JPWO2008102606A1 - ゲノムdna断片の増幅または欠失の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.(a)検査対象となる細胞由来のゲノムDNA断片である被験ゲノムDNA断片を下記一般式(1)で示される標識物質または一般式(2)で示される標識物質の何れか一方の標識物質で標識し、当該被験ゲノムDNA断片との違いを検出するための基準となる対照ゲノムDNA断片を残りの一方の標識物質で標識し、(b)標識された被験ゲノムDNA断片と標識された対照ゲノムDNA断片を、被験ゲノムDNA断片と対照ゲノムDNA断片との違いを検出するための核酸配列を含む標本核酸に競合的にハイブリダイズさせ、(c)得られる蛍光強度を指標として、被験ゲノムDNA断片中の増幅または欠失を検出する方法。
本発明において、CGH法とは、原理的には、(a)検査対象となる細胞由来のゲノムDNA断片である被験ゲノムDNA断片と当該被験ゲノムDNA断片との違いを検出するための基準となる対照ゲノムDNA断片とを、それぞれ異なる波長の2種の標識物質で標識し、(b)標識された被験ゲノムDNA断片と標識された対照ゲノムDNA断片とを、被験ゲノムDNA断片と対照ゲノムDNA断片との違いを検出するための核酸配列を含む標本核酸に競合的にハイブリダイズさせ、(c)得られる蛍光強度を指標として、被験ゲノムDNAのコピー数異常(即ち、被験ゲノムDNA断片中の増幅または欠失)を検出する方法である。
この際、コピー数異常の検出は、通常、被験ゲノムDNA断片と対照ゲノムDNA断片との競合的ハイブリダイジーション後に標本核酸上の蛍光強度を測定し、被験ゲノムDNA断片由来の標識物質と対照ゲノムDNA断片由来の標識物質との蛍光強度比を求め、これを解析することによって行われる。即ち、対照ゲノムDNA断片由来の標識物質に対する被験ゲノムDNA断片由来の標識物質の蛍光強度比が高い場合には、標本核酸上の当該部分(領域)は、対照ゲノムDNA断片に比較して被験ゲノムDNA断片とより強くハイブリダイズしたことを示し、被験ゲノムDNAにおける、標本核酸上の当該部分(領域)に相当する領域が増幅している(コピー数が増加している)と判断され、逆に、対照ゲノムDNA断片由来の標識物質に対する被験ゲノムDNA断片由来の標識物質の蛍光強度比が低い場合(或いは被験ゲノムDNA断片由来の標識物質の蛍光が認められない場合)には、標本核酸上の当該部分(領域)は、被験ゲノムDNA断片に比較して対照ゲノムDNA断片とより強くハイブリダイズしたこと(或いは対照ゲノムDNA断片のみがハイブリダイズしたこと)を示し、被験ゲノムDNAにおける、標本核酸上の当該部分(領域)に相当する領域が欠失している(コピー数が減少或いはコピーされていない)と判断される。尚、本発明においては、上記したような被験ゲノムDNA中のコピー数異常(または染色体異常)を判断すること、言い換えれば、被験ゲノムDNA中のコピー数異常の有無(または染色体異常の有無)或いはコピー数の増加量または減少量を定量(または半定量)することをも含む。
本発明は、前述した如きCGH法において使用される異なる波長の2種の標識物質として、一般式(1)及び(2)で示される蛍光物質を用いることを特徴とする。
本発明において、「被験ゲノムDNA断片」とは、検査対象となる(コピー数異常或いは染色体異常を検出・調査したい)細胞に由来するゲノムDNAを、また、「対照ゲノムDNA断片」とは、当該被験ゲノムDNA断片との違い(即ち、被験ゲノムDNAのコピー数異常)を検出するための基準となるゲノムDNA断片を意味する。
より具体的には、例えば、(1)同一個体(生体、生物種)における異なる種類の細胞、細胞集団、体液等、(2)異なる個体(生体、生物種)間〔例えば特定個体と標準(正常)個体間〕又は特定の個体(生体、生物種)と集団間〔例えば特定個体と標準(正常)集団間〕における、同じ種類の細胞、細胞集団、体液等、(3)異なる個体(生体、生物種)間〔例えば罹患個体と標準(正常)個体間〕又は特定個体(生体、生物種)と集団間〔罹患個体と標準(正常)集団間〕における、異なる種類の細胞、細胞集団、体液等〔例えば異常細胞(組織、器官、体液)と正常細胞(組織、器官、体液)等〕、(4)環境、状態等が異なる場合(例えば薬剤投与前後、ストレス付加前後、病態の異なるステージ、培養前後等)の同一個体(生体、生物種)における、同じ種類の細胞、細胞集団、体液等が挙げられる。
尚、被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片は、実質的に同一の核酸(DNA)配列を含むものであるが、一般的には、対照ゲノムDNA断片はゲノムDNAのコピー数に変化がない(ゲノムDNAのコピー数に異常をきたしていない)試料〔例えば標準(正常)個体または集団、正常細胞(組織、器官、体液)等〕から得られるゲノムDNA断片であり、また、被験ゲノムDNA断片はこれ以外のゲノムDNAのコピー数に変化が生じている(ゲノムDNAのコピー数に異常をきたしている)か或いは当該変化が生じている疑いがある(当該異常をきたしている疑いがある)試料〔例えば特定個体、罹患個体、異常(組織、器官、体液)等〕から得られるゲノムDNA断片であるが、このような組合せに限定されない。
尚、一般的には、例えば両者のうち一方が全ての染色体(または特定の染色体)に相当する配列を実質的に有するものである場合には他方も同様に全ての染色体(または特定の染色体)に相当する配列を実質的に有するものであり、また、両者のうち一方が染色体(全ての染色体または特定の染色体)の一部に相当する配列を有するものである場合には他方は当該一部分と同じ部分の染色体(全ての染色体または特定の染色体)に相当する配列を有するものである。
また、ゲノムDNAクローン断片の調製法、cDNAの調製法、制限酵素による断片化法、化学的断片化法、増幅方法(例えばGenomics 87(2006)298-306に記載されたDOPPCR、roling Cycle Amprification、GenomePlex等の増幅法、ICAN法、LAMP法、その他ゲノムを増幅できる方法等)等も自体公知の方法や市販のキット等に従えばよい。
本発明において、上記した如き被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片を標識するための標識物質は下記一般式(1)で示される蛍光標識物質(以下、本発明に係る標識物質(1)と略記する。)と下記一般式(2)で示される蛍光標識物質(以下、本発明に係る標識物質(2)と略記する。)の2種である。
尚、一般式(1)においてR1〜R4およびR8〜R11のうちの少なくとも1つは−SO3R15(R15は前記と同じ。)であるのが好ましく、N+と分子内塩を形成していても良い。
尚、一般式(2)においてR21〜R24およびR28〜R31のうちの少なくとも1つは−SO3R35(R35は前記と同じ。)であるのが好ましく、N+と分子内塩を形成していても良い。
有機アンモニウムイオンとしては、例えばトリアルキルアンモニウムイオン等が挙げられる。また、当該トリアルキルアンモニウムイオンとしては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数1〜10のもの、好ましくは1〜6のものが挙げられ、具体的には、例えばトリメチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、トリn-プロピルアンモニウムイオン、トリイソプロピルアンモニウムイオン、トリブチルアンモニウムイオン、トリヘキシルアンモニウムイオン、トリオクチルアンモニウムイオン、トリノニルアンモニウムイオン、トリデシルアンモニウムイオン、トリシクロペンチルアンモニウムイオン、トリシクロヘキシルアンモニウムイオン、トリシクロヘプチルアンモニウムイオン、トリシクロオクチルアンモニウムイオン等が挙げられる。中でもトリメチルアンモニウムイオン又はトリエチルアンモニウムイオンが好ましく、トリエチルアンモニウムイオンがより好ましい。
また、スルホアルキル基の具体例としては、例えばスルホエチル基、スルホプロピル基、スルホブチル基、スルホペンチル基、スルホヘキシル基等が挙げられ、好ましくは2−スルホエチル基、3−スルホプロピル基、4−スルホブチル基である。
また、カルボキシアルキル基の具体例としては、例えばカルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシブチル基、カルボキシペンチル基、カルボキシヘキシル基、1,2−ジカルボキシエチル基、1,3−ジカルボキシプロピル基、3,5−ジカルボキシフェニル基、3,4−ジカルボキシフェニル基、2,4−ジカルボキシフェニル基、4−(1,2−ジカルボキシエチル)−フェニル基等が挙げられ、好ましくは、カルボキシメチル基、2−カルボキシエチル基、3−カルボキぷろぴる基、4−カルボキシブチル基、5−カルボキシヘキシル基等が挙げられる。好ましくは2−カルボキシエチル基、3−カルボキプロピル基、4−カルボキシブチル基である。
また、市販品〔例えば、DYOMICS社(Dyomics GmbH)製、DY-647およびDY-547等〕を使用することもできる。
前述したように、本発明の方法は、CGH法において、本発明に係る標識物質(1)または標識物質(2)の何れか一方の標識物質で標識された被験ゲノムDNA断片(以下、標識被験ゲノムDNA断片と略記する。)と残りの一方の標識物質で標識された対照ゲノムDNA断片(以下、標識対照ゲノムDNA断片と略記する。)とを用いるものである。
本発明において、標識被験ゲノムDNA断片は本発明に係る標識物質(1)または標識物質(2)の何れか一方の標識物質を上記した如き被験ゲノムDNA断片に直接またはリンカー等を介して間接的に結合させたものであり、また、標識対照ゲノムDNA断片は本発明に係る標識物質(1)または標識物質(2)の残りの一方の標識物質(即ち、本発明に係る標識物質(1)および(2)のうち、被験ゲノムDNA断片に結合させたもの以外の残りの一方)を上記した如き対照ゲノムDNA断片に直接またはリンカー等を介して間接的に結合させたものである。
具体的には、これら標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片は、本発明に係る標識物質(1)中のカルボキシアルキル基〔一般式(1)におけるR13〕または本発明に係る標識物質(2)中のカルボキシアルキル基〔一般式(1)におけるR33〕が被験ゲノムDNA断片または対照ゲノムDNA断片と直接またはリンカー等を介して間接的に結合したものである。
なかでも、本発明において用いられる標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片としては、本発明に係る標識物質(1)中のカルボキシアルキル基〔一般式(1)におけるR13〕または本発明に係る標識物質(2)中のカルボキシアルキル基〔一般式(1)におけるR33〕が被験ゲノムDNA断片または対照ゲノムDNA断片とリンカー等を介して間接的に結合したものが好ましい。
なかでも、これら標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片としては、本発明に係る標識物質(1)または(2)でリンカー等を介して間接的に標識されたヌクレオチド残基を含むものが好ましい。
より具体的には、標識被験ゲノムDNA断片としては、下記一般式(3)で示されるヌクレオチド残基または一般式(4)で示されるヌクレオチド残基の何れか一方のヌクレオチド残基を含むものが好ましく、また、標識対照ゲノムDNA断片としては、残りの一方のヌクレオチド残基を含むものが好ましい。
具体的には、このようなヌクレオチド残基としては、例えば一般式(i)、(ii)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(xii)および(xiii)で示されるプリンヌクレオチド残基、または一般式(iii)、(iv)、(x)および(xi)で示されるピリミジンヌクレオチド残基が挙げられる。
尚、R51とR52は、R51がHでありR52がOHまたはO−の組合せ、R51およびR52がともにHの組合せ、R51がOHでありR52がH、OHまたはO−の組合せ、が好ましく、R51がHでありR52がOHまたはO−の組合せがより好ましい。
また、R53は−PO2H−または−PO3H2が好ましい。
尚、一般式(3)および(4)のヌクレオチド残基を、後述する標識モノヌクレオチドを用いて酵素的にDNA断片を標識する方法で使用するための標識モノヌクレオチドとして使用する場合には、Q1およびQ2で示されるヌクレオチド残基は一般式(i)〜(vi)から選ばれるものが好ましい。また、一般式(i)〜(vi)のR51とR52は、R51がHでありR52がOHの組合せ、R51およびR52がともにOHの組合せが好ましく、R51がHでありR52がOHの組合せがより好ましい。更に、R53は−P3O9H4が好ましい。
即ち、当該リンカーの一方の末端が、前述したQ1およびQ2で示されるヌクレオチド残基のうち、ピリミジンヌクレオチド残基についてはそのピリミジン環の5位〔一般式(iii)、(iv)の場合〕またはそのりん酸残基のりん原子〔一般式(x)、(xi)の場合〕に結合し、また、プリンヌクレオチド残基についてはその7−デアザプリン環の7位〔一般式(i)、(ii)、(v)、(vi)の場合〕またはそのプリン環(又は7−デアザプリン環)のりん酸残基のりん原子〔一般式(vii)、(viii)、(ix)、(xii)、(xiii)の場合〕に結合している。
更に、当該リンカーの他方の末端が、W1〔一般式(1')〕およびW2〔一般式(2')〕で示される標識物質のカルボニル基〔一般式(1')におけるR13'に結合するカルボニル基、一般式(2')におけるR33'に結合するカルボニル基〕に結合している。
尚、上記において、X1およびX2で示されるアルキレン基は前述のXで示されるアルキレン基と同じであり、その具体例、好ましい例等も同様である。また、Y1およびY2で示されるアルキレン基は前述のYで示されるアルキレン基と同じであり、その具体例、好ましい例等も同様である。
また、R1〜R12、R14、R21〜R32およびR34は前記と同じであり、その具体例、好ましい例等も前記した通りである。
このような標識方法としては、自体公知の直接標識法や間接標識法〔例えばWO96/17628号パンフレット(特開2002-12782号公報)、米国特許第6974873号、特開2002-193991号公報、WO99/12544号パンフレット、特開平11-80189号公報等に記載された方法等〕が挙げられる。
また、(1)標識物質が結合した標識モノヌクレオチドを用いて酵素的にDNA断片を標識する方法〔例えばプライマーエクステンション法(ランダムプライマー法、プライマー法等)、ニックトランスレーション法、末端付加反応法(ターミナルデオキシトランスフェラーゼ法等)、PCR法、Degenerate Oligonucleotide Primer PCR (DOP-PCR)法等〕等、(2)標識物質が結合した標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて酵素的にDNA断片を標識する方法〔例えばプライマーエクステンション法(ランダムプライマー法、プライマー法等)、PCR法、Degenerate Oligonucleotide Primer PCR (DOP-PCR)法等〕、および(3)標識物質が結合した標識オリゴ又はポリヌクレオチドを酵素的にDNA断片に結合させて標識する方法〔末端付加反応法(ライゲーション法)等〕を使用することもできる。
更に、DNA断片に反応性基(例えばアミノアリル基、スルフヒドリル基等)を導入した後にこの反応性基と標識物質とを結合させる方法や、DNA断片に生理活性物質〔例えばビオチン、DIG(ジゴシキゲニン)、糖鎖等〕を導入した後に、当該生理活性物質に標識物質が結合した当該生理活性物質と結合し得る物質(例えばアビジン、特異的抗体、レクチン等)を結合させる方法等によって標識を行なっても良い。
尚、上記した方法は、例えばWO93/018186号パンフレット(特表平07-505053号公報)、特開2006-115844号公報、特開2005-304481号公報、特開2006-94726号公報、特開平11-258233号公報、特許2595201、nucleic Acids Research vol 14 number 19 1986年 p7617等に記載されている。
また、被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片を本発明に係る標識物質(1)または(2)で標識するに際しては、本発明に係る標識物質(1)および(2)を用いる以外は、上記した如き標識法に基づく市販の標識キットを使用すればより簡便である。
尚、本発明において、これらの方法を利用するには、本発明に係る標識物質(1)が結合した標識モノヌクレオチドおよび本発明に係る標識物質(2)が結合した標識モノヌクレオチドが必要であるが、これら標識ヌクレオチドは自体公知の方法(例えば上記の標識方法等)により調製することができる。
具体的には、例えば特開2002-193991号公報([0102]〜[0121]段落)に記載の方法に準じて、例えば以下のように調製することができる。
・MeOTfa:トリフルオロ酢酸メチル
・−Tfa:トリフルオロアセチル基
・Bu3SnH:水素化トリ(n−ブチル)すず
・AIBN:アゾイソブチロニトリル
・Et3N:トリエチルアミン
・HO−Su:N−ヒドロキシこはく酸イミド
・DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
・TMS−Acetamide:N,O−ビス(トリメチルシリル)アセトアミド
・PdCl2(CH3CN)2:ビス(アセトニトリル)ジクロロパラジウム(II)
・tris(TBAPP):トリス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェート
・(EtO)3PO:りん酸トリエチル
・TFP:トリ−2−フリルホスフィン
・Pd2(dba)3:トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)
尚、この化合物は、上記一般式(A)で示されるリンカー(−E−X−T−Y−NH−)において、Tが−NH−CO−である場合の、−E−X−NH−に相当する化合物であって、Eが−CH=CH−およびXがメチレン基である化合物である。
尚、この化合物は、上記一般式(A)で示されるリンカー(−E−X−T−Y−NH−)において、Tが−NH−CO−である場合の、−CO−Y−NH−に相当する化合物であって、Yがペンタメチレン基である化合物である。
尚、この化合物は、一般式(3')(Q1−E1−X1−T1−Y1−NH−W1)のQ1−E1−X1−T1−Y1−NH−または一般式(4')(Q2−E2−X2−T2−Y2−NH−W2)のQ2−E2−X2−T2−Y2−NH−に相当する化合物であって、Q1又はQ2が2'−デオキシシチジン、E1又はE2が−CH=CH−、X1又はX2がメチレン基、T1又はT2が−NH−CO−、Y1又はY2がペンタメチレン基である化合物である。
尚、当該化合物は、一般式(3')(Q1−E1−X1−T1−Y1−NH−W1)または一般式(4')(Q2−E2−X2−T2−Y2−NH−W2)におけるQ1及びQ2が2'−デオキシシチジン、E1及びE2が−CH=CH−、X1及びX2がメチレン基、T1及びT2が−NH−CO−、Y1及びY2がペンタメチレン基であって、W1とW2の一方が下記化合物(12a)、残りの一方が下記化合物(12b)である化合物である。
尚、この化合物は、一般式(3')(Q1−E1−X1−T1−Y1−NH−W1)のQ1−E1−X1−T1−Y1−NH−または一般式(4')(Q2−E2−X2−T2−Y2−NH−W2)のQ2−E2−X2−T2−Y2−NH−に相当する化合物であって、Q1又はQ2が2'−デオキシウリジン、E1又はE2が−CH=CH−、X1又はX2がメチレン基、T1又はT2が−NH−CO−、Y1又はY2がペンタメチレン基である化合物である。
尚、当該化合物は、一般式(3')(Q1−E1−X1−T1−Y1−NH−W1)または一般式(4')(Q2−E2−X2−T2−Y2−NH−W2)におけるQ1及びQ2が2'−デオキシウリジン、E1及びE2が−CH=CH−、X1及びX2がメチレン基、T1及びT2が−NH−CO−、Y1及びY2がペンタメチレン基であって、W1とW2の一方が下記化合物(12a)、残りの一方が下記化合物(12b)である化合物である。
(a)ランダムプライマー法の場合:
i)ランダムプライマー法用のプライマー(ランダムな塩基配列を持つプライマー)、ii) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii) DNA Polymerase(例えばKlenow Fragment、phi 29 DNA Polymerase、Bca BEST DNA Polymerase等)、好ましくはKlenow Fragment、iv)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(b)プライマー法の場合:
i)プライマー法用のプライマー(特定の塩基配列を持つプライマー)、ii) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii) DNA Polymerase(例えばKlenow Fragment、phi 29 DNA Polymerase、Bca BEST DNA Polymerase等)、好ましくはKlenow Fragment、iv)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(c)ニックトランスレーション法の場合:
i) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、ii) DNase IおよびDNA Polymerase I、iii)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(d)末端付加反応法(ターミナルデオキシトランスフェラーゼを用いた方法)の場合:
i)ターミナルデオキシトランスフェラーゼ、ii)要すればdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii)更に要すれば反応緩衝液等。
(e)PCR法の場合:
i) PCR法用のプライマー(特定の塩基配列を持つプライマー)、ii) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii)耐熱性DNA Polymerase、iv)要すれば反応緩衝液等。
(f)DOP-PCR法の場合:
i)DOP-PCR法用のプライマー(ランダムな塩基配列を持つプライマー)、ii) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii) 耐熱性DNA Polymerase、iv)要すれば反応緩衝液等。
尚、このようなプライマーとしては、例えばランダムプライマー法の場合はランダムな塩基配列を持つプライマー(ランダムプライマー法用のプライマー)であり、プライマー法の場合は特定の塩基配列を持つプライマー(プライマー法用のプライマー)である。また、PCR法の場合は特定の塩基配列を持つプライマー(PCR法用プライマー)であり、DOP-PCR法の場合はランダムな塩基配列を持つプライマー(DOP-PCR法用のプライマー)である。
(a)ランダムプライマー法の場合:
i) dATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、ii) DNA Polymerase(例えばKlenow Fragment、phi 29 DNA Polymerase、Bca BEST DNA Polymerase等)、好ましくはKlenow Fragment、iii)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(b)プライマー法の場合:
i) dATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、ii) DNA Polymerase(例えばKlenow Fragment、phi 29 DNA Polymerase、Bca BEST DNA Polymerase等)、好ましくはKlenow Fragment、iii)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(c)PCR法の場合:
i) dATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、ii)耐熱性DNA Polymerase、iii)要すれば反応緩衝液等。
(d)DOP-PCR法の場合:
i) dATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、ii) 耐熱性DNA Polymerase、iii)要すれば反応緩衝液等。
(a)ライゲーション法の場合:
i)リガーゼ、ii) ATP、iii)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
本発明において、「標本核酸」とは、前述した如き被験ゲノムDNA断片と対照ゲノムDNA断片との違い(即ち、被験ゲノムDNAのコピー数異常)を検出するための核酸配列を含むものである。
即ち、「標本核酸」は、検査対象となる(コピー数異常或いは染色体異常を検出・調査したい)細胞(生物)の全ゲノム(全染色体に実質的に相当するゲノム)に相当する核酸配列または上記のような違い(コピー数異常)を検出しようとする特定のゲノム〔特定の染色体、染色体の特定領域(特定部位)または特定の遺伝子等に対応するゲノム〕に相当する核酸配列を含むものであればよい。
このような「標本核酸」としては、例えば全染色体、特定の染色体、これらの特定領域、ゲノムDNA断片(例えば全染色体に実質的に相当するDNA配列を有するもの等)、ゲノムDNA断片の一部(例えば特定の染色体や染色体の特定領域に実質的に相当するDNA配列を有するもの、特定の遺伝子に対応するDNA配列を有するもの等)、mRNA(全部または一部)、cDNA(全部または一部、これらの増幅産物)等が挙げられる。
具体的には、染色体(全染色体、特定の染色体、これらの特定領域)としては、通常正常リンパ球のメタフェーズ(分裂中期染色体)またはその一部が使用されるが、これに限定されるものではない。
また、ゲノムDNA断片としては、細胞または細胞集団等から自体公知の方法により抽出されたゲノムDNA断片、クローニングされたゲノムDNA断片、これらゲノムDNA断片の一部等が挙げられ、これらゲノムDNA断片の特定領域の配列を有する合成オリゴDNAフラグメント、これらゲノムDNA断片を制限酵素により断片化或いは化学的に断片化したDNAフラグメント、これらを増幅した増幅産物等も使用可能である。
上記において、クローニングされたゲノムDNA断片とは、適当なベクターにクローニングされたゲノムDNA断片を意味し、例えばBAC(Bacterial Artificial Chromosome)、YAC(Yeast Artificial Chromosome)、PAC(P1-derived Artificial chromosome)、HAC(Human Artificial Chromosome)、MAC(Mammalian Artificial Chromosome)、TAC(Transformation competent Artificial Chromosome)等の人工染色体にクローニングされたゲノムDNA断片、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等にクローニングされたゲノムDNA断片等が挙げられる。
このような標本核酸は、自体公知の抽出法或いは市販の抽出キットを使用して調製することができる。また、市販品を使用することも可能である。
本発明は、上記した標本核酸が定着(固定化)された基板を用いる、所謂 アレイCGH法に有効である。
アレイCGH法は、上記した如き標本核酸を基板(例えばスライドグラス、ガラスや金属、樹脂性の板状チップ、マイクロビーズ、繊維状担体等)に共有結合や非共有結合等により体着(固定化)したものを用いてCGH法(解析)を行う方法である。
なかでも、本発明は、前記した如きゲノムDNA断片、ゲノムDNA断片の一部、cDNA等を定着(固定)させた基板を用いる場合に有効であり、特にクローニングされたゲノムDNA断片を定着(固定)させた基板を用いる場合に有効である。
また、クローニングされたゲノムDNA断片を定着(固定)させた基板としては、BACにクローニングされたゲノムDNA断片を定着(固定)させた基板(BACアレイ)を用いるのが好ましい。
尚、クローニングされたゲノムDNA断片を定着(固定)させた基板は、検査対象となる(コピー数異常或いは染色体異常を検出・調査したい)細胞(生物)の全ゲノムに全て対応できる個数のゲノムDNA断片を含むか、上記のような違い(コピー数異常)を検出しようとする染色体の特定領域(特定部位)または目的遺伝子に対応するゲノムDNA断片を含むものであればよい。即ち、複数のDNA断片が組み合わさって総合的に、実質的に全染色体(または特定の染色体)或いは染色体の特定領域に相当するDNA配列をカバーするように、これら複数のDNA断片が定着(固定化)されたものでも、1または2種以上の特定の遺伝子(またはmRNA、cDNA等)に対応する1種または2種以上のDNA配列を有する核酸断片(DNA断片、RNA断片)が定着(固定化)されたものであってもよい。
また、これらクローニングされたゲノムDNA断片は、染色体上の位置が確認されている(マッピングされている)ことが好ましい。
また、市販品を使用することも可能である〔例えばMacrogen社製「MacArray」、米国Spectral Genomics社製「SpectralChip」、Affymetrix社製「GeneChip」、GE Healthcare社製「CodeLink」、DNAチップ研究所製「AceGene」等〕。
本発明の方法は、前述した如き原理に基づくCGH法に準じて実施することができる。
即ち、(a)前述した如き標本核酸に、(b)本発明に係る標識物質(1)または標識物質(2)の何れか一方の標識物質で標識された被験ゲノムDNA断片と残りの一方の標識物質で標識された対照ゲノムDNA断片とを競合的にハイブリダイズさせ(ハイブリダイゼーション工程)、得られる蛍光強度を指標として、被験ゲノムDNA中の増幅または欠失(即ち、被験ゲノムDNAのコピー数異常)を検出する(分析工程)。
ここで使用される標識被験ゲノムDNA断片と標識対照ゲノムDNA断片との総量は、通常0.001〜1000μg、好ましくは0.01〜100μg、より好ましくは1〜32μgである。
また、標識被験ゲノムDNA断片と標識対照ゲノムDNA断片との使用比率は、混合液中の重量比として、被験ゲノムDNA1重量に対して対照ゲノムDNAの重量が、通常0.01倍〜100倍、好ましくは0.1倍〜10倍、より好ましくは0.5倍〜2倍である。
ハイブリダイゼーションの温度は通常0℃〜95℃、好ましくは30℃〜70℃、より好ましくは35℃〜46℃であり、ハイブリダイゼーションの時間は通常1〜480時間、好ましくは4時間〜240時間、より好ましくは24〜120時間、更に好ましくは36〜72時間である。
また、ハイブリダイゼーションは、ゲノムDNA断片中に存在する非特異的な繰り返し配列をブロックするためにCot-1 DNA等のブロック剤の存在下(例えば上記混合液中にCot-1 DNA等のブロック剤を共存させて)で行うことが好ましい。また、標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片の基板への非特異的な結合を防止するためにサケ精子DNAの存在下で行うこともできる。
尚、非特異的なシグナルをできるだけなくすために、ハイブリダイゼーション後に、得られた標本核酸を適当な洗浄液で洗浄するのが好ましい。
標本核酸上の蛍光強度は、例えばレーザースキャナーやCCDカメラ等の画像解析装置により標本核酸上の蛍光イメージを取得し、取得した蛍光イメージを画像解析ソフト等を使用して求めることができる。
また、得られた蛍光強度を指標として、被験ゲノムDNA中の増幅または欠失(即ち、被験ゲノムDNAのコピー数異常)を検出するには、例えば得られた蛍光強度から、画像解析ソフト等を使用して被験ゲノムDNA断片由来の標識物質と対照ゲノムDNA断片由来の標識物質との蛍光強度比を求め、これを解析すればよい。
即ち、対照ゲノムDNA断片由来の標識物質に対する被験ゲノムDNA断片由来の標識物質の蛍光強度比が高い場合には、標本核酸上の当該部分(領域)は、対照ゲノムDNA断片に比較して被験ゲノムDNA断片とより強くハイブリダイズしたことを示し、被験ゲノムDNAにおける、標本核酸上の当該部分(領域)に相当する領域の増幅(コピー数の増加)が検出され、逆に、対照ゲノムDNA断片由来の標識物質に対する被験ゲノムDNA断片由来の標識物質の蛍光強度比が低い場合(或いは被験ゲノムDNA断片由来の標識物質の蛍光が認められない場合)には、標本核酸上の当該部分(領域)は、被験ゲノムDNA断片に比較して対照ゲノムDNA断片とより強くハイブリダイズしたこと(或いは対照ゲノムDNA断片のみがハイブリダイズしたこと)を示し、被験ゲノムDNAにおける、標本核酸上の当該部分(領域)に相当する領域の欠失(コピー数の減少或いはコピーされていないこと)が検出される。尚、上記において蛍光強度比を求めるにあたっては、被験ゲノムDNA断片由来の標識物質の蛍光強度の平均と対照ゲノムDNA断片由来の標識物質の蛍光強度の平均〔言い換えれば、本発明に係る標識物質(1)に由来する蛍光強度の平均と本発明に係る標識物質(2)に由来する蛍光強度の平均〕を同じ値に補正した後に、当該補正値に基づいて蛍光強度比を求めるのが好ましい。
尚、本発明においては、上記したような被験ゲノムDNA中のコピー数異常(或いは染色体異常)を判断する工程〔言い換えれば、被験ゲノムDNA中のコピー数異常の有無(または染色体異常の有無)或いはコピー数の増加量または減少量を定量(または半定量)する工程〕や上記した如き標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を調製する工程を含んでいてもよい。
例えば、前述のようにして細胞または細胞集団から抽出した被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片をそれぞれ鋳型として、ランダムプライマー法を利用して、本発明に係る標識物質(1)〔または本発明に係る標識物質(2)〕で標識された標識被験ゲノムDNA断片および本発明に係る用いて標識物質(2)〔または本発明に係る標識物質(1)〕で標識された標識対照ゲノムDNA断片をそれぞれ合成する。これにより、鎖長100〜5000bp程度の標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を得ることができる。尚、必要により、自体公知の精製法や市販の精製キットにより、得られた標識被験ゲノムDNA断片または標識対照ゲノムDNA断片を含有する溶液から標識ゲノムDNA断片に取り込まれなかった標識物質等を除去して、標識ゲノムDNA断片を精製する。
得られた標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を含有する溶液に、繰り返し配列をブロックするためCot-1 DNA(50〜100μg)等を加え、これをエタノール沈殿法などによって沈殿させ、沈殿した精製された標識被験ゲノムDNA断片、標識対照ゲノムDNA断片およびCot-1 DNAの混合物をハイブリダイゼーション溶液〔例えば50%ホルムアミド/2xSSC(2xSSC: 2倍濃度の標準クエン酸緩衝液)/10%硫酸デキストラン/4% SDS (SDS: ドデシル硫酸ナトリウム)/100mg/ml 酵母tRNA, pH 7.0等〕に溶解する。標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を溶解したハイブリダイゼーション溶液を、例えば70℃で10分間加熱処理して標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を一本鎖化し、その後37℃で60分間インキュベートすることで、標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片中の非特異的な繰り返し配列をCot-1 DNAでブロックする。
例えば前述のようにして得られたBACアレイあるいは市販のBACアレイにおいては、アレイ上に定着(固定化)されている標本核酸(DNA)が一本鎖である場合はそのままハイブリダイゼーションに供し、当該標本核酸(DNA)が二本鎖の状態であれば、例えば沸騰水中に1分程度加熱するなどにより二本鎖標本核酸(DNA)を一本鎖化した後、これを乾燥させてからハイブリダイゼーションに供する。
尚、アレイ担体への標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片中の吸着を抑制するために、サケ精子由来DNA(10mg/ml)を含むハイブリダイゼーション溶液に30分程度浸漬した後、精製水で洗浄し、直ちに乾燥させておくとよい。
BACアレイ上に定着(固定化)されている標本核酸(DNA)断片(BAC クローンDNA断片)と、得られた標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を接触させて、標本核酸(DNA)と標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片との競合的ハイブリダイゼーション反応を前述した如き条件下で行う。尚、BACアレイ上の標本核酸と標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片との接触は、上記のようにして得られた標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を溶解したハイブリダイゼーション溶液をBACアレイ上に滴下して行い、また、滴下後、アレイ上にカバーグラス等をかけて、湿潤条件下でハイブリダイゼーションを行う。尚、接触・ハイブリダイゼーションは、アレイでのハイブリダイゼーション用の市販装置を用いて行ってもよい。
ハイブリダイゼーション反応が完了した後、得られたBACアレイを洗浄し、特異的な標本核酸(DNA)と標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片との結合を残し、非特異的なハイブリダイゼーション、あるいは吸着している標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を標本核酸(DNA)から除く。BACアレイの洗浄は、例えば46℃に加温した50%ホルムアミド/2xSSC, pH7に15分、0.1%SDS/2xSSC, pH7に30分浸漬し、続いて室温の0.1%NP40/0.1Mりん酸緩衝液, pH7に15分、2xSSC, pH7に5分浸漬することにより行い、洗浄後は得られたBACアレイをエタノールで濯いで乾燥させるとよい。
BACアレイ上に定着(固定化)されている各標本核酸(DNA)にハイブリダイズした被験ゲノムDNA断片由来の蛍光強度(シグナル)と対照ゲノムDNA断片由来の蛍光強度(シグナル)の測定を行う。蛍光強度は、例えばレーザースキャナーやCCDカメラ等の画像解析装置により各標本核酸(DNA)の蛍光画像(イメージ)を取得し、取得した蛍光画像(イメージ)を画像解析ソフト等を使用して求める。
被験ゲノムDNA中の増幅または欠失(即ち、被験ゲノムDNAのコピー数異常)の検出は、例えば画像解析ソフト等を使用して得られた蛍光強度から被験ゲノムDNA断片由来の標識物質と対照ゲノムDNA断片由来の標識物質との蛍光強度比を求め、これを解析して行う。
即ち、標本核酸(DNA)断片(BAC クローンDNA断片)に相当するゲノム領域において、被験ゲノムDNA断片を抽出したもとの細胞(例えば異常細胞等)でコピー数増加(増幅)が生じていれば被験ゲノムDNA断片が対照ゲノムDNA断片に比べ相対的に多くハイブリダイズし、一方、被験ゲノムDNA断片を抽出したもとの細胞(例えば異常細胞等)でコピー数減少(欠失)が生じていれば、対照ゲノムDNA断片が被験ゲノムDNA断片に比べ相対的に多くハイブリダイズすることになる。従って、BACアレイ上の各標本核酸(DNA断片)毎に、被験ゲノムDNA断片由来の蛍光強度(シグナル)と対照ゲノムDNA断片由来の蛍光強度(シグナル)を比較することにより(即ち、これらの蛍光強度比を算出し、これを解析することにより)、各標本核酸(DNA断片)に相当するゲノム領域において、被験ゲノムDNA断片を抽出したもとの細胞(例えば異常細胞等)でコピー数増加が生じているか、減少しているか、正常レベルであるのかを判定することができる。
本発明のキットは、上記した如き本発明の方法を実施するために使用されるものである。
このようなキットとしては、(i)少なくとも、被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片を標識するために用いられる、本発明の標識物質(1)で標識されたヌクレオチド残基と本発明に係る標識物質(2)で標識されたヌクレオチド残基、好ましくは上記した如き一般式(3)で示される標識ヌクレオチド残基と一般式(4)で示される標識ヌクレオチド残基、より好ましくは一般式(3')で示される標識ヌクレオチド残基と一般式(4')で示される標識ヌクレオチド残基を含んでなるものであり、(ii)好ましくは、更に、前述した如きプライマー、酵素類、試薬類等から選ばれる少なくとも1種を含んでなるものである。
このようなキットとしては、例えば以下のような構成要件を含むものが挙げられる。
尚、構成要件の好ましい態様と具体例は前述した通りである。
i)本発明の標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチドと本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド、ii)ランダムプライマー法用のプライマー(ランダムな塩基配列を持つプライマー)、iii) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iv) DNA Polymerase(例えばKlenow Fragment、phi 29 DNA Polymerase、Bca BEST DNA Polymerase等)、好ましくはKlenow Fragment、v)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(b)標識モノヌクレオチドを用いるプライマー法用のキットの場合:
i)本発明の標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチドと本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド、ii)プライマー法用のプライマー(特定の塩基配列を持つプライマー)、iii) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iv) DNA Polymerase(例えばKlenow Fragment、phi 29 DNA Polymerase、Bca BEST DNA Polymerase等)、好ましくはKlenow Fragment、v)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(c)標識モノヌクレオチドを用いるニックトランスレーション法用のキットの場合:
i)本発明の標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチドと本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド、ii) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii) DNase IおよびDNA Polymerase I、iv)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(d)標識モノヌクレオチドを用いる末端付加反応法(ターミナルデオキシトランスフェラーゼを用いた方法)の場合:
i)本発明の標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチドと本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド、ii)ターミナルデオキシトランスフェラーゼ、iii)要すればdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iv)更に要すれば反応緩衝液等。
(e)標識モノヌクレオチドを用いるPCR法の場合:
i)本発明の標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチドと本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド、ii) PCR法用のプライマー(特定の塩基配列を持つプライマー)、iii) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iv)耐熱性DNA Polymerase、v)要すれば反応緩衝液等。
(f)標識モノヌクレオチドを用いるDOP-PCR法の場合:
i)本発明の標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチドと本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド、ii)DOP-PCR法用のプライマー(ランダムな塩基配列を持つプライマー)、iii) dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP(又はdUTP)から選ばれる上記した如き標識モノヌクレオチド以外の少なくとも3種、好ましくはdATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iv) 耐熱性DNA Polymerase、v)要すれば反応緩衝液等。
i)本発明に係る標識物質(1)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド(ランダムな塩基配列を持つランダムプライマー法用のプライマー)および本発明に係る標識物質(2)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド(ランダムな塩基配列を持つランダムプライマー法用のプライマー)、ii) dATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii) DNA Polymerase(例えばKlenow Fragment、phi 29 DNA Polymerase、Bca BEST DNA Polymerase等)、好ましくはKlenow Fragment、iv)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(h)標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるプライマー法の場合:
i)本発明に係る標識物質(1)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド(特定な塩基配列を持つプライマー法用のプライマー)および本発明に係る標識物質(2)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド(特定な塩基配列を持つプライマー法用のプライマー)、ii) dATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii) DNA Polymerase(例えばKlenow Fragment、phi 29 DNA Polymerase、Bca BEST DNA Polymerase等)、好ましくはKlenow Fragment、iv)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
(i)標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるPCR法の場合:
i)本発明に係る標識物質(1)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド(特定な塩基配列を持つPCR法用のプライマー)および本発明に係る標識物質(2)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド(特定な塩基配列を持つPCR法用のプライマー)、ii) dATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii)耐熱性DNA Polymerase、iv)要すれば反応緩衝液等。
(j)標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるDOP-PCR法の場合:
i)本発明に係る標識物質(1)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド(ランダムな塩基配列を持つDOP-PCR法用のプライマー)および本発明に係る標識物質(2)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド(ランダムな塩基配列を持つDOP-PCR法用のプライマー)、ii) dATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、iii) 耐熱性DNA Polymerase、iv)要すれば反応緩衝液等。
i)本発明に係る標識物質(1)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴ又はポリヌクレオチドおよび本発明に係る標識物質(2)が結合した標識ヌクレオチド残基を含むオリゴ又はポリヌクレオチド、ii)リガーゼ、iii) ATP、iv)要すれば反応緩衝液、反応停止液等。
a)DNA断片を標識するための酵素類用の反応緩衝液(例えばマグネシウム塩等の塩類、メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール等を含有するグッド緩衝液等)、
b)DNA断片を標識するための酵素類の反応を停止するための反応停止液(例えばキレート剤等の反応停止剤を含有する例えば水やグッド緩衝液等)、
c)標識モノヌクレオチドや標識ゲノムDNA断片(被験ゲノムDNA断片、対照ゲノムDNA断片)を精製するための試薬類、
d)標本核酸及び標本核酸を定着(固定化)させるための基板、または標本核酸が定着(固定化)された基板、
e)ハイブリダイゼーション用の緩衝液〔例えば50%ホルムアミド、2×SSC、4%SDS及び10%デキストラン硫酸を含む緩衝液(pH7)等〕、
f)ハイブリダイゼーション時の非特異吸着防止用の試薬(例えばサケ精巣由来DNA、t-RNA、Cot-1DNA等)、
g)ハイブリダゼーション後の洗浄液(例えば50%ホルムアミド含有2×SSC、0.1%SDS含有2×SSC、0.1%NP-40含有0.1Mりん酸緩衝液、2×SSC、エタノール、イソプロパノール等)、
h)被験ゲノムDNA断片又は/及び対照ゲノムDNA断片を抽出するための抽出用試薬(例えば粉砕用緩衝液、DNA精製のためのRNase、蛋白除去用のプロテアーゼ、フェノール、クロロホルム、SDS、β−メルカプトエタノール、精製用のカラム等)、
i)被験ゲノムDNA断片又は/及び対照ゲノムDNA断片を断片化するための断片化試薬(例えば制限酵素等)、
j)例えば抽出、標識、断片化、精製等を行った後に、得られた被験ゲノムDNA断片又は/及び対照ゲノムDNA断片を確認するための電気泳動用試薬(アガロース又はポリアクリルアミドゲル、ローディング緩衝液、臭化エチジウム染色用試薬等)、
k)アルコール沈澱用試薬(例えばエタノール溶液、イソプロパノール溶液、高分子キャリアー、酢酸ナトリウム溶液等)等。
本発明に係る標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチド(2'−デオキシシチジン−5'−トリホスフェート)および本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド(2'−デオキシシチジン−5'−トリホスフェート)をそれぞれ前記した合成経路に従って、以下のように合成した。
(i)トリフルオロアセチル(Tfa)化(第1工程)
21gのPropagylamine〔前述の合成経路中の(1)の化合物〕(東京化成(株)製)に、氷冷下でトリフルオロ酢酸メチル(MeOTfa)(54g)を滴下した後、室温で2時間攪拌した。反応終了後、減圧蒸留(20mmHg、74℃)で精製を行い、56gの化合物〔前述の合成経路中の(2)の化合物〕を得た(収率;98.1%)。
15gの化合物(2)〔前述の合成経路中の(2)の化合物〕をベンゼン(300mL)に溶解し、水素化トリ(n−ブチル)すず(Bu3SnH)(35mL),アゾイソブチロニトリル(AIBN)(2.1g)を添加した後、還流下で1.5時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム(溶離液;AcOEt:Hexane=1:20)で精製し、11.4gの化合物(3)(部分リンカーA)〔前述の合成経路中の(3)の化合物〕を得た(収率;25.8%)。
(i)トリフルオロアセチル(Tfa)化(第3工程)
10gの6-Aminohexanoic acid〔前述の合成経路中の(4)の化合物〕(和光純薬工業(株)製)をCHCl3に懸濁し、トリフルオロ酢酸メチル(MeOTfa)(25g),トリエチルアミン(Et3N)(25mL)を添加した後、室温で2日間攪拌した。反応終了後、溶媒を留去し、水より結晶化を行うことで、8.4gの化合物〔前述の合成経路中の(5)の化合物〕を得た(収率;48.6%)。
2.3gの化合物(5)〔前述の合成経路中の(5)の化合物〕をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(50mL)に溶解し、N−ヒドロキシこはく酸イミド(HO-Su)(1.4g),WSC(2.3g)を添加した後、室温で終夜攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで分液洗浄した。有機層を減圧濃縮することで、3.6gの化合物(6)(部分リンカーB)〔前述の合成経路中の(6)の化合物〕を得た(収率;定量的)。
(i)部分リンカーAの導入(第5工程)
1.0gの5−ヨード−2'−デオキシシチジン〔前述の合成経路中の(7)の化合物〕(和光純薬工業(株)製)をアセトニトリル(30mL)に懸濁し、Arガス置換下でN,O−ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(TMS-Acetamide)(3mL)を添加した後、還流下で2時間攪拌した。反応液を室温に冷却した後、ビス(アセトニトリル)ジクロロパラジウム(II)[PdCl2(CH3CN)2](40mg),及び2gの部分リンカーA〔前述の合成経路中の(3)の化合物〕を添加し、更に50〜60℃で20時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム(溶離液;CHCl3:MeOH=9:1)で精製を行い、ジエチルエーテルより結晶化することで、720mgの2'-デオキシシチジン誘導体〔前述の合成経路中の(8)の化合物〕を得た(収率;67.3%)。
500mgの2'-デオキシシチジン誘導体〔前述の合成経路中の(8)の化合物〕をEtOH(10mL)に溶解し、25%-アンモニア水(25mL)を添加した後、室温で4時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮した。残渣をODSカラムクロマト(溶離液;5%-MeOH)で精製することで、190mgの2'-デオキシシチジン誘導体〔前述の合成経路中の(9)の化合物〕を得た(収率;50.9%)。
190mgの2'-デオキシシチジン誘導体〔前述の合成経路中の(9)の化合物〕をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(4mL)に溶解し、330mgの部分リンカーB〔前述の合成経路中の(6)の化合物〕を添加した後、室温で終夜攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラム(溶離液;CHCl3:MeOH:AcOH=80:20:5)で精製を行った。更に、ODSカラムクロマト(溶離液;20%-MeOH)で精製することで、169mgの2'-デオキシシチジン誘導体〔前述の合成経路中の(10)の化合物〕を得た(収率;51.2%)。
(i)トリりん酸化試薬0.5M トリス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェート[tris(TBAPP)]の調製
Dowex50W×8(H+Form)(100cm3)カラムにピロりん酸ナトリウム・10水和物水溶液(6.7g/100mL)をチャージし、溶出液(ピロりん酸溶液)を10.6mLのトリブチルアミンを含むEtOH(50mL)溶液に直接滴下した。10分間攪拌した後、減圧濃縮し、残渣にEtOH(30mL×2回),トルエン(30mL×3回),N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(20mL×2)を順次添加し、減圧濃縮を繰り返した。DMFで30mLにメスアップした後、MS4Aを添加し、終夜脱水することで、0.5M-tris(TBAPP)溶液を得た。
147mg(0.3mmol)の2'-デオキシシチジン誘導体〔前述の合成経路中の(10)の化合物〕をりん酸トリエチル[(EtO)3PO](1.4mL)に溶解し、オキシ塩化りん(27μL+24μL)を添加した後、低温室で4時間攪拌した。これに上記で得た0.5M-tris(TBAPP)(4mL)を投入し、低温室で2時間攪拌した後、反応液に7%-トリエチルアミン(Et3N)水溶液(7mL)を添加し、更に終夜攪拌した。反応後、反応液をジエチルエーテルで洗浄し、DEAE-TOYOPEARLカラム(溶離液;水→0.2M-TEABグラジェント)で精製した。次いで、濃縮残渣を25%-アンモニア水(30mL)に溶解し、低温室で終夜攪拌した。反応終了後、アンモニアを減圧留去し、残渣を凍結乾燥することで、130mgの2'-dCTP-アミノリンカー誘導体〔前述の合成経路中の(11)の化合物〕を得た(HPLC純度;95.8%,含量;77.3%)。
2.8mgの2'-dCTP-アミノリンカー誘導体〔前述の合成経路中の(11)の化合物〕をイオン交換水(150μL)に溶解し、Dy547-NHS-ester(Dyomics社製)〔前述の合成経路中の(12a)の化合物〕のDMF溶液(1mg/100μL)を5回添加した後、室温で終夜攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、ワコーシル50C18カラム(溶離液;5%-MeOH),次いでDEAE-TOYOPEARL 650Mカラム(溶離液;0.2M-TEAB)で精製を行った。濃縮残渣を凍結乾燥することで2.5mgの蛍光標識2'-dCTP誘導体〔前述の合成経路中の(13a)の化合物(Dy547-dCTP):本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド〕を得た。
また、Dy547-NHS-esterの代わりにDy647-NHS-ester(Dyomics社製)〔前述の合成経路中の(12b)の化合物〕を用いる以外は上記と同様に行って、2.5mgの蛍光標識2'-dCTP誘導体〔前述の合成経路中の(13b)の化合物(Dy647-dCTP):本発明に係る標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチド〕を得た。
本発明に係る標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチド(2'−デオキシウリジン−5'−トリホスフェート)および本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド(2'−デオキシウリジン−5'−トリホスフェート)をそれぞれ前記した合成経路に従って、以下のように合成した。
(i)部分リンカーAの導入(第5工程)
3.0gの5−ヨード−2'−デオキシウリジン〔前述の合成経路中の(14)の化合物〕(和光純薬工業(株)製)をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(25mL)に懸濁し、Arガス置換下でトリ−2−フリルホスフィン(TFP)(80mg)、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)[Pd2(dba)3](160mg)、及び4.5gの部分リンカーA〔前述の合成経路中の(3)の化合物〕を添加し、室温で20時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、エタノールより結晶化することで、2.4gの2'-デオキシウリジン誘導体〔前述の合成経路中の(15)の化合物〕を得た(収率;80.5%)。
1.6gの2'-デオキシウリジン誘導体〔前述の合成経路中の(15)の化合物〕をMeOH(20mL)に溶解し、25%-アンモニア水(25mL)を添加した後、室温で4時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、エタノールで結晶化することで、1.0gの2'-デオキシウリジン誘導体〔前述の合成経路中の(16)の化合物〕を得た(収率;82.6%)。
700mgの2'-デオキシウリジン誘導体〔前述の合成経路中の(16)の化合物〕をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(10mL)に溶解し、1gの部分リンカーB〔前述の合成経路中の(6)の化合物〕を添加した後、室温で終夜攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラム(溶離液;CHCl3:MeOH:AcOH=80:20:5)で精製することで、870mgの2'-デオキシシチジン誘導体〔前述の合成経路中の(17)の化合物〕を得た(収率;71.3%)。
(i)トリりん酸化(第8工程)
147mg(0.3mmol)の2'-デオキシウリジン誘導体〔前述の合成経路中の(17)の化合物〕をりん酸トリエチル[(EtO)3PO](1.4mL)に溶解し、オキシ塩化りん(27μL+24μL)を添加した後、低温室で4時間攪拌した。これに上記で得た0.5M トリス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェート[tris(TBAPP)](4mL)を投入し、低温室で2時間攪拌した後、反応液に7%-トリエチルアミン水溶液(7mL)を添加し、更に終夜攪拌した。反応後、反応液をジエチルエーテルで洗浄し、DEAE-TOYOPEARLカラム(溶離液;水→0.2M-TEABグラジェント)で精製した。次いで、濃縮残渣を25%-アンモニア水(30mL)に溶解し、低温室で終夜攪拌した。反応終了後、アンモニアを減圧留去し、残渣を凍結乾燥することで、130mgの2'-dUTP-アミノリンカー誘導体〔前述の合成経路中の(18)の化合物〕を得た(HPLC純度;96.3%,含量;42.0%)。
1.4mgの2'-dUTP-アミノリンカー誘導体〔前述の合成経路中の(18)の化合物〕をイオン交換水(150μL)に溶解し、Dy547-NHS-ester(Dyomics社製)〔前述の合成経路中の(12a)の化合物〕のDMF溶液(1mg/100μL)を5回添加した後、室温で終夜攪拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、ワコーシル50C18カラム(溶離液;5%-MeOH),次いでDEAE-TOYOPEARL 650Mカラム(溶離液;0.2M-TEAB)で精製を行った。濃縮残渣を凍結乾燥することで2.2mgの蛍光標識2'-dUTP誘導体〔前述の合成経路中の(19a)の化合物(Dy547-dUTP):本発明に係る標識物質(2)で標識されたモノヌクレオチド〕を得た。
また、Dy547-NHS-esterの代わりにDy647-NHS-ester(Dyomics社製)〔前述の合成経路中の(12b)の化合物〕を用いる以外は上記と同様に行って、1.8mgの蛍光標識2'-dUTP誘導体〔前述の合成経路中の(19b)の化合物(Dy647-dUTP):本発明に係る標識物質(1)で標識されたモノヌクレオチド〕を得た。
被験ゲノムDNA断片として正常女性ゲノムDNAを使用し、対照ゲノムDNA断片として正常男性ゲノムDNAを使用して、BACアレイによるCGH解析を行った。
(i)標識ヌクレオチドの取込み
正常Male DNA(Promega社製)(対照ゲノムDNA断片)と正常Female DNA(Promega社製)(被験ゲノムDNA断片)各500ngをPCR用チューブにそれぞれ分取し、1500μg/ml Random Octamer solution(ニッポンEGT社製)10μL、250mM MOPS(pH7.0)(25mM MgCl2, 50mM 2-mercaptoethanol含有) 10μlを添加し、滅菌水を加えて全量を39μLに調整した。これらの混合液を、100℃で10分間加熱後、氷上で5分間冷却し、ランダムプライマーをMale DNAおよびFemale DNAにそれぞれアニールさせた。続いて室温に5分間放置した後、dNTP溶液〔和光純薬工業(株)製、dNTPset(2mM dATP、2mM dGTP、2mM dTTPおよび1mM dCTP含有〕)を5μL添加した。
さらに、Male DNA(対照ゲノムDNA断片)のチューブには1mM Dy547-dCTP〔合成例.1で得られた前述の合成経路中の(13a)の化合物〕を、Female DNA(被験ゲノムDNA断片)のチューブには1mM Dy647-dCTP〔合成例.1で得られた前述の合成経路中の(13b)の化合物〕を各3μL添加した。遠心分離機によるスピンダウン後、これらの混合液にKlenowFlagment(Fermentas社製)を3μL(30unit)添加し、マイクロピペッターでピペッティングにより泡を作らないように混合した。
37℃で16時間反応後、各チューブに0.5M EDTA溶液を5μL添加し、反応を停止させた。
PCR Purification Kit (Qiagen社製)を用いて、上記(i)の反応液中に存在する未反応の標識ヌクレオチド(Dy547-dCTPおよびDy647-dCTP)の除去を行った。反応停止後の各チューブにBinding Buffer(Qiagen社製のPCR Purification Kitに含まれているBuffer)を275μL加え、ピペッティングにより混合した。
混合液全量をスピンカラム(Qiagen社製のPCR Purification Kitに含まれているカラム))にアプライし、6,000r.p.m.(3,500×g)で2分遠心分離処理した。
フロースルーを捨て、スピンカラムWash Buffer(Qiagen社製のPCR Purification Kitに含まれているBuffer)750μLを添加し、6000r.p.m.(3,500×g)で2分遠心分離処理した。フロースルーを捨て12,000r.p.m.(14,000×g)で3分遠心分離処理した。
新しい1.5mLのマイクロチューブをスピンカラムにセットし、カラムの中心にElution Buffer(Qiagen社製のPCR Purification Kitに含まれているBuffer)を50μL添加後、遮光下、5分室温に放置し、12,000r.p.m.(14,000×g)で3分遠心分離処理した。カラムの中心にElution Buffer(Qiagen社製のPCR Purification Kitに含まれているBuffer)を30μL添加後、遮光下、5分室温に放置し、12,000r.p.m.(14,000×g)で3分遠心分離処理し、精製したDy-547標識Male DNA(標識対照ゲノムDNA断片)80μlとDy-647標識Female DNA(標識被験ゲノムDNA断片)80μlをそれぞれ得た。
BACアレイとして、市販のBACアレイ キット〔MAC Array Karyo 4000、Macrogen社製〕を用いて、以下のように行った。
このBACアレイはヒトゲノムBACライブラリ由来のクローン4000個がスライドガラス上に2回スポット(定着・固定化)されたもので、各クローンは、両端エンドシークエンスが決定され、また、FISH法によって染色体上の位置が確認されている。
上記(1)で得られたDy-547標識Male DNAおよびDy-647標識Female DNA 各80μlを混合し、さらにMAC Array Karyo 4000(Macrogen社製)に含まれるSolution B(Cot-1 DNA含有)100μl、3M 酢酸ナトリウム25μlおよび冷100%エタノール700μlを添加して混合した。これらの混合液を−20℃で60分置いた後、12,000r.p.m.(14,000×g)で4℃、20分、遠心分離処理した。ペレットを捨てないように、上清を捨て、冷70%エタノールを1ml添加混合後、再度12,000r.p.m.(14,000×g)で4℃、5分遠心分離処理した。ペレットを捨てないように、上清を捨て、遮光下10分間乾燥させた。得られたペレットにMAC Araay Karyo 4000に含まれるSolution C(ハイブリダイゼーション溶液) 140μlおよびSolution D(yeast tRNA含有) 4μlを加え、ペレットを溶解させた。
得られた溶解液を70℃で10分間加熱し、二本鎖DNAの変性(一本鎖化)を行い、37℃で60分間プレアニーリングさせてCot-1 DNAによる繰り返し配列のブロッキング反応を行い、ハイブリダイゼーション用サンプルDNA(標識サンプルDNA)溶液とした。
MAC Array Karyo 4000に含まれるSolution C(ハイブリダイゼーション溶液) 30μlとSolution E(サケ精子DNA含有) 10μlを混合し、70℃で10分間加熱後、氷中で5分間冷却し、プレハイブリダイゼーション溶液とした。
MAC Array Karyo 4000のBACアレイ(スライド)上にプレハイブリダイゼーション溶液40μlをアプライし、溶液がアレイ全体に行き渡るように、スポットしているアレイがすべて隠れる大きさのカバーガラスをかぶせた。湿箱中で室温30分間インキュベートした。
インキュベート終了後、カバーガラスを外し、滅菌脱イオン水でアレイを2回洗浄し、100%イソプロパノールで1回洗浄し、スライド用遠心機により2,000 r.p.m.(780×g)2分間遠心分離処理した。
プレハイブリダイゼーションが終了したBACアレイ(スライド)を自動スライド処理装置HybStation(GenomicSolution社製)にセットし、(i)で得られたハイブリダイゼーション用サンプルDNA(標識サンプルDNA)溶液120μlをアプライした。ハイブリダイゼーション温度を37℃にセットし、一定時間ごとにハイブリダイゼーション用サンプルDNA(標識サンプルDNA)溶液を攪拌しつつ、44時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後の洗浄も自動スライド処理装置により、洗浄液1(50%)ホルムアミド/2×SSC,pH7にて46℃5分間3回、洗浄液2(0.1% SDS/2×SSC,pH7)にて46℃、10分間3回、洗浄液3(0.1% NP-40/0.1Mりん酸緩衝液, pH7)にて、46℃、10分間3回、洗浄液4(2×SSC, pH7)にて46℃、2分間3回の洗浄操作を行った。その後、BACアレイ(スライド)を装置からはずし、70%、85%、100%の各エタノールを満たした洗浄瓶中に各1分間浸漬後、スライド用遠心機により2,000 r.p.m.(780×g)2分遠心分離処理して乾燥させた。
ハイブリダイゼーションおよび洗浄後のBACアレイをマイクロアレイ用のスキャナーGenePix 4000A(Axon Instrumants社製)にてスキャンし、BACアレイ上のMale DNA(対照ゲノムDNA断片)由来の蛍光およびFemale DNA(被験ゲノムDNA断片)由来の蛍光による蛍光画像(イメージ)を取得した。得られた蛍光画像(イメージ)データを、アレイCGH解析用ソフトウェアMacViewer(Macrogen社製)により解析し、アレイスポットごとにDy-547およびDy-647の蛍光シグナルを測定し、データをノーマライズした後、Log2(Dy-647/Dy-547)値をBACクローンごとに算出した。
各BACクローンごとのLog2(Dy-647/Dy-547)値から、常染色体(1〜22番染色体)およびX染色体におけるLog2(Dy-647/Dy-547)の平均値とS.D.をそれぞれ算出した。
算出結果を以下に示す。
・常染色体(Chr.1-22): 0.0209(平均)± 0.0420(S.D.)
・X染色体(Chr.X) : 0.671 (平均)± 0.110 (S.D.)
図1において、縦軸は正常男性と比較した増減のレベルを蛍光強度比(Log2比)で示し、正(+)の値はコピー数が増加していることを、負(−)の値はコピー数が減少していることを表す。また、横軸は染色体番号を示す。
本発明と比較するために、従来の蛍光標識物質を用いてBACアレイによるCGH解析を行った。
以下の蛍光標識ヌクレオチド(蛍光標識2'-dCTP誘導体)を用いた以外は、実施例.1の(1)と同様にして標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片の調製を行った。
(a)CyDye標識ヌクレオチド
・対照ゲノムDNA断片(Male DNA):Cy3標識dCTP(PerkinElmer社製、Cy3-dCTP)
・被験ゲノムDNA断片(Female DNA):Cy5標識dCTP(PerkinElmer社製、Cy5-dCTP)
(b)HiLyteDye標識ヌクレオチド
・対照ゲノムDNA断片(Male DNA):HiLyte Fluor 555標識dCTP
・被験ゲノムDNA断片(Female DNA):HiLyte Fluor 647標識dCTP
尚、これらHiLyteDye標識ヌクレオチドは、合成例.1で得られた2'-dCTP-アミノリンカー誘導体〔前述の合成経路中の(11)の化合物〕と、市販の蛍光標識物質HiLyte Fluor 555(Anaspec社製、HiLyte 555-SE)およびHiLyte Fluor 647(Anaspec社製、HiLyte 647-SE)を用いて、合成例.1の(5)に従って調製した。
上記(1)で得られた、以下の標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を用いた以外は、実施例.1の(2)と同様にしてBACアレイへのハイブリダイゼーションを行った。
(a)CyDye標識被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片
・標識対照ゲノムDNA断片(Male DNA):Cy3標識Male DNA
・標識被験ゲノムDNA断片(Female DNA):Cy5標識Female DNA
(b)HiLyteDye標識被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片
・標識対照ゲノムDNA断片(Male DNA):HiLyte Fluor 555標識Male DNA
・標識被験ゲノムDNA断片(Female DNA):HiLyte Fluor 647標識Female DNA
実施例.1の(3)と同様にして測定・解析を行った。
尚、解析は、アレイスポットごとにCy3およびCy5の蛍光シグナル、並びにHiLyte Fluor 555およびHiLyte Fluor 647をそれぞれ測定し、データをノーマライズした後、Log2(Cy5/Cy3)値およびLog2(HiLyte Fluor 647/ HiLyte Fluor 555)値をそれぞれBACクローンごとに算出した。
各BACクローンごとのLog2(Cy5/Cy3)値から、常染色体(1〜22番染色体)およびX染色体におけるLog2(Cy5/Cy3)の平均値とS.D.を、また、Log2(HiLyte Fluor 647/ HiLyte Fluor 555)値から、常染色体(1〜22番染色体)およびX染色体におけるLog2(HiLyte Fluor 647/ HiLyte Fluor 555)の平均値とS.D.をそれぞれ算出した。
算出結果を以下にそれぞれ示す。
(a)CyDye標識被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片を用いた場合
・常染色体(Chr.1-22): 0.0107(平均)± 0.0756(S.D.)
・X染色体(Chr.X) : 0.619 (平均)± 0.120 (S.D.)
(b)HiLyteDye標識被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片を用いた場合
・常染色体(Chr.1-22): 0.00279(平均)± 0.0787(S.D.)
・X染色体(Chr.X) : 0.641 (平均)± 0.112(S.D.)
尚、図2及び図3において、縦軸は正常男性と比較した増減のレベルを蛍光強度比(Log2比)で示し、正(+)の値はコピー数が増加していることを、負(−)の値はコピー数が減少していることを表す。また、横軸は染色体番号を示す。
即ち、常染色体である1番〜22番染色体では、男性、女性各二本ずつ染色体をもっているため、理論上、常染色体でのLog2比は0となるが、実際には各クローン(染色体)間で誤差が生じる。この誤差はS.D.により表され、常染色体でのLog2比のS.D.が小さいほどバラツキ(誤差)が少なく、増減の評価であるカットオフ値を下げることができるので、高精度な測定が可能であると判断することができる。
一方、X染色体は、女性で二本、男性で一本であるため、理論上蛍光量(蛍光強度)が2倍となり、X染色体でのLog2比は1となる。このX染色体でのLog2比は染色体の増加の指標となり、X染色体でのLog2比が1に近いほど増減がはっきりわかるため、増減の変化量が少なくても検出が可能である、言い換えれば、高感度な検出が可能であると判断することができる。
そこで、実施例.1で得られた本発明の方法における常染色体でのLog2比のS.D.とX染色体でのLog2比、および比較例.1で得られた従来の蛍光標識物質を用いた方法における常染色体でのLog2比のS.D.とX染色体でのLog2比とを、下表に示す。
また、本発明の方法におけるX染色体でのLog2比は0.671であり、Cy3およびCy5を用いた場合(0.619)とHiLyte Fluor 555およびHiLyte Fluor 647を用いた場合(0.641)よりも1に近いことが判る。このことから、本発明の方法は、従来法に比べてより高感度な検出が可能であることが判る。
被験ゲノムDNA断片として肝癌細胞由来ゲノムDNAを使用し、対照ゲノムDNA断片として正常男性ゲノムDNAを使用して、BACアレイによるCGH解析を行った。
(1)標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片の調製
以下の被験ゲノムDNA断片および対照ゲノムDNA断片を用いた以外は、実施例.1の(1)と同様にして標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片の調製を行った。
・被験ゲノムDNA断片:肝癌細胞株Hep3Bを継代培養した細胞に由来するゲノムDNA(肝細胞由来ゲノムDNA)
・対照ゲノムDNA断片:正常ヒトMale DNA(Promega社製)
上記(1)で得られた、以下の標識被験ゲノムDNA断片および標識対照ゲノムDNA断片を用いた以外は、実施例.1の(2)と同様にしてBACアレイへのハイブリダイゼーションを行った。
・標識対照ゲノムDNA断片(Male DNA):Dy-547標識Male DNA
・標識被験ゲノムDNA断片(肝細胞由来ゲノムDNA):Dy-647標識肝癌DNA
実施例.1の(3)と同様にして測定・解析を行った。
各BACクローンごとのLog2(Dy-647/Dy-547)値を染色体番号順にプロットした結果を図4に示す。
図4において、縦軸は正常男性と比較した増減のレベルを蛍光強度比(Log2比)で示し、正(+)の値はコピー数が増加していることを、負(−)の値はコピー数が減少していることを表す。また、横軸は染色体番号を示す。
Claims (12)
- (a)検査対象となる細胞由来のゲノムDNA断片である被験ゲノムDNA断片を下記一般式(1)で示される標識物質または一般式(2)で示される標識物質の何れか一方の標識物質で標識し、当該被験ゲノムDNA断片との違いを検出するための基準となる対照ゲノムDNA断片を残りの一方の標識物質で標識し、(b)標識された被験ゲノムDNA断片と標識された対照ゲノムDNA断片を、被験ゲノムDNA断片と対照ゲノムDNA断片との違いを検出するための核酸配列を含む標本核酸に競合的にハイブリダイズさせ、(c)得られる蛍光強度を指標として、被験ゲノムDNA断片中の増幅または欠失を検出する方法。
〔式中、R1〜R4およびR8〜R11はそれぞれ独立して水素原子または−SO3R15(式中、R15は水素原子、アルカリ金属原子、有機アンモニウムイオンまたはアンモニウムイオンを表す。)を表し、R5およびR12はそれぞれ独立してアルキル基またはスルホアルキル基を表し、R6、R7およびR14はそれぞれ独立してアルキル基を表し、R13はカルボキシアルキル基を表す。〕
〔式中、R21〜R24およびR28〜R31はそれぞれ独立して水素原子または−SO3R35(式中、R35は水素原子、アルカリ金属原子、有機アンモニウムイオンまたはアンモニウムイオンを表す。)を表し、R25およびR32はそれぞれ独立してアルキル基またはスルホアルキル基を表し、R26、R27およびR34はそれぞれ独立してアルキル基を表し、R33はカルボキシアルキル基を表す。〕 - 前記標本核酸が、基板に定着(固定化)されているものである、請求項1に記載の方法。
- 前記標本核酸が、人工染色体に由来するものである、請求項2に記載の方法。
- 前記標本核酸が、BAC(Bacterial Artificial chromosome) DNAである、請求項3に記載の方法。
- 前記標識された被験ゲノムDNA断片が下記一般式(3)で示されるヌクレオチド残基または一般式(4)で示されるヌクレオチド残基の何れか一方のヌクレオチド残基を含むものであり、前記標識された対照ゲノムDNA断片が残りの一方のヌクレオチド残基を含むものである、請求項1に記載の方法。
〔式中、Q1はヌクレオチド残基を表し、V1はリンカーを表し、W1は下記一般式(1')を表す。
(式中、Z1はV1と結合する結合手を、R13'はアルキル基を表し、R1〜R12およびR14は前記と同じ。)〕、
〔式中、Q2はヌクレオチド残基を表し、V2はリンカーを表し、W2は下記一般式(2')を表す。
(式中、Z2はV2と結合する結合手を、R33'はアルキル基を表し、R21〜R32およびR34は前記と同じ。)〕。 - 前記被験ゲノムDNAの標識物質による標識および前記対照ゲノムDNAの標識物質による標識が、プライマーエクステンション法、ニックトランスレーション法、および末端付加反応法から選ばれる方法によるものである、請求項1〜6の何れかに記載の方法。
- 下記一般式(1)で示される標識物質で標識されたヌクレオチド残基と下記一般式(2)で示される標識物質で標識されたヌクレオチド残基とを含んでなる、請求項1〜7の何れかに記載の方法のためのキット。
〔式中、R1〜R4およびR8〜R11はそれぞれ独立して水素原子または−SO3R15(式中、R15は水素原子、アルカリ金属原子、有機アンモニウムイオンまたはアンモニウムイオンを表す。)を表し、R5およびR12はそれぞれ独立してアルキル基またはスルホアルキル基を表し、R6、R7およびR14はそれぞれ独立してアルキル基を表し、R13はカルボキシアルキル基を表す。〕
〔式中、R21〜R24およびR28〜R31はそれぞれ独立して水素原子または−SO3R35(式中、R35は水素原子、アルカリ金属原子、有機アンモニウムイオンまたはアンモニウムイオンを表す。)を表し、R25およびR32はそれぞれ独立してアルキル基またはスルホアルキル基を表し、R26、R27およびR34はそれぞれ独立してアルキル基を表し、R33はカルボキシアルキル基を表す。〕 - 前記一般式(1)で示される標識物質で標識されたヌクレオチド残基が下記一般式(3)で示されるヌクレオチド残基であり、前記一般式(2)で示される標識物質で標識されたヌクレオチド残基が下記一般式(4)で示されるヌクレオチド残基である、請求項8に記載のキット。
〔式中、Q1はヌクレオチド残基を表し、V1はリンカーを表し、W1は下記一般式(1')を表す。
(式中、Z1はV1と結合する結合手を、R13'はアルキル基を表し、R1〜R12およびR14は前記と同じ。)〕、
〔式中、Q2はヌクレオチド残基を表し、V2はリンカーを表し、W2は下記一般式(2')を表す。
(式中、Z2はV2と結合する結合手を、R33'はアルキル基を表し、R21〜R32およびR34は前記と同じ。)〕。 - 前記一般式(3)で示されるヌクレオチド残基が下記一般式(3')で示されるヌクレオチド残基であり、前記一般式(4)で示されるヌクレオチド残基が一般式(4')で示されるヌクレオチド残基である、請求項9に記載のキット。
(式中、E1は−CH=CH−または−C≡C−を表し、X1は炭素数1〜6のアルキレン基(直鎖・分枝・環状)を表し、Y1は炭素数2〜8のアルキレン基(直鎖・分枝・環状)を表し、T1は−O−または−NH−CO−を表し、Q1およびW1は前記と同じ。)
(式中、E2は−CH=CH−または−C≡C−を表し、X2は炭素数1〜6のアルキレン基(直鎖・分枝・環状)を表し、Y2は炭素数2〜8のアルキレン基(直鎖・分枝・環状)を表し、T2は−O−または−NH−CO−を表し、Q2およびW2は前記と同じ。) - 更に、ランダムプライマー法用のプライマー、dATP、dGTP、dCTP、dTTP又は/及びdUTP、およびクレノウ フラグメントから選ばれる少なくとも1種を含む、請求項8〜10の何れかに記載のキット。
- 更に、請求項1〜7の何れかに記載の方法での使用のための説明書を含む、請求項8〜11の何れかに記載のキット。
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