JPH1189596A - Ｒｎａ量の測定方法並びに測定キット - Google Patents
Ｒｎａ量の測定方法並びに測定キットInfo
- Publication number
- JPH1189596A JPH1189596A JP9271993A JP27199397A JPH1189596A JP H1189596 A JPH1189596 A JP H1189596A JP 9271993 A JP9271993 A JP 9271993A JP 27199397 A JP27199397 A JP 27199397A JP H1189596 A JPH1189596 A JP H1189596A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- mrna
- sequence
- nucleic acid
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 簡便で操作性、再現性に優れ、かつ高感度
な、ＰＣＲ法を利用したＲＮＡの定量手段を提供する。 【解決手段】 ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの合成、並び
に該ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを用いてＲＮＡ量を測
定するとき、当該ｃＤＮＡの合成、並びにＰＣＲを、Ｒ
ＮＡ又はｃＤＮＡ競合物の存在下に一つの反応容器中で
連続して行うＲＮＡ量の測定方法。逆転写活性を有する
酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボ
ヌクレオチド三リン酸、少なくとも１対のプライマー
対、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ競合物、リボヌクレアーゼ阻害
剤を含有する、上記ＲＮＡ量の測定方法に使用される反
応液。該反応液を含有するＲＮＡ量の測定キット。
な、ＰＣＲ法を利用したＲＮＡの定量手段を提供する。 【解決手段】 ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの合成、並び
に該ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを用いてＲＮＡ量を測
定するとき、当該ｃＤＮＡの合成、並びにＰＣＲを、Ｒ
ＮＡ又はｃＤＮＡ競合物の存在下に一つの反応容器中で
連続して行うＲＮＡ量の測定方法。逆転写活性を有する
酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボ
ヌクレオチド三リン酸、少なくとも１対のプライマー
対、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ競合物、リボヌクレアーゼ阻害
剤を含有する、上記ＲＮＡ量の測定方法に使用される反
応液。該反応液を含有するＲＮＡ量の測定キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体由来試料中に
存在する微量のＲＮＡの定量を迅速、簡便、高感度に、
かつコンタミネーションの危険なく行うための方法、並
びに該方法に使用する試薬キットに関する。
存在する微量のＲＮＡの定量を迅速、簡便、高感度に、
かつコンタミネーションの危険なく行うための方法、並
びに該方法に使用する試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】今日、遺伝子増幅法は微量な核酸を検出
するための必須の技術として広範な分野で用いられてお
り、特に臨床診断の分野で著しい。そのような遺伝子増
幅法の代表例はポリメラーゼ・チェーン・リアクション
（ＰＣＲ）法として広く知られている。現在、その利用
分野はＲＮＡ、特にｍＲＮＡの定量においても活発に利
用されるようになってきた。ＲＮＡの定量に通常使用さ
れる競合ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＮＡ競合物の共存下でＲ
ＮＡに逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを作製する反
応、更に目的遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣ
ＲによってｃＤＮＡを増幅する反応、という２工程を経
て行われている。また、この変法として、ＲＮＡに逆転
写酵素を作用させてｃＤＮＡを作製する反応、更にこの
ｃＤＮＡにｃＤＮＡ競合物を添加してのＰＣＲ、という
２工程からなるものがある。更に、高感度な検出を目的
として、上記方法のＰＣＲの工程を２回行う、いわゆる
ネステッドＰＣＲ法という方法も取入れられてきた。し
かし、これらの古典的なＲＮＡ定量法には、いくつかの
問題があった。例えば、上記の各工程ごとに反応液を移
し変えなければならず、この操作は反応液の調製も含め
て繁雑でかつ時間を要し、クロスコンタミネーションを
引起こす原因となっていた。特にＰＣＲ工程にネステッ
ドＰＣＲ法を用いた場合には全体として３工程となり、
ますます上記問題は顕著になる。ＰＣＲ法が広く応用さ
れる今日に至ってもこれらの問題を解決する技術は発表
されていない。なお、ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、並び
にＰＣＲ反応を１つの反応容器で行う方法は既にバイオ
テクニクス（BioTechniques ）、第18巻、第678 〜687
頁（1995）に報告されているが、これは競合ＲＴ−ＰＣ
Ｒではなく、ＲＮＡの定量を可能にしたものではなかっ
た。
するための必須の技術として広範な分野で用いられてお
り、特に臨床診断の分野で著しい。そのような遺伝子増
幅法の代表例はポリメラーゼ・チェーン・リアクション
（ＰＣＲ）法として広く知られている。現在、その利用
分野はＲＮＡ、特にｍＲＮＡの定量においても活発に利
用されるようになってきた。ＲＮＡの定量に通常使用さ
れる競合ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＮＡ競合物の共存下でＲ
ＮＡに逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを作製する反
応、更に目的遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣ
ＲによってｃＤＮＡを増幅する反応、という２工程を経
て行われている。また、この変法として、ＲＮＡに逆転
写酵素を作用させてｃＤＮＡを作製する反応、更にこの
ｃＤＮＡにｃＤＮＡ競合物を添加してのＰＣＲ、という
２工程からなるものがある。更に、高感度な検出を目的
として、上記方法のＰＣＲの工程を２回行う、いわゆる
ネステッドＰＣＲ法という方法も取入れられてきた。し
かし、これらの古典的なＲＮＡ定量法には、いくつかの
問題があった。例えば、上記の各工程ごとに反応液を移
し変えなければならず、この操作は反応液の調製も含め
て繁雑でかつ時間を要し、クロスコンタミネーションを
引起こす原因となっていた。特にＰＣＲ工程にネステッ
ドＰＣＲ法を用いた場合には全体として３工程となり、
ますます上記問題は顕著になる。ＰＣＲ法が広く応用さ
れる今日に至ってもこれらの問題を解決する技術は発表
されていない。なお、ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、並び
にＰＣＲ反応を１つの反応容器で行う方法は既にバイオ
テクニクス（BioTechniques ）、第18巻、第678 〜687
頁（1995）に報告されているが、これは競合ＲＴ−ＰＣ
Ｒではなく、ＲＮＡの定量を可能にしたものではなかっ
た。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＰＣ
Ｒ法を利用したＲＮＡの定量法に関する上記の問題点を
克服し、簡便で操作性、再現性に優れ、かつ高感度なＲ
ＮＡの定量手段を提供することにある。
Ｒ法を利用したＲＮＡの定量法に関する上記の問題点を
克服し、簡便で操作性、再現性に優れ、かつ高感度なＲ
ＮＡの定量手段を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はＲＮＡ量の測定方法に関し、ＲＮＡ
に相補的なｃＤＮＡの合成、並びに該ｃＤＮＡを鋳型と
したＰＣＲを用いてＲＮＡ量を測定する方法において、
当該ｃＤＮＡの合成、並びにＰＣＲを、ＲＮＡ又はｃＤ
ＮＡ競合物の存在下に一つの反応容器中で連続して行う
ことを特徴とする。本発明の第２の発明は第１の発明の
ＲＮＡ測定方法に使用される反応液に関し、逆転写活性
を有する酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオ
キシリボヌクレオチド三リン酸、少なくとも１対のプラ
イマー対、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ競合物、リボヌクレアー
ゼ阻害剤を含有することを特徴とする。更に、本発明の
第３の発明はＲＮＡ量の測定キットに関し、第２の発明
の反応液、又は該反応液が分注された反応容器を含有す
ることを特徴とする。
発明の第１の発明はＲＮＡ量の測定方法に関し、ＲＮＡ
に相補的なｃＤＮＡの合成、並びに該ｃＤＮＡを鋳型と
したＰＣＲを用いてＲＮＡ量を測定する方法において、
当該ｃＤＮＡの合成、並びにＰＣＲを、ＲＮＡ又はｃＤ
ＮＡ競合物の存在下に一つの反応容器中で連続して行う
ことを特徴とする。本発明の第２の発明は第１の発明の
ＲＮＡ測定方法に使用される反応液に関し、逆転写活性
を有する酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオ
キシリボヌクレオチド三リン酸、少なくとも１対のプラ
イマー対、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ競合物、リボヌクレアー
ゼ阻害剤を含有することを特徴とする。更に、本発明の
第３の発明はＲＮＡ量の測定キットに関し、第２の発明
の反応液、又は該反応液が分注された反応容器を含有す
ることを特徴とする。
【０００５】本発明者らは鋭意研究を重ね、驚くべきこ
とにある条件下ではこれらの複数の分断された工程を連
続した１工程で、しかも１つの反応容器の中で実施可能
であることを発見し、上記問題点を解決し、高感度、迅
速、簡便にクロスコンタミネーションの危険性なく行
う、連続競合ＲＴ−ＰＣＲ（ＣＣＲＰ）法、並びに該方
法に使用する試薬キットを開発し、本発明を完成するに
至った。
とにある条件下ではこれらの複数の分断された工程を連
続した１工程で、しかも１つの反応容器の中で実施可能
であることを発見し、上記問題点を解決し、高感度、迅
速、簡便にクロスコンタミネーションの危険性なく行
う、連続競合ＲＴ−ＰＣＲ（ＣＣＲＰ）法、並びに該方
法に使用する試薬キットを開発し、本発明を完成するに
至った。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明の方法を適応することができる試料には特に
限定はないが、例えば細胞、組織、血液、喀痰、糞便、
尿のような生体試料、食品、土壌、排水のような生物を
含有する可能性のある試料から公知の方法で処理するこ
とで得られる全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子、例
えばｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。
ＲＮＡ試料は水溶液、あるいは適切な固相に吸着又は固
定化した状態で用いられる。全ＲＮＡ量としては反応液
１００μｌ当り０．０１ng〜１μｇが適している。
る。本発明の方法を適応することができる試料には特に
限定はないが、例えば細胞、組織、血液、喀痰、糞便、
尿のような生体試料、食品、土壌、排水のような生物を
含有する可能性のある試料から公知の方法で処理するこ
とで得られる全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子、例
えばｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。
ＲＮＡ試料は水溶液、あるいは適切な固相に吸着又は固
定化した状態で用いられる。全ＲＮＡ量としては反応液
１００μｌ当り０．０１ng〜１μｇが適している。
【０００７】本発明において連続競合ＲＴ−ＰＣＲ（Ｃ
ＣＲＰ）法に使用される反応用緩衝液としては、逆転写
活性を有する酵素、並びにＤＮＡポリメラーゼが活性を
示すのに適した水溶性緩衝液であればよく、例えばｐＨ
７〜１０のトリス緩衝液が挙げられ、好ましくはｐＨ８
〜９のものが良い。更にこの緩衝液の中には逆転写活性
を有する酵素並びにＤＮＡポリメラーゼの活性に必要な
種々のイオンを含む。中でもＮａ、Ｋイオンは塩の形で
５〜５０mMの濃度で添加される。Ｍｇイオンは塩の形で
１〜１０mMで添加される。その他、必要に応じて界面活
性剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン等、逆
転写活性を有する酵素並びにＤＮＡポリメラーゼの活性
を促進、安定化する薬剤が添加される。また、試料中の
ＲＮＡ及びＲＮＡ競合物の分解を抑制するためにリボヌ
クレアーゼ阻害剤が添加されていてもよい。
ＣＲＰ）法に使用される反応用緩衝液としては、逆転写
活性を有する酵素、並びにＤＮＡポリメラーゼが活性を
示すのに適した水溶性緩衝液であればよく、例えばｐＨ
７〜１０のトリス緩衝液が挙げられ、好ましくはｐＨ８
〜９のものが良い。更にこの緩衝液の中には逆転写活性
を有する酵素並びにＤＮＡポリメラーゼの活性に必要な
種々のイオンを含む。中でもＮａ、Ｋイオンは塩の形で
５〜５０mMの濃度で添加される。Ｍｇイオンは塩の形で
１〜１０mMで添加される。その他、必要に応じて界面活
性剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン等、逆
転写活性を有する酵素並びにＤＮＡポリメラーゼの活性
を促進、安定化する薬剤が添加される。また、試料中の
ＲＮＡ及びＲＮＡ競合物の分解を抑制するためにリボヌ
クレアーゼ阻害剤が添加されていてもよい。
【０００８】逆転写活性を有する酵素としてはトリ骨芽
球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ）、ラウス関連ウ
イルス由来逆転写酵素（ＲＡＶ２）、モロニー・ネズミ
白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ）、サーマス
・サーモフィルス（Thermusthermophilus）由来ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｔｔｈ）、バチルス・カルドテナクス
（Bacillus cardotenax ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ
ｃａ）、並びにそれらの誘導体が挙げられるが、中でも
ＡＭＶが最も本発明に適している。なお、これらの酵素
はその本来の起源より精製して取得されたもの、あるい
は遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質のいずれで
あってもよい。
球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ）、ラウス関連ウ
イルス由来逆転写酵素（ＲＡＶ２）、モロニー・ネズミ
白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ）、サーマス
・サーモフィルス（Thermusthermophilus）由来ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｔｔｈ）、バチルス・カルドテナクス
（Bacillus cardotenax ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ
ｃａ）、並びにそれらの誘導体が挙げられるが、中でも
ＡＭＶが最も本発明に適している。なお、これらの酵素
はその本来の起源より精製して取得されたもの、あるい
は遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質のいずれで
あってもよい。
【０００９】ＰＣＲ法に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼとしては、種々の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば
サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus ）由来
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、上記のＴｔｈ、ピロコ
ッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）由来ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、ピロコッカス・ボウゼイ
（Pyrococcus wosei）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗ
ｏ）、ピロコッカス ＫＯＤ１株（Pyrococcus sp. str
ain KOD1）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）、クレン
タックＤＮＡポリメラーゼ（ＫｌｅｎＴａｑ）等が使用
できる。これらの酵素はその本来の起源より精製して取
得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組換
え蛋白質のいずれであってもよく、またその活性を失わ
ない範囲で適当な修飾がなされた誘導体酵素であっても
よい。
ゼとしては、種々の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば
サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus ）由来
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、上記のＴｔｈ、ピロコ
ッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）由来ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、ピロコッカス・ボウゼイ
（Pyrococcus wosei）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗ
ｏ）、ピロコッカス ＫＯＤ１株（Pyrococcus sp. str
ain KOD1）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）、クレン
タックＤＮＡポリメラーゼ（ＫｌｅｎＴａｑ）等が使用
できる。これらの酵素はその本来の起源より精製して取
得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組換
え蛋白質のいずれであってもよく、またその活性を失わ
ない範囲で適当な修飾がなされた誘導体酵素であっても
よい。
【００１０】本発明では、好ましくは校正活性、すなわ
ち３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼと校正活性を持たない耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼとを混合して使用される。校正活性を有する
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＰｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋ
ＯＤ等が挙げられるが、中でもＰｆｕが最も適してい
る。校正活性を持たない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとし
てはＴａｑ、ＫｌｅｎＴａｑ等が挙げられるが、中でも
Ｔａｑが最も適している。これらの酵素を混合して使用
することにより、ＰＣＲの効率、例えば増幅効率を向上
させることができる。
ち３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼと校正活性を持たない耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼとを混合して使用される。校正活性を有する
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＰｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋ
ＯＤ等が挙げられるが、中でもＰｆｕが最も適してい
る。校正活性を持たない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとし
てはＴａｑ、ＫｌｅｎＴａｑ等が挙げられるが、中でも
Ｔａｑが最も適している。これらの酵素を混合して使用
することにより、ＰＣＲの効率、例えば増幅効率を向上
させることができる。
【００１１】本発明のＲＮＡの定量方法では逆転写活性
を有する酵素と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの両方を含む
反応液が使用される。逆転写活性を有する酵素は反応液
に十分量添加されなければならず、ＤＮＡポリメラーゼ
と同等又はより過剰である必要がある。具体的には１０
０μｌの反応系で５〜２００Ｕが適しており、特にＡＭ
Ｖでは５〜５０Ｕが適している。また、ＤＮＡポリメラ
ーゼとの比率は１：１〜５：１、さらに好ましくは２：
１〜４：１が適している。また、本発明では逆転写活性
を有する酵素、校正活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ、校正活性を有しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの
３種を含む反応液も使用される。逆転写活性を有する酵
素としてＡＭＶ、校正活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
としてＰｆｕ、校正活性を有しないＤＮＡポリメラーゼ
としてＴａｑをそれぞれ使用する場合、特に限定するも
のではないが、各々の活性比率としてＡＭＶ、Ｐｆｕ、
Ｔａｑを２４：１：６の割合で含む反応液が特に本発明
に好適である。
を有する酵素と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの両方を含む
反応液が使用される。逆転写活性を有する酵素は反応液
に十分量添加されなければならず、ＤＮＡポリメラーゼ
と同等又はより過剰である必要がある。具体的には１０
０μｌの反応系で５〜２００Ｕが適しており、特にＡＭ
Ｖでは５〜５０Ｕが適している。また、ＤＮＡポリメラ
ーゼとの比率は１：１〜５：１、さらに好ましくは２：
１〜４：１が適している。また、本発明では逆転写活性
を有する酵素、校正活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ、校正活性を有しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの
３種を含む反応液も使用される。逆転写活性を有する酵
素としてＡＭＶ、校正活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
としてＰｆｕ、校正活性を有しないＤＮＡポリメラーゼ
としてＴａｑをそれぞれ使用する場合、特に限定するも
のではないが、各々の活性比率としてＡＭＶ、Ｐｆｕ、
Ｔａｑを２４：１：６の割合で含む反応液が特に本発明
に好適である。
【００１２】反応液にはｃＤＮＡ合成並びにＰＣＲにお
いて基質となる４種のデオキシヌクレオチド三リン酸
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；本明細書
ではこの４種を総称してｄＮＴＰと記載する）が添加さ
れる。また、ｄＮＴＰはそのすべて、又は一部が、プラ
イマーから合成されるＤＮＡ鎖の伸長を可能とする範囲
で修飾及び／又は標識されたｄＮＴＰに置き換えること
もできる。
いて基質となる４種のデオキシヌクレオチド三リン酸
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；本明細書
ではこの４種を総称してｄＮＴＰと記載する）が添加さ
れる。また、ｄＮＴＰはそのすべて、又は一部が、プラ
イマーから合成されるＤＮＡ鎖の伸長を可能とする範囲
で修飾及び／又は標識されたｄＮＴＰに置き換えること
もできる。
【００１３】本発明において標的ＲＮＡからのｃＤＮＡ
合成に用いられるプライマーとしては、例えば標的ＲＮ
Ａに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがあ
り、使用される反応条件において標的ＲＮＡに対してア
ニールするものであれば特に限定されるものではない。
長さは、６〜１００ヌクレオチド、好ましくは１０〜３
０ヌクレオチドの長さのものが使用される。また修飾及
び／又は標識されたプライマーも使用できる。該プライ
マーは、例えば公知方法により化学的に合成することが
できる。また、ＰＣＲにおいて使用されるプライマー
も、標的ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを鋳型としたＤＮＡの増
幅が可能であれば特に限定はない。上記の標的ＲＮＡか
らのｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーをＤＮＡの増
幅反応に使用しても差支えない。
合成に用いられるプライマーとしては、例えば標的ＲＮ
Ａに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがあ
り、使用される反応条件において標的ＲＮＡに対してア
ニールするものであれば特に限定されるものではない。
長さは、６〜１００ヌクレオチド、好ましくは１０〜３
０ヌクレオチドの長さのものが使用される。また修飾及
び／又は標識されたプライマーも使用できる。該プライ
マーは、例えば公知方法により化学的に合成することが
できる。また、ＰＣＲにおいて使用されるプライマー
も、標的ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを鋳型としたＤＮＡの増
幅が可能であれば特に限定はない。上記の標的ＲＮＡか
らのｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーをＤＮＡの増
幅反応に使用しても差支えない。
【００１４】本発明において使用されるＲＮＡ競合物並
びにｃＤＮＡ競合物は公知の方法で作製することができ
る。例えば、プロシーディングズ オブ ザ ナショナ
ルアカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳ
Ａ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第87巻、第2725〜
2729頁（1990）、クリニカル ケミストリー（Clin. Ch
em. ）、第41巻、第819 〜825 頁（1995）、ブラッド
（Blood ）、第82巻、第1929〜1936頁（1993）等に記載
の方法がある。これら競合物は標的ＲＮＡ由来の塩基配
列を有していてもよく、またこれとは全く関係ない塩基
配列、例えばγ−グロビン遺伝子の塩基配列から作製さ
れてもよい。また、競合物はその増幅産物が標的ＲＮＡ
由来のものと区別できるよう、標的ＲＮＡとは異なる鎖
長の増幅産物を与えるように設計すべきである。両者の
差は適切な分析方法、分析機器によって明確に区別でき
るものであればよく、通常の電気泳動法では１０〜２０
０bpの差が用いられる。好ましくは競合物由来の増幅産
物の鎖長が標的ＲＮＡ由来のものの７５〜１２５％の範
囲であればよい。
びにｃＤＮＡ競合物は公知の方法で作製することができ
る。例えば、プロシーディングズ オブ ザ ナショナ
ルアカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳ
Ａ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第87巻、第2725〜
2729頁（1990）、クリニカル ケミストリー（Clin. Ch
em. ）、第41巻、第819 〜825 頁（1995）、ブラッド
（Blood ）、第82巻、第1929〜1936頁（1993）等に記載
の方法がある。これら競合物は標的ＲＮＡ由来の塩基配
列を有していてもよく、またこれとは全く関係ない塩基
配列、例えばγ−グロビン遺伝子の塩基配列から作製さ
れてもよい。また、競合物はその増幅産物が標的ＲＮＡ
由来のものと区別できるよう、標的ＲＮＡとは異なる鎖
長の増幅産物を与えるように設計すべきである。両者の
差は適切な分析方法、分析機器によって明確に区別でき
るものであればよく、通常の電気泳動法では１０〜２０
０bpの差が用いられる。好ましくは競合物由来の増幅産
物の鎖長が標的ＲＮＡ由来のものの７５〜１２５％の範
囲であればよい。
【００１５】上記の競合物はその既知量を試料と共に反
応液中に添加し、逆転写反応、ＰＣＲを実施して使用さ
れる。この際、通常は試料あるいは競合物を数段階に希
釈して使用し、できるだけこの両者からの増幅産物量が
近い反応を観察できるようにする。反応終了後、反応液
中に生成した標的ＲＮＡ並びに競合物由来の増幅産物量
を比較し、競合物由来増幅産物に対する標的ＲＮＡ由来
増幅産物の割合と添加された競合物の量とを基に試料中
の標的ＲＮＡ量を知ることができる。例えば両増幅産物
の量比が１：１である場合には標的ＲＮＡの量は添加さ
れた競合物の量に等しい。増幅産物量は、例えば通常の
電気泳動法によって測定することができる。例えばアガ
ロースゲル電気泳動によって増幅産物量を測定する場合
には、泳動後のゲルを適当な核酸染色試薬、例えばエチ
ジウムブロマイド等で染色した後にゲルの写真を撮る
か、又は適当な画像解析装置を使用して泳動結果を解析
すればよい。
応液中に添加し、逆転写反応、ＰＣＲを実施して使用さ
れる。この際、通常は試料あるいは競合物を数段階に希
釈して使用し、できるだけこの両者からの増幅産物量が
近い反応を観察できるようにする。反応終了後、反応液
中に生成した標的ＲＮＡ並びに競合物由来の増幅産物量
を比較し、競合物由来増幅産物に対する標的ＲＮＡ由来
増幅産物の割合と添加された競合物の量とを基に試料中
の標的ＲＮＡ量を知ることができる。例えば両増幅産物
の量比が１：１である場合には標的ＲＮＡの量は添加さ
れた競合物の量に等しい。増幅産物量は、例えば通常の
電気泳動法によって測定することができる。例えばアガ
ロースゲル電気泳動によって増幅産物量を測定する場合
には、泳動後のゲルを適当な核酸染色試薬、例えばエチ
ジウムブロマイド等で染色した後にゲルの写真を撮る
か、又は適当な画像解析装置を使用して泳動結果を解析
すればよい。
【００１６】以下、本発明による競合連続ＲＴ−ＰＣＲ
（ＣＣＲＰ）の反応条件を以下に示す。反応容器内にｄ
ＮＴＰ、Ｍｇ塩、リボヌクレアーゼ阻害剤、逆転写活性
を有する酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ又は
ｃＤＮＡ競合物、プライマー等を含む反応液を加え反応
開始までは４℃以下で保冷しておく。これに測定しよう
とする試料を添加し４５〜７０℃、好ましくは５０〜６
０℃で５〜３０分、好ましくは１０〜２０分反応させｃ
ＤＮＡ合成を行う。引続き９０〜９９℃で１〜２分保温
し、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を変性させる。更に９０〜
９９℃の変性反応、４５〜６５℃のアニーリング反応、
６０〜８０℃のＤＮＡ伸長反応からなる温度サイクル反
応を２〜５０サイクル行って標的ＲＮＡ由来のＤＮＡ断
片を増幅する。更に感度及び／又は特異性を向上するた
めにネステッドＰＣＲを行う場合には、１段階目、２段
階目のＰＣＲに使用するプライマーを共に最初から反応
容器内に添加しておき、２段階のＰＣＲを連続して行う
こともできる。この場合１段階目のＰＣＲ用プライマー
量は２段階目のＰＣＲ用プライマー量より少なくするこ
とが必要で、好ましくは１００倍以下の量が適してい
る。
（ＣＣＲＰ）の反応条件を以下に示す。反応容器内にｄ
ＮＴＰ、Ｍｇ塩、リボヌクレアーゼ阻害剤、逆転写活性
を有する酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ又は
ｃＤＮＡ競合物、プライマー等を含む反応液を加え反応
開始までは４℃以下で保冷しておく。これに測定しよう
とする試料を添加し４５〜７０℃、好ましくは５０〜６
０℃で５〜３０分、好ましくは１０〜２０分反応させｃ
ＤＮＡ合成を行う。引続き９０〜９９℃で１〜２分保温
し、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を変性させる。更に９０〜
９９℃の変性反応、４５〜６５℃のアニーリング反応、
６０〜８０℃のＤＮＡ伸長反応からなる温度サイクル反
応を２〜５０サイクル行って標的ＲＮＡ由来のＤＮＡ断
片を増幅する。更に感度及び／又は特異性を向上するた
めにネステッドＰＣＲを行う場合には、１段階目、２段
階目のＰＣＲに使用するプライマーを共に最初から反応
容器内に添加しておき、２段階のＰＣＲを連続して行う
こともできる。この場合１段階目のＰＣＲ用プライマー
量は２段階目のＰＣＲ用プライマー量より少なくするこ
とが必要で、好ましくは１００倍以下の量が適してい
る。
【００１７】本発明の方法によりその量を測定される標
的ＲＮＡには何ら制限はなく、適当なプライマーを作製
可能な任意のＲＮＡ、すなわちその塩基配列若しくはそ
のｃＤＮＡの塩基配列、あるいはこれらの一部が既知で
あるＲＮＡの定量を行うことができる。ｍＲＮＡを標的
とした場合には、用いた試料中での該ｍＲＮＡにコード
されるタンパクの発現量を知ることができる。また、例
えば該タンパクの発現量の変動が特定の疾病への罹患を
示唆するものであった場合には、本発明の方法をその診
断に利用することもできる。また、本発明の方法によ
り、ウイルスの測定を行うことができる。対象となるウ
イルスには特に限定はなく、例えばＤＮＡウイルスの場
合にはゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡを、また、Ｒ
ＮＡウイルスの場合にはゲノムＲＮＡ自体を標的として
試料中に存在するウイルスの量を知ることができる。例
えばヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）などが検出対象として挙げられる。
的ＲＮＡには何ら制限はなく、適当なプライマーを作製
可能な任意のＲＮＡ、すなわちその塩基配列若しくはそ
のｃＤＮＡの塩基配列、あるいはこれらの一部が既知で
あるＲＮＡの定量を行うことができる。ｍＲＮＡを標的
とした場合には、用いた試料中での該ｍＲＮＡにコード
されるタンパクの発現量を知ることができる。また、例
えば該タンパクの発現量の変動が特定の疾病への罹患を
示唆するものであった場合には、本発明の方法をその診
断に利用することもできる。また、本発明の方法によ
り、ウイルスの測定を行うことができる。対象となるウ
イルスには特に限定はなく、例えばＤＮＡウイルスの場
合にはゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡを、また、Ｒ
ＮＡウイルスの場合にはゲノムＲＮＡ自体を標的として
試料中に存在するウイルスの量を知ることができる。例
えばヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）などが検出対象として挙げられる。
【００１８】本発明の方法によりその発現量を測定され
る標的ＲＮＡ、特にヒトのｍＲＮＡとしては、例えばＷ
Ｔ１ ｍＲＮＡ、β−アクチン ｍＲＮＡ、サイトケラ
チンｍＲＮＡ、Ｆｌｔ３ ｍＲＮＡ、ｂｃｒ／ａｂｌ
ｍＲＮＡ、ｐｍｌ／ｒａｒａ ｍＲＮＡ、ａｍｌ１／ｍ
ｔｇ８ ｍＲＮＡ、ｅ２ａ／ｐｂｘ１ ｍＲＮＡ等が挙
げられる。これらのｍＲＮＡの塩基配列に関する情報
は、それぞれ下記の報文に記載されている。ＷＴ１：プ
ロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー
オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第88巻、
第9618〜9622頁（1991）。β−アクチン：ヌクレイック
アシッズ リサーチ（Nucl. Acids Res.）、第12巻、
第1687〜1696頁（1984）。サイトケラチン１９：ヌクレ
イックアシッズ リサーチ、第15巻、第10058 頁（198
7）。サイトケラチン２０：ディフェレンティエーショ
ン（Differentiation ）、第53巻、第95〜104 頁（199
3）。Ｆｌｔ３：ブラッド、第82巻、第1110〜1119頁（1
993）。ｂｃｒ／ａｂｌ（ＡＬＬ型）：プロシーディン
グズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第83巻、第9768〜9772
頁（1986）。ｂｃｒ／ａｂｌ（ＣＭＬ型）：モレキュラ
ー アンド セルラー バイオロジー（Mol. Cell. Bio
l.）、第６巻、第607 〜616 頁（1986）、セル（Cel
l）、第47巻、第277 〜284 頁（1986）。ｐｍｌ／ｒａ
ｒａ：セル、第66巻、第663 〜674 頁（1991）。ａｍｌ
１／ｍｔｇ８：ジ エンボ ジャーナル（The EMBO Jou
rnal）、第12巻、第2715〜2721頁（1993）。ｅ２ａ／ｐ
ｂｘ１：セル、第60巻、第535 〜545頁（1990）。
る標的ＲＮＡ、特にヒトのｍＲＮＡとしては、例えばＷ
Ｔ１ ｍＲＮＡ、β−アクチン ｍＲＮＡ、サイトケラ
チンｍＲＮＡ、Ｆｌｔ３ ｍＲＮＡ、ｂｃｒ／ａｂｌ
ｍＲＮＡ、ｐｍｌ／ｒａｒａ ｍＲＮＡ、ａｍｌ１／ｍ
ｔｇ８ ｍＲＮＡ、ｅ２ａ／ｐｂｘ１ ｍＲＮＡ等が挙
げられる。これらのｍＲＮＡの塩基配列に関する情報
は、それぞれ下記の報文に記載されている。ＷＴ１：プ
ロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー
オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第88巻、
第9618〜9622頁（1991）。β−アクチン：ヌクレイック
アシッズ リサーチ（Nucl. Acids Res.）、第12巻、
第1687〜1696頁（1984）。サイトケラチン１９：ヌクレ
イックアシッズ リサーチ、第15巻、第10058 頁（198
7）。サイトケラチン２０：ディフェレンティエーショ
ン（Differentiation ）、第53巻、第95〜104 頁（199
3）。Ｆｌｔ３：ブラッド、第82巻、第1110〜1119頁（1
993）。ｂｃｒ／ａｂｌ（ＡＬＬ型）：プロシーディン
グズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第83巻、第9768〜9772
頁（1986）。ｂｃｒ／ａｂｌ（ＣＭＬ型）：モレキュラ
ー アンド セルラー バイオロジー（Mol. Cell. Bio
l.）、第６巻、第607 〜616 頁（1986）、セル（Cel
l）、第47巻、第277 〜284 頁（1986）。ｐｍｌ／ｒａ
ｒａ：セル、第66巻、第663 〜674 頁（1991）。ａｍｌ
１／ｍｔｇ８：ジ エンボ ジャーナル（The EMBO Jou
rnal）、第12巻、第2715〜2721頁（1993）。ｅ２ａ／ｐ
ｂｘ１：セル、第60巻、第535 〜545頁（1990）。
【００１９】上記のような本発明の方法によるＲＮＡ量
の定量に使用される反応液、すなわち逆転写反応とＰＣ
Ｒの２つの酵素反応に必要な各種成分（ｄＮＴＰ、Ｍｇ
塩、ｐＨ調整のための緩衝成分等）、逆転写活性を有す
る酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、上記の２反応に使
用されるプライマー、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ競合物をすべ
て含有する反応液を作製することができる。更に酵素を
安定化するような成分やリボヌクレアーゼ阻害剤等が添
加されたものであってもよい。該反応液はその必要量を
適当な反応容器にとり、測定しようとする試料を添加す
るだけで反応を開始することができるため、ＲＮＡ量の
測定を非常に簡便に行うことができ、特に多数の試料を
扱う場合に有用である。また、あらかじめ該反応液の１
回分の必要量が分注された反応容器を準備しておくこと
により、更に操作効率を改善することができる。本発明
のキットは上記の方法に従ってＲＮＡの定量を簡便、迅
速に、かつクロスコンタミネーションの問題なく行える
キットである。該キットとしては、例えば上記方法に使
用する各種試薬を含有するキット、上記の本発明に使用
される反応液を含有するキット、該反応液の１回分が分
注された反応容器を含有するキット等が挙げられる。該
キットは特に種々の検査、中でも臨床診断用キットとし
て有用であり、白血病の検査、固型がんの微小転移の検
査、残存微小病変の検査、感染症の検査などに広く利用
できる。
の定量に使用される反応液、すなわち逆転写反応とＰＣ
Ｒの２つの酵素反応に必要な各種成分（ｄＮＴＰ、Ｍｇ
塩、ｐＨ調整のための緩衝成分等）、逆転写活性を有す
る酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、上記の２反応に使
用されるプライマー、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ競合物をすべ
て含有する反応液を作製することができる。更に酵素を
安定化するような成分やリボヌクレアーゼ阻害剤等が添
加されたものであってもよい。該反応液はその必要量を
適当な反応容器にとり、測定しようとする試料を添加す
るだけで反応を開始することができるため、ＲＮＡ量の
測定を非常に簡便に行うことができ、特に多数の試料を
扱う場合に有用である。また、あらかじめ該反応液の１
回分の必要量が分注された反応容器を準備しておくこと
により、更に操作効率を改善することができる。本発明
のキットは上記の方法に従ってＲＮＡの定量を簡便、迅
速に、かつクロスコンタミネーションの問題なく行える
キットである。該キットとしては、例えば上記方法に使
用する各種試薬を含有するキット、上記の本発明に使用
される反応液を含有するキット、該反応液の１回分が分
注された反応容器を含有するキット等が挙げられる。該
キットは特に種々の検査、中でも臨床診断用キットとし
て有用であり、白血病の検査、固型がんの微小転移の検
査、残存微小病変の検査、感染症の検査などに広く利用
できる。
【００２０】
【実施例】以下、本発明を実施例をもって更に具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。
【００２１】実施例１ ＷＴ１ ｍＲＮＡの定量測定 （１）ＲＮＡ競合物の作製 ヒト白血病細胞であるＫ−５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ−２４３）よりＴｒｉＺｏｌ試薬（ギブコＢＲＬ社
製）を用いて全ＲＮＡを調製した。次に、この全ＲＮＡ
を鋳型とし、ＲＮＡ ＰＣＲキット（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．
２．１（宝酒造社製）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって
ＷＴ１ ｃＤＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲにはＷＴ１
−Ｆ１、ＷＴ１−Ｒ１（配列表の配列番号１、２にそれ
ぞれプライマー ＷＴ１−Ｆ１、ＷＴ１−Ｒ１の塩基配
列を示す。）の２つのプライマーを使用した。これによ
って鎖長２８７bpのＷＴ１ ｃＤＮＡが得られた。上記
のＷＴ１ ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、その塩
基配列の一部を欠損した欠損ｃＤＮＡを作製した。な
お、ＰＣＲにはＰＣＲアンプリフィケーションキット
（宝酒造社製）、上記のプライマー ＷＴ１−Ｆ１及び
プライマー ＷＴ−Comp２（配列表の配列番号３にプラ
イマー ＷＴ−Comp２の塩基配列を示す）を使用した。
これによって鎖長２５３bpの欠損ＷＴ１ ｃＤＮＡが得
られた。次に、この欠損ＷＴ１ ｃＤＮＡを用いてＲＮ
Ａ競合物を作製した。まず、ｐＴ７BlueＴ ベクターキ
ット（ノバジェン社製）を使用したＴＡ−クローニング
法により、該欠損ｃＤＮＡのサブクローニングを行い、
プラスミドｐＴ７BlueＷＴ１Δ１を作製した。該プラス
ミドをＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロース
ゲル電気泳動を行い、Ｓｕｐｒｅｃ−０１（宝酒造社
製）を用いて３１４０bpの直鎖ＤＮＡ（７×１０11コピ
ー／μｌ）をゲルより回収した。得られた直鎖ＤＮＡは
ｃＤＮＡ競合物としてＷＴ１ ｍＲＮＡの定量に使用す
ることができる。更にこの直鎖ＤＮＡを鋳型とし、ラー
ジスケール Ｔ７トランスクリプションキット（ノバジ
ェン社製）を使用したイン・ビトロ転写反応を行い、Ｒ
ＮＡ競合物を作製した。得られたＲＮＡ競合物（ＷＴ１
ｃＲＮＡ）を２６０nmの吸光度により定量したところ、
その濃度は７×１０12コピー／μｌであった。
Ｌ−２４３）よりＴｒｉＺｏｌ試薬（ギブコＢＲＬ社
製）を用いて全ＲＮＡを調製した。次に、この全ＲＮＡ
を鋳型とし、ＲＮＡ ＰＣＲキット（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．
２．１（宝酒造社製）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって
ＷＴ１ ｃＤＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲにはＷＴ１
−Ｆ１、ＷＴ１−Ｒ１（配列表の配列番号１、２にそれ
ぞれプライマー ＷＴ１−Ｆ１、ＷＴ１−Ｒ１の塩基配
列を示す。）の２つのプライマーを使用した。これによ
って鎖長２８７bpのＷＴ１ ｃＤＮＡが得られた。上記
のＷＴ１ ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、その塩
基配列の一部を欠損した欠損ｃＤＮＡを作製した。な
お、ＰＣＲにはＰＣＲアンプリフィケーションキット
（宝酒造社製）、上記のプライマー ＷＴ１−Ｆ１及び
プライマー ＷＴ−Comp２（配列表の配列番号３にプラ
イマー ＷＴ−Comp２の塩基配列を示す）を使用した。
これによって鎖長２５３bpの欠損ＷＴ１ ｃＤＮＡが得
られた。次に、この欠損ＷＴ１ ｃＤＮＡを用いてＲＮ
Ａ競合物を作製した。まず、ｐＴ７BlueＴ ベクターキ
ット（ノバジェン社製）を使用したＴＡ−クローニング
法により、該欠損ｃＤＮＡのサブクローニングを行い、
プラスミドｐＴ７BlueＷＴ１Δ１を作製した。該プラス
ミドをＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロース
ゲル電気泳動を行い、Ｓｕｐｒｅｃ−０１（宝酒造社
製）を用いて３１４０bpの直鎖ＤＮＡ（７×１０11コピ
ー／μｌ）をゲルより回収した。得られた直鎖ＤＮＡは
ｃＤＮＡ競合物としてＷＴ１ ｍＲＮＡの定量に使用す
ることができる。更にこの直鎖ＤＮＡを鋳型とし、ラー
ジスケール Ｔ７トランスクリプションキット（ノバジ
ェン社製）を使用したイン・ビトロ転写反応を行い、Ｒ
ＮＡ競合物を作製した。得られたＲＮＡ競合物（ＷＴ１
ｃＲＮＡ）を２６０nmの吸光度により定量したところ、
その濃度は７×１０12コピー／μｌであった。
【００２２】（２）連続競合ＲＴ−ネステッドＰＣＲ法
によるＷＴ１ ｍＲＮＡの定量 上記のＫ−５６２細胞由来全ＲＮＡを試料として、以下
に示す操作でＷＴ１ｍＲＮＡの定量を行った。以下の成
分を含む反応液を調製した；５０mMのトリス−塩酸（ｐ
Ｈ９．２、２５℃）、１mMのＭｇＣｌ2 、１０mMのＫＣ
ｌ、１４mMの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、各１mMのｄＮＴＰ、
各０．４ｎＭのプライマーＷＴ１−Ｆ１及びＷＴ１−Ｒ
１、各４００nMのプライマーＣ及びプライマーＤ（配列
表の配列番号４、５にそれぞれプライマー Ｃ及びプラ
イマーＤの塩基配列を示す。）、１０Ｕのリボヌクレア
ーゼ阻害剤（宝酒造社製）、２４ＵのＡＭＶ逆転写酵素
（宝酒造社製）、１ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ
（ストラタジーン社製）、６ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（宝酒造社製）、１０6 コピーの上記のＲＮＡ競
合物、上記のＫ−５６２細胞由来全ＲＮＡ。なお、上記
のＫ−５６２細胞由来全ＲＮＡは０．０１ng、０．１n
g、１ng、１０ng、１００ng、１０００ngの６種のＲＮ
Ａ量で反応液に添加した。調製した反応液を下記〜
の条件で順次反応させた； ５４℃、１５分、 ９４℃、９０秒、 ９４℃、１５秒〜５４℃、３０秒〜７２℃、３０秒
を１サイクルとする１０サイクル反応、 ９４℃、１５秒〜５０℃、３０秒〜７２℃、３０秒
を１サイクルとする３５サイクル反応。
によるＷＴ１ ｍＲＮＡの定量 上記のＫ−５６２細胞由来全ＲＮＡを試料として、以下
に示す操作でＷＴ１ｍＲＮＡの定量を行った。以下の成
分を含む反応液を調製した；５０mMのトリス−塩酸（ｐ
Ｈ９．２、２５℃）、１mMのＭｇＣｌ2 、１０mMのＫＣ
ｌ、１４mMの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、各１mMのｄＮＴＰ、
各０．４ｎＭのプライマーＷＴ１−Ｆ１及びＷＴ１−Ｒ
１、各４００nMのプライマーＣ及びプライマーＤ（配列
表の配列番号４、５にそれぞれプライマー Ｃ及びプラ
イマーＤの塩基配列を示す。）、１０Ｕのリボヌクレア
ーゼ阻害剤（宝酒造社製）、２４ＵのＡＭＶ逆転写酵素
（宝酒造社製）、１ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ
（ストラタジーン社製）、６ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（宝酒造社製）、１０6 コピーの上記のＲＮＡ競
合物、上記のＫ−５６２細胞由来全ＲＮＡ。なお、上記
のＫ−５６２細胞由来全ＲＮＡは０．０１ng、０．１n
g、１ng、１０ng、１００ng、１０００ngの６種のＲＮ
Ａ量で反応液に添加した。調製した反応液を下記〜
の条件で順次反応させた； ５４℃、１５分、 ９４℃、９０秒、 ９４℃、１５秒〜５４℃、３０秒〜７２℃、３０秒
を１サイクルとする１０サイクル反応、 ９４℃、１５秒〜５０℃、３０秒〜７２℃、３０秒
を１サイクルとする３５サイクル反応。
【００２３】反応終了後、反応液をアガロースゲル電気
泳動に供した。泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染
色の後に蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯIIマルチ
−ビュー（宝酒造社製）を用いて解析することにより、
標的ｍＲＮＡ及びＲＮＡ競合物由来の増幅産物量を比較
し、試料中の標的ｍＲＮＡ（ＷＴ１ ｍＲＮＡ）量を求
めた。結果を図１に示す。図１は同一の試料を使用して
異なる日時に行った４回の測定の結果を示す。図中□、
◇、○、△はそれぞれ同じ日時の測定結果を示し、●は
それらの平均を示す。また図１中横軸は反応液に添加さ
れた全ＲＮＡ量（ng）、縦軸は反応液中に検出されたＷ
Ｔ１ ｍＲＮＡのコピー数を示す。図１に示されるよう
に、添加された全ＲＮＡ量と測定された標的ｍＲＮＡ量
は良好な直線関係を示し、また、各測定日時毎の測定結
果の変動（日差変動）も見られず、本発明の方法が安定
した測定法であることが示された。また、今回の測定に
要した時間は、各工程を独立して行う従来法に比べて約
１／４に短縮された。
泳動に供した。泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染
色の後に蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯIIマルチ
−ビュー（宝酒造社製）を用いて解析することにより、
標的ｍＲＮＡ及びＲＮＡ競合物由来の増幅産物量を比較
し、試料中の標的ｍＲＮＡ（ＷＴ１ ｍＲＮＡ）量を求
めた。結果を図１に示す。図１は同一の試料を使用して
異なる日時に行った４回の測定の結果を示す。図中□、
◇、○、△はそれぞれ同じ日時の測定結果を示し、●は
それらの平均を示す。また図１中横軸は反応液に添加さ
れた全ＲＮＡ量（ng）、縦軸は反応液中に検出されたＷ
Ｔ１ ｍＲＮＡのコピー数を示す。図１に示されるよう
に、添加された全ＲＮＡ量と測定された標的ｍＲＮＡ量
は良好な直線関係を示し、また、各測定日時毎の測定結
果の変動（日差変動）も見られず、本発明の方法が安定
した測定法であることが示された。また、今回の測定に
要した時間は、各工程を独立して行う従来法に比べて約
１／４に短縮された。
【００２４】（３）添加回収試験 上記のＫ−５６２細胞由来全ＲＮＡを種々の比率で健常
人末梢血由来の全ＲＮＡと混合したものを試料として、
上記の方法によりＷＴ１ ｍＲＮＡ量の測定を行った。
末梢血からの全ＲＮＡの調製にはＴｒｉＺｏｌ試薬を用
いた。この結果、測定値は試料中に添加されたＫ−５６
２細胞由来全ＲＮＡの量とよく一致しており、本測定方
法が十分な添加回収性を有していることが示された。
人末梢血由来の全ＲＮＡと混合したものを試料として、
上記の方法によりＷＴ１ ｍＲＮＡ量の測定を行った。
末梢血からの全ＲＮＡの調製にはＴｒｉＺｏｌ試薬を用
いた。この結果、測定値は試料中に添加されたＫ−５６
２細胞由来全ＲＮＡの量とよく一致しており、本測定方
法が十分な添加回収性を有していることが示された。
【００２５】実施例２ 連続競合ＲＴ−ＰＣＲ法を利用
したβ−アクチン ｍＲＮＡ定量用反応液の作製 容量２００μｌのＰＣＲ用チューブに、下記表１の成分
を含む２５μｌのβ−アクチン ｍＲＮＡ定量用反応液
を調製した。この反応液は−２０℃以下で安定に保存さ
れた。なお、プライマー ＡＣ−Ｆ１、ＢＡ−Ｒ１の塩
基配列をそれぞれ配列表の配列番号６、７に示す。
したβ−アクチン ｍＲＮＡ定量用反応液の作製 容量２００μｌのＰＣＲ用チューブに、下記表１の成分
を含む２５μｌのβ−アクチン ｍＲＮＡ定量用反応液
を調製した。この反応液は−２０℃以下で安定に保存さ
れた。なお、プライマー ＡＣ−Ｆ１、ＢＡ−Ｒ１の塩
基配列をそれぞれ配列表の配列番号６、７に示す。
【００２６】
【表１】 表 １ ────────────────────────────────── ＡＭＶ逆転写真酵素 ：２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ：２．５Ｕ プライマー ＡＣ−Ｆ１ ：５pmol プライマー ＢＡ−Ｒ１ ：５pmol リボヌクレアーゼ阻害剤 ：２０Ｕ β−アクチンｃＤＮＡ競合物（ヒトβ−アクチン コンペティティブＰＣＲセット、宝酒造社製） ：１×１０5 コピー トリス−塩酸（ｐＨ９．２、２５℃） ：終濃度５０mM ＭｇＣｌ2 ：終濃度５mM ＫＣｌ ：終濃度１０mM （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：終濃度１４mM ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ：終濃度０．０１％ ｄＮＴＰ ：各１mM ──────────────────────────────────
【００２７】Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５
９３）よりＴｒｉＺｏｌ試薬を用いて調製した全ＲＮＡ
を０．０３〜１００ng／μｌの範囲で段階希釈した。こ
れらの１μｌずつをそれぞれ上記の反応液に添加し、こ
れを下記〜の条件で順次反応させた； ４５℃、１５分、 ９４℃、９０秒、 ９４℃、１５秒〜５４℃、３０秒〜７２℃、３０秒
を１サイクルとする３０サイクル反応、
９３）よりＴｒｉＺｏｌ試薬を用いて調製した全ＲＮＡ
を０．０３〜１００ng／μｌの範囲で段階希釈した。こ
れらの１μｌずつをそれぞれ上記の反応液に添加し、こ
れを下記〜の条件で順次反応させた； ４５℃、１５分、 ９４℃、９０秒、 ９４℃、１５秒〜５４℃、３０秒〜７２℃、３０秒
を１サイクルとする３０サイクル反応、
【００２８】反応終了後、反応液をアガロースゲル電気
泳動に供し、実施例１同様の操作で増幅産物の定量を行
った。測定結果を図２に示す。図２中横軸は反応液に添
加された全ＲＮＡ量（ng）、縦軸は標的ＲＮＡ由来増幅
産物量の競合物由来増幅産物量に対する割合（Ｔ／Ｃ
比）を示す。図２に示されるように、添加された全ＲＮ
Ａ量と測定されたＴ／Ｃ比は良好な直線関係を示し、上
記の反応液を使用することによってβ−アクチン ｍＲ
ＮＡ量を簡便、かつ正確に定量できることが示された。
泳動に供し、実施例１同様の操作で増幅産物の定量を行
った。測定結果を図２に示す。図２中横軸は反応液に添
加された全ＲＮＡ量（ng）、縦軸は標的ＲＮＡ由来増幅
産物量の競合物由来増幅産物量に対する割合（Ｔ／Ｃ
比）を示す。図２に示されるように、添加された全ＲＮ
Ａ量と測定されたＴ／Ｃ比は良好な直線関係を示し、上
記の反応液を使用することによってβ−アクチン ｍＲ
ＮＡ量を簡便、かつ正確に定量できることが示された。
【００２９】実施例３ 種々のヒトｍＲＮＡ測定キット
の作製 実施例１記載のヒトＷＴ１ ｍＲＮＡ定量で使用された
反応液の組成を参考に、本発明の方法によって下記表２
記載のヒトｍＲＮＡ量を測定するためのキットを作製し
た。各キット共ＡＭＶ逆転写酵素、Ｐｆｕ ＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの３種の酵素を
含むものとし、表２記載の各プライマー、並びに該プラ
イマーと各標的ｍＲＮＡ塩基配列とから実施例１記載の
方法で作製された競合物とをそれぞれのキットに添付し
た。各ｍＲＮＡの測定に使用されるプライマーを表２に
示す。なお、表２中に４種のプライマーを示したもの
は、それぞれ１組のプライマー対を使用する２段階のＰ
ＣＲ（ネステッドＰＣＲ）を行うものである。また、３
種のプライマーを示したものは１つのプライマーがその
両方に共通して使用される２段階のＰＣＲを行うもので
ある。
の作製 実施例１記載のヒトＷＴ１ ｍＲＮＡ定量で使用された
反応液の組成を参考に、本発明の方法によって下記表２
記載のヒトｍＲＮＡ量を測定するためのキットを作製し
た。各キット共ＡＭＶ逆転写酵素、Ｐｆｕ ＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの３種の酵素を
含むものとし、表２記載の各プライマー、並びに該プラ
イマーと各標的ｍＲＮＡ塩基配列とから実施例１記載の
方法で作製された競合物とをそれぞれのキットに添付し
た。各ｍＲＮＡの測定に使用されるプライマーを表２に
示す。なお、表２中に４種のプライマーを示したもの
は、それぞれ１組のプライマー対を使用する２段階のＰ
ＣＲ（ネステッドＰＣＲ）を行うものである。また、３
種のプライマーを示したものは１つのプライマーがその
両方に共通して使用される２段階のＰＣＲを行うもので
ある。
【００３０】
【表２】 表 ２ 標的ｍＲＮＡ プライマー、及び配列表中の配列番号 サイトケラチン１９ ＣＫ１９−Ｆ２（配列番号９） ＣＫ１９−Ｒ１（配列番号１０） ＣＫ１９−Ｒ２（配列番号１１） サイトケラチン２０ ＣＫ２０−Ｆ１（配列番号１２） ＣＫ２０−Ｒ１（配列番号１３） ＣＫ２０−Ｒ２（配列番号１４） Ｆｌｔ３ Ｆｌｔ３−Ｆ１（配列番号１５） Ｆｌｔ３−Ｆ２（配列番号１６） ｂｃｌ／ａｂｌ（ＣＭＬ型） ｂａ−Ｆ１（配列番号１７） ｂａ−Ｆ２（配列番号１８） ｂａ−Ｒ１（配列番号１９） ｂｃｌ／ａｂｌ（ＡＬＬ型） ｂａ−Ｆ３（配列番号２０） ｂａ−Ｆ４（配列番号２１） ｂａ−Ｒ３（配列番号２２） ｂａ−Ｒ４（配列番号２３） ｐｍｌ／ｒａｒａ ｐｒ−Ｆ１（配列番号２４） ｐｒ−Ｆ２（配列番号２５） ｐｒ−Ｒ１（配列番号２６） ｐｒ−Ｒ２（配列番号２７） ａｍｌ／ｍｔｇ８ ａｍ−Ｆ１（配列番号２８） ａｍ−Ｆ２（配列番号２９） ａｍ−Ｒ１（配列番号３０） ａｍ−Ｒ２（配列番号３１） ｅ２ａ／ｐｂｘ ｅｐ−Ｆ１（配列番号３２） ｅｐ−Ｆ２（配列番号３３） ｅｐ−Ｒ１（配列番号３４） ｅｐ−Ｒ２（配列番号３５）
【００３１】
【発明の効果】本発明により、従来技術では非常に繁雑
で、時間を要していたＲＮＡの高感度定量を簡便、迅速
に行うことが可能になる。更に、これまでは各工程ごと
の反応液の移し換えの際に問題となったピペッティング
の誤差やコンタミネーションの危険もなく正確、かつ再
現性の高い測定を行うことができる。
で、時間を要していたＲＮＡの高感度定量を簡便、迅速
に行うことが可能になる。更に、これまでは各工程ごと
の反応液の移し換えの際に問題となったピペッティング
の誤差やコンタミネーションの危険もなく正確、かつ再
現性の高い測定を行うことができる。
【００３２】
【００３３】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACAGATGCAC AGCAGGAAGC 20
【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGATGGCGGA CTAATTCATC 20
【００３５】配列番号：３ 配列の長さ：６２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGTGATGGCG GACTAATTCA TCAACTTTTT CTGACAACTT GGACTTGTTT TACCTGTATG 60 AG 62
【００３６】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGCAGGAAGC ACACTGGTGA 20
【００３７】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AACTTTTTCT GACAACTTGG 20
【００３８】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAAGAGATGG CCACGGCTGC T 21
【００３９】配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCCTTCTGCA TCCTGTCGGC A 21
【００４０】配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCGGGCAACG AGAAGCTAAC C 21
【００４１】配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATGCAGAACC TCAACGACCG C 21
【００４２】配列番号：１０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCTGCATCTC CAGGTCGGTC C 21
【００４３】配列番号：１１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAGTGCCTGT TCCGTCTCAA A 21
【００４４】配列番号：１２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAGACACACG GTGAACTATG G 21
【００４５】配列番号：１３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GATCAGCTTC CACTGTTAGA CG 22
【００４６】配列番号：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AAGTCCTCAG CAGCCAGTTT A 21
【００４７】配列番号：１５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGTCGAGCAG TACTCTAAAC A 21
【００４８】配列番号：１６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATCCTAGTAC CTTCCCAAAC TC 22
【００４９】配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGATGCTGAC CAACTCGTGT 20
【００５０】配列番号：１８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTCGCCTGAC CATCAATAAG 20
【００５１】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCCACAAAAT CATACAGTGC 20
【００５２】配列番号：２０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGGCCCCGCA GGTCCTACTC C 21
【００５３】配列番号：２１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCACTGCCCG GTTGTCGTGT C 21
【００５４】配列番号：２２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CATACAGTGC AACGAAAGGT 20
【００５５】配列番号：２３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGGGTCCAG CGAGAAGGTT T 21
【００５６】配列番号：２４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCCCAGAGCC TGCAAGCTGC C 21
【００５７】配列番号：２５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGGCTTCGAC GAGTTCAAGG T 21
【００５８】配列番号：２６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CATAGTGGTA GCCTGAGGAC 20
【００５９】配列番号：２７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGGGCACTA TCTCTTCAGA A 21
【００６０】配列番号：２８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGCAATGATG AAAACTACTC G 21
【００６１】配列番号：２９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGAAGTGGAA GAGGGAAAAG C 21
【００６２】配列番号：３０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCCTATCTCG GGTGAAATGT C 21
【００６３】配列番号：３１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGGGAGGTGG CATTGTTGGA G 21
【００６４】配列番号：３２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCGCTGGCCT CAGGTTTCAC C 21
【００６５】配列番号：３３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGAGGCAGCC ACCCCGAGGA C 21
【００６６】配列番号：３４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGACCCTCCG CCCTTCTCAG G 21
【００６７】配列番号：３５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCCACGCCTT CCGCTAACAG C 21
【図１】本発明方法によるＷＴ１ ｍＲＮＡの定量の結
果を、添加全ＲＮＡ量とＷＴ１ｍＲＮＡのコピー数と関
係で示したグラフである。
果を、添加全ＲＮＡ量とＷＴ１ｍＲＮＡのコピー数と関
係で示したグラフである。
【図２】本発明方法によるβ−アクチン ｍＲＮＡの定
量の結果を、添加全ＲＮＡ量とＴ／Ｃ比との関係で示し
たグラフである。
量の結果を、添加全ＲＮＡ量とＴ／Ｃ比との関係で示し
たグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日野 文嗣 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内
Claims (8)
- 【請求項１】 ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの合成、並び
に該ｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ・チェーン・リ
アクション（ＰＣＲ）を用いてＲＮＡ量を測定する方法
において、当該ｃＤＮＡの合成、並びにＰＣＲを、ＲＮ
Ａ又はｃＤＮＡ競合物の存在下に一つの反応容器中で連
続して行うことを特徴とするＲＮＡ量の測定方法。 - 【請求項２】 ＰＣＲを、少なくとも１対のプライマー
対を使用した２段階のＰＣＲによって行うことを特徴と
する請求項１記載のＲＮＡ量の測定方法。 - 【請求項３】 ＰＣＲを、校正活性を有する耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼと、校正活性を有さない耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼとの混合物によって実施することを特徴とす
る請求項１あるいは２記載のＲＮＡ量の測定方法。 - 【請求項４】 ＷＴ１ ｍＲＮＡ、β−アクチン ｍＲ
ＮＡ、サイトケラチン ｍＲＮＡ、Ｆｌｔ３ ｍＲＮ
Ａ、ｂｃｒ／ａｂｌ ｍＲＮＡ、ｐｍｌ／ｒａｒａ ｍ
ＲＮＡ、ａｍｌ１／ｍｔｇ８ ｍＲＮＡ、ｅ２ａ／ｐｂ
ｘ１ ｍＲＮＡから選択されるｍＲＮＡを測定対象とす
る請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ量の測定
方法。 - 【請求項５】 逆転写活性を有する酵素、耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン
酸、少なくとも１対のプライマー対、ＲＮＡ又はｃＤＮ
Ａ競合物、リボヌクレアーゼ阻害剤を含有する、請求項
１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ量の測定方法に使
用される反応液。 - 【請求項６】 ＷＴ１ ｍＲＮＡ、β−アクチン ｍＲ
ＮＡ、サイトケラチン ｍＲＮＡ、Ｆｌｔ３ ｍＲＮ
Ａ、ｂｃｒ／ａｂｌ ｍＲＮＡ、ｐｍｌ／ｒａｒａ ｍ
ＲＮＡ、ａｍｌ１／ｍｔｇ８ ｍＲＮＡ、ｅ２ａ／ｐｂ
ｘ１ ｍＲＮＡから選択されるｍＲＮＡを測定対象とす
る請求項５記載の反応液。 - 【請求項７】 請求項５あるいは６記載の反応液の１反
応分の必要量が分注されている反応容器。 - 【請求項８】 請求項５又は６記載の反応液、あるいは
請求項７記載の反応容器を含有することを特徴とするＲ
ＮＡ量の測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9271993A JPH1189596A (ja) | 1997-09-19 | 1997-09-19 | Ｒｎａ量の測定方法並びに測定キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9271993A JPH1189596A (ja) | 1997-09-19 | 1997-09-19 | Ｒｎａ量の測定方法並びに測定キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1189596A true JPH1189596A (ja) | 1999-04-06 |
Family
ID=17507663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9271993A Pending JPH1189596A (ja) | 1997-09-19 | 1997-09-19 | Ｒｎａ量の測定方法並びに測定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1189596A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7063854B1 (en) | 1998-09-30 | 2006-06-20 | Corixa Corporation | Composition and methods for WTI specific immunotherapy |
| US7115272B1 (en) | 1998-09-30 | 2006-10-03 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7144581B2 (en) | 2000-10-09 | 2006-12-05 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7323181B2 (en) | 1998-09-30 | 2008-01-29 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7329410B1 (en) | 1998-09-30 | 2008-02-12 | Corixa Corporation | Compositions and method for WT1 specific immunotherapy |
| US7553494B2 (en) | 2001-08-24 | 2009-06-30 | Corixa Corporation | WT1 fusion proteins |
| WO2014115779A1 (ja) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | 大塚製薬株式会社 | WT1 mRNAの発現量定量方法 |
-
1997
- 1997-09-19 JP JP9271993A patent/JPH1189596A/ja active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7063854B1 (en) | 1998-09-30 | 2006-06-20 | Corixa Corporation | Composition and methods for WTI specific immunotherapy |
| US7115272B1 (en) | 1998-09-30 | 2006-10-03 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7323181B2 (en) | 1998-09-30 | 2008-01-29 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7329410B1 (en) | 1998-09-30 | 2008-02-12 | Corixa Corporation | Compositions and method for WT1 specific immunotherapy |
| US7368119B2 (en) | 1998-09-30 | 2008-05-06 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7655249B2 (en) | 1998-09-30 | 2010-02-02 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7662386B2 (en) | 1998-09-30 | 2010-02-16 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7144581B2 (en) | 2000-10-09 | 2006-12-05 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7553494B2 (en) | 2001-08-24 | 2009-06-30 | Corixa Corporation | WT1 fusion proteins |
| US7915393B2 (en) | 2001-08-24 | 2011-03-29 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| WO2014115779A1 (ja) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | 大塚製薬株式会社 | WT1 mRNAの発現量定量方法 |
| US10280467B2 (en) | 2013-01-22 | 2019-05-07 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Quantification method for expression level of WT1 mRNA |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3085409B2 (ja) | 標的核酸配列の検出方法およびそのための試薬キット | |
| JP3514630B2 (ja) | 核酸配列の増幅および検出 | |
| US6541205B1 (en) | Method for assaying nucleic acid | |
| JP3903059B2 (ja) | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー | |
| JPH06507316A (ja) | 増幅生成物の迅速アッセイ | |
| JP2006512081A (ja) | Ｒｎａのローリングサークル増幅 | |
| EP2652154B1 (en) | Universal reference dye for quantitative amplification | |
| US20100304377A1 (en) | Method of detecting norovirus rna | |
| US6221584B1 (en) | Method of detecting telomerase activity | |
| CA2706444A1 (en) | Reduced inhibition of one-step rt-pcr | |
| US5049490A (en) | Quantitative determination of a DNA polymerase and a test kit useful in same | |
| EP1556517B1 (en) | Improved methods for generating multiple rna copies | |
| UA47432C2 (uk) | Олігонуклеотидний праймер, призначений для ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини типу 1 (віл-1) (варіанти), пара олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 (варіанти), спосіб ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 | |
| JP2001512301A (ja) | 核酸増幅のための内部陽性対照 | |
| JPH1189596A (ja) | Ｒｎａ量の測定方法並びに測定キット | |
| JP2017532030A (ja) | 診断方法及び組成物 | |
| JP2009296948A (ja) | Ｐｃｒ用プライマー、標的核酸の検出方法及び標的生体分子の検出方法 | |
| JPH04211400A (ja) | 修飾核酸の製造方法 | |
| CN111378730A (zh) | 一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液及其应用 | |
| JP2009017824A (ja) | 改良されたノロウイルスｒｎａの検出方法 | |
| US20070141595A1 (en) | METHOD FOR ASSAYING REG IV mRNA | |
| JP4406968B2 (ja) | 簡便で増強された核酸増幅法 | |
| KR100454172B1 (ko) | Ｄｎａ 증폭방법 및 그의 키트 | |
| JPWO2006011667A1 (ja) | ヘテロ核リボヌクレオチドタンパク質Ｂ１（ｈｎＲＮＰＢ１）ｍＲＮＡの測定方法 | |
| KR102441122B1 (ko) | 폴리머라제 활성 측정 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050823 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051019 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051109 |