JP6636247B2 - WT1mRNAの発現量定量方法 - Google Patents
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-
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Description
(I-1)ヒトWT1 mRNAの発現量を1ステップRT-PCR法を用いて定量する方法であって、ヒトWT1 mRNAおよびハウスキーピング遺伝子(mRNA)の逆転写反応および伸長反応を、同時かつ、同一容器内で連続して進行させることを特徴とする、ヒトWT1 mRNAの発現量の定量方法。
(I-2)ハウスキーピング遺伝子がGAPDH mRNAである(I-1)に記載する方法。
(I-3)ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、
(a)配列番号3に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
(b)配列番号9に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット
を用いる(I-1)または(I-2)に記載する方法。
(I-4)ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、
(a’)配列番号3に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号5に示す塩基配列からなるプローブ、または
(b’)配列番号9に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号11に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる(I-1)または(I-2)に記載する方法。
(I-5)ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、さらに
(c)配列番号6に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号7若しくは12に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット
を用いる(I-3)または(I-4)に記載する方法。
(I-6)ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、さらに
(c’)配列番号6に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号7若しくは12に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号8に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる(I-3)または(I-4)に記載する方法。
(II-1)(a)配列番号3に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号4 に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
(b)配列番号9に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、
を含むヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
(II-2)(a’)配列番号3に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号5に示す塩基配列からなるプローブ、または
(b’)配列番号9に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号11に示す塩基配列からなるプローブ、
を含むヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
(II-3)さらに(c)配列番号6に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号7若しくは12に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセットを含む、
(II-1)または(II-2)に記載するヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
(II-4)さらに(c’)配列番号6に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号7若しくは12に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号8に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる、(II-1)または(II-2)に記載するヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット。
本発明の方法は、ヒトWT1 mRNAの発現量を1ステップRT-PCR法を用いて定量する方法である。
本発明のRT-PCR用試薬キットは、ヒトWT1 mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットと、ハウスキーピング遺伝子、好ましくはGAPDH mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットの両方を包含することを特徴とする。また当該キットには、RT-PCR法で増幅されたヒトWT1 mRNAの増幅産物、及びハウスキーピング遺伝子の増幅産物を検出するために使用されるプローブを含めることができる。
(1)プライマーとプローブの設計
測定対象の目的遺伝子としてヒトWT1 mRNA,測定対象の発現量を補正する内在性コントロール遺伝子(補正用遺伝子)としてGAPDH mRNAを選択し、それぞれの遺伝子に対して特異的増幅と検出を可能とするプライマーセット及びプローブを設計し、合成した。
標準品は、WT1 mRNAおよびGAPDH mRNAを発現している白血病細胞株K562よりRNAを抽出し、このRNAを鋳型として、 WT1 mRNAおよびGAPDH mRNAの塩基配列にそれぞれ相補的なプライマーを用いて、RT-PCRを行い、WT1 mRNAおよびGAPDH mRNAの一部の塩基配列を得た。得られたWT1 mRNA配列およびGAPDH mRNA配列をpT7blueプラスミドベクターにクローニングし、大腸菌DH5α株を形質転換した。次いでこの形質転換大腸菌を培養し、プラスミドDNAを抽出した。プラスミドDNA中、WT1 mRNA配列およびGAPDH mRNA配列が挿入されている部分より後ろにある配列を、制限酵素EcoRIを用いて切断し、直鎖状のDNAとした。プラスミドDNAに含まれるT7プロモーター配列を認識し、DNAを鋳型としてRNAを合成する酵素であるT7 RNAポリメラーゼを用いて、WT1 mRNA及びGAPDH mRNAのRNA配列を合成した。合成したRNAを、反応容器への非特異的な吸着を防ぐために50 ng/μLの大腸菌トランスファーRNAを含むTE バッファーで希釈し、それぞれの遺伝子(WT1およびGAPDH)のRNA標準品を調製した。
RT-PCR反応は、逆転写反応とPCR反応を一つのチューブ内で連続して行う1ステップRT-PCR法を行った。
Z05 DNA polymerase(Thermostable enzyme from Thermus species Z05:Roche Diagnostics社)を使用した。
(a)逆転写反応とPCR反応
55℃で5分間、60℃で5分間、65℃で5分間の計15分間かけて逆転写反応を行った後、92℃で15秒間の熱変性、60℃で40秒間のアニーリング、及びDNA伸長反応からなるPCR反応を45サイクロ繰り返した。
反応液の容量を20μLとし、その中のPrimer濃度は、Forward primer、及びReverse primerそれぞれ終濃度を0.2μMとした。Probe濃度は終濃度を0.1μMとした。
RT-PCR法は、Applied Biosystems 7500 Fast Realtime PCR system(ライフテクノロジーズ社)を用いて行った。
(4−1)蛍光増幅曲線の確認
(a)WT1 RNA標準品をWT1 mRNAを単独で増幅を行った場合、(b)GAPDH RNA標準品をGAPDH mRNAを単独で増幅を行った場合、及び(c)WT1 RNA標準品及びGAPDH RNA標準品のそれぞれについてWT1 mRNA及びGAPDH mRNAを同時に増幅を行った場合の、蛍光増幅曲線と増幅サイクル数を確認した。
本実施例では、WT1 mRNAとGAPDH mRNAを同時に増幅する、1ステップかつマルチプレックスなRT-PCR法と、逆転写反応とPCRを別の容器でそれぞれ行い、WT1 mRNAとGAPDH mRNAを別個に増幅する2ステップRT-PCR法とで、測定感度を比較した。なお、2ステップRT-PCR法は、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」(大塚製薬株式会社)を使用して行った。
1ステップRT-PCR法によるWT1 mRNA測定及びGAPDH mRNA測定に使用したプライマー及びプローブの配列を表6に示す。なお2ステップ RT-PCR法は、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」を使用したため、プライマー及びプローブは不明である。
標準品(WT1 mRNA、GAPDH mRNA)として、1ステップ RT-PCR法では、実施例1に記載した方法と同様の方法で調製したRNA標準品を用いた。WT1 RNA標準品の濃度を2.5×101,2.5×103,2.5×105,2.5×107copies/test,GAPDH RNA標準品の濃度を1.0×103,1.0×105,1.0×107,1.0×109copies/testとした。2ステップ RT-PCR法では、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」に備え付けられた標準品を使用した。
被験試料として、WT1陽性白血病細胞株K562より抽出したRNAを用いた。具体的には、K562より抽出したTotal RNAを、チューブへの非特異的な核酸の吸着を防ぐためにキャリアRNAとして大腸菌トランスファーRNAを終濃度50ng/μLとなるようにあらかじめ添加したTE bufferを用いて、最終濃度が2、5、10 pg/μLになるように希釈して、これを被験試料とした。
1ステップRT-PCR反応は、実施例1と同様の方法で行った。2ステップRT-PCRは、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」(大塚製薬株式会社)を用いてその添付文書に従って行った。測定は各被験試料について2重測定で行った。測定結果はWT1 mRNA測定キット「オーツカ」の添付文書に従い、Total RNA 1μg当たりのWT1 mRNA数であるcopy/μgRNAとして算出した。
(5−1)K562抽出RNAによる希釈測定結果
表7にK562抽出RNAを被験試料として、1ステップRT-PCR法及び2ステップRT-PCR法を用いて実施した希釈試験の結果を示す。
本実施例では、WT1 mRNAとGAPDH mRNAを同時に増幅する1ステップRT-PCRを、プライマーおよびプローブとして、表8に示すセット(配列セットB)、及び表9に示すセットをそれぞれ用いて実施し、交差反応性を評価した。
<アガロースゲル電気泳動条件>
泳動条件:15min、4%E-gal、
Photo条件:SYBR用filter、
E-gal装置より直接photo、
シャッタースピード:1/15、
しぼり:4.5
Apply条件:Sample 2.5μL+dH2O 16.5μL
Marker 2.5μL+dH2O 16.5μL
[結果]
Human Genomic DNAにはGAPDHの遺伝子は存在しないものの、GAPDHの偽遺伝子が存在することが知られている。本実施例では、表8に示したプライマーおよびプローブ配列を用いて1ステップRT-PCRを実施すると、図5(A)のレーン1〜3に示すように、Human Genome DNAにおいて電気泳動でGAPDHと一致するバンドは認められなかった。すなわち、本発明のプライマーおよびプローブを用いた1ステップRT-PCRによれば、GAPDHとGAPDHの偽遺伝子とが明確に識別でき、GAPDHの偽遺伝子をGAPDHと誤認することがないことが確認できた。一方、表9に示したプライマーおよびプローブ配列を用いて1ステップRT-PCRを実施すると、図5(B)のレーン1〜3に示すように、電気泳動でGAPDHと一致するバンドが認められた。すなわち、当該プライマーおよびプローブを用いた1ステップRT-PCRではGAPDHとGAPDHの偽遺伝子とを区別することができなかった。
Claims (4)
- 被験試料におけるヒトWT1 mRNAの発現量を1ステップRT-PCR法を用いて定量する方法であって、
ハウスキーピング遺伝子(mRNA)としてGAPDH mRNAを用い、
ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、下記(b)及び(c−2)を用いて、ヒトWT1 mRNAおよびハウスキーピング遺伝子(mRNA)の逆転写反応および伸長反応を、当該被験試料において同時かつ同一容器内で連続して進行させることを特徴とする、ヒトWT1 mRNAの発現量の定量方法:
(b)配列番号9に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、
(c−2)配列番号6に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号12に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット。 - 被験試料におけるヒトWT1 mRNAの発現量を1ステップRT-PCR法を用いて定量する方法であって、
ハウスキーピング遺伝子(mRNA)としてGAPDH mRNAを用い、
ヒトWT1 mRNAのPCR増幅に、下記(b’)及び(c’−2)を用いて、ヒトWT1 mRNAおよびハウスキーピング遺伝子(mRNA)の逆転写反応および伸長反応を、当該被験試料において同時かつ同一容器内で連続して進行させることを特徴とする、ヒトWT1 mRNAの発現量の定量方法:
(b’)配列番号9に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号11に示す塩基配列からなるプローブ、
(c’−2)配列番号6に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号12に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号8に示す塩基配列からなるプローブ。 - 下記(b)及び(c−2)を含む、ヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット:
(b)配列番号9に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、
(c−2)配列番号6に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号12に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット。 - 下記(b’)及び(c’−2)を含む、ヒトWT1 mRNAの発現量を定量するためのリアルタイムPCR用キット:
(b’)配列番号9に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号11に示す塩基配列からなるプローブ、
(c’−2)配列番号6に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号12に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号8に示す塩基配列からなるプローブ。
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