KR20090106414A - 게놈 ｄｎａ 단편의 증폭 또는 결실의 검출방법 - Google Patents

게놈 ｄｎａ 단편의 증폭 또는 결실의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 보다 정밀도가 좋고 또한 고감도로 검출할 수 있는 CGH법, 특히 CGH마이크로어레이법을 제공하는 것을 과제로 한다.
(a) 검사대상이 되는 세포 유래의 게놈 DNA 단편인 피실험 게놈 DNA 단편을 하기 일반식(1)로 나타내는 표지물질 또는 일반식(2)로 나타내는 표지물질 중 어느 한 쪽의 표지물질로 표지하고, 해당 피실험 게놈 DNA 단편과의 차이를 검출하기 위한 기준이 되는 대조게놈 단편을 나머지 한쪽 표지물질로 표지하고, (b) 표지된 피실험 게놈 DNA 단편과 표지된 대조게놈 DNA 단편을, 피실험 게놈 단편과 대조게놈단편과의 차이를 검출하기 위한 핵산서열을 포함하는 표본핵산에 경합적으로 하이브리다이즈시켜, (c) 얻어지는 형광강도를 지표로 하여, 피실험 게놈 DNA 단편 중의 증폭 또는 결실을 검출하는 방법, 및 하기 일반식(1)로 나타내는 표지물질로 표지된 뉴클레오티드 잔기와 하기 일반식(2)로 나타내는 표지물질로 표지된 뉴클레오티드 잔기를 포함하여 이루어지는, 해당 방법을 위한 키트.
게놈 DNA 단편, 뉴클레오티드, 표지물질

Description

게놈 ＤＮＡ 단편의 증폭 또는 결실의 검출방법{METHOD OF DETECTING AMPLIFICATION OR DELETION IN GENOMIC DNA FRAGMENT}
본 발명은, 비교 게놈 하이브리디제이션법(Comparative Genomic Hybridization법 : CGH법), 특히, 마이크로어레이를 사용하는 CGH마이크로어레이법에 관한 것이다.
최근, Kallioniemi 등에 의하여 CGH법이 개발되었다(특허문헌1, 비특허문헌1). 이 CGH법은, 한 번의 하이브리디제이션으로 모든 염색체에 대하여 게놈 DNA의 카피수 이상(異常)을 검출하는 것이 가능하며, 게놈 이상해석법(異常解析法)으로서 널리 이용되고 있다. 그 구체적인 방법은 다음과 같다. 예를 들면, 먼저 종양조직(세포)으로부터 추출한 DNA와 정상조직(세포)으로부터 얻어진 DNA를 각각 다른 형광색소(예를 들면 Cy3 및 Cy5 등)로 표지하고, 정상 염색체 표본과 경합적으로 하이브리다이즈시켜, 염색체의 형광색의 차이를 해석하는 것이다. 이때, 종양조직(세포) 중에서 유전자·염색체의 증폭이 생기고 있다면, 그것에 상당하는 정상 염색체 영역은 종양조직(세포)으로부터 추출한 DNA가 상대적으로 많이 하이브리다이즈 하기 때문에 종양조직(세포)으로부터 추출한 DNA에 유래하는 형광색이 강하게 발생되며, 반대로, 종양조직(세포)에 있어서 유전자·염색체의 결실영역이 존재하는 경우 에는, 그것에 상당하는 정상염색체 영역은 정상조직(세포)으로부터 얻어진 DNA가 상대적으로 많이 하이브리다이즈하기 때문에 정상염색체 영역은 정상조직(세포)으로부터 얻어진 DNA에 유래하는 형광색이 강하게 [종양조직(세포)로부터 추출한 DNA에 유래하는 형광색이 약하게] 발생하게 된다. 이 때문에, 이 색조로부터 종양조직(세포)에 있어서의 유전자·염색체의 카피수가 불균형하게 되어 있는 영역을 염색체 표본상의 위치로서 검출할 수가 있다.
또한, 이 CGH법을 보다 간편하고 신속하게 실시하기 위하여, 정상염색체 표본 대신에, 모든 염색체 영역을 커버하는 DNA클론이나 cDNA, 올리고뉴클레오티드 등이 결합한 마이크로어레이를 사용하는 CGH마이크로어레이법이 개발되어 있다(특허문헌2, 특허문헌3, 특허문헌4).
그러나, 상기한 바와 같은 종래의 CGH법은, 사용되는 형광색소에 기인하며, 검출 감도 및 검출 정밀도가 반드시 충분한 것이 아니었다.
특허문헌1 : 일본국 특표평 07-505053호 공보
특허문헌2 : 일본국 특개 2006-9115844호 공보
특허문헌3 : 일본국 특개 2006-94726호 공보
특허문헌4 : 일본국 특개 2005-304481호 공보
비특허문헌1 : Kallioniemi et al., Science, 258, p.818-821, 1992
본 발명은, 상기한 바와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로서, 정밀도가 보다 좋고 또한 고감도로 검출할 수 있는 CGH법, 특히 CGH마이크로어레이법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여 이루어진 것으로서, 다음과 같은 구성으로 이루어진다.
1. (a) 검사대상이 되는 세포유래의 게놈 DNA 단편인 피실험 게놈 DNA 단편을 하기 일반식(1)로 나타내는 표지물질 또는 일반식(2)로 나타내는 표지물질 중 어느 한 쪽의 표지물질로 표지하고, 해당 피실험 게놈 DNA 단편과의 차이를 검출하기 위한 기준이 되는 대조게놈 DNA 단편을 나머지 한 쪽의 표지물질로 표지하고, (b) 표지된 피실험 게놈 DNA 단편과 표지된 대조게놈 DNA 단편을, 피실험 게놈 DNA 단편과 대조게놈 DNA 단편과의 차이를 검출하기 위한 핵산서열을 포함하는 표본핵산에 경합적으로 하이브리다이즈시켜, (c) 얻어지는 형광강도를 지표로 하여, 피실험 게놈 DNA 단편 중의 증폭 또는 결실을 검출하는 방법.
Figure 112009050749446-PCT00001
[식 중, R1~R4 및 R8~R11은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R15(식 중, R15는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나타내며, R5 및 R12는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R6, R7 및 R14는 각각 독립하여 알킬기를 나타내며, R13은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
Figure 112009050749446-PCT00002
[식 중, R21~R24 및 R28~R31은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R35(식 중, R35는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나타내고, R25 및 R32는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R26, R27 및 R34는 각각 독립하여 알킬기를 나타내고, R33은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
2. 하기 일반식(1)로 나타내는 표지물질로 표지된 뉴클레오티드 잔기와 하기 일반식(2)로 나타내는 표지물질로 표지된 뉴클레오티드 잔기를 포함하여 이루어지는, 상기 1.에 기재된 방법을 위한 키트.
Figure 112009050749446-PCT00003
[식 중, R1~R4 및 R8~R11은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R15(식 중, R15는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나타내고, R5 및 R12는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R6, R7 및 R14는 각각 독립하여 알킬기를 나타내고, R13은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
Figure 112009050749446-PCT00004
[식 중, R21~R24 및 R28~R31은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R35(식 중, R35는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나타내고, R25 및 R32는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R26, R27 및 R34는 각각 독립하여 알킬기를 나타내고, R33은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
본 발명의 방법에 의하면, 종래의 CGH법, 특히 CGH마이크로어레이법과 비교하여, 정밀도가 보다 좋고 또한 고감도로, CGH해석을 실시하는 것, 즉, 게놈 DNA의 카피수 이상을 고정밀도로 또한 고감도로 검출할 수가 있다.
도 1은, 실시예 1에서 얻어진, 본 발명에 있어서의 표지물질(2)(Dy-647)로 표지된 표지 피실험 게놈 DNA 단편(Female DNA) 및 본 발명에 있어서의 표지물질(1)(Dy-547)로 표지된 표지 대조게놈 DNA 단편(Male DNA)을 사용한 경우에 얻어진 각 BAC클론마다의 Log2(Dy-647/Dy-547)값을 염색체 번호순으로 플롯한 결과를 나타내는 도면.
도 2는, 비교예 1의 (a)에서 얻어진, Cy5로 표지된 표지 피실험 게놈 DNA 단편(Female DNA) 및 Cy3로 표지된 표지 대조게놈 DNA 단편(Male DNA)을 사용한 경우 에 얻어진 각 BAC클론마다의 Log2(Cy5/Cy3)값을 염색체 번호순으로 플롯한 결과를 나타내는 도면.
도 3은, 비교예 1의 (b)에서 얻어진, HiLyte Fluor 647로 표지된 표지 피실험 게놈 DNA 단편(Female DNA) 및 HiLyte Fluor 555로 표지된 표지 대조게놈 DNA 단편(Male DNA)을 사용한 경우에 얻어진 각 BAC클론마다의 Log2(HiLyte Fluor 647/HiLyte Fluor 555값을 염색체 번호순으로 플롯한 결과를 나타내는 도면.
도 4는, 실시예 2에서 얻어진, 본 발명에 있어서의 표지물질(2)(Dy-647)로 표지된 표지 피실험 게놈 DNA 단편(간암세포주 Hep3B 유래의 게놈 DNA) 및 본 발명에 있어서의 표지물질(1)(Dy-547)로 표지된 표지 대조게놈 DNA 단편(Male DNA)을 사용한 경우에 얻어진 각 BAC클론마다의 Log2(Dy-647/Dy-547)값을 염색체 번호순으로 플롯한 결과를 나타내는 도면.
1. CGH법
본 발명에 있어서, CGH법이란, 원리적으로는, (a) 검사대상이 되는 세포유래의 게놈 DNA 단편인 피실험 게놈 DNA 단편과 해당 피실험 게놈 DNA 단편과의 차이를 검출하기 위한 기준이 되는 대조게놈 DNA 단편을, 각각 다른 파장의 2종의 표지물질로 표지하고, (b) 표지된 피실험 게놈 DNA 단편과 표지된 대조게놈 DNA 단편을, 피실험 게놈 DNA 단편과 대조게놈 DNA 단편과의 차이를 검출하기 위한 핵산서열을 포함하는 표본핵산에 경합적으로 하이브리다이즈시키고, (c) 얻어지는 형광강 도를 지표로 하여, 피실험 게놈 DNA의 카피수 이상(즉, 피실험 게놈 DNA 단편 중의 증폭 또는 결실)을 검출하는 방법이다.
이때, 카피수 이상의 검출은, 통상적으로, 피실험 게놈 DNA 단편과 대조게놈 DNA 단편과의 경합적 하이브리디제이션 후에 표본핵산상의 형광강도를 측정하고, 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질과 대조게놈 DNA단편 유래의 표지물질과의 형광강도비를 구하고, 이것을 해석하는 것에 의하여 실시된다. 즉, 대조게놈 DNA 단편 유래의 표지물질에 대한 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질의 형광강도비가 높은 경우에는, 표본핵산상의 해당 부분(영역)은, 대조게놈 DNA 단편과 비교하여 피실험 게놈 DNA 단편보다 강하게 하이브리다이즈한 것을 나타내며, 피실험 게놈 DNA에 있어서의, 표본핵산상의 해당 부분(영역)에 상당하는 영역이 증폭하고 있다(카피수가 증가하고 있다)고 판단되며, 반대로, 대조게놈 DNA 단편 유래의 표지물질에 대한 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질의 형광강도비가 낮을 경우(또는 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질의 형광을 인정하지 못하는 경우)에는, 표본핵산상의 해당 부분(영역)은, 피실험 게놈 DNA 단편과 비교하여 대조게놈 DNA 단편보다 강하게 하이브리다이즈한 것(또는 대조게놈 DNA 단편만이 하이브리다이즈한 것)을 나타내며, 피실험 게놈 DNA에 있어서의, 표본핵산상의 해당 부분(영역)에 상당하는 영역이 결실되어 있다(카피수가 감소 또는 카피되어 있지 않다)고 판단된다. 또한, 본 발명에 있어서는, 상기한 바와 같은 피실험게놈 DNA 중의 카피수 이상(또는 염색체 이상)을 판단하는 것, 환언하면, 피실험 게놈 DNA 중의 카피수 이상의 유무(또는 염색체 이상의 유무) 또는 카피수의 증가량 또는 감소량을 정량(定 量)(또는 반정량)하는 것도 포함한다.
2. 본 발명의 방법
본 발명은, 상술한 바와 같이 CGH법에 있어서 사용되는 다른 파장의 2종의 표지물질로서, 일반식(1) 및 (2)로 나타내는 형광물질을 사용하는 것을 특징으로 한다.
(1) 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편
본 발명에 있어서, 「피실험 게놈 DNA 단편」이란, 검사대상이 되는(카피수 이상 또는 염색체 이상을 검출·조사하고자 한다) 세포에 유래하는 게놈 DNA를, 또, 「대조게놈 DNA 단편」이란, 해당 피실험 게놈 DNA 단편과의 차이(즉, 피실험 게놈 DNA의 카피수 이상)를 검출하기 위한 기준이 되는 게놈 DNA 단편을 의미한다.
또, 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편은 각각 다른 시료로부터 얻어진 각각 다른 게놈 DNA에서 유래하는 것이다. 다른 시료로서는, 예를 들면, (1) 시료의 종류는 다르나, 시료의 유래[생체(개체·집단), 장소 등]는 동일한 경우, (2) 시료의 종류는 동일하나, 시료의 유래가 다른 경우, (3) 시료의 종류 및 시료의 유래가 다른 경우, (4) 시료의 종류 및 시료의 유래가 동일한 경우이다.
보다 구체적으로 예를 들면, (1) 동일개체(생체, 생물종(生物種))에 있어서의 다른 종류의 세포, 세포집단, 체액 등, (2) 다른 개체(생체, 생물종)간 [예를 들면, 특정개체와 표준(정상)개체간] 또는 특정한 개체(생체, 생물종)와 집단간[예를 들면 특정개체와 표준(정상)집단간]에 있어서의, 동일 종류의 세포, 세포집단, 체액 등, (3) 다른 개체(생체, 생물종)간 [예를 들면, 병에 걸린 개체와 표준(정 상)개체간] 또는 특정개체(생체, 생물종)와 집단간[병이 걸린 개체와 표준(정상)집단간]에 있어서의, 다른 종류의 세포, 세포집단, 체액 등[예를 들면 이상세포(조직, 기관, 액체)와 정상세포(조직, 기관, 체액) 등], (4) 환경, 상태 등이 다른 경우(예를 들면, 약제투여 전·후, 스트레스부가 전·후, 병태가 다른 스테이지, 배양 전·후 등)의 동일개체(생체, 생물종)에 있어서의, 동일 종류의 세포, 세포집단, 체액 등을 들 수가 있다.
또한, 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편은, 실질적으로 동일한 핵산(DNA)서열을 포함하는 것인바, 일반적으로는, 대조게놈 DNA 단편은 게놈 DNA의 카피수에 변화가 없는(게놈 DNA의 카피수에 이상을 초래하고 있지 않는) 시료[예를 들면, 표준(정상)개체 또는 집단, 정상세포(조직, 기관, 액체) 등]로부터 얻어지는 게놈 DNA 단편이며, 또, 피실험 게놈 DNA 단편은 이것 이외의 게놈 DNA의 카피수에 변화가 발생하고 있거나(게놈 DNA의 카피수에 이상을 초래하고 있는), 또는, 해당 변화가 발생하고 있다는 의심이 있는(해당 이상을 초래하고 있을 의심이 있는) 시료[예를 들면, 특정개체, 병이 걸린 개체, 이상(조직, 기관, 체액) 등]로부터 얻어지는 게놈 DNA 단편이지만, 이와 같은 조합에 한정되지 않는다.
피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편에는, 예를 들면, 모든 염색체에 상당하는 서열을 실질적으로 갖는 게놈 DNA 단편, 예를 들면 특정의 염색체에 상당하는 서열을 실질적으로 갖는 게놈 DNA 단편, 이들 염색체(모든 염색체 또는 특정의 염색체)의 일부에 상당하는 서열을 갖는 게놈 DNA 단편 등이 포함된다. 또, 게놈 DNA클론단편, 이들의 게놈 DNA 단편이나 게놈 DNA 클론단편을 제한효소에 의하 여 단편화 또는 화학적으로 단편화한 DNA 프래그먼트, 이들의 게놈 DNA 단편, 게놈 DNA 클론단편 또는 DNA 프래그먼트를 증폭한 증폭산물 등도 사용이 가능하다. 또, cDNA, 그 DNA 프래그먼트 또는 이들의 증폭산물도 사용이 가능하다.
또한, 일반적으로 예를 들면, 양자 중 어느 한 쪽이 모든 염색체(또는 특정의 염색체)에 상당하는 서열을 실질적으로 갖는 것인 경우에는 다른 쪽도 마찬가지로 모든 염색체(또는 특정의 염색체)에 상당하는 서열을 실질적으로 갖는 것이며, 또, 양자 중 한 쪽이 염색체(모든 염색체 또는 특정의 염색체)의 일부에 상당하는 서열을 갖는 것인 경우에는 다른 쪽은 해당하는 일부분과 동일한 부분의 염색체(모든 염색체 또는 특정의 염색체)에 상당하는 서열을 갖는 것이다.
본 발명이 적용되는 시료의 종류로서는, 이 분야에서 사용되고 있는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 시료로서는, 예를 들면 세포, 조직, 기관, 체액(혈액, 혈청, 혈장, 골수액, 활액, 췌액, 림파액 등), 배설물(오줌, 타액, 분변 등), 가래, 고름, 피부 유래물 등의 생체 유래의 시료; 미생물(균류, 세균류, 바이러스 등); 예를 들면, 환경시료(식품, 음료, 수돗물, 해수, 호소수(湖沼水), 하천수, 공장폐액, 반도체용 세정수, 의료기구 등을 세정한 후의 세정액 등); 이들로부터 얻어지는 추출액; 및 이들을 물이나 통상적으로 이 분야에서 사용되고 있는 완충액 등(트리스완충액, 글리신완충액, 인산완충액, 베로날완충액, 붕산완충액, Good's 완충액 등)에 적절히 용해시켜 재구성하여 얻어진 처리물 등을 들 수가 있다.
이와 같은 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편은, 상기한 바와 같은 시료로부터 자체공지의 추출법 또는 시판되고 있는 추출키트를 사용하여 조제할 수가 있다. 또, 목적에 따라서는, 시판품 등의 입수가능한 게놈 DNA 단편[예를 들면, 표준(정상)시료 유래의 게놈 DNA 단편(대조게놈 DNA 단편)이나 어느 종류의 암환자 유래의 게놈 DNA 단편(피실험 게놈 DNA 단편)]을 사용하는 것도 가능하다.
또, 게놈 DNA 클론단편의 조제법, cDNA의 조제법, 제한효소에 의한 단편화법, 화학적 단편화법, 증폭방법(예를 들면 Genomics 87(2006)298-306에 기재된 DOPPCR, roling Cycle Amprification, GenomePlex 등의 증폭법, ICAN법, LAMP법, 기타 게놈을 증폭시킬 수 있는 방법 등) 등도 자체공지의 방법이나 시판의 키트 등에 따르면 좋다.
(2) 표지물질
본 발명에 있어서, 상기한 바와 같은 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 표지하기 위한 표지물질은 하기 일반식(1)로 나타내는 형광표지물질(이하, 본 발명에 있어서의 표지물질(1)로 약기한다.)과 하기 일반식(2)로 나타내는 형광표지물질(이하, 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 약기한다.)의 2종이다.
Figure 112009050749446-PCT00005
[식 중, R1~R4 및 R8~R11은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R15(식 중, R15는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나 타내며, R5 및 R12는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R6, R7 및 R14는 각각 독립하여 알킬기를 나타내며, R13은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
또한, 일반식(1)에 있어서 R1~R4 및 R8~R11 중 적어도 하나는 -SO3R15(R15는 상기와 동일.)인 것이 바람직하며, N+와 분자내의 염을 형성하고 있어도 좋다.
Figure 112009050749446-PCT00006
[식 중, R21~R24 및 R28~R31은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R35(식 중, R35는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나타내며, R25 및 R32는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R26, R27 및 R34는 각각 독립하여 알킬기를 나타내며, R33은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
또한, 일반식(2)에 있어서 R21~R24 및 R28~R31 중 적어도 하나는 -SO3R35(R35는 상기와 동일.)인 것이 바람직하며, N+와 분자내의 염을 형성하고 있어도 좋다.
상기 일반식(1) 및 (2)에 있어서, R1, R2, R3, R4, R8, R9, R10, R11, R21, R22, R23, R24, R28, R29, R30 및 R31로 나타내는 -SO3R15 및 -SO3R35에 있어서, R15 및 R35로 나 타내는 알칼리 금속원자로서는, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 리튬 등을 들 수가 있으며, 그 중에서도 리튬, 나트륨이 바람직하다.
유기 암모늄이온으로서는, 예를 들면, 트리알킬 암모늄이온 등을 들 수가 있다. 또, 해당 트리알킬 암모늄이온으로서는, 직쇄형상, 분지형상 또는 환상 중 어느 것이라도 좋으며, 통상적으로 탄소수 1~10의 것, 바람직하게는 1~6의 것을 들 수가 있으며, 구체적으로 예를 들면, 트리메틸 암모늄이온, 트리에틸 암모늄이온, 트리n-프로필 암모늄이온, 트리이소프로필 암모늄이온, 트리부틸 암모늄이온, 트리헥실 암모늄이온, 트리옥틸 암모늄이온, 트리노닐 암모늄이온, 트리데실 암모늄이온, 트리시클로펜틸 암모늄이온, 트리시클로헥실 암모늄이온, 트리시클로헵틸 암모늄이온, 트리시클로옥틸 암모늄이온 등을 들 수가 있다. 그 중에서도 트리메틸 암모늄이온 또는 트리에틸 암모늄이온이 바람직하며, 트리에틸 암모늄이온이 보다 바람직하다.
R5, R6, R7, R12, R14, R25, R26, R27, R32 및 R34로 나타내는 알킬기로서는, 직쇄형상, 분지형상 또는 환상 중 어느 것이라도 좋으며, 통상적으로 탄소수 1~6, 바람직하게는 1~3의 것을 들 수가 있으며, 구체적으로 예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, 이소펜틸기, sec-펜틸기, tert-펜틸기, 네오펜틸기, n-헥실기, 이소헥실기, sec-헥실기, tert-헥실기, 네오헥실기, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기 등을 들 수가 있다. 그 중에서도 메틸기, 에틸기, n-프로필기 등 의 직쇄형상의 알킬기가 바람직하다.
R5, R12, R25 및 R32로 나타내는 술포알킬기로서는, 술포기를 갖는, 통상적으로 탄소수 1~10, 바람직하게는 1~6의 알킬기이다. 이와 같은 알킬기로서는, 직쇄형상, 분지형상 또는 환상 중 어느 것이라도 좋으며, 예를 들면, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기 등을 들 수가 있다.
또, 술포알킬기의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 술포에틸기, 술포프로필기, 술포부틸기, 술포펜틸기, 술포헥실기 등을 들 수가 있으며, 바람직하게는 2-술포에틸기, 3-술포프로필기, 4-술포부틸기이다.
R13 및 R33으로 나타내는 카르복시알킬기로서는, 통상적으로 1~3개, 바람직하게는 한개의 카르복시기를 갖는, 통상적으로 탄소수 1~10, 바람직하게는 1~6의 알킬기이다. 이와 같은 알킬기로서는, 직쇄형상, 분지형상 또는 환상 중 어느 것이라도 좋으며, 예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, 이소펜틸기, sec-펜틸기, tert-펜틸기, 네오펜틸기, n-헥실기, 이소헥실기, sec-헥실기, tert-헥실기, 네오헥실기, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기 등을 들 수가 있다. 그 중에서도 직쇄형상의 것이 바람직하다.
또, 카르복시알킬기의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 카르복시메틸기, 카르복시에틸기, 카르복시프로필기, 카르복시부틸기, 카르복시펜틸기, 카르복시헥실기, 1,2-디카르복시에틸기, 1,3-디카르복시프로필기, 3,5-디카르복시페닐기, 3,4-디카 르복시페닐기, 2,4-디카르복시페닐기, 4-(1,2-디카르복시에틸)-페닐기 등을 들 수가 있으며, 바람직하게는, 카르복시메틸기, 2-카르복시에틸기, 3-카르복시프로필기, 4-카르복시부틸기, 5-카르복시헥실기 등을 들 수가 있다. 바람직하게는 2-카르복시에틸기, 3-카르복시프로필기, 4-카르복시부틸기이다.
본 발명에 있어서의 표지물질(1)의 바람직한 구체적인 예로서는, 예를 들면 하기에 나타내는 것을 들 수가 있다.
Figure 112009050749446-PCT00007
본 발명에 있어서의 표지물질(2)의 바람직한 구체적인 예로서는, 예를 들면 하기에 나타내는 것을 들 수가 있다.
Figure 112009050749446-PCT00008
본 발명에 있어서의 표지물질(1)과 표지물질(2)의 조합으로서는, 동일 치환기를 갖는 것이 바람직하고, 구체적으로 예를 들면, 상기 표의 (1)-1과 (2)-1의 조합, (1)-2와 (2)-2의 조합, (1)-3과 (2)-3의 조합, (1)-4와 (2)-4와의 조합 등이 보다 바람직하며, (1)-1과 (2)-1의 조합이 특히 바람직하다.
또, 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 및 (2)는, 예를 들면 WO96/17628호 팜 플렛(일본국 특개2002-12782호 공보), 미국특허 제6974873호 등에 기재된 자체공지의 합성방법에 의하여 합성할 수가 있다.
또, 시판품[예를 들면, DYOMICS사(Dyomics GmbH)제품, DY-647 및 DY-547 등]을 사용하는 것도 가능하다.
(3) 표지 피실험 게놈 DNA 단편, 표지대조DNA단편 및 표지방법
상술한 바와 같이, 본 발명의 방법은, CGH법에 있어서, 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 표지물질(2)의 어느 한 쪽의 표지물질로 표지된 피실험 게놈 DNA 단편(이하, 표지 피실험 게놈 DNA 단편으로 약기한다.)과 나머지 한 쪽의 표지물질로 표지된 대조게놈 DNA 단편(이하, 표지 대조게놈 DNA 단편으로 약기한다.)을 사용하는 것이다.
본 발명에 있어서, 표지 피실험 게놈 DNA단편은 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 표지물질(2)의 어느 한 쪽의 표지물질을 상기한 바와 같은 피실험 게놈 DNA 단편에 직접 또는 링커 등에 의해서 간접적으로 결합시킨 것이며, 또, 표지 대조게놈 DNA 단편은 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 표지물질(2)의 나머지 한 쪽의 표지물질(즉, 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 및 (2) 중, 피실험 게놈 DNA 단편에 결합시킨 것 이외의 나머지 한 쪽)을 상기한 바와 같은 대조게놈 DNA 단편에 직접 또는 링커 등에 의해서 간접적으로 결합시킨 것이다.
구체적으로는, 이들 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편은, 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 중의 카르복시알킬기[일반식(1)에 있어서의 R13] 또는 본 발명에 있어서의 표지물질(2) 중의 카르복시알킬기[일반식(1)에 있어서의 R33]가 피실험 게놈 DNA 단편 또는 대조게놈 DNA 단편과 직접 또는 링커 등에 의해서 간접적으로 결합한 것이다.
그 중에서도, 본 발명에 있어서 사용되는 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편으로서는, 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 중의 카르복시알킬기[일반식(1)에 있어서의 R13] 또는 본 발명에 있어서의 표지물질(2) 중의 카르복시알킬기[일반식(1)에 있어서의 R33]가 피실험 게놈 DNA 단편 또는 대조게놈 DNA 단편과 링커 등을 통하여 간접적으로 결합한 것이 바람직하다.
상기에 있어서, 링커로서는, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 것이라면 모두 사용이 가능하나, 구체적으로는, 하기 일반식(A)로 나타내는 구조의 링커를 들 수가 있다.
Figure 112009050749446-PCT00009
(식 중, E는 -CH=CH- 또는 -C≡C-를 나타내고, X 및 Y는 각각 독립하여 알킬렌기를 나타내며, T는 -O- 또는 -NH-CO-를 나타낸다.)
상기 일반식(A)에 있어서, X로 나타내는 알킬렌기로서는, 직쇄형상, 분지형상 또는 환상이라도 좋으며, 통상적으로 탄소수 1~10, 바람직하게는 1~6, 보다 바람직하게는 1~3의 것을 들 수가 있으며, 구체적으로 예를 들면, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 펜타메틸렌기, 헥사메틸렌기, 헵타메틸렌기, 옥타메틸렌기, 노나메틸렌기, 데카메틸렌기 등의 직쇄형상 알킬렌기, 예를 들면, 에틸리덴기, 프로필렌기, 이소프로필리덴기, 1-메틸트리메틸렌기, 2-메틸트리메틸렌기, 1,1-디메틸에틸렌기, 1,2-디메틸에틸렌기, 에틸에틸렌기, 1-메틸테트라메틸렌기, 1,1-디메틸트리메틸렌기, 2,2-디메틸트리메틸렌기, 2-에틸트리메틸렌기, 1-메틸펜타메틸렌기, 1-메틸헥사메틸렌기, 1-메틸헵타메틸렌기, 1,4-디에틸테트라메틸렌기, 2,4-디메틸헵타메틸렌기, 1-메틸옥타메틸렌기, 1-메틸노나메틸렌기 등의 분지형상 알킬렌기, 예를 들면, 시클로프로필렌기, 1,3-시클로부틸렌기, 1,3-시클로펜틸렌기, 1,4-시클로헥실렌기, 1,5-시클로헵틸렌기, 1,5-시클로옥틸렌기, 1,5-시클로노닐렌기, 1,6-시클로데칼렌기 등의 환상 알킬렌기 등을 들 수가 있다. 그 중에서도 직쇄형상의 것이 바람직하다.
Y로 나타내는 알킬렌기로서는, 직쇄형상, 분지형상 또는 환상이라도 좋으며, 통상적으로 탄소수 1~10, 바람직하게는 2~8, 보다 바람직하게는 2~6의 것을 들 수가 있으며, 구체적으로 예를 들면, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 펜타메틸렌기, 헥사메틸렌기, 헵타메틸렌기, 옥타메틸렌기, 노나메틸렌기, 데카메틸렌기 등의 직쇄형상 알킬렌기, 예를 들면, 에틸리덴기, 프로필렌기, 이소프로필리덴기, 1-메틸트리메틸렌기, 2-메틸트리메틸렌기, 1,1-디메틸에틸렌기, 1,2-디메틸에틸렌기, 에틸에틸렌기, 1-메틸테트라메틸렌기, 1,1-디메틸트리메틸렌기, 2,2-디메틸트리메틸렌기, 2-에틸트리메틸렌기, 1-메틸펜타메틸렌기, 1-메틸헥사메틸렌기, 1-메틸헵타메틸렌기, 1,4-디에틸테트라메틸렌기, 2,4-디메틸헵타메틸렌기, 1-메틸옥타메틸렌기, 1-메틸노나메틸렌기 등의 분지형상 알킬렌기, 예를 들 면, 시클로프로필렌기, 1,3-시클로부틸렌기, 1,3-시클로펜틸렌기, 1,4-시클로헥실렌기, 1,5-시클로헵틸렌기, 1,5-시클로옥틸렌기, 1,5-시클로노닐렌기, 1,6-시클로데칼렌기 등의 환상 알킬렌기 등을 들 수가 있다. 그 중에서도 직쇄형상의 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편은 상기한 바와 같으나, 환언하면, 표지 피실험 게놈 DNA 단편은, 본 발명에 있어서의 표지물질(1)에서 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 표지된 뉴클레오티드 잔기, 또는 본 발명에 있어서의 표지물질(2)에서 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 표지된 뉴클레오티드 잔기 중 어느 한 쪽의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것이며, 또, 표지 대조게놈 DNA 단편으로서는, 나머지 한 쪽의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것이다.
그 중에서도, 이들 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편으로서는, 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 (2)에서 링커 등을 통하여 간접적으로 표지된 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로는, 표지 피실험 게놈 DNA 단편으로서는, 하기 일반식(3)으로 나타내는 뉴클레오티드 잔기 또는 일반식(4)로 나타내는 뉴클레오티드 잔기 중 어느 한 쪽의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것이 바람직하고, 또, 표지 대조게놈 DNA 단편으로서는, 나머지 한 쪽의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
Figure 112009050749446-PCT00010
[식 중, Q1은 뉴클레오티드 잔기를 나타내고, V1은 링커를 나타내며, W1은 하기 일반식(1')를 나타낸다.
Figure 112009050749446-PCT00011
(식 중, Z1은 V1과 결합하는 결합수(結合手)를, R13'은 알킬기를 나타내며, R1~R12 및 R14는 상기와 동일.)],
Figure 112009050749446-PCT00012
[식 중, Q2는 뉴클레오티드 잔기를 나타내고, V2는 링커를 나타내며, W2는 하기 일반식(2')를 나타낸다.
Figure 112009050749446-PCT00013
(식 중, Z2는 V2와 결합하는 결합수를, R33'는 알킬기를 나타내며, R21~R32 및 R34는 상기와 동일.)].
일반식(3) 및 (4)에 있어서 Q1 및 Q2로 나타내는 뉴클레오티드 잔기로서는, 예를 들면, 리보뉴클레오티드 잔기, 2'-데옥시리보뉴클레오티드 잔기, 3'-데옥시리보뉴클레오티드 잔기, 5'-데옥시리보뉴클레오티드 잔기, 2',3'-디데옥시리보뉴클레오티드 잔기 등을 들 수가 있다.
구체적으로는, 이와 같은 뉴클레오티드 잔기로서는, 예를 들면, 일반식 (i), (ii), (v), (vi), (vii), (viii), (xii) 및 (xiii)로 나타내는 푸린뉴클레오티드 잔기, 또는 일반식 (iii), (iv), (x) 및 (xi)로 나타내는 피리미딘뉴클레오티드 잔기를 들 수가 있다.
Figure 112009050749446-PCT00014
Figure 112009050749446-PCT00015
상기 일반식에 있어서, Z3은 V1 또는 V2와 결합하는 결합수를, R51 및 R52는 각각 독립하여 H, OH 또는 O-를 나타내며, R53은 -PO2H-, -PO3H2, -P2O6H3, -P3O9H4 또는 그 염을 나타낸다. 또한, 염의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리금속염, 예를 들면, 암모늄염, 트리에틸암모늄염, 피리딘염 등의 유기아민염 등을 들 수가 있다.
또, R51과 R52는, R51이 H이며 R52가 OH 또는 O-의 조합, R51 및 R52가 모두 H의 조합, R51이 OH이며 R52가 H, OH 또는 O-의 조합이 바람직하며, R51이 H이며 R52가 OH 또는 O-의 조합이 보다 바람직하다.
또, R53은 -PO2H- 또는 -PO3H2가 바람직하다.
또, 일반식(3) 및 (4)의 뉴클레오티드 잔기를, 후술하는 표지 모노뉴클레오티드를 사용하여 효소적으로 DNA단편을 표지하는 방법으로 사용하기 위한 표지 모노뉴클레오티드로서 사용하는 경우에는, Q1 및 Q2로 나타내는 뉴클레오티드 잔기는 일반식(i)~(vi)로부터 선택되는 것이 바람직하다. 또, 일반식(i)~(vi)의 R51과 R52는, R51이 H이며 R52가 OH의 조합, R51 및 R52가 모두 OH의 조합이 바람직하며, R51이 H이며 R52가 OH의 조합이 보다 바람직하다. 또한, R53은 -P3O9H4가 바람직하다.
일반식(3) 및 (4)에 있어서 V1 및 V2로 나타내는 링커는, Q1 및 Q2로 나타내는 뉴클레오티드 잔기와, W1[일반식(1')] 및 W2[일반식(2')]로 나타내는 형광표지를 결합시키기 위한 링커이다.
즉, 해당 링커의 한 쪽 말단이, 상술한 Q1 및 Q2로 나타내는 뉴클레오티드 잔기 중, 피리미딘 뉴클레오티드 잔기에 대해서는 그 피리미딘환의 5위[일반식(iii), (iv)의 경우] 또는 인산잔기의 인원자[일반식(x), (xi)의 경우]에 결합하고, 또, 푸린뉴클레오티드 잔기에 대해서는 그 7-데아자푸린환의 7위[일반식(i), (ii), (v), (vi)의 경우] 또는 그 푸린환(또는 7-데아자푸린환)의 인산잔기의 인원자[일반식(vii), (viii), (ix), (xii), (xiii)의 경우]에 결합하고 있다.
또한, 해당 링커의 다른 쪽 말단이, W1[일반식(1')] 및 W2[일반식(2')]로 나 타내는 표지물질의 카르보닐기[일반식(1')에 있어서의 R13'에 결합하는 카르보닐기, 일반식(2')에 있어서의 R33'에 결합하는 카르보닐기]에 결합하고 있다.
이와 같은 링커로서는, W1[일반식(1')] 및 W2[일반식(2')]로 나타내는 표지물질의 카르보닐기[일반식(1')에 있어서의 R13'에 결합하는 카르보닐기, 일반식(2')에 있어서의 R33'에 결합하는 카르보닐기]와 Q1 및 Q2로 나타내는 뉴클레오티드 잔기를 결합할 수가 있는 것이라면 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는, 하기 일반식(A)로 나타내는 구조의 링커를 들 수가 있다.
Figure 112009050749446-PCT00016
식 중, E, X, T 및 Y는 상기와 동일하며, 또, 이들의 구체적인 예, 바람직한 예 등도 상술한 바와 같다.
따라서, 일반식(3) 및 일반식(4)로 나타내는 뉴클레오티드 잔기로서는, 각각 하기 일반식(3') 및 (4')로 나타내는 것이 바람직하며, 하기 일반식(3'') 및 (4'')로 나타내는 것이 보다 바람직하다.
Figure 112009050749446-PCT00017
Figure 112009050749446-PCT00018
(식 중, E1 및 E2는 각각 독립하여 -CH=CH- 또는 -C≡C-를 나타내며, X1, X2, Y1 및 Y2는 각각 독립하여 알킬렌기를 나타내며, T1 및 T2는 각각 독립하여 -O- 또는 -NH-CO-를 나타낸다. 또, Q1, Q2, W1 및 Y2는 상기와 동일하다.)
또한, 상기에 있어서, X1 및 X2로 나타내는 알킬렌기는 상술한 X로 나타내는 알킬렌기와 동일하며, 그 구체적인 예, 바람직한 예 등도 동일하다. 또, Y1 및 Y2로 나타내는 알킬렌기는 상술한 Y로 나타내는 알킬렌기와 동일하며, 그 구체적인 예, 바람직한 예 등도 동일하다.
Figure 112009050749446-PCT00019
Figure 112009050749446-PCT00020
(식 중, n은 1~10, 바람직하게는 1~6, 보다 바람직하게는 1~4의 정수를, m은 1~10, 바람직하게는 2~8, 보다 바람직하게는 2~4의 정수를 나타낸다. 또, Q1, Q2, W1, Y2, E1, E2, T1 및 T2는 상기와 동일하다.)
일반식(1') 및 (2')에 있어서 R13' 및 R33'으로 나타내는 알킬기로서는, 통상적으로 탄소수 1~9, 바람직하게는 1~5의 알킬기이다. 이와 같은 알킬기로서는, 직쇄형상, 분지형상 또는 환상 중 어느 것이라도 좋으며, 예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, 이소펜틸기, sec-펜틸기, tert-펜틸기, 네오펜틸기, n-헥실기, 이소헥실기, sec-헥실기, tert-헥실기, 네오헥실기, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기 등을 들 수가 있다. 그 중에서도 직쇄형상의 것이 바람직하다.
또, R1~R12, R14, R21~R32 및 R34는 상기와 동일하며, 그 구체적인 예, 바람직한 예 등도 상기한 바와 같다.
이와 같은 W1[일반식(1')] 및 W2[일반식(2')]로 나타내는 표지물질로서는, 상기한 바와 같은 본 발명에 있어서의 표지물질(1)[일반식(1)] 및 표지물질(2)[일반식(2)]에서 각각 유래하는 것이며, 이들의 바람직한 구체적인 예도 상술한 바와 같은 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 및 표지물질(2)와 동일하다.
상기한 바와 같은 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 (2)로 표지하는 방법으로서는, 최종적으로, 본 발명에 있어서의 표지물질(1)로 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 표지된 뉴클레오티드 잔기, 또는 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 표지된 뉴클레오티드 잔기 중 어느 한 쪽의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 피실험 게놈 DNA 단편, 및 나머지 한 쪽의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 대조게놈 DNA 단편을 얻을 수가 있는 것이라면 모두 사용할 수가 있다.
이와 같은 표지방법으로서는, 자체 공지의 직접표지법이나 간접표지법[예를 들면 WO96/17628호 팜플렛(일본국 특개2002-12782호 공보), 미국 특허 제6974873호, 일본국 특개2002-193991호 공보, WO99/12544호 팜플렛, 일본국 특개평 11-80189호 공보 등에 기재된 방법 등]을 들 수가 있다.
또, (1) 표지물질이 결합한 표지 모노뉴클레오티드를 사용하여 효소적으로 DNA단편을 표지하는 방법[예를 들면, 프라이머 익스텐션법(랜덤프라이머법, 프라이 머법 등), 닉 트랜슬레이션(nick translation)법, 말단부가반응법(터미널 데옥시 트랜스페라제법 등), PCR법, Degenerate Oligonucleotide Primer PCR(DOP-PCR)법 등] 등, (2) 표지물질이 결합한 표지 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 효소적으로 DNA단편을 표지하는 방법[예를 들면 프라이머 익스텐션법(랜덤프라이머법, 프라이머법 등), PCR법, Degenerate Oligonucleotide Primer PCR(DOP-PCR)법 등], 및 (3) 표지물질이 결합한 표지 올리고 또는 폴리뉴클레오티드를 효소적으로 DNA단편에 결합시켜서 표지하는 방법[말단부가반응법(라이게이션법) 등]을 사용하는 것도 가능하다.
또한, DNA단편에 반응성기(예를 들면 아미노알릴기, 설프히드릴기 등)를 도입한 후에 이 반응성기와 표지물질을 결합시키는 방법이나, DNA단편에 생리활성물질[예를 들면, 비오틴, DIG(digoxigenin), 당사슬(sugar chain) 등]을 도입한 후에, 해당 생리활성물질에 표지물질이 결합한 해당 생리활성물질과 결합할 수 있는 물질(예를 들면 아비딘, 특이적 항체, 렉틴 등)을 결합시키는 방법 등에 의하여 표지를 실시하여도 좋다.
또한, 상기한 방법은, 예를 들면 WO93/018186호 팜플렛(일본국 특표평 07-505053호 공보), 일본국 특개2006-115844호 공보, 일본국 특개2005-304481호 공보, 일본국 특개2006-94726호 공보, 일본국 특개평 11-258233호 공보, 일본국 특허2595201, nucleic Acids Research vol 14 number 19 1986년 p7617 등에 기재되어 있다.
또, 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 본 발명에 있어서의 표지 물질(1) 또는 (2)로 표지하는데 있어서는, 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 및 (2)를 사용하는 것 이외는, 상기한 바와 같은 표지법에 근거하는 시판의 표지키트를 사용하면 보다 간편하다.
상기한 표지방법 중에서도, 표지 모노뉴클레오티드를 사용하여 효소적으로 DNA단편을 표지하는 방법이 바람직하며, 랜덤프라이머법, 닉 트랜슬레이션법, 말단부가반응법이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서, 이들의 방법을 이용하는데, 본 발명에 있어서의 표지물질(1)이 결합한 표지 모노뉴클레오티드 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)가 결합한 표지 모노뉴클레오티드가 필요하나, 이들 표지 뉴클레오티드는 자체공지의 방법(예를 들면, 상기의 표지방법 등)에 의하여 제조할 수가 있다.
구체적으로, 예를 들면 일본국 특개 2002-193991호 공보([0102]~[0121]단락)에 기재된 방법에 준하여, 예를 들면 이하와 같이 조제할 수가 있다.
즉, 예를 들면 하기 일반식(a)로 나타내는 뉴클레오티드 유도체와 하기 일반식(b)로 나타내는 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 (2)의 숙신이미딜에스테르체를 반응시키는 것에 의해 용이하게 얻을 수가 있다.
Figure 112009050749446-PCT00021
(식 중, Q는 Q1 또는 Q2를 나타낸다. Q1, Q2, E, X, T 및 Y는 상기와 동일하다.)
Figure 112009050749446-PCT00022
(식 중, W는 W1 또는 W2를 나타내며, Su는 숙신이미드기를 나타낸다. W1 및 W2는 상기와 동일하다.)
또, 상술한 바와 같은 일반식으로 나타내는 링커 부분의 T(즉, T1 및 T2)가 -NH-CO-인 경우에는, 예를 들면 다음과 같이 조제하는 것도 가능하다.
즉, 예를 들면, 먼저 하기 일반식(c)로 나타내는 링커의 일부분(부분링커A)을 도입하고, 다시 나머지의 링커 부분(부분링커B)의 숙신이미딜에스테르체를 반응시켜서, 링커가 도입된 하기 일반식(d)로 나타내는 뉴클레오티드 유도체를 조제한다. 또한, 이 하기 일반식(d)로 나타내는 뉴클레오티드 유도체와 하기 일반식(e)로 나타내는 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 (2)의 숙신이미딜에스테르체를 반응시키는 것에 의해 용이하게 얻을 수 있다.
Figure 112009050749446-PCT00023
(식 중, E 및 X는 상기와 동일하다.)
Figure 112009050749446-PCT00024
(식 중, Q, E, X 및 Y는 상기와 동일하다.)
Figure 112009050749446-PCT00025
(식 중, W 및 Su는 상기와 동일하다.)
보다 구체적으로는, 상기한 바와 같이 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 표지물질(2)가 결합한 표지 모노뉴클레오티드 중, 형광표지 2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 유도체 및 형광표지 2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트 유도체는, 예를 들면 다음과 같은 합성경로에 준하여 합성할 수가 있다.
또한, 하기 합성경로에 있어서 사용되는 약칭 정식명칭은 하기와 같다.
·MeOTfa : 트리플루오로 아세트산 메틸
·-Tfa : 트리플루오로아세틸기
· Bu3SnH : 수소화트리(n-부틸)주석
·AIBN : 아조이소부티로니트릴
·Et3N : 트리에틸아민
·HO-Su : N-하이드록시 호박산이미드
·DMF : N,N-디메틸포름아미드
·TMS-Acetamide : N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드
·PdCl2(CH3CN)2 : 비스(아세토니트릴)디클로로팔라듐(II)
·tris(TBAPP) : 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트
·(EtO)3PO : 인산트리에틸
·TFP : 트리-2-푸릴포스핀
·Pd2(dba)3 : 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(O)
(1) 부분링커A의 합성
또한, 이 화합물은, 상기 일반식(A)로 나타내는 링커(-E-X-T-Y-NH-)에 있어서, T가 -NH-CO-인 경우의, -E-X-NH-에 상당하는 화합물로서, E가 -CH=CH- 및 X가 메틸렌기인 화합물이다.
Figure 112009050749446-PCT00026
(2) 부분링커B의 합성
또, 이 화합물은, 상기 일반식(A)로 나타내는 링커(-E-X-T-Y-NH-)에 있어서, T가 -NH-CO-인 경우의, -CO-Y-NH-에 상당하는 화합물에 있어서, Y가 펜타메틸렌기인 화합물이다.
Figure 112009050749446-PCT00027
(3) 2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 유도체[일반식(d)의 화합물]의 합성
또한, 이 화합물은, 일반식(3')(Q1-E1-X1-T1-Y1-NH-W1)의 Q1-E1-X1-T1-Y1-NH- 또는 일반식(4')(Q2-E2-X2-T2-Y2-NH-W2)의 Q2-E2-X2-T2-Y2-NH-에 상당하는 화합물에 있어서, Q1 또는 Q2가 2'-데옥시시티딘, E1 또는 E2가 -CH=CH-, X1 또는 X2가 메틸렌기, T1 또는 T2가 -NH-CO-, Y1 또는 Y2가 펜타메틸렌기인 화합물이다.
Figure 112009050749446-PCT00028
(4) 형광표지 2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 유도체[본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 (2)로 표지된 모노뉴클레오티드]의 합성
또, 해당 화합물은, 일반식(3')(Q1-E1-X1-T1-Y1-NH-W1) 또는 일반식(4')(Q2-E2-X2-T2-Y2-NH-W2)에 있어서의 Q1 및 Q2가 2'-데옥시시티딘, E1 및 E2가 -CH=CH-, X1 및 X2가 메틸렌기, T1 및 T2가 -NH-CO-, Y1 및 Y2가 펜타메틸렌기에 있어서, W1과 W2의 한 쪽이 하기 화합물(12a), 나머지 한 쪽이 하기 화합물(12b)인 화합물이다.
Figure 112009050749446-PCT00029
(5) 2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트 유도체[일반식(d)의 화합물]의 합성
또한, 이 화합물은, 일반식(3')(Q1-E1-X1-T1-Y1-NH-W1)의 Q1-E1-X1-T1-Y1-NH- 또는 일반식(4')(Q2-E2-X2-T2-Y2-NH-W2)의 Q2-E2-X2-T2-Y2-NH-에 상당하는 화합물에 있어서, Q1 또는 Q2가 2'-데옥시우리딘, E1 또는 E2가 -CH=CH-, X1 또는 X2가 메틸렌기, T1 또는 T2가 -NH-CO-, Y1 또는 Y2가 펜타메틸렌기인 화합물이다.
Figure 112009050749446-PCT00030
(6) 형광표지 2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트 유도체[본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 (2)로 표지된 모노뉴클레오티드]의 합성
또한, 해당 화합물은, 일반식(3')(Q1-E1-X1-T1-Y1-NH-W1) 또는 일반식(4')(Q2-E2-X2-T2-Y2-NH-W2)에 있어서의 Q1 및 Q2가 2'-데옥시우리딘, E1 및 E2가 -CH=CH-, X1 및 X2가 메틸렌기, T1 및 T2가 -NH-CO-, Y1 및 Y2가 펜타메틸렌기에 있어서, W1과 W2의 한 쪽이 하기 화합물(12a), 나머지 한 쪽이 하기 화합물(12b)인 화합물이다.
Figure 112009050749446-PCT00031
Figure 112009050749446-PCT00032
또, 상기 이외의 표지 뉴클레오티드에 대해서도 동일하게, 대응하는 원료를 사용하여 상기에 준하여 적절히 합성할 수가 있다.
표지물질이 결합한 표지 모노뉴클레오티드를 사용하여 효소적으로 DNA단편을 표지하는 방법을 이용하는 경우에는, 상기한 바와 같은, 본 발명에 있어서의 표지 물질(1)이 결합한 표지 모노뉴클레오티드 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)가 결합한 표지 모노뉴클레오티드를 사용하는 것 이외는, 이들 방법에서 사용되는 효소류나 시약류는 모두 사용이 가능하며, 예를 들면 이하와 같은 것을 들 수가 있다.
(a) 랜덤프라이머법의 경우 :
i) 랜덤프라이머법용 프라이머(랜덤한 염기서열을 갖는 프라이머), ii) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) DNA Polymerase(예를 들면 Klenow Fragment, phi 29 DNA Polymerase, Bca BEST DNA Polymerase 등), 바람직하게는 Klenow Fragment, iv) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(b) 프라이머법의 경우 :
i) 프라이머법용 프라이머(특정의 염기서열을 갖는 프라이머), ii) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) DNA Polymerase(예를 들면 Klenow Fragment, phi 29 DNA Polymerase, Bca BEST DNA Polymerase 등), 바람직하게는 Klenow Fragment, iv) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(c) 닉 트랜슬레이션법의 경우 :
i) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, ii) DNase I 및 DNA Polymerase I, iii) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(d) 말단부가반응법(터미널 데옥시 트랜스페라제를 사용한 방법)의 경우 :
i) 터미널 데옥시 트랜스페라제, ii) 필요에 따라서 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) 또한 필요에 따라서 반응완충액 등.
(e) PCR법의 경우 :
i) PCR법용 프라이머(특정의 염기서열을 갖는 프라이머), ii) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) 내열성 DNA Polymerase, iv) 필요에 따라서 반응완충액 등.
(f) DOP-PCR법의 경우 :
i) DOP-PCR법용의 프라이머(랜덤한 염기서열을 갖는 프라이머), ii) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) 내열성 DNA Polymerase, iv) 필요에 따라서 반응완충액 등.
또, 표지물질이 결합한 표지 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 효소적으로 DNA단편을 표지하는 방법을 이용하는 경우에는, 상기한 바와 같은, 본 발명에 있어서의 표지물질(1)이 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고 뉴클레오티드(프라이머) 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)가 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(프라이머)를 사용하는 것 이외는, 이들 방법에서 사용되는 효소류나 시약류는 모두 사용이 가능하며, 예를 들면 이하와 같은 것을 들 수가 있다.
또한, 이와 같은 프라이머로서는, 예를 들면 랜덤프라이머법의 경우는 랜덤한 염기서열을 갖는 프라이머(랜덤프라이머법용의 프라이머)이며, 프라이머법의 경우는 특정의 염기서열을 갖는 프라이머(프라이머법용의 프라이머)이다. 또, PCR법의 경우는 특정의 염기서열을 갖는 프라이머(PCR법용 프라이머)이며, DOP-PCR법의 경우는 랜덤한 염기서열을 갖는 프라이머(DOP-PCR법용 프라이머)이다.
(a) 랜덤프라이머법의 경우 :
i) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, ii) DNA Polymerase(예를 들면 Klenow Fragment, Phi 29 DNA Polymerase, Bca BEST DNA Polymerase 등), 바람직하게는 Klenow Fragment, iii) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(b) 프라이머법의 경우,
i) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, ii) DNA Polymerase(예를 들면 Klenow Fragment, Phi 29 DNA Polymerase, Bca BEST DNA Polymerase 등), 바람직하게는 Klenow Fragment, iii) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(c) PCR법의 경우 :
i) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, ii) 내열성 DNA Polymerase, iii) 필요에 따라서 반응완충액 등.
(d) DOP-PCR법의 경우 :
i) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, ii) 내열성 DNA Polymerase, iii) 필요에 따라서 반응완충액 등.
또한, 표지물질이 결합한 표지 올리고 또는 폴리뉴클레오티드를 효소적으로 DNA단편에 결합시켜서 표지하는 방법을 이용하는 경우에는, 상기한 바와 같은, 본 발명에 있어서의 표지물질(1)이 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고 또는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)가 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것 이외는, 이들 방법에서 사용되는 효소류나 시약류는 모두 사용이 가능하며, 예를 들면 이하와 같은 것을 들 수가 있다.
(a) 라이게이션법의 경우 :
i) 리가아제, ii) ATP, iii) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
또, 상기와 같이 하여 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 표지한 후, 자체공지의 정제방법(예를 들면 에탄올 침전법 등)에 의하여 유리(遊離)의 표지물질(또는 유리의 표지 모노뉴클레오티드)를 제거하는 것이 바람직하다. 또, 얻어진 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 후술하는 하이브리디제이션 공정에 사용할 때에는, 이들 게놈 DNA 단편 중에 존재하는 비특이적인 반복서열을 블록하기 위하여 Cot-1 DNA 등으로 처리해두는 것이 바람직하다. 또, 얻어진 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편이 2개 사슬 DNA인 경우에는, 가열처리 등에 의하여 1개 사슬화한 후에 하이브리디제이션 공정에 공급하 는 것이 일반적이다.
(4) 표본핵산
본 발명에 있어서, 「표본핵산」이란, 상술한 바와 같은 피실험 게놈 DNA 단편과 대조게놈 DNA 단편과의 차이(즉, 피실험 게놈 DNA의 카피수 이상)를 검출하기 위한 핵산서열을 포함하는 것이다.
즉, 「표본핵산」은, 검사대상이 되는(카피수 이상 또는 염색체 이상을 검출·조사하고자 하는) 세포(생물)의 모든 게놈(전체 염색체에 실질적으로 상당하는 게놈)에 상당하는 핵산서열 또는 상기와 같은 차이(카피수 이상)를 검출하고자 하는 특정의 게놈[특정의 염색체, 염색체의 특정영역(특정부위) 또는 특정의 유전자 등에 대응하는 게놈]에 상당하는 핵산서열을 포함하는 것이라면 좋다.
이와 같은 「표본핵산」으로서는, 예를 들면 모든 염색체, 특정의 염색체, 이들의 특정영역, 게놈 DNA 단편(예를 들면, 특정의 염색체에 실질적으로 상당하는 DNA서열을 갖는 것 등), 게놈 DNA단편의 일부(예를 들면, 특정의 염색체나 염색체의 특정영역에 실질적으로 상당하는 DNA서열을 갖는 것, 특정의 유전자에 대응하는 DNA서열을 갖는 것 등), mRNA(전부 또는 일부), cDNA(전부 또는 일부, 이들의 증폭산물) 등을 들 수가 있다.
구체적으로, 염색체(모든 염색체, 특정의 염색체, 이들의 특정영역)로서는, 통상적으로 정상 림파구의 메타페이즈(분열 중기 염색체) 또는 그 일부가 사용되나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
또, 게놈 DNA 단편으로서는, 세포 또는 세포집단 등으로부터 자체공지의 방 법에 의하여 추출된 게놈 DNA 단편, 클로닝된 게놈 DNA 단편, 이들 게놈 DNA 단편의 일부 등을 들 수가 있으며, 이들 게놈 DNA 단편의 특정영역의 서열을 갖는 합성올리고 DNA 프래그먼트, 이들 게놈 DNA 단편을 제한효소에 의하여 단편화 또는 화학적으로 단편화한 DNA 프래그먼트, 이들을 증폭시킨 증폭산물 등도 사용이 가능하다.
상기에 있어서, 클로닝된 게놈 DNA 단편이란, 적당한 벡터에 클로닝된 게놈 DNA 단편을 의미하며, 예를 들면, BAC(Bacterial Artificial Chromosome), YAC(Yeast Artificial Chromosome), PAC(P1-derived Artificial Chromosome), HAC(Human Artificial Chromosome), MAC(Mammalian Artificial Chromosome), TAC(Transformation competent Artificial Chromosome) 등의 인공염색체에 클로닝된 게놈 DNA 단편, 예를 들면, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터 등에 클로닝된 게놈 DNA 단편 등을 들 수가 있다.
이와 같은 표본핵산은, 자체공지된 추출법 또는 시판하는 추출키트를 사용하여 조제할 수가 있다. 또, 시판품을 사용하는 것도 가능하다.
(5) 어레이CGH
본 발명은, 상기한 표본핵산이 정착(고정화)된 기판을 사용하는, 소위 어레이CGH법에 유효하다.
어레이CGH법은, 상기한 바와 같은 표본핵산을 기판(예를 들면, 슬라이드 글라스, 유리나 금속, 수지성의 판상 칩, 마이크로 비즈, 섬유상 담체 등)에 공유결합이나 비공유결합 등에 의하여 체착(體着)(고정화)한 것을 사용하여 CGH법(해석) 을 실시하는 방법이다.
그 중에서도, 본 발명은, 상기한 바와 같은 게놈 DNA 단편, 게놈 DNA 단편의 일부, cDNA 등을 정착(고정)시킨 기판을 사용하는 경우에 유효하며, 특히 클로닝된 게놈 DNA 단편을 정착(고정)시킨 기판을 사용하는 경우에 유효하다.
또, 클로닝된 게놈 DNA 단편을 정착(고정)시킨 기판으로서는, BAC에 클로닝된 게놈 DNA 단편을 정착(고정)시킨 기판(BAC어레이)를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 클로닝된 게놈 DNA 단편을 정착(고정)시킨 기판은, 검사대상이 되는(카피수 이상 또는 염색체 이상을 검출·조사하고자 하는) 세포(생물)의 전체 게놈에 모두 대응할 수 있는 개수의 게놈 DNA 단편을 포함하거나, 상기와 같은 차이(카피수 이상)을 검출하고자 하는 염색체의 특정영역(특정부위) 또는 목적유전자에 대응하는 게놈 DNA 단편을 포함하는 것이라면 좋다. 즉, 복수의 DNA단편이 조합되어 종합적으로, 실질적으로 모든 염색체(또는 특정의 염색체) 또는 염색체의 특정영역에 상당하는 DNA서열을 커버하도록, 이들 복수의 DNA단편이 정착(고정화)된 것이라도, 1종 또는 2종 이상의 특정의 유전자(또는 mRNA, cDNA 등)에 대응하는 1종 또는 2종 이상의 DNA서열을 갖는 핵산단편(DNA단편, RNA단편)이 정착(고정화)된 것이라도 좋다.
또, 이들 클로닝된 게놈 DNA 단편은, 염색체 상의 위치가 확인되어 있는 것(도식화되어 있는)이 바람직하다.
표본핵산이 정착(고정)시킨 기판은, 자체공지의 방법[예를 들면 일본국 특개2006-115844호 공보, 일본국 특개2005-304481호 공보, 일본국 특개2006-94726호 공 보, 일본국 특개2005-500023호 공보, 일본국 특개2005-525786호 공보, 일본국 특개2005-304497호 공보 등에 기재된 방법 등] 등에 의하여 제조할 수가 있다.
또, 시판품을 사용하는 것도 가능하다[예를 들면, Macrogen사 제품「MacArray」, 미국 Spectral Genomics사 제품「SpectralChip」, Affymetrix사 제품「GeneChip」, GE Healthcare사 제품「CodeLink」, DNA칩 연구소 제품「AceGene」등].
(6) 구체적 방법
본 발명의 방법은, 상술한 바와 같은 원리에 근거하는 CGH법에 준하여 실시할 수가 있다.
즉, (a) 상술한 바와 같은 표본핵산에, (b) 본 발명에 있어서의 표지물질(1) 또는 표지물질(2) 중 어느 한 쪽의 표지물질로 표지된 피실험 게놈 DNA 단편과 나머지 한 쪽의 표지물질로 표지된 대조게놈 DNA 단편을 경합적으로 하이브리다이즈시켜(하이브리디제이션 공정), 얻어지는 형광강도를 지표로 하여, 피실험 게놈 DNA 중의 증폭 또는 결실(즉, 피실험 게놈 DNA의 카피수 이상)을 검출한다(분석공정).
상기에 있어서, 하이브리디제이션공정은, 표본핵산에 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 경합적으로 하이브리다이즈시키는 것이며, 예를 들면 표지 피실험 게놈 DNA 단편과 표지 대조게놈 DNA 단편을 포함하는 혼합액을 사용하는 등 하여, 이들 표지 피실험 게놈 DNA 단편과 표지 대조게놈 DNA 단편을 동시에 표본핵산에 접촉시키면 된다.
여기서, 사용되는 표지 피실험 게놈 DNA 단편과 표지 대조게놈 DNA 단편의 총량은, 통상 0.001~1000㎍, 바람직하게는 0.01~100㎍, 보다 바람직하게는 1~32㎍이다.
또, 표지 피실험 게놈 DNA 단편과 표지 대조게놈 DNA 단편의 사용비율은, 혼합액 중의 중량비로서, 피실험 게놈 DNA 1중량에 대하여 대조게놈 DNA의 중량이, 통상적으로 0.01배~100배, 바람직하게는 0.1배~10배, 보다 바람직하게는 0.5배~2배이다.
하이브리디제이션의 온도는 통상적으로 0℃~95℃, 바람직하게는 30℃~70℃, 보다 바람직하게는 35℃~46℃이며, 하이브리디제이션의 시간은 통상적으로 1~480시간, 바람직하게는 4~240시간, 보다 바람직하게는 24~120시간, 더욱 바람직하게는 36~72시간이다.
또, 하이브리디제이션은, 게놈 DNA 단편 중에 존재하는 비특이적 반복서열을 블록하기 위하여 Cot-1 DNA 등의 블록제의 존재하(예를 들면, 상기 혼합액 중에 Cot-1 DNA 등의 블록제를 공존시켜)에서 실시하는 것이 바람직하다. 또, 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편의 기판으로의 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 연어정자DNA의 존재하에서 실시할 수도 있다.
또한, 비특이적인 시그널을 가능한한 없애기 위하여, 하이브리디제이션 후에, 얻어진 표본핵산을 적당한 세정액으로 세정하는 것이 바람직하다.
상기 하이브리디제이션 공정은, 「스트린젠트한 조건」에서 실시하는 것이 바람직하다. 「스트린젠트한 조건」은, 자체공지의 CGH법에 있어서 사용되는 조건으로부터 적절히 선택하여 설정하면 좋으며, 특별히 한정되지 않으나, 구체적으로 예를 들면「50% 포름아미드, 2×SSC 및 4% SDS, 10% 덱스트란 황산을 포함하는 하이브리디제이션 완충액(pH7) 중 또는 이것과 동등한 스트린젠트한 조건을 얻을 수 있는 하이브리디제이션 완충액 중, 35~42℃의 온도에서 36시간~72시간 하이브리디제이션을 실시하고, 50% 포름아미드 함유 2×SSC(pH7), 0.1% SDS함유 2×SSC(pH7) 및 0.1% NP-40함유 0.1M 인산완충액(pH8), 또는 이들과 동등한 스트린젠트한 조건을 얻을 수 있는 완충액 등으로 필요에 따라 예비세정을 실시한 후, 2×SSC 또는 이것과 동등한 염농도의 용액 등으로 세정」이라는 조건이다. 또, 유사한 스트린젠시 조건을 얻기 위하여 동일한 정도이면서 다른 하이브리디제이션 및 세정조건을 이용할 수 있다는 것은 말할 나위도 없다.
상기에 있어서, 분석공정은, 하이브리디제이션 공정을 실시한 후, 표본핵산상의 형광강도를 측정하고, 얻어지는 형광강도를 지표로 하여, 피실험 게놈 DNA 중의 증폭 또는 결실(즉, 피실험 게놈 DNA의 카피수 이상)을 검출하는 것이다.
표본핵산상의 형광강도는, 예를 들면 레이저스캐너나 CCD카메라 등의 화상해석장치에 의하여 표본핵산상의 형광이미지를 취득하고, 취득한 형광이미지를 화상해석소프트 등을 사용하여 구할 수가 있다.
또, 얻어진 형광강도를 지표로 하여, 피실험 게놈 DNA 중의 증폭 또는 결실(즉, 피실험 게놈 DNA의 카피수 이상)을 검출하는데는, 예를 들면 얻어진 형광강도로부터, 화상해석 소프트 등을 사용하여 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질과 대조게놈 DNA 단편 유래의 표지물질과의 형광강도의 비를 구하여, 이것을 해석하면 된다.
즉, 대조게놈 DNA 단편 유래의 표지물질에 대한 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질의 형광강도의 비가 높을 경우에는, 표본핵산상의 해당 부분(영역)은, 대조게놈 DNA 단편과 비교하여 피실험 게놈 DNA 단편 보다 강하게 하이브리다이즈한 것을 나타내며, 피실험 게놈 DNA에 있어서의 표본핵산상의 해당 부분(영역)에 상당하는 영역의 증폭(카피수의 증가)이 검출되며, 반대로, 대조게놈 DNA 단편 유래의 표지물질에 대한 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질의 형광강도의 비가 낮을 경우(또는 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질의 형광이 확인되지 않은 경우)에는, 표본핵산상의 해당 부분(영역)은, 피실험 게놈 DNA 단편과 비교하여 대조게놈 DNA 단편 보다 강하게 하이브리다이즈한 것(또는 대조게놈 DNA 단편만이 하이브리다이즈한 것)을 나타내며, 피실험 게놈 DNA에 있어서의, 표본핵산상의 해당 부분(영역)에 상당하는 영역의 결실(카피수의 감소 또는 카피되어 있지 않은 것)이 검출된다. 또한, 상기에 있어서 형광강도의 비를 구하는데 있어서는, 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질의 형광강도의 평균과 대조게놈 DNA 단편 유래의 표지물질의 형광강도의 평균[환언하면, 본 발명에 있어서의 표지물질(1)에서 유래하는 형광강도의 평균과 본 발명에 있어서의 표지물질(2)에서 유래하는 형광강도의 평균]을 동일한 값으로 보정한 후에, 해당 보정값에 근거하여 형광강도의 비를 구하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서는, 상기한 바와 같은 피실험 게놈 DNA 중의 카피수 이상(또는 염색체 이상)을 판단하는 공정[환언하면, 피실험 게놈 DNA 중의 카피수 이상의 유무(또는 염색체 이상의 유무) 또는 카피수의 증가량 또는 감소량을 정량 (定量)(또는 반정량)하는 공정]이나 상기한 바와 같은 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 조제하는 공정을 포함하고 있어도 좋다.
본 발명의 방법은, 상기한 바와 같으나, 구체적으로 예를 들면 WO93/018186호 팜플렛(일본국 특표평 07-505053호 공보), 일본국 특개 2006-115844호, 일본국 특개 2005-304481호 공보, 일본국 특개 2006-94726호 공보, 일본국 특개 2005-500023호 공보, 일본국 특개 2005-525786호 공보, 일본국 특개 2005-304497호 공보, 일본국 특개평 11-258233호 공보 등에 기재된 방법 등에 준하여 실시할 수가 있으며, 이들에 기재된 시약류, 조건(예를 들면 하이브리디제이션 조건 등)은 모두 사용할 수가 있다.
이하에, 본 발명 방법의 일예로서, BAC어레이를 사용한 경우에 대하여 보다 구체적으로 기술한다.
(a) 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편의 조제
예를 들면, 상술한 바와 같이 하여 세포 또는 세포집단으로부터 추출한 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 각각 주형(형틀)으로 하여, 랜덤프라이머법을 이용하여, 본 발명에 있어서의 표지물질(1)[또는 본 발명에 있어서의 표지물질(2)]로 표지된 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)[또는 본 발명에 있어서의 표지물질(1)]로 표지된 표지 대조게놈 DNA 단편을 각각 합성한다. 이에 의하여, 사슬길이 100~5000bp정도의 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 얻을 수가 있다. 또, 필요에 따라, 자체공지의 정제법이나 시판의 정제키트에 의하여, 얻어진 표지 피실험 게놈 DNA 단편 또는 표지 대조게놈 DNA 단편을 함유하는 용액으로부터 표지게놈 DNA 단편에 포함되지 않았던 표지물질 등을 제거하여, 표지게놈 DNA 단편을 정제한다.
얻어진 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 함유하는 용액에, 반복서열을 블록하기 위하여 Cot-1 DNA(50~100㎍) 등을 추가하여, 이것을 에탄올 침전법 등에 의하여 침전시키고, 침전한 정제된 표지 피실험 게놈 DNA 단편, 표지 대조게놈 DNA 단편 및 Cot-1 DNA의 혼합물을 하이브리디제이션 용액[예를 들면 50% 포름아미드/2xSSC(2xSSC : 2배 농도의 표준구연산 완충액)/10% 황산덱스트란/4% SDS(SDS : 도데실 황산나트륨)/100mg/ml 효모tRNA, pH7.0 등]에 용해시킨다. 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 용해시킨 하이브리디제이션 용액을, 예를 들면 70℃에서 10분간 가열처리하여 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 1개 사슬화하고, 그 후 37℃에서 60분간 인큐베이팅하는 것에 의하여, 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편 중의 비특이적인 반복서열을 Cot-1 DNA로 블록한다.
(b) BAC어레이의 전처리
예를 들면, 상술한 바와 같이 하여 얻어진 BAC어레이 또는 시판의 BAC어레이에 있어서는, 어레이 위에 정착(고정화)되어 있는 표본핵산(DNA)이 1개 사슬인 경우는 그대로 하이브리디제이션에 제공하고, 해당 표본핵산(DNA)이 2개 사슬의 상태라면, 예를 들면 비등수 중에 1분 정도 가열하는 등에 의해 2개 사슬 표본핵산(DNA)을 1개 사슬화한 후, 이것을 건조시키고 나서 하이브리디제이션에 제공한다.
또한, 어레이담체에로의 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편 중의 흡착을 억제하기 위하여, 연어정자 유래의 DNA(10mg/ml)를 포함하는 하이브리디제이션 용액에 30분 정도 침지시킨 후, 정제수로 세정하고, 곧바로 건조시켜두면 좋다.
(c) 하이브리디제이션(Hybridization)
BAC어레이 위에 정착(고정화)되어 있는 표본핵산(DNA) 단편(BAC 클론DNA 단편)과, 얻어진 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 접촉시켜, 표본핵산(DNA)과 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편과의 경합적 하이브리디제이션 반응을 상술한 바와 같은 조건하에서 실시한다. 또한, BAC어레이 위의 표본핵산과 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편과의 접촉은, 상기한 바와 같이 하여 얻어진 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 용해시킨 하이브리디제이션 용액을 BAC어레이 위에 적하하여 실시하고, 또, 적하한 후, 어레이 위에 커버글라스 등을 걸쳐서, 습윤조건하에서 하이브리디제이션을 실시한다. 또한, 접촉·하이브리디제이션은, 어레이에서의 하이브리디제이션용 시판장치를 사용하여 실시하여도 좋다.
하이브리디제이션 반응이 완료한 후, 얻어진 BAC어레이를 세정하고, 특이적인 표본핵산(DNA)과 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편과의 결합을 남기고, 비특이적인 하이브리디제이션, 또는 흡착하고 있는 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 표본핵산(DNA)으로부터 제거한다. BAC어레이의 세정은, 예를 들면 46℃로 가온한 50% 포름아미드/2xSSC, pH7에 15분, 0.1% SDS/2xSSC, pH7에 30분 침지하고, 이어서 실온의 0.1% NP40/0.1M 인산완충액, pH7에 15분, 2xSSC, pH7에 5분 침지하는 것에 의해 실시하고, 세정후는 얻어진 BAC어레이를 에탄올로 씻어서 건조시키면 좋다.
(d) 형광강도의 측정
BAC어레이 위에 정착(고정화)되어 있는 각 표본핵산(DNA)에 하이브리다이즈한 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 형광강도(시그널)와 대조게놈 DNA 단편 유래의 형광강도(시그널)의 측정을 실시한다. 형광강도는, 예를 들면 레이저스캐너나 CCD카메라 등의 화상 해석장치에 의하여 각 표본핵산(DNA)의 형광화상(이미지)을 취득하고, 취득한 형광화상(이미지)을 화상해석소프트 등을 사용하여 구한다.
(e) 증폭 또는 결실의 검출
피실험 게놈 DNA 중의 증폭 또는 결실(즉, 피실험 게놈 DNA의 카피수 이상)의 검출은, 예를 들면 화상해석소프트 등을 사용하여 얻어진 형광강도로부터 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 표지물질과 대조게놈 DNA 단편 유래의 표지물질과의 형광강도의 비를 구하여, 이것을 해석하여 실시한다.
즉, 표본핵산(DNA) 단편(BAC 클론DNA 단편)에 상당하는 게놈영역에 있어서, 피실험 게놈 DNA 단편을 추출한 원래의 세포(예를 들면 이상세포 등)에서 카피수 증가(증폭)가 발생되어 있으면 피실험 게놈 DNA 단편이 대조게놈 DNA 단편에 비하여 상대적으로 많이 하이브리다이즈하고, 한편, 피실험 게놈 DNA 단편을 추출한 원래의 세포(예를 들면 이상세포 등)에서 카피수 감소(결실)가 발생되어 있으면, 대조게놈 DNA 단편이 피실험 게놈 DNA 단편에 비하여 상대적으로 많이 하이브리다이 즈하게 된다. 따라서, BAC어레이 위의 각 표본핵산(DNA단편)마다에, 피실험 게놈 DNA 단편 유래의 형광강도(시그널)와 대조게놈 DNA 단편 유래의 형광강도(시그널)를 비교하는 것에 의해(즉, 이들 형광강도의 비를 산출하고, 이것을 해석하는 것에 의하여), 각 표본핵산(DNA단편)에 상당하는 게놈영역에 있어서, 피실험 게놈 DNA 단편을 추출한 원래의 세포(예를 들면 이상세포 등)에서 카피수 증가가 발생되어 있는지, 감소하고 있는지, 정상레벨인지를 판정할 수가 있다.
(7) 본 발명의 키트
본 발명의 키트는, 상기한 바와 같은 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 사용되는 것이다.
이와 같은 키트로서는, (i) 적어도, 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 표지하기 위하여 사용되는, 본 발명의 표지물질(1)로 표지된 뉴클레오티드 잔기와 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 뉴클레오티드 잔기, 바람직하게는 상기한 바와 같은 일반식(3)으로 표지되는 표지 뉴클레오티드 잔기와 일반식(4)로 나타내는 표지 뉴클레오티드 잔기, 보다 바람직하게는 일반식(3')로 나타내는 표지 뉴클레오티드 잔기와 일반식(4')로 나타내는 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하여 이루어지는 것이며, (ii) 바람직하게는, 다시, 상술한 바와 같은, 프라이머, 효소류, 시약류 등으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하여 이루어지는 것이다.
이와 같은 키트로서는, 예를 들면 다음와 같은 구성요건을 포함하는 것을 들 수가 있다.
또한, 구성요건의 바람직한 양태와 구체적인 예는 상술한 바와 같다.
(a) 표지 모노뉴클레오티드를 사용하는 랜덤프라이머법용 키트의 경우 :
i) 본 발명의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드와 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드, ii) 랜덤프라이머법용의 프라이머(랜덤한 염기서열을 갖는 프라이머), iii) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iv) DNA Polymerase(예를 들면 Klenow Fragment, phi 29 DNA Polymerase, Bca BEST DNA Polymerase 등), 바람직하게는 Klenow Fragment, v) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(b) 표지 모노뉴클레오티드를 사용하는 프라이머법용 키트의 경우 :
1) 본 발명의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드와 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드, ii) 프라이머법용의 프라이머(특정의 염기서열을 갖는 프라이머), iii) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iv) DNA Polymerase(예를 들면 Klenow Fragment, phi 29 DNA Polymerase, Bca BEST DNA Polymerase 등), 바람직하게는 Klenow Fragment, v) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(c) 표지 모노뉴클레오티드를 사용하는 닉 트랜슬레이션법용 키트의 경우 :
i) 본 발명의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드와 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드, ii) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3 종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) DNase I 및 DNA Polymerase I, iv) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(d) 표지 모노뉴클레오티드를 사용하는 말단부가반응법(터미널 데옥시 트랜스페라제를 사용한 방법)의 경우 :
i) 본 발명의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드와 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드, ii) 터미널 데옥시 트랜스페라제, iii) 필요에 따라서 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iv) 또한 필요에 따라서 반응완충액 등.
(e) 표지 모노뉴클레오티드를 사용하는 PCR법의 경우 :
i) 본 발명의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드와 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드, ii) PCR법용 프라이머(특정의 염기서열을 갖는 프라이머), iii) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 또는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iv) 내열성 DNA Polymerase, v) 필요에 따라서 반응완충액 등.
(f) 표지 모노뉴클레오티드를 사용하는 DOP-PCR법의 경우 :
i) 본 발명의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드와 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드, ii) DOP-PCR법용 프라이머(랜덤한 염기서열을 갖는 프라이머), iii) dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(또는 dUTP)로부터 선택되는 상기한 바와 같은 표지 모노뉴클레오티드 이외의 적어도 3종, 바람직하게는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iv) 내열성 DNA Polymerase, v) 필요에 따라서 반응완충액 등.
(g) 표지 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 랜덤프라이머법의 경우 :
i) 본 발명에 있어서의 표지물질(1)이 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(랜덤한 염기서열을 갖는 랜덤프라이머법용의 프라이머) 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)가 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(랜덤한 염기서열을 갖는 랜덤프라이머법용의 프라이머), ii) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) DNA Polymerase(예를 들면 Klenow Fragment, phi 29 DNA Polymerase, Bca BEST DNA Polymerase 등), 바람직하게는 Klenow Fragment, iv) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(h) 표지 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 프라이머법의 경우 :
i) 본 발명에 있어서의 표지물질(1)이 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(특정한 염기서열을 갖는 프라이머법용 프라이머) 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)가 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(특정한 염기서열을 갖는 프라이머법용 프라이머), ii) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) DNA Polymerase(예를 들면 Klenow Fragment, phi 29 DNA Polymerase, Bca BEST DNA Polymerase 등), 바람직하게는 Klenow Fragment, iv) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
(i) 표지 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 PCR법의 경우 :
i) 본 발명에 있어서의 표지물질(1)이 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(특정한 염기서열을 갖는 PCR법용의 프라이머) 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)가 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(특정한 염기서열을 갖는 PCR법용의 프라이머), ii) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) 내열성 DNA Polymerase, iv) 필요에 따라서 반응완충액 등.
(j) 표지 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 DOP-PCR법의 경우 :
i) 본 발명에 있어서의 표지물질(1)이 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(랜덤한 염기서열을 갖는 DOP-PCR법용의 프라이머) 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)가 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고누클리오티드(랜덤한 염기서열을 갖는 DOP-PCR법용 프라이머), ii) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, iii) 내열성 DNA Polymerase, iv) 필요에 따라서 반응완충액 등.
(k) 라이게이션법용 키트의 경우 :
i) 본 발명에 있어서의 표지물질(1)이 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고 또는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)가 결합한 표지 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고 또는 폴리뉴클레오티드, ii) 리가아제, iii) ATP, iv) 필요에 따라서 반응완충액, 반응정지액 등.
또한, 상기 이외의 효소나 시약류를 첨가하여, 본 발명의 키트로 할 수도 있다. 이와 같은 시약류로서는, 예를 들면 다음과 같은 a)~k)로부터 선택되는 적어도 1종을 들 수가 있다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.
a) DNA단편을 표지하기 위한 효소류용의 반응완충액(예를 들면 마그네슘염 등의 염류, 메르캅토에탄올 또는 디티오스레이톨 등을 함유하는 Good's 완충액 등),
b) DNA단편을 표지하기 위한 효소류의 반응을 정지하기 위한 반응정지액(예를 들면 킬레이트제 등의 반응정지제를 함유하는, 예를 들면, 물이나 Good's 완충액 등),
c) 표지 모노뉴클레오티드나 표지게놈 DNA 단편(피실험 게놈 DNA 단편, 대조게놈 DNA 단편)을 정제하기 위한 시약류,
d) 표본핵산 및 표본핵산을 정착(고정화)시키기 위한 기판, 또는 표본핵산이 정착(고정화)된 기판,
e) 하이브리디제이션용의 완충액[예를 들면 50% 포름아미드, 2×SSC, 4% SDS 및 10% 덱스트란 황산을 포함하는 완충액(pH7) 등],
f) 하이브리디제이션할 때의 비특이흡착방지용 시약(예를 들면 연어정소 유래 DNA, t-RNA, Cot-1 DNA 등),
g) 하이브리디제이션 후의 세정액(예를 들면 50% 포름아미드 함유 2×SSC, 0.1% SDS함유 2×SSC, 0.1% NP-40함유 0.1M인산완충액, 2×SSC, 에탄올, 이소프로판올 등),
h) 피실험 게놈 DNA 단편 또는/및 대조게놈 DNA 단편을 추출하기 위한 추출용 시약(예를 들면 분쇄용 완충액, DNA정제를 위한 RNase, 단백제거용 프로테아제, 페놀, 클로로포름, SDS, β-메르캅토에탄올, 정제용 칼럼 등),
i) 피실험 게놈 DNA 단편 또는/및 대조게놈 DNA 단편을 단편화하기 위한 단편화시약(예를 들면 제한효소 등),
j) 예를 들면, 추출, 표지, 단편화, 정제 등을 실시한 후에, 얻어진 피실험 게놈 DNA 단편 또는/및 대조게놈 DNA 단편을 확인하기 위한 전기영동용 시약(아가로스 또는 폴리아크릴아미드겔, 로딩 완충액, 브롬화 에티듐염색용 시약 등),
k) 알코올침전용 시약(예를 들면 에탄올용액, 이소프로판올 용액, 고분자캐리어, 아세트산나트륨 용액 등) 등.
또, 상술한 바와 같은 본 발명의 방법에서의 사용을 위한 설명서 등을 포함시켜두는 것도 좋다. 상기 「설명서」란, 본 발명의 방법에 있어서의 특징·원리·조작순서 등이 문장 또는 도표 등에 의해 실질적으로 기재되어 있는 해당 키트의 취급설명서, 첨부문서, 또는 팜플렛(리플릿) 등을 의미한다.
이하에 합성예, 실시예 등을 들어서, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
합성예 1. 표지 모노뉴클레오티드(형광표지 2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트유도체)의 합성
본 발명에 있어서의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드(2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트) 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드(2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트)를 각각 상기한 합성경로를 따라서, 다음 과 같이 합성하였다.
(1) 부분링커A의 합성
(i) 트리플루오로아세틸(Tfa)화(제1공정)
21g의 Propagylamine[상술한 합성경로중 (1)의 화합물](도쿄카세이(주) 제품)에, 빙냉하에서 트리플루오로 아세트산 메틸(MeOTfa)(54g)을 적하한 후, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응종료후, 감압증류(20mmHg, 74℃)로 정제를 실시하고, 56g의 화합물[상술한 합성경로중 (2)의 화합물]을 얻었다(수득률;98.1%).
(ii) 트리(n-부틸)주석(Bu3Sn)화(제2공정)
15g의 화합물(2)[상술한 합성경로중 (2)의 화합물]를 벤젠(300mL)에 용해시키고, 수소화트리(n-부틸)주석(Bu3SnH)(35mL), 아조이소부티로니트릴(AIBN)(2.1g)을 첨가한 후, 환류하에서 1.5시간 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하였다. 잔사를 실리카겔칼럼(용리액;AcOEt:Hexane=1:20)으로 정제하여, 11.4g의 화합물(3)(부분링커A)[상술한 합성경로중 (3)의 화합물]을 얻었다(수득률;25.8%).
(2) 부분링커B의 합성
(i) 트리플루오로아세틸(Tfa)화(제3공정)
10g의 6-Aminohexanoic acid[상술한 합성경로중 (4)의 화합물](와코준야쿠고교(주) 제품)를, CHCl3에 현탁하고, 트리플루오로 아세트산 메틸(MeOTfa)(25g), 트리에틸아민(Et3N)(25mL)을 첨가한 후, 실온에서 2일간 교반하였다. 반응종료후, 용매를 증류제거하고, 물로부터 결정화를 실시하는 것에 의해, 8.4g의 화합물[상술한 합성경로중 (5)의 화합물]을 얻었다(수득률;48.6%).
(ii) 활성에스테르화(제4공정)
2.3g의 화합물(5)[상술한 합성경로중 (5)의 화합물]를 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(50mL)에 용해시키고, N-하이드록시 호박산 이미드(HO-Su)(1.4g), WSC(2.3g)를 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, 아세트산에틸로 분액세정하였다. 유기층을 감압농축하는 것에 의해, 3.6g의 화합물(6)(부분링커B)[상술한 합성경로중 (6)의 화합물]을 얻었다(수득률;정량적).
(3) 링커의 도입
(i) 부분링커A의 도입(제5공정)
1.0g의 5-요오드-2'-데옥시시티딘[상술한 합성경로중 (7)의 화합물](와코준야쿠고교(주) 제품)을 아세토니트릴(30mL)에 현탁하고, Ar가스 치환하에서 N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드(TMS-Acetamide)(3mL)를 첨가한 후, 환류하에서 2시간 교반하였다. 반응액을 실온에서 냉각시킨 후, 비스(아세토니트릴)디클로로팔라듐(II)[PdCl2(CH3CN)2](40mg), 및 2g의 부분링커A[상술한 합성경로중 (3)의 화합물]를 첨가하고, 다시 50~60℃에서 20시간 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하였다. 잔사를 실리카겔칼럼(용리액;CHCl3:MeOH=9:1)으로 정제를 실시하고, 디에틸에테르로부터 결정화하는 것에 의해, 720mg의 2'-데옥시시티딘 유도체[상술한 합성경로중 (8)의 화합물]를 얻었다(수득률;67.3%).
(ii) 탈(脫) 트리플루오로아세틸(Tfa)화(제6공정)
500mg의 2'-데옥시시티딘 유도체[상술한 합성경로중 (8)의 화합물]를 EtOH(10mL)에 용해시키고, 25%-암모니아수(25mL)를 첨가한 후, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하였다. 잔사를 ODS칼럼크로마토(용리액;5%-MeOH)로 정제하는 것에 의해, 190mg의 2'-데옥시시티딘 유도체[상술한 합성경로중 (9)의 화합물]를 얻었다(수득률;50.9%).
(iii) 부분링커B의 도입(제7공정)
190mg의 2'-데옥시시티딘 유도체[상술한 합성경로중 (9)의 화합물]를 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(4mL)에 용해시키고, 330mg의 부분링커B[상술한 합성경로중 (6)의 화합물]를 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, 잔사를 실리카겔칼럼(용리액;CHCl3:MeOH:AcOH=80:20:5)으로 정제를 실시하였다. 또한, ODS칼럼크로마토(용리액;20%-MeOH)로 정제하여, 169mg의 2'-데옥시시티딘 유도체[상술한 합성경로중 (10)의 화합물]를 얻었다(수득률;51.2%).
(4) 모노뉴클레오티드의 트리 인산화
(i) 트리 인산화 시약 0.5M 트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트 [tris(TBAPP)]의 조제
Dowex50W×8(H+Form)(100cm3) 칼럼에 피로인산나트륨·10수화물수용액(6.7g/100mL)을 채우고, 용출액(피로인산용액)을 10.6mL의 트리부틸아민을 포함하는 EtOH(50mL)용액에 직접 적하하였다. 10분간 교반한 후, 감압농축하고, 잔사에 EtOH(30mL×2회), 톨루엔(30mL×3회), N,N-디메틸포름아미드(DMF)(20mL×2)를 차례로 첨가하고, 감압농축을 반복하였다. DMF로 30mL에 정량(定量)으로 한 후, MS4A를 첨가하고, 하룻밤 탈수시켜, 0.5M-tris(TBAPP)용액을 얻었다.
(ii) 트리 인산화(제8공정)
147mg(0.3mmol)의 2'-데옥시시티딘 유도체[상술한 합성경로중 (10)의 화합물]를 인산트리에틸[(EtO)3PO](1.4mL)에 용해시키고, 옥시염화인(27μL+24μL)을 첨가한 후, 저온실에서 4시간 교반하였다. 이것에 상기에서 얻은 0.5M-tris(TBAPP)(4mL)를 투입하고, 저온실에서 2시간 교반한 후, 반응액에 7%-트리에틸아민(Et3N)수용액(7mL)을 첨가하고, 다시 하룻밤 교반하였다. 반응후, 반응액을 디에틸에테르로 세정하고, DEAE-TOYOPEARL칼럼(용리액;물 → 0.2M-TEAB그라디언트)으로 정제하였다. 이어서, 농축잔사를 25%-암모니아수(30mL)에 용해시키고, 저온실에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 암모니아를 감압하에서 증류제거하고, 잔사를 동결건조시키는 것에 의해, 130mg의 2'-dCTP-아미노링커 유도체[상술한 합성경로중 (11)의 화합물]를 얻었다(HPLC순도;95.8%, 함량;77.3%).
(5) 모노뉴클레오티드의 표지(제9공정)
2.8mg의 2'-dCTP-아미노링커 유도체[상술한 합성경로중 (11)의 화합물]를 이온교환수(150μL)에 용해시키고, Dy547-NHS-ester(Dyomics사 제품)[상술한 합성경로중 (12a)의 화합물]의 DMF용액(1mg/100μL)을 5회 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, Wakosil 50C18칼럼(용리액;5%- MeOH), 이어서 DEAE-TOYOPEARL 650M칼럼(용리액;0.2M-TEAB)으로 정제를 실시하였다. 농축잔사를 동결건조하는 것에 의해 2.5mg의 형광표지 2'-dCTP유도체[상술한 합성경로중 (13a)의 화합물(Dy547-dCTP):본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드]를 얻었다.
또, Dy547-NHS-ester의 대신에 Dy647-NHS-ester(Dyomics사 제품)[상술한 합성경로중 (12b)의 화합물]를 사용하는 것 이외는 상기와 동일하게 실시하여, 2.5mg의 형광표지 2'-dCTP유도체[상술한 합성경로중 (13b)의 화합물(Dy647-dCTP):본 발명에 있어서의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드]을 얻었다.
합성예 2. 표지 모노뉴클레오티드(형광표지 2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트유도체)의 합성
본 발명에 있어서의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드(2'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트) 및 본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드(2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트)를 각각 상기한 합성경로를 따라서, 다음과 같이 합성하였다.
(1) 링커의 도입
(i) 부분링커A의 도입(제5공정)
3.0g의 5-요오드-2'-데옥시우리딘[상술한 합성경로중 (14)의 합성물](와코준야쿠고교(주) 제품)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(25mL)에 현탁하고, Ar가스치환하에서 트리-2-푸릴포스핀(TFP)(80mg), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라 듐(O)[Pd2(dba)3](160mg), 및 4.5g의 부분링커A[상술한 합성경로중 (3)의 화합물]를 첨가하고, 실온에서 20시간 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, 에탄올로 결정화하는 것으로, 2.4g의 2'-데옥시우리딘 유도체[상술한 합성경로중 (15)의 화합물]를 얻었다(수득률;80.5%).
(ii) 탈(脫) 트리플루오로아세틸(Tfa)화(제6공정)
1.6g의 2'-데옥시우리딘 유도체[상술한 합성경로중 (15)의 화합물]를 MeOH(20mL)에 용해시키고, 25%-암모니아수(25mL)를 첨가한 후, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, 에탄올로 결정화하는 것에 의해, 1.0g의 2'-데옥시우리딘 유도체[상술한 합성경로중 (16)의 화합물]를 얻었다(수득률;82.6%).
(iii) 부분링커B의 도입(제7공정)
700mg의 2'-데옥시우리딘 유도체[상술한 합성경로중 (16)의 화합물]를 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(10mL)에 용해시키고, 1g의 부분링커B[상술한 합성경로중 (6)의 화합물]를 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, 잔사를 실리카겔칼럼(용리액;CHCl3:MeOH:AcOH=80:20:5)으로 정제하여, 870mg의 2'-데옥시시티딘 유도체[상술한 합성경로중 (17)의 화합물]를 얻었다(수득률;71.3%).
(2) 모노뉴클레오티드의 트리 인산화
(i) 트리 인산화(제8공정)
147mg(0.3mmol)의 2'-데옥시우리딘 유도체[상술한 합성경로중 (17)의 화합물]를 인산트리에틸[(EtO)3PO](1.4mL)에 용해시키고, 옥시염화인(27μL+24μL)을 첨가한 후, 저온실에서 4시간 교반하였다. 이것에 상기에서 얻은 0.5M트리스(트리-n-부틸암모늄)피로포스페이트[tris(TBAPP)](4mL)를 투입하고, 저온실에서 2시간 교반한 후, 반응액에 7%-트리에틸아민 수용액(7mL)을 첨가하고, 다시 하룻밤 교반하였다. 반응후, 반응액을 디에틸에테르로 세정하고, DEAE-TOYOPEARL칼럼(용리액;물 → 0.2M-TEAB그라디언트)으로 정제하였다. 이어서, 농축잔사를 25%-암모니아수(30mL)에 용해시키고, 저온실에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 암모니아를 감압하에서 증류제거하고, 잔사를 동결건조하는 것에 의해, 130mg의 2'-dUTP-아미노링커 유도체[상술한 합성경로중 (18)의 화합물]를 얻었다(HPLC순도;96.3%, 함량;42.0%).
(3) 모노뉴클레오티드의 표지(제9공정)
1.4mg의 2'-dUTP-아미노실리카유도체[상술한 합성경로중 (18)의 화합물]를 이온교환수(150μL)에 용해시키고, Dy547-NHS-ester(Dyomics사 제품)[상술한 합성경로중 (12a)의 화합물]의 DMF용액(1mg/100μL)을 5회 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고, Wakosil 50C18칼럼(용리액;5%-MeOH), 이어서 DEAE-TOYOPEARL 650M칼럼(용리액;0.2M-TEAB)으로 정제를 실시하였다. 농축잔사를 동결건조하는 것에 의해 2.2mg의 형광표지 2'-dUTP유도체[상술한 합성경로중 (19a)의 화합물(Dy547-dUTP):본 발명에 있어서의 표지물질(2)로 표지된 모노뉴클레오티드]를 얻었다.
또, Dy547-NHS-ester의 대신에 Dy647-NHS-ester(Dyomics사 제품)[상술한 합성경로중 (12b)의 화합물]를 사용하는 것 이외는 상기와 동일하게 실시하여, 1.8mg의 형광표지 2'-dUTP유도체[상술한 합성경로중 (19b)의 화합물(Dy647-dUTP):본 발명에 있어서의 표지물질(1)로 표지된 모노뉴클레오티드]를 얻었다.
실시예 1. BAC어레이를 사용한 CGH해석
피실험 게놈 DNA 단편으로서 정상여성의 게놈 DNA를 사용하고, 대조게놈 DNA 단편으로서 정상남성의 게놈 DNA를 사용하여, BAC어레이에 의한 CGH해석을 실시하였다.
(1) 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편의 조제
(i) 표지 뉴클레오티드의 혼합
정상 Male DNA(Promega사 제품)(대조게놈 DNA 단편)과 정상 Female DNA(Promega사 제품)(피실험 게놈 DNA 단편) 각 500ng를 PCR용 튜브에 각각 분리채취하고, 1500㎍/ml Random Octamer solution(닛뽄EGT사 제품) 10μL, 250mM MOPS(pH7.0)(25mM MgCl2, 50mM 2-mercaptoethanol 함유) 10μl를 첨가하고, 멸균수를 첨가하여 전체량을 39μL로 조정하였다. 이들 혼합액을, 100℃에서 10분간 가열한 후, 얼음 위에서 5분간 냉각시키고, 랜덤프라이머를 Male DNA 및 Female DNA에 각각 어닐(anneal)시켰다. 이어서 실온에서 5분간 방치한 후, dNTP용액[와코준야쿠고교(주) 제품, dNTPset(2mM dATP, 2mM dGTP, 2mM dTTP 및 1mM dCTP함유])를 5μL첨가하였다.
또, Male DNA(대조게놈 DNA 단편)의 튜브에는 1mM Dy547-dCTP[합성예 1에서 얻어진 상술한 합성경로중 (13a)의 화합물]를, Female DNA(피실험게놈 DNA단편)의 튜브에는 1mM Dy647-dCTPp [합성예 1에서 얻어진 상술한 합성경로중 (13a)의 화합물]를 각각 3μL첨가하였다. 원심분리기에 의해 스핀다운 시킨 후, 이들의 혼합액에 Klenow Flagment(Fermentas사 제품)를 3μL(30unit)첨가하고, 마이크로 피펫으로 피펫팅하여 거품을 만들지 않도록 혼합하였다.
37℃에서 16시간 반응한 후, 각 튜브에 0.5M EDTA용액을 5μL첨가하고, 반응을 정지시켰다.
(ii) 스핀칼럼을 사용한 표지게놈 DNA 단편의 정제
PCR Purification Kit(Qiagen사 제품)를 사용하여, 상기 (i)의 반응액중에 존재하는 미반응 표지 뉴클레오티드(Dy547-dCTP 및 Dy647-dCTP)의 제거를 실시하였다. 반응정지후의 각 튜브에 Binding Buffer(Qiagen사 제품의 PCR Purification Kit에 포함되어 있는 Buffer)를 275μL 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하였다.
혼합액 전체량을 스핀칼럼(Qiagen사 제품의 PCR Purification Kit에 포함되어 있는 칼럼)으로 어플라이(apply)하고, 6,000r.p.m.(3,500×g)으로 2분간 원심분리처리하였다.
flow-through를 버리고, 스핀칼럼 Wash Buffer(Qiagen사 제품의 PCR Purification Kit에 포함되어 있는 Buffer) 750μL를 첨가하고, 6,000 r.p.m.(3,500×g)으로 2분간 원심분리 처리하였다. flow-through를 버리고 12,000r.p.m.(14,000×g)로 3분간 원심분리 처리하였다.
새로운 1.5mL의 마이크로튜브를 스핀칼럼에 부착하고, 칼럼의 중심에 Elution Buffer(Qiagen사 제품의 PCR Purification Kit에 포함되어 있는 Buffer)를 50μL첨가한 후, 차광하에서, 5분간 실온에서 방치하고, 12,000r.p.m.(14,000×g)으로 3분간 원심분리 처리하였다. 칼럼의 중심에 Elution Buffer(Qiagen사 제품의 PCR Purification Kit에 포함되어 있는 Buffer)를 30μL첨가한 후, 차광하에서, 5분간 실온에서 방치하고, 12,000r.p.m.(14,000×g)으로 3분간 원심분리 처리하고, 정제한 Dy-547표지 Male DNA(표지 대조게놈 DNA 단편) 80μl과 Dy-647표지 Female DNA(표지 피실험 게놈 DNA 단편) 80μl를 각각 얻었다.
(2) BAC어레이를 사용한 하이브리디제이션
BAC어레이로서, 시판의 BAC어레이키트[MAC Array Karyo 4000, Macrogen사 제품]를 사용하여, 다음과 같이 실시하였다.
상기 BAC어레이는 인간게놈BAC 라이브러리 유래의 클론 4000개가 슬라이드글라스상에 2회 스폿(정착·고정화)된 것으로서, 각 클론은, 양단 엔드시퀀스가 결정되고, 또, FISH법에 의해 염색체 상의 위치가 확인되고 있다.
(i) 하이브리디제이션용 샘플 DNA의 조정
상기 (1)에서 얻어진 Dy-547 표지 Male DNA 및 Dy-647 표지 Female DNA 각 80μl을 혼합하고, 다시 MAC Array Karyo 4000(Macrogen사 제품)에 포함되어 있는 Solution B(Cot-1 DNA 함유) 100μl, 3M 아세트산나트륨 25μl 및 냉 100% 에탄올 700μl를 첨가하여 혼합하였다. 이들의 혼합액을 -20℃에서 60분간 놓은 후, 12,000r.p.m.(14,000×g)으로 4℃, 20분간, 원심분리 처리하였다. 펠릿(pellet)을 버리지 않도록 상청을 버리고, 냉 70% 에탄올을 1ml 첨가하여 혼합한 후, 재차 12,000r.p.m.(14,000×g)으로 4℃, 5분 원심분리 처리하였다. 펠릿을 버리지 않도록 상청을 버리고, 차광하에서 10분간 건조시켰다. 얻어진 펠릿에 MAC Array Karyo 4000에 포함되는 Solution C(하이브리디제이션 용액) 140μl 및 Solution D(yeast tRNA 함유) 4μl를 첨가하고, 펠릿을 용해시켰다.
얻어진 용해액을 70℃에서 10분간 가열하고, 2개 사슬 DNA의 변성(1개 사슬화)을 실시하고, 37℃에서 60분간 프리어닐링(pre-annealing)시켜 Cot-1 DNA에 의한 반복 서열의 블록킹 반응을 실시하여, 하이브리디제이션용 샘플 DNA(표지샘플DNA)용액으로 하였다.
(ii) 프리하이브리디제이션(Pre-hybridization)
MAC Array Karyo 4000에 포함되는 Solution C(하이브리디제이션 용액) 30μl과 Solution E(연어정자DNA 함유) 10μl를 혼합하고, 70℃에서 10분간 가열한 후, 얼음중에서 5분간 냉각시켜 프리하이브리디제이션 용액으로 하였다.
MAC Array Karyo 4000의 BAC어레이(슬라이드)상에 프리하이브리디제이션 용액 40μl를 어플라이하고, 용액이 어레이 전체에 미치도록, 스폿하고 있는 어레이가 모두 감춰지는 크기의 커버글라스를 덮었다. 습한 상자 안에서 실온으로 30분간 인큐베이트하였다.
인큐베이트 종료 후, 커버글라스를 벗기고, 멸균 탈이온수로 어레이를 2회 세정하고, 100% 이소프로판올로 1회 세정하고, 슬라이드용 원심기에 의하여 2,000r.p.m.(780×g) 2분간 원심분리 처리하였다.
(iii) 하이브리디제이션
프리하이브리디제이션이 종료한 BAC어레이(슬라이드)를 자동 슬라이드 처리장치 HybStation(GenomicSolution사 제품)에 부착하고, (i)에서 얻어진 하이브리디제이션용 샘플DNA(표지샘플DNA) 용액 120μl를 어플라이하였다. 하이브리디제이션 온도를 37℃로 세팅하고, 일정한 시간마다 하이브리디제이션용 샘플DNA(표지샘플DNA)용액을 교반하면서, 44시간 하이브리디제이션을 실시하였다. 하이브리디제이션 후의 세정도 자동 슬라이드 처리장치에 의하여, 세정액1 (50%)포름아미드/12×SSC, pH7로 46℃, 5분간 3회, 세정액2 (0.1% SDS/2×SSC, pH7)로 46℃, 10분간 3회, 세정액3 (0.1% NP-40/0.1M 인산완충액, pH7)으로 46℃, 10분간 3회, 세정액4 (2×SSC, pH7)로 46℃, 2분간 3회의 세정조작을 실시하였다. 그 후, BAC어레이(슬라이드)를 장치로부터 풀고, 70%, 85%, 100%의 각 에탄올을 충전한 세정용 병 중에 각 1분간 침지시킨 후, 슬라이드용 원심기에 의해 2,000r.p.m.(780×g)로 2분간 원심분리처리하여 건조시켰다.
(3) 측정(스캐닝)·해석
하이브리디제이션 및 세정후의 BAC 어레이를 마이크로어레이용 스캐너 GenePix 4000A(Axon Instrumants사 제품)로 스캐닝하고, BAC 어레이상의 Male DNA(대조게놈 DNA 단편) 유래의 형광 및 Female DNA(피실험 게놈 DNA 단편) 유래의 형광에 의한 형광화상(이미지)를 취득하였다. 얻어진 형광화상(이미지) 데이터를, 어레이CGH 해석용 소프트웨어 MacViewer(Macrogen사 제품)에 의하여 해석하고, 어레이스폿마다 Dy-547 및 Dy-647의 형광시그널을 측정하고, 데이터를 정상화시킨 후, Log2(Dy-647/Dy-547)의 값을 BAC클론마다 산출하였다.
(4) 결과
각 BAC클론마다의 Log2(Dy-647/Dy-547)값으로부터, 상(常)염색체(1~22번 염색체) 및 X염색체에 있어서의 Log2(Dy-647/Dy-547)의 평균값과 S.D.를 각각 산출하였다.
산출결과를 다음과 같이 나타낸다.
· 상염색체(Chr.1-22) : 0.0209(평균)±0.0420(S.D.)
· X염색체(Chr.X) : 0.671(평균)±0.110(S.D.)
또, 각 BAC클론마다의 Log2(Dy-647/Dy-547)값을 염색체 번호순으로 플롯한 결과를 도1에 나타낸다.
도1에 있어서, 세로축은 정상남성과 비교한 증감의 레벨을 형광강도의 비(Log2비)로 나타내고, 정(+)의 값은 카피수가 증가하고 있는 것을, 부(-)의 값은 카피수가 감소하고 있는 것을 나타낸다. 또, 가로축은 염색체 번호를 나타낸다.
비교예 1. 종래의 형광표지물질을 사용한 BAC어레이 CGH 해석
본 발명과 비교하기 위하여, 종래의 형광표지물질을 사용하여 BAC어레이에 의한 CGH해석을 실시하였다.
(1) 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편의 조제
이하의 형광표지 뉴클레오티드(형광표지 2'-dCTP유도체)를 사용한 것 이외 는, 실시예 1의 (1)과 동일하게 하여 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편의 조제를 실시하였다.
(a) CyDye표지 뉴클레오티드
· 대조게놈 DNA 단편(Male DNA) : Cy3표지 dCTP(PerkinElmer사 제품, Cy3-dCTP)
· 피실험 게놈 DNA 단편(Female DNA) : Cy5표지 dCTP(PerkinElmer사 제품, Cy5-dCTP)
(b) HiLyteDye표지 뉴클레오티드
· 대조게놈 DNA 단편(Male DNA) : HiLyte Fluor 555표지 dCTP
· 피실험 게놈 DNA 단편(Female DNA) : HiLyte Fluor 647표지 dCTP
또한, 이들 HiLyteDye표지 뉴클레오티드는, 합성예 1에서 얻어진 2'-dCTP-아미노링커 유도체[상술한 합성경로중 (11)의 화합물]와, 시판의 형광표지물질 HiLyte Fluor 555(Anaspec사 제품, HiLyte 555-SE) 및 HiLyte Fluor 647(Anaspec사 제품, HiLyte 647-SE)를 사용하여, 합성예 1의 (5)에 따라서 조제하였다.
(2) BAC어레이를 사용한 하이브리디제이션
상기 (1)에서 얻어진, 이하의 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 사용한 것 이외는, 실시예 1의 (2)와 동일하게 하여 BAC어레이에로의 하이브리디제이션을 실시하였다.
(a) CyDye표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편
· 표지 대조게놈 DNA 단편(Male DNA) : Cy3표지 Male DNA
· 표지 피실험 게놈 DNA 단편(Female DNA) : Cy5표지 Female DNA
(b) HiLyteDye표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편
· 표지 대조게놈 DNA 단편(Male DNA) : HiLyte Fluor 555 표지 Male DNA
· 표지 피실험 게놈 DNA 단편(Female DNA) : HiLyte Fluor 647 표지 Female DNA
(3) 측정(스캐닝)·해석
실시예 1의 (3)과 동일하게 하여 측정·해석을 실시하였다.
또한, 해석은, 어레이스폿마다 Cy3 및 Cy5의 형광시그널, 및 HiLyte Fluor 555 및 HiLyte Fluor 647을 각각 측정하고, 데이터를 정상화시킨 후, Log2(Cy5/Cy3)값 및 Log2(HiLyte Fluor 647/HiLyte Fluor 555)값을 각각 BAC클론마다 산출하였다.
(4) 결과
각 BAC클론마다의 Log2(Cy5/Cy3)의 값으로부터, 상염색체(1~22번 염색체) 및 X염색체에 있어서의 Log2(Cy5/Cy3)의 평균값과 S.D.를, 또, Log2(HiLyte Fluor 647/HiLyte Fluor 555)값으로부터, 상염색체(1~22번 염색체) 및 X염색체에 있어서의 Log2(HiLyte Fluor 647/HiLyte Fluor 555)의 평균값과 S.D.를 각각 산출하였다.
산출결과를 이하에 각각 나타낸다.
(a) CyDye표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 사용한 경우
· 상염색체(Chr.1-22) : 0.0107(평균)±0.0756(S.D.)
· X염색체(Chr.X) : 0.619(평균)±0.120(S.D.)
(b) HiLyteDye표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 사용한 경우
· 상염색체(Chr.1-22) : 0.00279(평균)±0.0787(S.D.)
· X염색체(Chr.X) : 0.641(평균)±0.112(S.D.)
또, CyDye표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 사용한 경우에 얻어진 각 BAC클론마다의 Log2(Dy-647/Dy-547)값을 염색체 번호순으로 플롯한 결과를 도2에, HiLyteDye표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 사용한 경우에 얻어진 각 BAC클론마다의 Log2(Dy-647/Dy-547)값을 염색체 번호순으로 플롯 해석결과를 도3에 각각 나타낸다.
또, 도2 및 도3에 있어서, 세로축은 정상남성과 비교한 증감의 레벨을 형광강도의 비 (Log2비)로 나타내고, 정(+)의 값은 카피수가 증가하고 있는 것을, 부(-)의 값은 카피수가 감소하고 있는 것을 나타낸다. 또, 가로축은 염색체 번호를 나타낸다.
본 발명의 방법(실시예 1)과 종래의 형광표지물질을 사용한 방법(비교예.1)의 평가를, 상염색체에서의 Log2비의 S.D.와 X염색체에서의 Log2비에 기초하여 실시하였다.
즉, 상염색체인 1번~22번 염색체에서는, 남성, 여성 각각 2개씩 염색체를 갖 고 있기 때문에, 이론상으로, 상염색체에서의 Log2비는 0이 되지만, 실제로는 각 클론(염색체)사이에서 오차가 발생한다. 이 오차는 S.D.에 의하여 나타내며, 상염색체에서의 Log2비의 S.D.가 작을수록 오차가 적고, 증감의 평가인 컷오프의 값을 떨어뜨릴 수가 있기 때문에, 고정밀도의 측정이 가능하다고 판단할 수가 있다.
한편, X염색체는, 여성에게서 2개, 남성에게서 1개이기 때문에, 이론상 형광량(형광강도)이 2배가 되며, X염색체에서의 Log2의 비는 1이 된다. 이 X염색체에서의 Log2의 비는 염색체 증가의 지표가 되며, X염색체에서의 Log2의 비가 1에 가까울 수록 증감을 확실하게 알 수 있기 때문에, 증감의 변화량이 적을 때에도 검출이 가능하다. 환언하면, 고감도의 검출이 가능하다고 판단할 수가 있다.
그래서, 실시예 1에서 얻어진 본 발명의 방법에 있어서의 상염색체에서의 Log2비의 S.D.와 X염색체에서의 Log2비, 및 비교예 1에서 얻어진 종래의 형광표지물질을 사용한 방법에 있어서의 상염색체에서의 Log2비의 S.D.와 X염색체에서의 Log2비를, 하기의 표에 정리하여 나타낸다.
Figure 112009050749446-PCT00033
상기 표에서 명백히 알 수 있듯이, 본 발명의 방법에 있어서의 Log2비의 S.D.는 0.0420이며, Cy3 및 Cy5를 사용한 경우(0.0756)와 HiLyte Fluor 555 및 HiLyte Fluor 647을 사용한 경우(0.0787)와 비교하여 매우 낮은 것을 알 수 있다. 이 점으로부터, 본 발명의 방법은 종래방법과 비교하여 오차가 적고, 보다 고정밀도로 측정이 가능하다는 것을 알 수가 있다.
또, 본 발명의 방법에 있어서의 X염색체에서의 Log2의 비는 0.671이며, Cy3 및 Cy5를 사용한 경우(0.619)와 HiLyte Fluor 555 및 HiLyte Fluor 647을 사용한 경우(0.641)보다도 1에 가까운 것을 알 수가 있다. 이 점으로부터, 본 발명의 방법은, 종래방법과 비교하여 보다 고감도의 검출이 가능하다는 것을 알 수가 있다.
실시예 2. BAC어레이를 사용한 CGH법에 의한 간암세포게놈 이상의 해석
피실험 게놈 DNA 단편으로서 간암세포유래 게놈 DNA를 사용하고, 대조게놈 DNA 단편으로서 정상남성 게놈 DNA를 사용하여, BAC어레이에 의한 CGH해석을 실시하였다.
(1) 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편의 조제
이하의 피실험 게놈 DNA 단편 및 대조게놈 DNA 단편을 사용한 것 이외는, 실시예 1의 (1)과 동일하게 하여 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편의 조제를 실시하였다.
· 피실험 게놈 DNA 단편 : 간암세포주 Hep3B를 계대배양한 세포에서 유래하 는 게놈 DNA(간세포유래 게놈 DNA)
· 대조게놈 DNA 단편 : 정상인간 Male DNA(Promega사 제품)
(2) BAC어레이를 사용한 하이브리디제이션
상기 (1)에서 얻은, 이하의 표지 피실험 게놈 DNA 단편 및 표지 대조게놈 DNA 단편을 사용한 것 이외는, 실시예 1의 (2)와 동일하게 하여 BAC어레이로의 하이브리디제이션을 실시하였다.
· 표지 대조게놈 DNA 단편(Male DNA) : Dy-547 표지 Male DNA
· 표지 피실험 게놈 DNA 단편(간세포유래 게놈 DNA) : Dy-647 표지 간암DNA
(3) 측정(스캐닝)·해석
실시예 1의 (3)과 동일하게 하여 측정·해석을 실시하였다.
(4) 결과
각 BAC클론마다의 Log2(Dy-647/Dy-547)값을 염색체 번호순으로 플롯한 결과를 도4에 나타낸다.
도4에 있어서, 세로축은 정상남성과 비교한 증감의 레벨을 형광강도의 비(Log2비)로 나타내고, 정(+)의 값은 카피수가 증가하고 있는 것을, 부(-)의 값은 카피수가 감소하고 있는 것을 나타낸다. 또, 가로축은 염색체 번호를 나타낸다.
도4로부터 명백히 알 수 있듯이, 본원 발명의 방법에 의하여 얻어진 CGH해석패턴은 종래의 방법에서 얻어진 CGH해석패턴과 동일하며, 본원 발명의 방법에 의하여 간세포암의 CGH해석을 문제없이 실시할 수가 있다는 것을 알 수가 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 종래의 CGH법, 특히 CGH마이크로어레이법과 비교하여, 보다 정밀도가 좋고 고감도로, CGH해석을 실시하는 것, 즉, 게놈 DNA의 카피수 이상을 검출할 수가 있다.

Claims (12)

  1. (a) 검사대상이 되는 세포유래의 게놈 DNA 단편인 피실험 게놈 DNA 단편을 하기 일반식(1)로 나타내는 표지물질 또는 일반식(2)로 나타내는 표지물질 중 어느 한 쪽의 표지물질로 표지하고, 해당 피실험 게놈 DNA 단편과의 차이를 검출하기 위한 기준이 되는 대조게놈 DNA 단편을 나머지 한 쪽의 표지물질로 표지하고, (b) 표지된 피실험 게놈 DNA 단편과 표지된 대조게놈 DNA 단편을, 피실험 게놈 DNA 단편과 대조게놈 DNA 단편과의 차이를 검출하기 위한 핵산서열을 포함하는 표본핵산에 경합적으로 하이브리다이즈시켜, (c) 얻어지는 형광강도를 지표로 하여, 피실험 게놈 DNA 단편 중의 증폭 또는 결실을 검출하는 방법.
    Figure 112009050749446-PCT00034
    [식 중, R1~R4 및 R8~R11은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R15(식 중, R15는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나타내고, R5 및 R12는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R6, R7 및 R14는 각각 독립하여 알킬기를 나타내고, R13은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
    Figure 112009050749446-PCT00035
    [식 중, R21~R24 및 R28~R31은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R35(식 중, R35는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나타내고, R25 및 R32는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R26, R27 및 R34는 각각 독립하여 알킬기를 나타내고, R33은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
  2. 제1항에 있어서,
    상기 표본핵산이, 기판에 정착(고정화)되어 있는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 표본핵산이, 인공염색체에서 유래하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 표본핵산이, BAC(Bacterial Artificial chromosome) DNA인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 표지된 피실험 게놈 DNA 단편이 하기 일반식(3)으로 나타내는 뉴클레오티드 잔기 또는 일반식(4)로 나타내는 뉴클레오티드 잔기 중 어느 한 쪽의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것이며, 상기 표지된 대조게놈 DNA 단편이 나머지 한 쪽의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
    Figure 112009050749446-PCT00036
    [식 중, Q1는 뉴클레오티드 잔기를 나타내고, V1은 링커를 나타내며, W1은 하기 일반식(1')를 나타낸다.
    Figure 112009050749446-PCT00037
    (식 중, Z1은 V1과 결합하는 결합수(結合手)를, R13'은 알킬기를 나타내며, R1~R12 및 R14는 상기와 동일.)],
    Figure 112009050749446-PCT00038
    [식 중, Q2는 뉴클레오티드 잔기를 나타내고, V2는 링커를 나타내며, W2는 하기 일반식(2')를 나타낸다.
    Figure 112009050749446-PCT00039
    (식 중, Z2는 V2와 결합하는 결합수를, R33'는 알킬기를 나타내며, R21~R32 및 R34는 상기와 동일.)].
  6. 제5항에 있어서,
    상기 일반식(3)으로 나타내는 뉴클레오티드 잔기가 하기 일반식(3')로 나타내는 뉴클레오티드 잔기이며, 상기 일반식(4)로 나타내는 뉴클레오티드 잔기가 하기 일반식(4')로 나타내는 뉴클레오티드 잔기인 것을 특징으로 하는 검출방법.
    Figure 112009050749446-PCT00040
    (식 중, E1은 -CH=CH- 또는 -C≡C-를 나타내고, X1 및 Y1은 각각 독립하여 알킬렌기를 나타내며, T1은 -O- 또는 -NH-CO-를 나타내고, Q1 및 W1은 상기와 동일.)
    Figure 112009050749446-PCT00041
    (식 중, E2는 -CH=CH- 또는 -C≡C-를 나타내고, X2 및 Y2는 각각 독립하여 알킬렌기를 나타내며, T2는 -O- 또는 -NH-CO-를 나타내고, Q2 및 W2는 상기와 동 일.)
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피실험 게놈 DNA의 표지물질에 의한 표지 및 상기 대조게놈 DNA의 표지물질에 의한 표지가, 프라이머 익스텐션법, 닉 트랜슬레이션법, 및 말단부가반응법으로부터 선택되는 방법에 의한 것을 특징으로 하는 검출방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 일반식(1)로 나타내는 표지물질로 표지된 뉴클레오티드 잔기와 하기 일반식(2)로 나타내는 표지물질로 표지된 뉴클레오티드 잔기를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출방법을 위한 키트.
    Figure 112009050749446-PCT00042
    [식 중, R1~R4 및 R8~R11은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R15(식 중, R15는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나타내고, R5 및 R12는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R6, R7 및 R14는 각각 독립하여 알킬기를 나타내고, R13은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
    Figure 112009050749446-PCT00043
    [식 중, R21~R24 및 R28~R31은 각각 독립하여 수소원자 또는 -SO3R35(식 중, R35는 수소원자, 알칼리 금속원자, 유기 암모늄이온 또는 암모늄이온을 나타낸다.)를 나타내고, R25 및 R32는 각각 독립하여 알킬기 또는 술포알킬기를 나타내며, R26, R27 및 R34는 각각 독립하여 알킬기를 나타내고, R33은 카르복시알킬기를 나타낸다.]
  9. 제8항에 있어서,
    상기 일반식(1)로 나타내는 표지물질로 표지된 뉴클레오티드 잔기가 하기 일반식(3)으로 나타내는 뉴클레오티드 잔기이며, 상기 일반식(2)로 나타내는 표지물질로 표지된 뉴클레오티드 잔기가 하기 일반식(4)로 나타내는 뉴클레오티드 잔기인 것을 특징으로 하는 키트.
    Figure 112009050749446-PCT00044
    [식 중, Q1는 뉴클레오티드 잔기를 나타내며, V1은 링커를 나타내며, W1은 하기 일반식(1')를 나타낸다.
    Figure 112009050749446-PCT00045
    (식 중, Z1은 V1과 결합하는 결합수를, R13'은 알킬기를 나타내며, R1~R12 및 R14는 상기와 동일.)],
    Figure 112009050749446-PCT00046
    [식 중, Q2는 뉴클레오티드 잔기를 나타내고, V2는 링커를 나타내며, W2는 하기 일반식(2')를 나타낸다.
    Figure 112009050749446-PCT00047
    (식 중, Z2는 V2와 결합하는 결합수를, R33'는 알킬기를 나타내며, R21~R32 및 R34는 상기와 동일.)].
  10. 제9항에 있어서,
    상기 일반식(3)으로 나타내는 뉴클레오티드 잔기가 하기 일반식(3')로 나타내는 뉴클레오티드 잔기이며, 상기 일반식(4)로 나타내는 뉴클레오티드 잔기가 하 기 일반식(4')로 나타내는 뉴클레오티드 잔기인 것을 특징으로 하는 키트.
    Figure 112009050749446-PCT00048
    (식 중, E1은 -CH=CH- 또는 -C≡C-를 나타내며, X1은 탄소수 1~6의 알킬렌기(직쇄·분지·환상)를 나타내며, Y1은 탄소수 2~8의 알킬렌기(직쇄·분지·환상)를 나타내며, T1은 -O- 또는 -NH-CO-를 나타내며, Q1 및 W1은 상기와 동일.)
    Figure 112009050749446-PCT00049
    (식 중, E2는 -CH=CH- 또는 -C≡C-를 나타내고, X2는 탄소수 1~6의 알킬렌기(직쇄·분지·환상)를 나타내며, Y2는 탄소수 2~8의 알킬렌기(직쇄·분지·환상)를 나타내고, T2는 -O- 또는 -NH-CO-를 나타내며, Q2 및 W2는 상기와 동일.)
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    또한, 랜덤프라이머법용 프라이머, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는/및 dUTP, 및 Klenow Fragment로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 키트.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    또한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 있어서의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트.
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