な作業と多くのコストが掛かるが、め
でたく塩基配列が決定されると、次にこれにハイブリダ
イズするＤＮＡプローブを作成し、そして、このＤＮＡ
プローブを用いたウイルスの検出が行なわれた。
【００２５】しかし、本発明のＮＴＰＡ−ポリヌクレオ
チドを用いることにより、疑いのあるウイルスのＲＮＡ
の塩基配列を予め決定しておく必要はなくなる。例え
ば、アフィニティークロマトグラフィーを用いる場合、
担体として当該ウイルスＲＮＡをリガンドとして共有結
合させたアフィニティークロマトグラフィー担体を使用
し、これに対してＮＴＰＡ−ポリヌクレオチドを流す。
ＮＴＰＡ−ポリヌクレオチド中に、前記ウイルスＲＮＡ
とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブが含ま
れていれば、この時点で両者は結合する（ハイブリダイ
ズする）。その後、二次的にポリヌクレオチド溶出緩衝
液を流すことにより、それまでハイブリダイズしていた
ポリヌクレオチドプローブが溶出され回収できる。そし
て、この回収されたポリヌクレオチドプローブは、当然
のことながら当該ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ及びウイ
ルスに感染した細胞の染色体に導入されたウイルス由来
のＤＮＡとハイブリダイズする筈であるから、前記ウイ
ルス検出用プローブとして使用可能となるわけである。
チドを用いることにより、疑いのあるウイルスのＲＮＡ
の塩基配列を予め決定しておく必要はなくなる。例え
ば、アフィニティークロマトグラフィーを用いる場合、
担体として当該ウイルスＲＮＡをリガンドとして共有結
合させたアフィニティークロマトグラフィー担体を使用
し、これに対してＮＴＰＡ−ポリヌクレオチドを流す。
ＮＴＰＡ−ポリヌクレオチド中に、前記ウイルスＲＮＡ
とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブが含ま
れていれば、この時点で両者は結合する（ハイブリダイ
ズする）。その後、二次的にポリヌクレオチド溶出緩衝
液を流すことにより、それまでハイブリダイズしていた
ポリヌクレオチドプローブが溶出され回収できる。そし
て、この回収されたポリヌクレオチドプローブは、当然
のことながら当該ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ及びウイ
ルスに感染した細胞の染色体に導入されたウイルス由来
のＤＮＡとハイブリダイズする筈であるから、前記ウイ
ルス検出用プローブとして使用可能となるわけである。
【００２６】このように、本発明によれば、従来のよう
に検出すべきウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を
予め決定し作業者がそれを認識しておく必要はないの
で、その分、当該ウイルスの検出が簡便になり、しかも
処理時間が飛躍的に短縮化される。
に検出すべきウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を
予め決定し作業者がそれを認識しておく必要はないの
で、その分、当該ウイルスの検出が簡便になり、しかも
処理時間が飛躍的に短縮化される。
【００２７】ウイルス検出の所要時間の短縮化は、他の
生化学物質（例えば、酵素やホルモンなど）検出の処理
時間の短縮化と比べ、その意義において大きく異なり、
その効果は絶大である。というのは、ウイルスの場合、
“突然変異”、すなわちその塩基配列が変化する現象が
多々みられ、そのことからすれば、ウイルスの検出は１
分でも速い方がよく、むやみに時間をかけることが許さ
れないからである。
生化学物質（例えば、酵素やホルモンなど）検出の処理
時間の短縮化と比べ、その意義において大きく異なり、
その効果は絶大である。というのは、ウイルスの場合、
“突然変異”、すなわちその塩基配列が変化する現象が
多々みられ、そのことからすれば、ウイルスの検出は１
分でも速い方がよく、むやみに時間をかけることが許さ
れないからである。
【００２８】本発明で使用し得る核酸類似体（特定のＤ
ＮＡあるいはＲＮＡの検出や定量、あるいは各種ＤＮＡ
間、各種ＲＮＡ間の類縁性などを判断するために用いら
れるＤＮＡプローブやＲＮＡプローブを提供するため、
ＤＮＡあるいはＲＮＡに標識性を付与する目的で用いら
れる核酸の類似体）としては特に限定はなく、ＤＮＡプ
ローブライブラリー製造の場合には、例えば、１，Ｎ６
−エセノデオキシアデノシン−５’−三燐酸、蛍光標識
デオキシリボヌクレオチド三燐酸、化学修飾デオキシリ
ボヌクレオチド三燐酸等（より具体的には、１，Ｎ６−
エセノデオキシアデノシン−５’−三燐酸、フルオレセ
イン修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸、ビオチン修
飾デオキシウリジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾デオ
キシアデノシン−５’−三燐酸、ジゴキシゲニン修飾デ
オキシウリジン−５’−三燐酸、及びジニトロフェニル
修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸等）が挙げられ
る。また、ＲＮＡプローブライブラリー製造の場合に
は、例えば、１，Ｎ６−エセノアデノシン−５’−三燐
酸、蛍光標識リボヌクレオチド三燐酸、化学修飾リボヌ
クレオチド三燐酸等（より具体的には、１，Ｎ６−エセ
ノアデノシン−５’−三燐酸、フルオレセイン修飾ウリ
ジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾ウリジン−５’−三
燐酸、ビオチン修飾アデノシン−５’−三燐酸、ジゴキ
シゲニン修飾ウリジン−５’−三燐酸、及びジニトロフ
ェニル修飾ウリジン−５’−三燐酸等）が挙げられる。
これら核酸類似体は塩基の部分に指標物質が結合して標
識性を獲得してさえいれば充分であるが（プローブとし
て充分機能するが）、塩基が異なっていることのみなら
ず、これに加え、さらにペントースも相違している類似
体（例えば、下記［化１］に示すように、リボース（ａ
参照）の代わりにアラビノース（ｂ参照）やキシロース
（ｃ参照）等を含むヌクレオチド類似体、あるいは５員
環を構成するＯ（酸素）がＳ（硫黄）に入れ換わったも
の（ｄ参照）等の類似体）および／または燐酸基も相違
している類似体（例えば、下記［化２］に示すように、
Ｐ（燐）と結合するＯ（酸素）がＳ（硫黄）あるいはそ
の他の原子に入れ換わった類似体）の使用も本発明を妨
げるものではない（なお、［化２］では塩基としてアデ
ノシンを例示したがこれに限らず、グアニン、シトシン
の場合も有効）。
ＮＡあるいはＲＮＡの検出や定量、あるいは各種ＤＮＡ
間、各種ＲＮＡ間の類縁性などを判断するために用いら
れるＤＮＡプローブやＲＮＡプローブを提供するため、
ＤＮＡあるいはＲＮＡに標識性を付与する目的で用いら
れる核酸の類似体）としては特に限定はなく、ＤＮＡプ
ローブライブラリー製造の場合には、例えば、１，Ｎ６
−エセノデオキシアデノシン−５’−三燐酸、蛍光標識
デオキシリボヌクレオチド三燐酸、化学修飾デオキシリ
ボヌクレオチド三燐酸等（より具体的には、１，Ｎ６−
エセノデオキシアデノシン−５’−三燐酸、フルオレセ
イン修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸、ビオチン修
飾デオキシウリジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾デオ
キシアデノシン−５’−三燐酸、ジゴキシゲニン修飾デ
オキシウリジン−５’−三燐酸、及びジニトロフェニル
修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸等）が挙げられ
る。また、ＲＮＡプローブライブラリー製造の場合に
は、例えば、１，Ｎ６−エセノアデノシン−５’−三燐
酸、蛍光標識リボヌクレオチド三燐酸、化学修飾リボヌ
クレオチド三燐酸等（より具体的には、１，Ｎ６−エセ
ノアデノシン−５’−三燐酸、フルオレセイン修飾ウリ
ジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾ウリジン−５’−三
燐酸、ビオチン修飾アデノシン−５’−三燐酸、ジゴキ
シゲニン修飾ウリジン−５’−三燐酸、及びジニトロフ
ェニル修飾ウリジン−５’−三燐酸等）が挙げられる。
これら核酸類似体は塩基の部分に指標物質が結合して標
識性を獲得してさえいれば充分であるが（プローブとし
て充分機能するが）、塩基が異なっていることのみなら
ず、これに加え、さらにペントースも相違している類似
体（例えば、下記［化１］に示すように、リボース（ａ
参照）の代わりにアラビノース（ｂ参照）やキシロース
（ｃ参照）等を含むヌクレオチド類似体、あるいは５員
環を構成するＯ（酸素）がＳ（硫黄）に入れ換わったも
の（ｄ参照）等の類似体）および／または燐酸基も相違
している類似体（例えば、下記［化２］に示すように、
Ｐ（燐）と結合するＯ（酸素）がＳ（硫黄）あるいはそ
の他の原子に入れ換わった類似体）の使用も本発明を妨
げるものではない（なお、［化２］では塩基としてアデ
ノシンを例示したがこれに限らず、グアニン、シトシン
の場合も有効）。
【００２９】
【化１】
【化２】
【００３０】これらの類似体は、１種を単独で使用して
も良いし、２種以上を併用することもできる。類似体の
配合割合には特に限定はないが、デオキシリボヌクレオ
チドあるいはリボヌクレオチド全量１００に対し、１以
上（モル比）であることが好ましい。（デオキシ）リボ
ヌクレオチド全量１００に対する類似体の配合割合が１
未満の場合には、ＮＴＰＡ−ポリヌクレオチドの標識効
率の低下によりプローブとして使用できなくなるという
問題が生じる可能性がある。
も良いし、２種以上を併用することもできる。類似体の
配合割合には特に限定はないが、デオキシリボヌクレオ
チドあるいはリボヌクレオチド全量１００に対し、１以
上（モル比）であることが好ましい。（デオキシ）リボ
ヌクレオチド全量１００に対する類似体の配合割合が１
未満の場合には、ＮＴＰＡ−ポリヌクレオチドの標識効
率の低下によりプローブとして使用できなくなるという
問題が生じる可能性がある。
【００３１】なお、デオキシリボヌクレオチド類似体を
含有するデオキシリボヌクレオチドの重合時に、１−
（２’−デオキシリボフラノシル）−３−ニトロピロー
ル、１−（２’−デオキシリボフラノシル）−ニトロイ
ンドールを配合すること、及びリボヌクレオチド類似体
を含有するリボヌクレオチドの重合時に、１−（２’−
リボフラノシル）−３−ニトロピロール、１−（２’−
リボフラノシル）−ニトロインドールを配合することも
本発明の範疇である。プローブ合成時において、上記し
た化合物（以下、「多様化剤」という）を（デオキシ）
リボヌクレオチド類似体および（デオキシ）リボヌクレ
オチドと一緒に反応系中に配合することにより、合成さ
れるプローブ分子内に前記多様化剤が導入される（つま
り、ＮＴＰＡ−ポリヌクレオチド分子内に前記多様化剤
が取り込まれる）。多様化剤が取り込まれると、ＮＴＰ
Ａ−ポリヌクレオチドは配列特異性が低下し、これによ
り、（１）プローブの多様性が通常より増加する。
（２）ある遺伝子に対してスクリーニングしたプローブ
が該遺伝子の変異型に付いてもそのまま利用できる（例
えば、あるＨＩＶ−１についてスクリーニングしたプロ
ーブが、変異したＨＩＶ−１についてもそのまま利用で
きる）。このことより、通常以上に多様性を持ったプロ
ーブライブラリーを提供できることに加え、特定遺伝子
以外の変異型についても利用できるプローブを提供する
ことができる。
含有するデオキシリボヌクレオチドの重合時に、１−
（２’−デオキシリボフラノシル）−３−ニトロピロー
ル、１−（２’−デオキシリボフラノシル）−ニトロイ
ンドールを配合すること、及びリボヌクレオチド類似体
を含有するリボヌクレオチドの重合時に、１−（２’−
リボフラノシル）−３−ニトロピロール、１−（２’−
リボフラノシル）−ニトロインドールを配合することも
本発明の範疇である。プローブ合成時において、上記し
た化合物（以下、「多様化剤」という）を（デオキシ）
リボヌクレオチド類似体および（デオキシ）リボヌクレ
オチドと一緒に反応系中に配合することにより、合成さ
れるプローブ分子内に前記多様化剤が導入される（つま
り、ＮＴＰＡ−ポリヌクレオチド分子内に前記多様化剤
が取り込まれる）。多様化剤が取り込まれると、ＮＴＰ
Ａ−ポリヌクレオチドは配列特異性が低下し、これによ
り、（１）プローブの多様性が通常より増加する。
（２）ある遺伝子に対してスクリーニングしたプローブ
が該遺伝子の変異型に付いてもそのまま利用できる（例
えば、あるＨＩＶ−１についてスクリーニングしたプロ
ーブが、変異したＨＩＶ−１についてもそのまま利用で
きる）。このことより、通常以上に多様性を持ったプロ
ーブライブラリーを提供できることに加え、特定遺伝子
以外の変異型についても利用できるプローブを提供する
ことができる。
【００３２】なお、前記した多様化剤を用いる場合のそ
の添加量としては、デオキシリボヌクレオチドあるいは
リボヌクレオチド全量１００に対し、５〜８０（モル
比）であることが好ましい。多様化剤の添加量が８０を
超える場合は、プローブ自身の特異性が低下し過ぎてノ
イズが増え、偽陽性となる可能性がアップし、また５未
満の場合は、配列特異性がそれほど低下せず、上記した
（１）及び（２）の効果が得られにくくなる。
の添加量としては、デオキシリボヌクレオチドあるいは
リボヌクレオチド全量１００に対し、５〜８０（モル
比）であることが好ましい。多様化剤の添加量が８０を
超える場合は、プローブ自身の特異性が低下し過ぎてノ
イズが増え、偽陽性となる可能性がアップし、また５未
満の場合は、配列特異性がそれほど低下せず、上記した
（１）及び（２）の効果が得られにくくなる。
【００３３】ＤＮＡポリメラーゼは約２０℃以上、好ま
しくは約６０℃以上、さらに好ましくは約７０℃以上の
温度でも失活しないものが好ましい。その例としては、
上掲したセルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）等のセルモコッカス
属以外に、セルマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフィルス（Ｔ．ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマス属に属する細菌
のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
しくは約６０℃以上、さらに好ましくは約７０℃以上の
温度でも失活しないものが好ましい。その例としては、
上掲したセルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）等のセルモコッカス
属以外に、セルマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフィルス（Ｔ．ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマス属に属する細菌
のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３４】上記ＤＮＡポリメラーゼは１種を単独で使
用してもよいし、２種以上（２種、３種、……）を併用
した混合系として用いることもできる。ＤＮＡポリメラ
ーゼを２種以上併用してデオキシリボヌクレオチド、あ
るいはリボヌクレオチドを重合する場合は、１種単独で
重合する場合と比べ、一度に合成されるポリヌクレオチ
ドがさらに多様化し（すなわち、塩基配列がより様々な
ポリヌクレオチドライブラリーが得られ）、ポリヌクレ
オチドプローブとなり得るポリヌクレオチドの含有率が
高くなる。この場合、同属の異なる細菌のＤＮＡポリメ
ラーゼの併用でもよいし、異なる属の細菌のＤＮＡポリ
メラーゼでもよい。
用してもよいし、２種以上（２種、３種、……）を併用
した混合系として用いることもできる。ＤＮＡポリメラ
ーゼを２種以上併用してデオキシリボヌクレオチド、あ
るいはリボヌクレオチドを重合する場合は、１種単独で
重合する場合と比べ、一度に合成されるポリヌクレオチ
ドがさらに多様化し（すなわち、塩基配列がより様々な
ポリヌクレオチドライブラリーが得られ）、ポリヌクレ
オチドプローブとなり得るポリヌクレオチドの含有率が
高くなる。この場合、同属の異なる細菌のＤＮＡポリメ
ラーゼの併用でもよいし、異なる属の細菌のＤＮＡポリ
メラーゼでもよい。
【００３５】デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌク
レオチド（いずれも類似体を含む）とＤＮＡポリメラー
ゼとの反応における反応温度と時間は、ＤＮＡポリメラ
ーゼが失活しない範囲で選ぶことができ、約２０℃以上
でポリメラーゼ活性を示す範囲の温度条件下で反応させ
ることにより、反応を速やかに進行させることができ
る。たとえば、７４℃で数時間反応させてもよく、また
通常のＰＣＲ反応の条件、たとえば、（１）９５℃で１
分間保持、（２）４５℃で２分間保持、（３）７４℃で
３分間保持のサイクルを反復してもよい。反応は初期に
若干の遅延時間を経たのち開始され、やがて最大速度に
達する。本発明の方法により合成されるポリヌクレオチ
ドは鋳型やプライマーとなるべきＤＮＡやＲＮＡに依存
せず、反応系に存在するＤＮＡポリメラーゼの情報に依
存して合成されると考えられる。
レオチド（いずれも類似体を含む）とＤＮＡポリメラー
ゼとの反応における反応温度と時間は、ＤＮＡポリメラ
ーゼが失活しない範囲で選ぶことができ、約２０℃以上
でポリメラーゼ活性を示す範囲の温度条件下で反応させ
ることにより、反応を速やかに進行させることができ
る。たとえば、７４℃で数時間反応させてもよく、また
通常のＰＣＲ反応の条件、たとえば、（１）９５℃で１
分間保持、（２）４５℃で２分間保持、（３）７４℃で
３分間保持のサイクルを反復してもよい。反応は初期に
若干の遅延時間を経たのち開始され、やがて最大速度に
達する。本発明の方法により合成されるポリヌクレオチ
ドは鋳型やプライマーとなるべきＤＮＡやＲＮＡに依存
せず、反応系に存在するＤＮＡポリメラーゼの情報に依
存して合成されると考えられる。
【００３６】なお、ＤＮＡポリメラーゼを用いた（デオ
キシ）リボヌクレオチドの重合において、反応温度が２
０℃未満の場合には反応速度が低下し、また９０℃を超
える場合には酵素の安定性が低下するので好ましくな
い。また、ｐＨ約７または１０以下の弱アルカリ性条件
から外れる条件、すなわち酸性下条件及び強アルカリ性
条件下でも反応速度が低下するのでやはり好ましくな
い。上記の反応温度、及び反応系の液性（ｐＨ）に関し
ては、蛋白質の反応特性に依存する（Ｋｏｎｇ，Ｈ．ｅ
ｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１９６
５−１９７５（１９９３）参照）。
キシ）リボヌクレオチドの重合において、反応温度が２
０℃未満の場合には反応速度が低下し、また９０℃を超
える場合には酵素の安定性が低下するので好ましくな
い。また、ｐＨ約７または１０以下の弱アルカリ性条件
から外れる条件、すなわち酸性下条件及び強アルカリ性
条件下でも反応速度が低下するのでやはり好ましくな
い。上記の反応温度、及び反応系の液性（ｐＨ）に関し
ては、蛋白質の反応特性に依存する（Ｋｏｎｇ，Ｈ．ｅ
ｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１９６
５−１９７５（１９９３）参照）。
【００３７】合成されたＮＴＰＡ−ポリヌクレオチド
は、前述したように、遺伝子診断用のプローブライブラ
リーを提供する。遺伝子診断の例としてＨＩＶ感染を検
出するプローブを該プローブライブラリーよりスクリー
ニングし、該プローブを用いてＨＩＶ感染の診断を行な
う。スクリーニングの手法としては、親和性（アフィニ
ティー）クロマトグラフィーを用いる。まず、ＨＩＶ
ＲＮＡを適当なクロマトグラフィー担体、例えば、ＣＮ
Ｂｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）等
の担体に共有結合し、ＨＩＶ ＲＮＡアフィニティーカ
ラムを作製し、液体クロマトグラフィーを行う。クロマ
トグラフィーの条件としては、中性から弱アルカリ性ｐ
Ｈ約６〜約９までの高塩濃度の緩衝液にてカラムを平衡
化し、これにＮＴＰＡ−ポリヌクレオチドを供し、ＨＩ
Ｖ ＲＮＡとハイブリッド形成させる。次に、ＨＩＶ
ＲＮＡとハイブリッド形成したＮＴＰＡ−ポリヌクレオ
チドを溶出、回収するために、緩衝液を高濃度ホルムア
ミドを含む中性から弱アルカリ性（ｐＨ約６〜約９ま
で）にする。このとき溶出されてくるポリヌクレオチド
を検出するためには一般的にポリヌクレオチドの検出に
用いられる波長約２６０ｎｍの紫外線吸収の測定を行
う。かくして、ＮＴＰＡ−ポリヌクレオチドよりＨＩＶ
感染を検出できるプローブを分離することができ、この
アフィニティークロマトグラフィーに用いるＲＮＡやＤ
ＮＡを変えることにより、多様なプローブをスクリーニ
ングすることができる。例えば、インフルエンザウイル
スやＣ型肝炎ウィルス（以下、「ＨＣＶ」と略称）やＤ
型肝炎ウィルス（以下、「ＨＤＶ」と略称）等のウイル
スＲＮＡやｃＤＮＡ、あるいは細胞の腫瘍化に深く関与
している癌遺伝子や成長因子のｍＲＮＡやｃＤＮＡ等や
セントロメア等に存在している繰返し配列を持つＤＮＡ
等のアフィニティーカラムを用いればそれぞれに対応す
るプローブをスクリーニングすることができる。
は、前述したように、遺伝子診断用のプローブライブラ
リーを提供する。遺伝子診断の例としてＨＩＶ感染を検
出するプローブを該プローブライブラリーよりスクリー
ニングし、該プローブを用いてＨＩＶ感染の診断を行な
う。スクリーニングの手法としては、親和性（アフィニ
ティー）クロマトグラフィーを用いる。まず、ＨＩＶ
ＲＮＡを適当なクロマトグラフィー担体、例えば、ＣＮ
Ｂｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）等
の担体に共有結合し、ＨＩＶ ＲＮＡアフィニティーカ
ラムを作製し、液体クロマトグラフィーを行う。クロマ
トグラフィーの条件としては、中性から弱アルカリ性ｐ
Ｈ約６〜約９までの高塩濃度の緩衝液にてカラムを平衡
化し、これにＮＴＰＡ−ポリヌクレオチドを供し、ＨＩ
Ｖ ＲＮＡとハイブリッド形成させる。次に、ＨＩＶ
ＲＮＡとハイブリッド形成したＮＴＰＡ−ポリヌクレオ
チドを溶出、回収するために、緩衝液を高濃度ホルムア
ミドを含む中性から弱アルカリ性（ｐＨ約６〜約９ま
で）にする。このとき溶出されてくるポリヌクレオチド
を検出するためには一般的にポリヌクレオチドの検出に
用いられる波長約２６０ｎｍの紫外線吸収の測定を行
う。かくして、ＮＴＰＡ−ポリヌクレオチドよりＨＩＶ
感染を検出できるプローブを分離することができ、この
アフィニティークロマトグラフィーに用いるＲＮＡやＤ
ＮＡを変えることにより、多様なプローブをスクリーニ
ングすることができる。例えば、インフルエンザウイル
スやＣ型肝炎ウィルス（以下、「ＨＣＶ」と略称）やＤ
型肝炎ウィルス（以下、「ＨＤＶ」と略称）等のウイル
スＲＮＡやｃＤＮＡ、あるいは細胞の腫瘍化に深く関与
している癌遺伝子や成長因子のｍＲＮＡやｃＤＮＡ等や
セントロメア等に存在している繰返し配列を持つＤＮＡ
等のアフィニティーカラムを用いればそれぞれに対応す
るプローブをスクリーニングすることができる。
【００３８】プローブのスクリーニングが終了すると、
次に実際の遺伝子診断の例として、ＦＩＳＨ法を用いて
ＨＩＶ感染の検出を行なう。まず、ＣＤ４ ＋発現ＨｅＬ
ａ細胞（以下、「ＨｅＬａ ＣＤ４ ＋細胞」と略称）に
ＨＩＶ−１を感染させたものと感染させないものを公知
の方法により染色体標本（スライド標本）を作製する。
このスライド標本にＨＩＶ−１検出プローブとして、前
述の蛍光標識したプローブかまたは化学標識したプロー
ブを加え標本のＤＮＡと公知の手法によりハイブリッド
を形成させる。蛍光標識したプローブとハイブリッド形
成させた標本はそのまま蛍光顕微鏡で観察する。また、
化学標識したプローブとハイブリッドを形成させた標本
は、例えば、ビオチン標識ならばアビジン−ＦＩＴＣや
アビジン−ローダミン等のビオチンに結合できる物質に
前もって蛍光色素を共有結合したもの、フルオレセイン
標識ならば抗フルオレセイン−ＦＩＴＣや抗フルオレセ
イン−ローダミン等のフルオレセインに結合できる物質
に前もって蛍光色素を共有結合したもの、ジゴキシゲニ
ン標識ならば抗ジゴキシゲニン−ＦＩＴＣや抗ジゴキシ
ゲニン−ローダミン等のジゴキシゲニンに結合できる物
質に前もって蛍光色素を共有結合したもの、ジニトロフ
ェニル標識ならば抗ジニトロフェニル−ＦＩＴＣや抗ジ
ニトロフェニル−ローダミン等のジニトロフェニルに結
合できる物質に前もって蛍光色素を共有結合したもの
や、それぞれの標識化合物に特異的な抗体に前もって蛍
光色素を共有結合したものを用いて蛍光顕微鏡で観察す
る。その結果、ＨＩＶ−１が感染していない標本では蛍
光シグナルは観察できず、ＨＩＶ感染細胞からの標本で
は蛍光シグナルが観察できる。なお、ここで用いた方法
は、各種培養細胞はもとよりＨＩＶ感染患者の末消血に
も利用できる。
次に実際の遺伝子診断の例として、ＦＩＳＨ法を用いて
ＨＩＶ感染の検出を行なう。まず、ＣＤ４ ＋発現ＨｅＬ
ａ細胞（以下、「ＨｅＬａ ＣＤ４ ＋細胞」と略称）に
ＨＩＶ−１を感染させたものと感染させないものを公知
の方法により染色体標本（スライド標本）を作製する。
このスライド標本にＨＩＶ−１検出プローブとして、前
述の蛍光標識したプローブかまたは化学標識したプロー
ブを加え標本のＤＮＡと公知の手法によりハイブリッド
を形成させる。蛍光標識したプローブとハイブリッド形
成させた標本はそのまま蛍光顕微鏡で観察する。また、
化学標識したプローブとハイブリッドを形成させた標本
は、例えば、ビオチン標識ならばアビジン−ＦＩＴＣや
アビジン−ローダミン等のビオチンに結合できる物質に
前もって蛍光色素を共有結合したもの、フルオレセイン
標識ならば抗フルオレセイン−ＦＩＴＣや抗フルオレセ
イン−ローダミン等のフルオレセインに結合できる物質
に前もって蛍光色素を共有結合したもの、ジゴキシゲニ
ン標識ならば抗ジゴキシゲニン−ＦＩＴＣや抗ジゴキシ
ゲニン−ローダミン等のジゴキシゲニンに結合できる物
質に前もって蛍光色素を共有結合したもの、ジニトロフ
ェニル標識ならば抗ジニトロフェニル−ＦＩＴＣや抗ジ
ニトロフェニル−ローダミン等のジニトロフェニルに結
合できる物質に前もって蛍光色素を共有結合したもの
や、それぞれの標識化合物に特異的な抗体に前もって蛍
光色素を共有結合したものを用いて蛍光顕微鏡で観察す
る。その結果、ＨＩＶ−１が感染していない標本では蛍
光シグナルは観察できず、ＨＩＶ感染細胞からの標本で
は蛍光シグナルが観察できる。なお、ここで用いた方法
は、各種培養細胞はもとよりＨＩＶ感染患者の末消血に
も利用できる。
【００３９】これらの結果より、ＮＴＰＡ−ポリヌクレ
オチドは遺伝子診断用のプローブを提供できることが確
認される。また、この遺伝子診断はＨＩＶの他、例えば
インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ＨＤＶ等のウイルス
感染の検出や細胞の腫瘍化に深く関与している癌遺伝子
の検出にも利用できることから、今回合成された蛍光性
核酸類似体や化学修飾核酸類似体を含む本発明のＮＴＰ
Ａ−ポリヌクレオチドは、遺伝子診断用のプローブライ
ブラリーとして機能する。
オチドは遺伝子診断用のプローブを提供できることが確
認される。また、この遺伝子診断はＨＩＶの他、例えば
インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ＨＤＶ等のウイルス
感染の検出や細胞の腫瘍化に深く関与している癌遺伝子
の検出にも利用できることから、今回合成された蛍光性
核酸類似体や化学修飾核酸類似体を含む本発明のＮＴＰ
Ａ−ポリヌクレオチドは、遺伝子診断用のプローブライ
ブラリーとして機能する。
【００４０】なお、遺伝子診断の方法としては、ＦＩＳ
Ｈ法の他に公知の手法、例えば、サザン・ブロット法や
ノザン・ブロット法等を用いることができる。
Ｈ法の他に公知の手法、例えば、サザン・ブロット法や
ノザン・ブロット法等を用いることができる。
【００４１】本発明で用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
の製法、あるいはこれをコードする遺伝子の製法として
は今日において公知であり、当業者であれば容易に行う
ことができる。なお、以下に関連公報を列挙する（これ
らによっても得ることができる）。特開平２−６０５８
５号公報、特公平８−２４５７０号公報（特開平２−４
３４号公報）、特開平５−６８５４７号公報、特公平７
−５９１９５号公報（特開平５−１３０８７１号公
報）、特開平５−３２８９６９号公報、特開平７−５１
０６１号公報、特開平６−３３９３７３号公報、特開平
６−７１６０号公報
の製法、あるいはこれをコードする遺伝子の製法として
は今日において公知であり、当業者であれば容易に行う
ことができる。なお、以下に関連公報を列挙する（これ
らによっても得ることができる）。特開平２−６０５８
５号公報、特公平８−２４５７０号公報（特開平２−４
３４号公報）、特開平５−６８５４７号公報、特公平７
−５９１９５号公報（特開平５−１３０８７１号公
報）、特開平５−３２８９６９号公報、特開平７−５１
０６１号公報、特開平６−３３９３７３号公報、特開平
６−７１６０号公報
【００４２】
【実施例】以下に実施例の形で本発明をさらに説明する
が、これによって本発明が限定されるものではない。
が、これによって本発明が限定されるものではない。
【００４３】実施例１ （ＮＴＰＡ−ＤＮＡの合成（ＤＮＡプローブライブラリ
ーの製造）） 緩衝液Ａ［１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２
ＳＯ４、２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６
ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ オクトキシノール（トリ
トン Ｘ−１００）（全て最終濃度）］、及びデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］と下記
（１）〜（６）のデオキシリボヌクレオチド三燐酸類似
体（（１）：シグマ社製、（２）（３）及び（５）：ベ
ーリンガー・マンハイム社製、（４）：ギブコ社製、
（６）：フナコシ社製）から各々１つずつを選択したも
の（各々最終濃度２００μＭ）、２０単位／ｍｌ Ｔｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼから構成される反応液１００μ
ｌを、７４℃で３時間反応させた。
ーの製造）） 緩衝液Ａ［１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２
ＳＯ４、２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６
ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ オクトキシノール（トリ
トン Ｘ−１００）（全て最終濃度）］、及びデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］と下記
（１）〜（６）のデオキシリボヌクレオチド三燐酸類似
体（（１）：シグマ社製、（２）（３）及び（５）：ベ
ーリンガー・マンハイム社製、（４）：ギブコ社製、
（６）：フナコシ社製）から各々１つずつを選択したも
の（各々最終濃度２００μＭ）、２０単位／ｍｌ Ｔｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼから構成される反応液１００μ
ｌを、７４℃で３時間反応させた。
【００４４】 （１）１，Ｎ６−エセノデオキシアデノシン−５’−三
燐酸（［化３］参照。以下、「ε−ｄＡＴＰ」と略称） （２）フルオレセイン修飾デオキシウリジン−５’−三
燐酸（［化４］参照。以下、「Ｆｌｕ−ｄＵＴＰ」と略
称） （３）ビオチン修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸
（［化５］参照。以下「Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ」と略称） （４）ビオチン修飾デオキシアデノシン−５’−三燐酸
（以下「Ｂｉｏ−ｄＡＴＰ」と略称） （５）ジゴキシゲニン修飾デオキシウリジン−５’−三
燐酸（［化６］参照、以下、「Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ」と略
称） （６）ジニトロフェニル修飾デオキシウリジン−５’−
三燐酸（以下「Ｄｎｐ−ｄＵＴＰ」と略称）
燐酸（［化３］参照。以下、「ε−ｄＡＴＰ」と略称） （２）フルオレセイン修飾デオキシウリジン−５’−三
燐酸（［化４］参照。以下、「Ｆｌｕ−ｄＵＴＰ」と略
称） （３）ビオチン修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸
（［化５］参照。以下「Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ」と略称） （４）ビオチン修飾デオキシアデノシン−５’−三燐酸
（以下「Ｂｉｏ−ｄＡＴＰ」と略称） （５）ジゴキシゲニン修飾デオキシウリジン−５’−三
燐酸（［化６］参照、以下、「Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ」と略
称） （６）ジニトロフェニル修飾デオキシウリジン−５’−
三燐酸（以下「Ｄｎｐ−ｄＵＴＰ」と略称）
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【００４５】ε−ｄＡＴＰ（上記（１））を含む反応液
を０．８％アガロースゲルにて電気泳動後そのまま紫外
線照射下で観察した。その結果、５０−１０，０００塩
基対（以下、「ｂｐ」と略称）のところに発光するバン
ドが確認された。
を０．８％アガロースゲルにて電気泳動後そのまま紫外
線照射下で観察した。その結果、５０−１０，０００塩
基対（以下、「ｂｐ」と略称）のところに発光するバン
ドが確認された。
【００４６】次に、他のデオキシリボヌクレオチド三燐
酸（上記（２）〜（６））を含む反応液については同様
に０．８％アガロースゲルにて電気泳動し、その後ニト
ロセルロースフィルター（シュライヒャー＆シュエル社
製）にＤＮＡをトランスファーした。このフィルターを
８０℃で２時間乾燥させ、プレハイブリッド形成緩衝液
［５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（６００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、６０ｍＭ クエン酸３ナトリウム２水和物）、５
０ｍＭ ヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ナカライテクス社製）
／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．５％ ポリビニルピロ
リドン、０．５％ フィコール４００（シグマ社製）、
０．５％ 仔牛血清アルブミン、１０ｍｇ／ｍｌ 変性
サケ精子ＤＮＡ（シグマ社製）］１０ｍｌに浸し、４２
℃、２時間プレハイブリッド形成をさせた。その後、フ
ィルターを緩衝液Ｔ［５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］５０ｍｌに浸し、室
温で５分間放置し、続けてフィルターを緩衝液Ｔ １０
ｍｌに移し替え浸した。このなかに、類似体（２）を含
む反応液については下記（１）を、また、類似体
（３）、（４）を含む反応液については下記（２）を、
類似体（５）を含む反応液については下記（３）を、類
似体（６）を含む反応液については下記（４）を、それ
ぞれ５０μｇ加え、室温で１時間反応させた。
酸（上記（２）〜（６））を含む反応液については同様
に０．８％アガロースゲルにて電気泳動し、その後ニト
ロセルロースフィルター（シュライヒャー＆シュエル社
製）にＤＮＡをトランスファーした。このフィルターを
８０℃で２時間乾燥させ、プレハイブリッド形成緩衝液
［５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（６００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、６０ｍＭ クエン酸３ナトリウム２水和物）、５
０ｍＭ ヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ナカライテクス社製）
／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．５％ ポリビニルピロ
リドン、０．５％ フィコール４００（シグマ社製）、
０．５％ 仔牛血清アルブミン、１０ｍｇ／ｍｌ 変性
サケ精子ＤＮＡ（シグマ社製）］１０ｍｌに浸し、４２
℃、２時間プレハイブリッド形成をさせた。その後、フ
ィルターを緩衝液Ｔ［５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］５０ｍｌに浸し、室
温で５分間放置し、続けてフィルターを緩衝液Ｔ １０
ｍｌに移し替え浸した。このなかに、類似体（２）を含
む反応液については下記（１）を、また、類似体
（３）、（４）を含む反応液については下記（２）を、
類似体（５）を含む反応液については下記（３）を、類
似体（６）を含む反応液については下記（４）を、それ
ぞれ５０μｇ加え、室温で１時間反応させた。
【００４７】 （１）抗フルオレセイン−アルカリホスファターゼ標識
抗体（抗Ｆｌｕ−ＡＰ抗体、フナコシ社製） （２）アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジ
ン（以下「ＳＡ−ＡＰ」と略称、フナコシ社製） （３）抗ジゴキシゲニン−アルカリフォスファターゼ標
識抗体（抗Ｄｉｇ−ＡＰ抗体、ベーリンガー・マンハイ
ム社製）。
抗体（抗Ｆｌｕ−ＡＰ抗体、フナコシ社製） （２）アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジ
ン（以下「ＳＡ−ＡＰ」と略称、フナコシ社製） （３）抗ジゴキシゲニン−アルカリフォスファターゼ標
識抗体（抗Ｄｉｇ−ＡＰ抗体、ベーリンガー・マンハイ
ム社製）。
【００４８】 （４）抗ジニトロフェノールアルカリフォスファターゼ
標識抗体（抗Ｄｎｐ−ＡＰ抗体、フナコシ社製）。
標識抗体（抗Ｄｎｐ−ＡＰ抗体、フナコシ社製）。
【００４９】フィルターを緩衝液Ｔ ５０ｍｌにて３回
洗浄し、これらフィルターを発色液［１００ｍＭ トリ
ス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１
００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０μｇ／ｍｌ ２−（４−イ
オドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フ
ェニル−テトラゾリウムクロライド（シグマ社製、以下
「ＩＮＴ」と略称）、２５０μｇ／ｍｌ ５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルフォスフェード（シグマ社
製、以下「Ｘ−フォスフェート」と略称）］１０ｍｌに
浸し、室温で３０分間反応させ、発色完了後、水洗し乾
燥させた。この結果、全ての反応液で５０−１０，００
０ｂｐに分布する青色を呈するバンドが確認された。
洗浄し、これらフィルターを発色液［１００ｍＭ トリ
ス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１
００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０μｇ／ｍｌ ２−（４−イ
オドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フ
ェニル−テトラゾリウムクロライド（シグマ社製、以下
「ＩＮＴ」と略称）、２５０μｇ／ｍｌ ５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルフォスフェード（シグマ社
製、以下「Ｘ−フォスフェート」と略称）］１０ｍｌに
浸し、室温で３０分間反応させ、発色完了後、水洗し乾
燥させた。この結果、全ての反応液で５０−１０，００
０ｂｐに分布する青色を呈するバンドが確認された。
【００５０】これらの結果より全ての核酸類似体がＮＴ
ＰＡ−ＤＮＡ中に取込まれたことが確認された。すなわ
ち、鋳型・プライマー複合体非依存的ＤＮＡを化学修飾
および蛍光標識できることが確認された。
ＰＡ−ＤＮＡ中に取込まれたことが確認された。すなわ
ち、鋳型・プライマー複合体非依存的ＤＮＡを化学修飾
および蛍光標識できることが確認された。
【００５１】実施例２ （ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いたＮＴＰＡ−ＤＮＡ中のＨＩＶ−ＲＮＡ特異的
プローブの精製） ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティークロマトカラムの調
整を行った。
ーを用いたＮＴＰＡ−ＤＮＡ中のＨＩＶ−ＲＮＡ特異的
プローブの精製） ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティークロマトカラムの調
整を行った。
【００５２】まず、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ
（ファルマシア社製）を１ｍＭ ＨＣｌにて洗浄し、ゲ
ルを膨潤させた。次いで、ゲルをカップリング緩衝液
［０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）、０．５Ｍ
ＮａＣｌ］で洗浄した。ＨＩＶ−１ ＲＮＡ１０μｇを
このカップリング緩衝液に溶解し、ゲル懸濁液と混ぜ、
室温で２時間混合した。残りの活性基をブロックするた
めにゲルをブロッキング試薬（０．２Ｍ グリシン、ｐ
Ｈ８．０）に移し、室温で２時間混合した。カップリン
グ緩衝液で一回洗浄後、洗浄液［０．１Ｍ 酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ］にて洗浄し、再
びカップリング緩衝液にて洗浄した。
（ファルマシア社製）を１ｍＭ ＨＣｌにて洗浄し、ゲ
ルを膨潤させた。次いで、ゲルをカップリング緩衝液
［０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）、０．５Ｍ
ＮａＣｌ］で洗浄した。ＨＩＶ−１ ＲＮＡ１０μｇを
このカップリング緩衝液に溶解し、ゲル懸濁液と混ぜ、
室温で２時間混合した。残りの活性基をブロックするた
めにゲルをブロッキング試薬（０．２Ｍ グリシン、ｐ
Ｈ８．０）に移し、室温で２時間混合した。カップリン
グ緩衝液で一回洗浄後、洗浄液［０．１Ｍ 酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ］にて洗浄し、再
びカップリング緩衝液にて洗浄した。
【００５３】次に、該ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティ
ークロマトグラフィー担体を用いてＮＴＰＡ−ＤＮＡ中
のＨＩＶ−ＲＮＡ特異的なプローブの精製を行った。
ークロマトグラフィー担体を用いてＮＴＰＡ−ＤＮＡ中
のＨＩＶ−ＲＮＡ特異的なプローブの精製を行った。
【００５４】まず、開始緩衝液［０．７Ｍ ＮａＣｌ、
５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５％ホル
ムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ］にてカラムを平衡化
し、このカラムにジゴキシゲニン修飾ＮＴＰＡ−ＤＮＡ
（以下、「Ｄｉｇ−ＤＮＡ」と略称）１０μｇを供し
た。開始緩衝液でカラムを洗浄後、ＤＮＡ溶出緩衝液
［１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ラウロイル−サルコシン、
９０％ ホルムアミド］にてＨＩＶ−１ ＲＮＡ特異的
なＤｉｇ−ＤＮＡの溶出を行い、２６０ｎｍの吸収をモ
ニタリングすることによりＤｉｇ−ＤＮＡの検出、及び
回収を行った。
５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５％ホル
ムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ］にてカラムを平衡化
し、このカラムにジゴキシゲニン修飾ＮＴＰＡ−ＤＮＡ
（以下、「Ｄｉｇ−ＤＮＡ」と略称）１０μｇを供し
た。開始緩衝液でカラムを洗浄後、ＤＮＡ溶出緩衝液
［１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ラウロイル−サルコシン、
９０％ ホルムアミド］にてＨＩＶ−１ ＲＮＡ特異的
なＤｉｇ−ＤＮＡの溶出を行い、２６０ｎｍの吸収をモ
ニタリングすることによりＤｉｇ−ＤＮＡの検出、及び
回収を行った。
【００５５】実施例３ （Ｄｉｇ−ＤＮＡプローブを用いてのＨＩＶ感染細胞の
検出） まず、ＨＩＶ−１感染細胞の調整を行った。ＨｅＬａ
ＣＤ４ ＋細胞を培養補助液［１０％牛胎児血清、１０μ
ｇ／ｍｌ 臭化ヘキサジメトリン（商品名：Ｐｏｌｙｂ
ｒｅｎｅ）］を含むダルベッコ変法イーグル培地（以
下、「ＤＭＥＭ」と略称、ギブコ社製）にて３７℃で１
２穴培養プレートにて培養した。
検出） まず、ＨＩＶ−１感染細胞の調整を行った。ＨｅＬａ
ＣＤ４ ＋細胞を培養補助液［１０％牛胎児血清、１０μ
ｇ／ｍｌ 臭化ヘキサジメトリン（商品名：Ｐｏｌｙｂ
ｒｅｎｅ）］を含むダルベッコ変法イーグル培地（以
下、「ＤＭＥＭ」と略称、ギブコ社製）にて３７℃で１
２穴培養プレートにて培養した。
【００５６】その後、細胞を培養補助液を含むＤＭＥＭ
で２回洗浄後、２００μｌの同培地に懸濁し、ＨＩＶ−
１を２０μｌ加え、３７℃２時間ウィルスを吸着させ
た。その後細胞を２回ＤＭＥＭにて洗浄し、のち１０％
牛胎児血清を含むＤＭＥＭ １ｍｌに懸濁し、３７℃で
５日間培養した。その後０．１μＭ メソトレキセート
（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、日本レダリー社製）を加
え、ＤＮＡのデ・ノボ合成経路を止めＳ期への進行をブ
ロックし、さらに１日培養し、ＤＭＥＭにて２回洗浄し
た。
で２回洗浄後、２００μｌの同培地に懸濁し、ＨＩＶ−
１を２０μｌ加え、３７℃２時間ウィルスを吸着させ
た。その後細胞を２回ＤＭＥＭにて洗浄し、のち１０％
牛胎児血清を含むＤＭＥＭ １ｍｌに懸濁し、３７℃で
５日間培養した。その後０．１μＭ メソトレキセート
（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、日本レダリー社製）を加
え、ＤＮＡのデ・ノボ合成経路を止めＳ期への進行をブ
ロックし、さらに１日培養し、ＤＭＥＭにて２回洗浄し
た。
【００５７】１０％牛胎児血清、１０μＭチミジンを含
むＤＭＥＭ １ｍｌにて懸濁し、６時間培養した。サン
プリング開始３０分前に５μｇ／ｍｌアクチノマイシン
Ｄを加え、Ｇ２期の染色体凝縮を抑制し、さらに１０分
前に２０μｇ／ｍｌコルセミドを加えた。遠沈して細胞
を集め、７５ｍＭ ＫＣｌ ７ｍｌに懸濁し、１５分後
固定液（メタノール：酢酸＝３：１）を等量加えてピペ
ッティングし、細胞を遠沈させた。細胞を固定液１４ｍ
ｌにて洗浄する作業を３回繰返し、スライドガラス上に
滴下した。１日間乾燥させ、７０、８０、１００％アル
コールシリーズを通して脱水した。６２℃で３時間ベー
キングし、７２℃に加温した変性液（７０％ホルムアミ
ド、２×ＳＳＣ）に標本を入れ２分間放置する。冷７０
％エタノールにて変性を止め、脱水後乾燥させた。
むＤＭＥＭ １ｍｌにて懸濁し、６時間培養した。サン
プリング開始３０分前に５μｇ／ｍｌアクチノマイシン
Ｄを加え、Ｇ２期の染色体凝縮を抑制し、さらに１０分
前に２０μｇ／ｍｌコルセミドを加えた。遠沈して細胞
を集め、７５ｍＭ ＫＣｌ ７ｍｌに懸濁し、１５分後
固定液（メタノール：酢酸＝３：１）を等量加えてピペ
ッティングし、細胞を遠沈させた。細胞を固定液１４ｍ
ｌにて洗浄する作業を３回繰返し、スライドガラス上に
滴下した。１日間乾燥させ、７０、８０、１００％アル
コールシリーズを通して脱水した。６２℃で３時間ベー
キングし、７２℃に加温した変性液（７０％ホルムアミ
ド、２×ＳＳＣ）に標本を入れ２分間放置する。冷７０
％エタノールにて変性を止め、脱水後乾燥させた。
【００５８】次にプローブ溶液を調整した。まず、２５
０ｎｇのＤｉｇ−ＤＮＡに２μｇのＣｏｔ−１ ＤＮＡ
（ギブコ社製）および２μｇのサケ精子ＤＮＡを加えた
全量５０μｌ溶液を１０分間煮沸し、その後氷中に５分
静置した。ハイブリッド形成液（５０％ホルムアミド、
１０％デキストラン硫酸、２×ＳＳＣ）を全量の７０％
となるように混和し、３７℃で３０分間プレアニーリン
グして反復配列を抑制した。この溶液を標本上に乗せ、
カバーガラスを被せて液体のりにてシールしてから３７
℃で一晩培養した。２×ＳＳＣに標本を移し、１０分間
振とう後カバーガラスを剥し、５０％ホルムアミド、１
×ＳＳＣにて４２℃１５分間を２回、１×ＳＳＣで室温
１５分間、２×ＳＳＣで室温１０分間振とうし、４×Ｓ
ＳＣで５分間静置した。染色液Ａ（２００μｇ／ｍｌ抗
ジゴキシゲニン−ローダミン、４×ＳＳＣ、１％牛血清
アルブミン）４０μｌを乗せ、３７℃、３０分間反応さ
せ、４×ＳＳＣ １０分間、４×ＳＳＣ＋０．０１％
トリトンＸ−１００（上掲） １０分間、４×ＳＳＣ
１０分間の洗浄を行なった。続いて標本中の染色体を染
色液Ｂ（０．５μｇ／ｍｌプロピデウムアイオダイド、
１μｇ／ｍｌ ４’，６’−ディアミディノ−２−フェ
ニルインドール）２０μｌにて１０分間染色した。その
後、５９６ｎｍの励起波長にて蛍光顕微鏡で観察した。
０ｎｇのＤｉｇ−ＤＮＡに２μｇのＣｏｔ−１ ＤＮＡ
（ギブコ社製）および２μｇのサケ精子ＤＮＡを加えた
全量５０μｌ溶液を１０分間煮沸し、その後氷中に５分
静置した。ハイブリッド形成液（５０％ホルムアミド、
１０％デキストラン硫酸、２×ＳＳＣ）を全量の７０％
となるように混和し、３７℃で３０分間プレアニーリン
グして反復配列を抑制した。この溶液を標本上に乗せ、
カバーガラスを被せて液体のりにてシールしてから３７
℃で一晩培養した。２×ＳＳＣに標本を移し、１０分間
振とう後カバーガラスを剥し、５０％ホルムアミド、１
×ＳＳＣにて４２℃１５分間を２回、１×ＳＳＣで室温
１５分間、２×ＳＳＣで室温１０分間振とうし、４×Ｓ
ＳＣで５分間静置した。染色液Ａ（２００μｇ／ｍｌ抗
ジゴキシゲニン−ローダミン、４×ＳＳＣ、１％牛血清
アルブミン）４０μｌを乗せ、３７℃、３０分間反応さ
せ、４×ＳＳＣ １０分間、４×ＳＳＣ＋０．０１％
トリトンＸ−１００（上掲） １０分間、４×ＳＳＣ
１０分間の洗浄を行なった。続いて標本中の染色体を染
色液Ｂ（０．５μｇ／ｍｌプロピデウムアイオダイド、
１μｇ／ｍｌ ４’，６’−ディアミディノ−２−フェ
ニルインドール）２０μｌにて１０分間染色した。その
後、５９６ｎｍの励起波長にて蛍光顕微鏡で観察した。
【００５９】その結果、ＨＩＶ−１が感染した細胞から
の染色体標本中にのみ濃赤色を呈する部分が見られた。
これにより、ＨＩＶ−１ ＲＮＡに対するプローブが、
実際に、染色体に組み込まれたＨＩＶ由来のＤＮＡを検
出できることが確認された。
の染色体標本中にのみ濃赤色を呈する部分が見られた。
これにより、ＨＩＶ−１ ＲＮＡに対するプローブが、
実際に、染色体に組み込まれたＨＩＶ由来のＤＮＡを検
出できることが確認された。
【００６０】実施例４ （ＮＴＰＡ−ＲＮＡの合成（ＲＮＡプローブライブラリ
ーの製造）） 緩衝液Ｒ［１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４，２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１５
ｍＭ ＭｎＣｌ２，０．１％ トリトンＸ−１００（全
て最終濃度）］及びリボヌクレオチド三燐酸［ＡＴＰ、
ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（全て最終濃度）５００ｍ
Ｍ）］と、下記（Ａ）〜（Ｄ）のリボヌクレオチド三燐
酸類似体（Ａ：シグマ社製、Ｂ〜Ｄ：ベーリンガー・マ
ンハイム社製）から各々１つずつを選択したもの（各々
最終濃度２００μＭ）、２０単位／ｍｌ Ｔｌｉ ＤＮ
Ａポリメラーゼから構成される反応液１００μｌを、７
４℃で３時間反応させた。
ーの製造）） 緩衝液Ｒ［１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４，２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１５
ｍＭ ＭｎＣｌ２，０．１％ トリトンＸ−１００（全
て最終濃度）］及びリボヌクレオチド三燐酸［ＡＴＰ、
ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（全て最終濃度）５００ｍ
Ｍ）］と、下記（Ａ）〜（Ｄ）のリボヌクレオチド三燐
酸類似体（Ａ：シグマ社製、Ｂ〜Ｄ：ベーリンガー・マ
ンハイム社製）から各々１つずつを選択したもの（各々
最終濃度２００μＭ）、２０単位／ｍｌ Ｔｌｉ ＤＮ
Ａポリメラーゼから構成される反応液１００μｌを、７
４℃で３時間反応させた。
【００６１】 （Ａ）１，Ｎ６−エセノアデノシン−５’−三燐酸（ε
−ＡＴＰ） （Ｂ）フルオレセイン修飾ウリジン−５’−三燐酸（Ｆ
ｌｕ−ＵＴＰ） （Ｃ）ビオチン修飾ウリジン−５’−三燐酸（Ｂｉｏ−
ＵＴＰ） （Ｄ）ジゴキシゲニン修飾ウリジン−５’−三燐酸（Ｄ
ｉｇ−ＵＴＰ）。
−ＡＴＰ） （Ｂ）フルオレセイン修飾ウリジン−５’−三燐酸（Ｆ
ｌｕ−ＵＴＰ） （Ｃ）ビオチン修飾ウリジン−５’−三燐酸（Ｂｉｏ−
ＵＴＰ） （Ｄ）ジゴキシゲニン修飾ウリジン−５’−三燐酸（Ｄ
ｉｇ−ＵＴＰ）。
【００６２】その後、実施例１と同様にして、合成され
たＲＮＡの検出を行なった。その結果、全ての合成され
たＲＮＡにおいて、上記したリボヌクレオチド類似体が
含まれていることが分かった。
たＲＮＡの検出を行なった。その結果、全ての合成され
たＲＮＡにおいて、上記したリボヌクレオチド類似体が
含まれていることが分かった。
【００６３】実施例５ （ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いてのＮＴＰＡ−ＲＮＡ中のＨＩＶ−ＲＮＡ特異
的プローブの精製、及び精製されたプローブによるＨＩ
Ｖ感染細胞の検出） ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティークロマトカラムの調
整を行った。まず、ＣＮＢｒ−活性化 セファロース
４Ｂ（ファルマシア社製）を１ｍＭ ＨＣｌにて洗浄
し、ゲルを膨潤させた。
ーを用いてのＮＴＰＡ−ＲＮＡ中のＨＩＶ−ＲＮＡ特異
的プローブの精製、及び精製されたプローブによるＨＩ
Ｖ感染細胞の検出） ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティークロマトカラムの調
整を行った。まず、ＣＮＢｒ−活性化 セファロース
４Ｂ（ファルマシア社製）を１ｍＭ ＨＣｌにて洗浄
し、ゲルを膨潤させた。
【００６４】次に、ゲルをカップリング緩衝液［０．１
Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ］で洗浄した。ＨＩＶ−１ ＲＮＡ１０μｇをこのカ
ップリングバッファーに溶解し、ゲル懸濁液と混ぜ、室
温で２時間混合した。残りの活性基をブロックするため
に、ゲルをブロッキング試薬（０．２Ｍ グリシン、ｐ
Ｈ８．０）に移し、室温で２時間混合した。カップリン
グ緩衝液で１回洗浄後、洗浄液［０．１Ｍ 酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ］にて洗浄後、再
びカップリング緩衝液にて洗浄した。
Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ］で洗浄した。ＨＩＶ−１ ＲＮＡ１０μｇをこのカ
ップリングバッファーに溶解し、ゲル懸濁液と混ぜ、室
温で２時間混合した。残りの活性基をブロックするため
に、ゲルをブロッキング試薬（０．２Ｍ グリシン、ｐ
Ｈ８．０）に移し、室温で２時間混合した。カップリン
グ緩衝液で１回洗浄後、洗浄液［０．１Ｍ 酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ］にて洗浄後、再
びカップリング緩衝液にて洗浄した。
【００６５】次に、このＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニテ
ィークロマトグラフィー担体を用いて、ＮＴＰＡ−ＲＮ
Ａ中のＨＩＶ−１ ＲＮＡ特異的プローブの精製を行っ
た。まず、開始緩衝液［０．７Ｍ ＮａＣｌ ５０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５％ ホルムアミ
ド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ］にてカラムを平衡化し、この
カラムにジゴキシゲニン修飾ＮＴＰＡ−ＲＮＡ（以下、
「Ｄｉｇ−ＲＮＡ」と略称）１０μｇを供した。開始緩
衝液でカラムを洗浄後、ＲＮＡ溶出緩衝液［１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．２％ ラウロイル−サルコシン、９０％ ホ
ルムアミド］にてＨＩＶ−１ ＲＮＡ特異的なＤｉｇ−
ＲＮＡの溶出を行い、２６０ｎｍの吸収をモニタリング
することによりＤｉｇ−ＲＮＡの検出、及び回収を行っ
た。
ィークロマトグラフィー担体を用いて、ＮＴＰＡ−ＲＮ
Ａ中のＨＩＶ−１ ＲＮＡ特異的プローブの精製を行っ
た。まず、開始緩衝液［０．７Ｍ ＮａＣｌ ５０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５％ ホルムアミ
ド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ］にてカラムを平衡化し、この
カラムにジゴキシゲニン修飾ＮＴＰＡ−ＲＮＡ（以下、
「Ｄｉｇ−ＲＮＡ」と略称）１０μｇを供した。開始緩
衝液でカラムを洗浄後、ＲＮＡ溶出緩衝液［１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．２％ ラウロイル−サルコシン、９０％ ホ
ルムアミド］にてＨＩＶ−１ ＲＮＡ特異的なＤｉｇ−
ＲＮＡの溶出を行い、２６０ｎｍの吸収をモニタリング
することによりＤｉｇ−ＲＮＡの検出、及び回収を行っ
た。
【００６６】回収されたＤｉｇ−ＲＮＡプローブを用い
て、実施例３と同様にしてＨＩＶ−１感染細胞の検出を
試みたところ、実際に、染色体に組み込まれたＨＩＶ由
来のＤＮＡを検出できることが確認された。
て、実施例３と同様にしてＨＩＶ−１感染細胞の検出を
試みたところ、実際に、染色体に組み込まれたＨＩＶ由
来のＤＮＡを検出できることが確認された。
【００６７】
【発明の効果】本発明により、容易にプローブライブラ
リーを得ることができた。このプローブライブラリー
は、鋳型及びプライマー複合体が存在しない反応系にお
いて合成されたものであり、その中には、さまざまな塩
基配列を持つＤＮＡあるいはＲＮＡが含まれている。こ
れにより、本発明のポリヌクレオチドプローブライブラ
リーは、そのハイブリッド形成能力に多様性があり、被
検出体であるウイルスが仮に変異を起こした場合でも、
前記多様性の範疇であれば、充分プローブとしての役割
を担う。
リーを得ることができた。このプローブライブラリー
は、鋳型及びプライマー複合体が存在しない反応系にお
いて合成されたものであり、その中には、さまざまな塩
基配列を持つＤＮＡあるいはＲＮＡが含まれている。こ
れにより、本発明のポリヌクレオチドプローブライブラ
リーは、そのハイブリッド形成能力に多様性があり、被
検出体であるウイルスが仮に変異を起こした場合でも、
前記多様性の範疇であれば、充分プローブとしての役割
を担う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 医学のあゆみ，1989年 ３月25日，第 148巻，第12号，ｐｐ．831−832 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．195，Ｎｏ．１，ｐｐ．157−162 （1991) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】鋳型およびプライマー複合体の不存在下、
セルモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼの存在下で、デオキシリボヌクレオチド類似体を
含むデオキシリボヌクレオチドを重合させることを特徴
とするプローブライブラリーの製造方法。 - 【請求項２】鋳型およびプライマー複合体の不存在下、
セルモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼの存在下で、リボヌクレオチド類似体を含むリボ
ヌクレオチドを重合させることを特徴とするプローブラ
イブラリーの製造方法。 - 【請求項３】前記した重合を、約２０〜９０℃の温度下
で行なう請求項１または２に記載の製造方法。 - 【請求項４】前記した重合を、中性〜弱アルカリ性の条
件下で行なう請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方
法。 - 【請求項５】前記デオキシリボヌクレオチド類似体が、
少なくともその塩基が異なる類似体である請求項１記載
の製造方法。 - 【請求項６】前記デオキシリボヌクレオチド類似体が、
１，Ｎ６−エセノデオキシアデノシン−５’−三燐酸、
フルオレセイン修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸、
ビオチン修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸、ビオチ
ン修飾デオキシアデノシン− ５’−三燐酸、ジゴキシゲ
ニン修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸、及びジニト
ロフェニル修飾デオキシウリジン−５’−三燐酸からな
る群より選ばれた少なくとも１種である請求項５記載の
製造方法。 - 【請求項７】前記リボヌクレオチド類似体が、少なくと
もその塩基が異なる類似体である請求項２記載の製造方
法。 - 【請求項８】前記リボヌクレオチド類似体が１，Ｎ６−
エセノアデノシン−５’−三燐酸、フルオレセイン修飾
ウリジン−５’−三燐酸、ビオチン修飾ウリジン−５’
−三燐酸、ビオチン修飾アデノシン−５’−三燐酸、ジ
ゴキシゲニン修飾ウリジン−５’−三燐酸、及びジニト
ロフェニル修飾ウリジン−５’−三燐酸からなる群より
選ばれた少なくとも１種である請求項７記載の製造方
法。 - 【請求項９】請求項１〜８のいずれか１項記載の製造方
法により得られたプローブライブラリー。 - 【請求項１０】請求項９記載のプローブライブラリーか
ら他のＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリッドを形成する能
力を有するプローブを精製する方法であって、前記した
他のＤＮＡまたはＲＮＡをリガンドとして共有結合した
アフィニティークロマトグラフィーを用いることにより
行なわれるプローブの精製方法。 - 【請求項１１】他のＤＮＡまたはＲＮＡが、ウイルス由
来である請求項１０記載の精製方法。 - 【請求項１２】前記ウィルスが、ヒト免疫不全ウィルス
である請求項１１記載の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17627296A JP3291555B2 (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | プローブライブラリーの製造方法、該製造方法により得られたプローブライブラリー、該プローブライブラリーから他のｄｎａまたはｒｎａとハイブリッドするプローブを精製する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17627296A JP3291555B2 (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | プローブライブラリーの製造方法、該製造方法により得られたプローブライブラリー、該プローブライブラリーから他のｄｎａまたはｒｎａとハイブリッドするプローブを精製する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1014572A JPH1014572A (ja) | 1998-01-20 |
| JP3291555B2 true JP3291555B2 (ja) | 2002-06-10 |
Family
ID=16010681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17627296A Expired - Fee Related JP3291555B2 (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | プローブライブラリーの製造方法、該製造方法により得られたプローブライブラリー、該プローブライブラリーから他のｄｎａまたはｒｎａとハイブリッドするプローブを精製する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3291555B2 (ja) |
-
1996
- 1996-07-05 JP JP17627296A patent/JP3291555B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１９５，Ｎｏ．１，ｐｐ．１５７−１６２（１９９１） |
| 医学のあゆみ，１９８９年 ３月２５日，第１４８巻，第１２号，ｐｐ．８３１−８３２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH1014572A (ja) | 1998-01-20 |
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