UA47432C2 - Олігонуклеотидний праймер, призначений для ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини типу 1 (віл-1) (варіанти), пара олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 (варіанти), спосіб ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 - Google Patents
Олігонуклеотидний праймер, призначений для ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини типу 1 (віл-1) (варіанти), пара олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 (варіанти), спосіб ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 Download PDFInfo
- Publication number
- UA47432C2 UA47432C2 UA98010265A UA98010265A UA47432C2 UA 47432 C2 UA47432 C2 UA 47432C2 UA 98010265 A UA98010265 A UA 98010265A UA 98010265 A UA98010265 A UA 98010265A UA 47432 C2 UA47432 C2 UA 47432C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- primer
- nucleic acid
- hiv
- amplification
- immunodeficiency virus
- Prior art date
Links
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 78
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 title claims abstract description 67
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 48
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 48
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 title claims 4
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims abstract description 54
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 113
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 241000560067 HIV-1 group M Species 0.000 abstract description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 abstract 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 28
- 101100187130 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nim-1 gene Proteins 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- -1 polymerase Substances 0.000 description 4
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UXTZUUVTGMDXNG-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzoxazine-3,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(=O)NOC2=C1 UXTZUUVTGMDXNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
У заявці описані поліпшені праймери для ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти гена gag вірусу імунодефіциту людини типу 1 (ВІЛ-1) з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Праймери і способи ампліфікації, згідно з винаходом, дозволяють виявляти всі ізоляти групи М ВІЛ-1 з приблизно однаковою ефективністю.
Description
Опис винаходу
Даний винахід відноситься до молекулярної біології і хімії нуклеїнових кислот. Зокрема воно відноситься 2 до способів і реагентів, призначених для виявлення вірусу імунодефіциту людини типу 1 (ВІЛ-1). Отже, областю застосування винаходу є медицина загалом, і більш конкретно медична діагностика і молекулярна біологія.
Створення способів ампліфікації певних послідовностей нуклеїнових кислот, зокрема полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), робить можливим швидке виявлення нуклеїнових кислот, присутніх в зразку в таких малих кількостях, що їх раніше було неможливо виявити (див. патенти США 4683195, 4683202 і 4965188). У 70 літературі є численні дані про вдосконалення і застосування ПЛР. Наприклад, широкий спектр пов'язаних з бензоксазиндиона проблем представлений в таких виданнях, як РСК Тесппоіоду ргіпсіріеєз апа арріїсайопв ог
ОМА аптріїпсайоп, 1989 (ред. Н.А. Епісп), БіосКОоп Ргевзв, Мем Могк, ММ; РСК РгоїосоЇв: А дціде ю теїповдв апа арріїсайоп5, 1990 (ред. М.А. Іппів і інш.,), Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, СА; і в РСК Зігаіедієз, 1995 (ред. М.А. Іппіз і інш.,, Асадетіс Ргезз, Зап Оіедо, СА. Комерційні постачальники, такі, як фірма Рекгкіп 12 Ерпег (Могмаїк, СТ), постачають на ринок реагенти для ПЛР і публікують ПЛР-протоколи.
Огляд даних по застосуванню ПЛР і гібридизації з використанням зондів для ампліфікації і виявлення нуклеїнової кислоти ВІЛ-1 представлений у КмокК, 1992, Апп. Мей. 24: 211-214; ії у Сошее і інш., 1991, Мої.
Сеь. Ргобез 5: 241-259. Засновані на використанні ПЛР методи виявлення ВІЛ-1 описані, наприклад, в патентах
США 5008182 і 5176775; у Кейодд і КмокК, 1990, в РСК РгоїосоЇв: А Сціде ю Меїйосдз апа Арріїсайопв, (ред. 20 |ппві інш.,, Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, СА, 337-347; у Ноіодпіу і інш., 1991, У. Ії. Оів. 163: 802-865;
Уаскгоп і інш., 1991, АІЮЗ 5: 1463-1467; і у Миїдег і інш., 1994, У. Сііп. Місгобіо!. 32(2): 292-300.
Комерційні набори для ампліфікації і виявлення ВІЛ-1 постачаються фірмою Нойтапп-І а Кцспе (МийШеу, МУ).
Набір Атріїсог/М НІМ-1 Теві призначений для виявлення іп міго провирусної ДНК ВІЛ-1 набір АМРИСОВ. НІМ-1 25 МОМІТОВ М Теві призначений для кількісної оцінки іп міго РНК ВІЛ-1. У обох тест-наборах Атріїсог для сч ампліфікації нуклеїнових кислот ВІЛ-1 використовується пара праймерів 5К462 (ЗЕО ІЮО МО: 5) і 5К431 (ЗЕО І (о)
МО: б), описаних у Мидег і інш., 1994, 9. Сп. Місгоріої. 32(2)3: 292-300, званих в даному описі
Атріїсог-праймерами для ВІЛ-1.
ВІЛ-1 володіє значною варіабельнцістю геномної послідовності. Філогенетичний аналіз послідовностей сч 30 нуклеїнових кислот генів дад і епм ВІЛ-1 описаний в роботі Муегз і інш., 1993, Нитап Кеїгомігиз апа АІЮ5, 1993, оз АІатоз Маїйопаї! І арогайогу, Їо5 Аіатовз, ММ, включеній в даний опис і якості посилання. Всередині Ге) групи М були виявлені підтипи А-). «
У літературі описані загальноприйняті методи молекулярної біології і хімії нуклеїнових кислот, що відносяться до області даного винаходу (див., наприклад, ЗатбргоокК і інш., 1989, Моїесшіаг Сіопіпд А - 35 І арогаюгу Мапиа!Ї, Соїд Зрі-іпд Нагрог І арогаїогу, Соїй Зргіпд Нагрог, Мем МогК; ОІідописіеокде Зупіпевів - (ред. М.). Саїї 1984); Мисівіс Асій Нурбгіаігабйоп (ред. В.О. Натпез і 5.3. Ніддіпв, 1984); і серії Ме(подзь іп Епгутоіоду (Асадетіс Ргевзв, Іпс.)).
Були виявлені численні ізоляти групи М вірусу імунодефіциту людини типу 1 (ВІЛ-1), які або не ампліфікуються, або недостатньо ефективно ампліфікуються з раніше описаними праймерами для гена дад, « 70 Зокрема з використанням Атріїсог-праймерів для ВІЛ-1 5К462 (ЗЕО ІЮО МО: 5) ії ЗК431 (5ЕО ІЮО МО: 6). Ці ізоляти -в виявляють не описану раніше варіабельність послідовностей в області, що включає сайти скріплення праймерів с Атріїсог-праймерів для ВІЛ-1. :з» Даний винахід відноситься до поліпшених праймерів, які здатні ефективно ампліфікувати ці недавно виявлені ізоляти, в доповнення до всіх ізолятам, які здатні ампліфікуватися з використанням Атріїсог-праймерів для 415 ВІЛ-1. Крім того, праймери по винаходу здатні ампліфікувати всі відомі ізоляти групи М ВІЛ-1 з приблизно їз однаковою ефективністю.
Даний винахід відноситься далі до поліпшених олігонуклеотидних праймерів, які здатні здійснювати -і ампліфікацію з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) області гена дад ізолятів підтипів А групи їз М ВІЛ-1 з приблизно однаковою ефективністю і без одночасної ампліфікації послідовностей, що не є мішенями. 50 Зокрема, даний винахід відноситься до олігонуклеотидних праймерів, призначених для ампліфікації і95) нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини типу 1 (ВІЛ-1), причому вказаний олігонуклеотидний праймер
КЗ вибирають з групи, що складається з ЗКСС1 (5ЕО ІЮ МО: 3) і ЗКССЗ (ЗЕ ІО МО: 4).
Переважно кожний з цих праймерів об'єднаний в пару олігонуклеотидних праймерів, що складається з 5К145 (ЗЕО ІО МО: 1) ії БКОС1 (5ЕО ІО МО: 3), або в пару олігонуклеотидних праймерів, що складається з ЗК145 (5ЕО
ІО МО: 1) ї ЗКССЗ (5ЕО ІО МО: 4).
У іншому варіанті ці пари праймерів можуть бути об'єднані з праймером 5К145М2 (ЗЕО ІЮО МО: 2) в набір (Ф) олігонуклеотидних праймерів, які складаються з олігонуклеотидних праймерів ЗК145 (ЗЕО ІЮ МО: 1), БКСОС1
Ге (ЗЕБЕО ІО МО: 3) ії 5К145М2 (5ЕБО ІО МО: 2), або в набір олігонуклеотидних праймерів, що складається з олігонуклеотидних праймерів ЗК145 (5ЕО ІЮ МО: 1), БКССЗ (5ЕО ІЮ МО: 4) і 5К145М2 (ЗЕО ІО МО: 2). во Винахід відноситься також до поліпшених способів ампліфікації області гена дад з підтипів групи М ВІЛ-1, що включають здійснення ПЛР з використанням праймерів по винаходу.
Даний винахід далі відноситься до наборів, що містять ампліфіцируючий праймер по даному винаходу. Ці набори можуть включати додаткові реагенти, такі, як зонди для виявлення або один або декілька реагентів для ампліфікації, наприклад, полімеразу, буфери і нуклеозидтрифосфати. ве Для кращого розуміння винаходу нижче визначені деякі поняття. "Нуклеїнова кислота" і "олігонуклеотид" відносяться до полідезоксирибонуклеотидам (утримуючим
2-дезокси-ЮО-рибозу), до полірибонуклеотидам (утримуючим ЮО-рибозу) і до будь-якого іншого типу полінуклеотида, що являє собою М-глікозід пуринової або пиримидинової основи або модифіковану пуринову або пиримидинову основу. Поняття "нуклеїнова кислота" і "олігонуклеотид" не мають на увазі відмінності в довжині ланцюга і можуть використовуватися взаємозамінне. Ці поняття відносяться тільки до первинної структури молекули. Таким чином, ці поняття включають двох- і одноланцюгову ДНК, а також двох- і однолінцюгову РНК.
Олігонуклеотиди можуть бути отримані будь-яким придатним для цієї мети способом, включаючи, наприклад, клонування і рестрикцію відповідних послідовностей і прямий хімічний синтез за допомогою такого методу, як 70 фосфотриефірний метод, описаний у Магапад і інш., 1979, Мей. Еплутої. 68: 90-99; фосфодіефирний метод, описаний у Вгом/п і інш., 1979, Мей. Епгутої!. 68: 109-151; діегилфосфорамідитний метод, описаний у Веаисаде і інш., 1981, Тейгапйедгоп Гей. 22: 1859-1862; і метод з використанням твердої підкладки, описаний в патенті
США 4458066. Огляд методів синтезу представлений у Сосаснійа, 1990, Віосопідаве Спетізігу, 1(3): 165-187.
Поняття "гібридизація" відноситься до утворення дуплексної структури двома одноланцюговими /5 Нуклеїновими кислотами внаслідок комплементарного спаровування основ. Гібридизація може відбуватися між повністю комплементарними ланцюжками нуклеїнової кислоти або між "практично комплементарними" ланцюжками нуклеїнової кислоти, які містять мінорні області помилкового спаровування. Умови, при яких можуть гібридуватися тільки повністю комплементарні ланцюжки нуклеїнової кислоти, називаються "суворими умовами гібридизації" або "умовами гібридизації, специфічними для послідовності". Стабільні дуплекси практично Комплементарних послідовностей можуть бути отримані при менш суворих умовах гібридизації; міра допустимих помилкових спарувань може контролюватися за допомогою відповідного регулювання умов гібридизації. Фахівці в області технології нуклеїнових кислот можуть визначити стабільність дуплекса емпіричного шляхом, враховуючи різні параметри, в тому числі, наприклад, довжину і концентрацію пар основ олігонуклеотидів, іонну силу і частоту помилкових спарувань основ, використовуючи для цієї мети відомий в даній області техніки сч посібник (див., наприклад, ЗатрбгооК і інш., 1989, МоїІесшаг Сіопіпд А І арогаїгу МапиаїЇ, Соїй Зргіпд Нагрог
І арогаюгу, Со Зргіпд Нагрог, Мем Могк; і МУейтиг, 1991, Стйіса! Кеміємув іп Віоспет. апа Мої. Віо!/., (8) 26(3/4): 227-259).
Поняття "праймер" відноситься до природного або синтетичного олігонуклеотиду, здатному діяти як точка ініціація синтезу ДНК в умовах, при яких індукується синтез продукту подовження праймера, комплементарного с зо ланцюга нуклеїнової кислоти, тобто в присутності чотирьох різних нуклеозидтрифосфатів і агента, що забезпечує полімеризацію (тобто ДНК-полімерази або зворотної транскриптази) у відповідному буфері і при о відповідній температурі. Праймер переважно являє собою одноланцюговий олігодезоксирибонуклеотид. «г
Відповідна довжина праймера залежить від цілей застосування праймера, але звичайно складає від 15 до 35 нуклеотидів. Короткі молекули праймера звичайно вимагають більш низьких температур для формування досить - стабільних гібридних комплексів з матрицею. Не потрібно, щоб праймер відображав точну послідовність «г нуклеїнової кислоти-матриці, але він повинен бути в достатній мірі комплементарним, щоб гібридизуватися з матрицею. Праймери можуть включати додаткові структури, які дозволяють виявляти або іммобілізувати праймер, але не змінюють основну властивість праймера, а саме, здатність діяти як точка ініціації синтезу
ДНК. Наприклад, праймери можуть містити додаткову нуклеотидну послідовність на 5-кінці, якій не « гібридизується з нуклеїновою кислотою-мішенню, але яка сприяє клонуванню ампліфікованого продукту. з с Область праймера, комплементарна матриці в достатній для гібридизації міри, в контексті даного опису означається як "область гібридизації". ;» У контексті даного опису поняття "праймер, що ініціює синтез проти ходу транскрипції" відноситься до праймеру, продукт подовження якого являє собою субпослідовність кодуючого ланцюжка. "Праймер, що ініціює бинтез по ходу транскрипції, відноситься до праймера, продукт подовження якого являє собою ї5» субпослідовність, комплементарну некодуючого ланцюжку.
Поняття "послідовність-мішень", "область-мішень" і "нуклеїнова кислота-мішень" відносяться до області
Ш- нуклеїнової кислоти, що підлягає амлификації, виявленню або іншому аналізу. У контексті даного опису праймер їх є "специфічним" для послідовності-мішені, якщо кількість помилкових спарувань, що утворюються між 5о праймером і послідовністю-мішенню, менше, чим кількість помилкових спарувань, що утворюються між о праймером і послідовностями, що не є мішенями, які можуть бути присутними в зразку. Можуть бути вибрані такі
Ге умови гібридизації, при яких стабільні дуплекси формуються тільки в тоді, коли кількість присутніх помилкових спарувань не більше кількості помилкових спарувань, що утворюються між праймером і послідовністю-мішенню.
При таких умовах праймер, специфічний для мішені, може утворювати стабільний дуплекс тільки з дв послідовністю-мішенню. Таким чином, застосування праймерів, специфічних для мішені, в умовах ампліфікації відповідної суворості дозволяє здійснювати специфічну ампліфікацію тих послідовностей, які мають сайти
Ф) скріплення, що є мішенями для праймера. Аналогічно цьому застосування зондів, специфічних для мішені, в ка умовах гібридизації відповідної суворості дає можливість виявляти конкретну послідовність-мішень.
Поняття "суміш для реакції ампліфікації" відноситься до розчину, який містить реагенти, необхідні для во здійснення реакції ампліфікації, і який звичайно містить праймери, термостабільну ДНК-полімеразу, ДНІТФ і катион двовалентного металу у відповідному буфері. Реакційна суміш називається повної, якщо вона містить всі реагенти, необхідні для здійснення реакції, і називається неповної, якщо вона містить неповний набір необхідних реагентів. Для фахівця в даній області техніки очевидно, що для зручності, збереження стабільності при зберіганні або ж для можливості регулювати концентрації компонентів в залежності від призначення, 65 Компоненти реакції звичайно зберігають у вигляді окремих розчинів, кожний з яких містить неповний набір всіх компонентів, а самі компоненти реакції об'єднують до реакції для створення повної реакційної суміші. Крім того, для фахівця в даній області техніки очевидно, що для продажу компоненти реакції упаковують по окремості і що придатні комерційні набори можуть містити будь-який неповний набір компонентів реакції, включаючого праймери поданому винаходу.
Праймери для ампліфікації ВІЛ-1.
Праймери по даному винаходу володіють здатністю ампліфікувати нуклеїнову кислоту підтипів групи М ВІЛ-1.
Праймери е істотно поліпшеними в порівнянні з раніше описаними праймерами в тому відношенні, що вони володіють здатністю ампліфікувати практично з однаковою ефективністю нуклеїнову кислоту з області гена дад всіх ізолятів підтипів А-б, що належать групі М, включаючи недавно відкриті ізоляти. Нуклеотидні 7/0 послідовності праймерів приведені нижче в орієнтації зліва направо 5'--53'.
Праймери, що ініціюють синтез проти ходу транскрипції:
ЗК145 (З5ЕО ІЮО МО: 1) АСТОСОООСАСАТСААОСАСССАТОСАААТ
ЗК145М2 (ЗЕО ІЮО МО: 2) АСТОСОСОбАСАССАСОСАССААТОСАААТ
Праймери, що ініціюють синтез по ходу транскрипції:
ЗКОСС1 (ЗЕО І МО: 3) ТАСТАСТАСТТССТОСТАТОТСАСТТОС
ЗКССЗ (ЗЕО ІЮ МО: 4) ТССААСОСТАСТАСТАСТТССТОСТАТ
Праймери по даному винаходу, що ініціюють синтез по ходу транскрипції, можуть застосовуватися з будь-яким приведеним в даному описі праймером, що ініціює синтез проти ходу транскрипції. Праймери по даному винаходу, що ініціюють синтез по ходу транскрипції, переважно застосовують з тим праймером ЗК145 (ЗЕ ІО МО: 1), який ініціює синтез проти ходу транскрипції, необов'язково в поєднанні з праймером ЗК145М2 (ЗЕО ІЮО МО: 2), що ініціює синтез проти ходу транскрипції. Ініціюючий синтез проти ходу транскрипції праймер
ЗК145 (5ЕО ІО МО: 1), описаний у Кейодо і КжокК, 1990, в РСК Ргоюсоїв: А Сціде ю Меїйодз апа Арріїсайопв, (ред. Іппів і інш.,), Асадетіс Ргезз, Зап Оіедо, СА: 337-347. Другий Ініціюючий синтез проти ходу транскрипції праймер ЗК145М2 (ЗЕ ІЮ МО: 2) гібридизується з такою ж областю, що і ЗК1І45(5ЕОІО МО:1), сч але він створений для більш точного спаровування з нуклеотидною послідовністю певних ізолятів підтипаА і Е
ВІЛ-1. Як зазначено нижче в прикладах, застосування що обох праймерів, що ініціюють синтез проти ходу о транскрипції, може сприяти вирівнюванню ефективності ампліфікації певних підтипів.
Ампліфікація.
Ампліфікації здійснюють в умовах, які дозволяють ампліфікувати всі підтипи групи М ВІЛ-1, але які Га зо Володіють достатньою суворістю для того, щоб уникнути ампліфікації послідовностей, що не є мішенями.
Переважні умови реакції ампліфікації описані в прикладах у Миїдег і інш., 1994, 9. Сііп. Місгобріо!Ї. 32(2): і. 292-300, і в інструкції, включеній в тест-набір АМРІЇСОМК НІМ-1 МОМІТОК Теві. Точні умови не мають «ф вирішального значення при практичному здійсненні винаходу. Оптимізація умов ампліфікації може бути проведена звичайним способом, засновуючись вказівками, які представлені в даному описі. в
Праймери і способи, які пропонуються, можуть застосовуватися для виявлення або провірусній ДНК ВІЛ-1, «І або РНК ВІЛ-1. Ампліфікація РНК з використанням полімеразної ланцюгової реакції із зворотною транскриптазою (З3Т-ПЛР) добре відома в даній області техніки і описана в патентах США 5322770 і 5310652; у Муегз і Сеїїапа, 1991, Віоспетівігу, З30(31): 7661-7666; і у Моцпд і інш., 1993, У. Сійп. Місгобіоії., 31(4): 882-886.
Ампліфікація РНК ВІЛ-1 з використанням ЗТ-ПЛР описана у Миїдег і інш., 1994, 9. Сіїп. МісгобріоІЇ. 32(2): « 40. 292-300 і у Ноісату і інш., 1991, У. Ії. Оів. 163: 802-865. 8 с Методи підготовки зразка, придатні для ампліфікації ДНК ії РНК ВІЛ-1, описані в літературі. Вибір й конкретного методу не має істотного значення при практичному здійсненні даного винаходу. Фахівець в даній "» області техніки може вибрати і оптимізувати придатні методи отримання зразка, засновуючись на даних, представлених в описі винахода. Переважні методи підготовки зразка, що застосовуються для виявлення провірусної ДНК ВІЛ-1, описані у Сазагеаіе і інш., 1992, РСК Меїбподз апа Арріїсайопв, 2: 149-153, і у «їз» Виїспег і Зрадого, 1992, Сііп. Іттипої. Мемузіецег, 12: 73-76. Переважний набір для підготовки зразка для виявлення провірусної ДНК ВІЛ-1 є на ринку у вигляді частини набору Атріїсог НІМ-1 Тевзі. Переважні методи - підготовки зразка, що застосовуються для виявлення РНК ВІЛ-1 в плазмі, описані у Миїдег і інш., 1994, У. ї» Сііп. Місгобіої. 32(2): 292-300. Переважний набір для підготовки зразка для виявлення і/або кількісної оцінки
РНК ВІЛ-1 є на ринку у вигляді частини набору АМРІІСОК НІМ-1 МОМІТОК Теві. о Аналіз апліфікованого продукту з Праймери для ампліфікації і способи по даному винаходу придатні для будь-якого застосування, заснованого на використанні ампліфікованої нуклеїнової кислоти. Наприклад, клонування і/або секвенування послідовностей
ВІЛ-1 полегшується при використанні праймерів по даному винаходу. Методи виявлення нуклеїнових кислот, ампліфікованих з допомогою ПЦР, добре відомі в даній області техніки. Метод, який застосовується для аналізу ампліфікованої нуклеїнової кислоти, не має істотного значення при практичному здійсненні винаходу, і тому іФ) може використовуватися будь-який придатний метод. Переважно використовують ампліфікацію РНК ВІЛ-1, як ко описано в прикладах, що стосуються кількісної оцінки вмісту вірусу.
Приклади способів виявлення ампліфікованої нуклеїнової кислоти включають аналіз продукту ампліфікації з бо допомогою гель-електрофореза і виявлення з допомогою гібридизації з комплементарними олігонуклеотидними зондами.
Придатні методи аналізу для дослідження гібридизації мішень-зонд добре відомі в даній області техніки і включають такі методи, як дот-блотинг і зворотний дот-блотинг.
При використанні методу дот-блотинга ампліфіковану ДНК- мішень іммобілізуються на твердій підкладці, б5 такій, як найлонова мембрана. Комплекс мембрана-мішень інкубують з міченим зондом при відповідних умовах гібридизації, негібридизований зонд видаляють шляхом промивки в умовах відповідній суворості і мембрану досліджують на присутність св'язаного зонда. Виявлення за допомогою дот-блотинга продуктів ПЛР-ампліфікації описане, наприклад, у заїкКі і інш., 1986, Майшге, 324: 163-166, і в патенті США 5468613.
При використанні методу зворотного дот-блотинга зонди іммобілізуються на твердій підкладці, такій, як найлонова мембрана, і мітять ампліфікуєму ДНК-мішень. ДНК-мішень звичайно мітять в процесі ампліфікації включенням мічених праймерів. Один або обидва праймера можуть бути міченими. Комплекс мембрана-зонд інкубують з міченою ампліфікованою ДНК-мішенню при відповідних умовах гібридизації, негібридизовану
ДНК-мішень видаляють шляхом промивки в умовах відповідній суворості і потім фільтр досліджують на присутність пов'язаної ДНК-мішені. Виявлення за допомогою методів зворотного дот-блотинга описане, /о наприклад, у заїкКі і інш., 1989, Ргос. Маїй!. Асад. Зеї. О5А, 86: 6230, і в патенті США 5468613.
У альтернативному варіанті аналіз на основі зворотного дот-блотинга може бути проведений з використанням твердої підкладки, що має множину сайтів для відпалу зонда або лунок. Наприклад, мікролунковий планшет найбільш придатний для крупномасштабних клінічних застосувань методів по даному винаходу. Зонди можуть бути іммобілізовані на мікролунковому планшеті або шляхом пасивного скріплення, або /5 за допомогою проміжного протеїну, такого, як бичачий сироватковий альбумін (БСА), який прилипає до мікролункових планшетів (див. Типад і інш., 1991, Віосопіддаїе Спет., 2: 464-465). Методи на основі зворотного дот-блотинга, в яких використовується мікролунковий планшет, описані в патенті США 5232829; у І оеПеїпої? і інш., 1992, 9. Сііп. Місгобіо!., З0(11): 2847-2851; у дасквоп і інш., 1991, АІЮ5Б, 5: 1463-1467; у Миїдег і інш., 1994, 9. Сіїп. МісгоріоІї. 32(2): 292-300; в інструкції, включеній в комерційний набір Атріїсог НІМ- 1 2о Тез; і в інструкції, включеній в комерційний набір АМРОІСОК НІМ-1 МОМІТОК Тезі.
Переважно виявлення і/або кількісну оцінку апліфікованого продукту здійснюють з допомогою гібридизації з олігонуклеотидним зондом, іммобілізованим на мікролунковому планшеті, з використанням реагентів і протоколів
Атріїсог НІМ-1 Тезі або АМРІИЇСОК НІМ-1 МОМІТОК Тевзі. Застосування методів по даному винаходу для кількісної оцінки РНК ВІЛ-1 описане нижче в прикладах. сч
У іншому варіанті зонди, кон'юговані з БСА, зв'язують з магнітними мікрочастками. Пов'язані зонди гібридизують в розчині з міченим продуктом ампліфікації і продукт, що утворився видаляють з розчину і) магнітного шляхом. Іммобілізовані магнітним шляхом гібридні дуплекси потім виявляють описаними вище способами.
Інший придатний метод аналізу, названий 5'-нуклеазним методом, описаний в патентах США 5210015 і с зо 5487972 і у Ноїапа і інш., 1988, Ргос. Май. Асад. беї. ОБА, 88: 7276-7280. В 5-нуклеазном методі мічені зонди, що виявляються, модифіковані таким чином, щоб вони не могли діяти в якості праймерів в синтезі ДНК, і додають в реакційну суміш в процесі ампліфікації. Будь-який зонд, який гібридизується з ДНК-мішенню протягом «г кожної стадії синтезу, тобто в процесі подовження праймера, розщеплюють за допомогою 5-53" екзонуклеазній активності ДНК-полімерази, наприклад, ДНК-полімерази Тад. Потім виявляють продукт розкладання зонда. -
Таким чином, присутність продукту розкладання зонда свідчить як про те, що сталася гібридизація між зондом і «І
ДНК-мішенню, так і про те, що сталася реакція ампліфікації У патентах США 5491063 і 5571673 описані поліпшені способи виявлення розщеплення зонда, яке супроводить ампліфікацію.
У описаних вище методах аналізу для полегшення виявлення гібридних дуплексів звичайно використовують мічені олігонуклеотиди. Олігонуклеотиди можуть бути помічені шляхом включення мітки, що виявляється « спектроскопічним, фотохімічним, біохімічним, імунохімічним або хімічним методами. Придатні мітки - с включають ЗР, флуоресцентні фарби, електронно-щільні реагенти, ферменти (наприклад, такі, які ц використовуються в методі ЕГІЗА5), біотин або гаптени і протеїни, для яких доступні антисироватка або ,» моноклональні антитіла. Мічені олігонуклеотиди по винаходу можуть бути синтезовані і помічені з використанням способів, описаних вище для олігонуклеотидів, що синтезуються.
Альтернативний метод виявлення ампліфікації нуклеїнової кислоти ВІЛ-1 шляхом оцінки збільшення г» загальної кількості двохланцюгової ДНК в реакційній суміші описаний у Нідиснпі і інш., 1992, Віо/Гесппоіоду, 10: 413-417; Нідиснпі і інш., 1993, Віо/ГесппоІоду, 11: 1026-1030; і в публікації європейської заявки 512334. ї Виявлення двохланцюгової ДНК-мішені засноване на зростанні флуоресценції, яка виявляється, коли г» етидійбромид (ЕїВг) і інші мітки, що зв'язуються з ДНК, зв'язуються з двохланцюгової ДНК. Мітку, що с 50 зв'язується з ДНК, додають в реакційну суміш для ампліфікації. Ампліфікація послідовності-мішені приводить до збільшення кількості двохланцюгової ДНК, що в свою чергу приводить до збільшення, що виявляється
Що) флуоресценції.
Даний винахід також відноситься до наборів, багатоконтейнерних наборів, що містять відповідні компоненти для практичного здійснення способу по даному винаходу. Такий набір містить, наприклад, праймери для
ПЛР-ампліфікації нуклеїнової кислоти ВІЛ-1. Набір також може містити засоби для виявлення ампліфікованій нуклеїнової кислоти ВІЛ-1, такі, як олігонуклеотидні зонди. У деяких випадках зонди фіксують на відповідній о підкладці-мембрані. Інші необов'язкові компоненти набору включають, наприклад, агент, придатний як іме) каталізатор синтезу продуктів подовження праймера, нуклеозидтрифосфати як субстрат, засоби, що застосовуються для мічення (наприклад, кон'югат авидин-фермент, або ферментний субстрат і хромоген, в тому 60 випадку, коли мітка являє собою біотин), відповідні буфери для ПЛР або реакцій гібридизації і інструкції по здійсненню даного методу.
Нижче винахід детальніше проілюстрований на прикладах, які не обмежують об'єм винаходу. Численні варіанти здійснення винаходу в об'ємі формули винаходу, які витікають з прикладів, повинні бути очевидні фахівцям в даній області техніки на основі вищенаведеного опису і подальших прикладів. 65 Приклад 1.
Конструювання кількісного стандарту.
Для кількісної оцінки змісту вірусу, здійснюваної з допомогою АМРІЇСОМК НІМ-1 МОМІТОК Теві, використовують кількісний стандарт (КС), який ампліфікують із застосуванням тієї ж самої пари праймерів, але який виявляють з використанням іншого зонда. КС додають до зразка, що тестується, у відомій концентрації з
Метою отримати відомий еталонний сигнал. Для широкого діапазону концентрацій мішені сигнал, що генерується ампліфікованій мішенню або ампліфікованим КС, пропорційній кількості, що є. Кількість копій мішені оцінюють шляхом порівняння сигналу, що генерується при ампліфікації невідомої мішені, і сигналу, що генерується відомим КС.
Праймери по даному винаходу ампліфікують область, яка не повністю охоплюється КС, включеним в набір /0 АМРИСОК НІМ-1 МОМІТОК Теві (КО-Атріїсог). Тому для застосування праймерів по даному винаходу конструювали новий КС. Новий КС конструювали з КС-Атріїсог шляхом подовження послідовності КСО-Атріїсог з метою включити сайти скріплення ЗКОС1 (5ЕО І МО: 3) ії БКССЗ (5ЕО І МО: 4). КС, що утворився, може бути виявлений за допомогою КОС-специфічного зонда, що використовується в АМРІЇСОК НІМ-1 МОМІТОК Тевзі.
Конструювання плазміди, що містить послідовність нового КС, з якої транскрибують РНК КС, може бути 7/5 Здійснене з використанням стандартних методів, як описане нижче.
КО-Атріїсог, отриманий з АМРИСОК НІМ-1 МОМІТОК Тезі, ампліфікують з використанням праймерів 5К145 (ЗЕО ІО МО: 1) ії К151 (5ЕО ІО МО: 7) в умовах, практично відповідних таким, які описані нижче в прикладі 2.
В результаті ампліфікації отримували ДНК- продукт, що містить сайти скріплення для 5К145 (5ЕО ІЮ МО: 1) і
ЗК151 (ЗЕО ІЮО МО: 7) і що зберігає внутрішню послідовність, що містить сайт скріплення КС-специфічного зонда.
Ампліфікований продукт, що далі утворився, подовжують для включення сайта скріплення праймера 5КСС1 (ЗЕО ІО МО: 3) і додають лінкер для можливості клонування продукту. Цього досягають за допомогою повторної ампліфікації продукту з використанням праймера 5К145 (5ЕО ІО МО: 1), подовженого на 5'-кінці з тією метою, щоб включити лінкер Ніпаш і ЗКОСС1 (5ЕО ІЮО МО: 3). Відповідні умови ампліфікації описані у КеПодд і Кугок, 1990, в РСК РгоїосоЇв: А Сціде о Меїййодз апа Арріїсайопв, (ред. Іппів і інш.,),, Асадетіс Ргезв, Зап Оіедо, сч ов СА: 337-347, за винятком того, що використовують більш низьку температуру відпалу/подовження (наприклад, 42"С) для гібридизації БХКСС1 (ЗЕО ІО МО: 3). і)
Після цього ампліфікований продукт, що утворився, ще раз подовжують для включення сайта скріплення праймера ЗКОССЗ (5ЕБО ІЮ МО: 4) і додають другу лінкер до іншого кінця для забезпечення можливості клонування продукція. Цього досягають за допомогою ампліфікації продукту з використанням праймера 5К145 с зо (ЗЕО О МО: 1), подовженого на 5-кінці з тією метою, щоб включити лінкер НіпаїїІ, як описано вище, поряд з праймером ЗКОССЗ (5ЕО 11) МО: 4), подовженим на 5-кінці для включення лінкера ХваЇ з використанням о описаних вище умов ампліфікації. «г
Потім ампліфікований продукт вбудовують в плазміду. Ампліфіковану ванну ДНК і плазміду реРб64 (фірма
Рготеда, Мадізоп, М/І) по окремості розщеплюють з допомогою Ніпай| і Хваї, а потім лигують з використанням ї- зв стандартних методів. Компетентні клітки трансформують рекомбінантними плазмідами і отримують клон, який «Е містить правильну вставку. Клоновану вставку в отриманої рекомбінантної плазміді необхідно секвенувати з метою визначити, що в сайти скріплення праймера або зонда не введені мутації.
РНК кількісного стандарту транскрибують виходячи з рекомбінантної плазміди, що містить КС-послідовність, з використанням набору МЕСАзсгірп" 5Рб (фірма Атрбіоп, Іпс., А!Мзііп, ТХ). «
Приклад 2. з с Кількісна оцінка РНК ВІЛ-1
У цьому прикладі описаний спосіб оцінки відносної ефективності ампліфікації різних ізолятів ВІЛ-1. Для ;» порівняння також здійснювали ампліфікації з використанням набору АМРІІСОК НІМ-1 МОМІТОК Тевзі.
Ізоляти ВІЛ-1 отримували з ВІЛ-1-позитивних клінічних зразків. Область гена дад клонували і секвенували по стандартних методах, а підтип клонуємого ВІЛ-1 визначали, засновуючись на аналізі послідовності. Був їх виявлений ряд нових ізолятів ВІЛ-1. Для цієї мети на основі нуклеотидних послідовностей вибирали певні ізоляти, для яких передбачається наявність проблем при використанні набору АМРІ ЇСОК НІМ-1 МОМІТОК Тевзі. - Крім того, використали ізоляти, яким була властива варіабельність послідовності, характерна для підтипів їх групи М.
Нуклеїнова кислота-мішень. о Конструювали плазміди, що містять область гена дад ВІЛ-1 з кожного ізолята, і РНК-матриці ВІЛ-1
Ге транскрибували практично відповідно до методу, описаного у Ноіоапіу і інш., 1991, У. Іпї. Оів., 163: 802-865.
Готували маточні розчини кожної матриці і визначали концентрації матриць. Маточні розчини розбавляли, засновуючись на визначенні відносних концентрацій, таким чином, щоб концентрація матриць, що додаються в дво Кожну реакційну суміш, була однаковою. Абсолютна кількість копій матриці, що додаються в реакційні суміші, становила приблизно 4000-8000. (Ф) Кількісний стандарт. ка КС, описаний в прикладі 1, вносили в кожну реакційну суміш у відомій концентрації, звичайно приблизно 100 копій на реакційну суміш. 60 Праймери.
Реакції А-Е здійснювали з використанням наступних комбінацій праймерів.
Комбінації праймерів, що зрівнюються
Реакція Комбінація праймерів б5
А ЗК462 (ВЕС О МО: 5)
ЗКА31 (ВЕС О МО: 6)
Б ЗК145 (ЗЕ ІО МО: 1)
ЗК151 (ВЕС ІО МО: 7) в ЗК145 (ЗЕ ІО МО: 1)
ЗКССІ (ЗЕО ІО МО: 3)
Г 8К145 (ВЕС ІО МО: 1) ї ЗК1А45М2 (ЗЕ 0 МО: 2)
ЗКССІ (ЗЕО ІО МО: 3)
Д ЗК145 (ЗЕ ІО МО: 1) 70 ЗКССЗ (ЗЕО ІЮ МО: 4)
Е 8К145 (ЗЕО ІО МО: 1) і ЗК1А5М2 (ЗЕ 0 МО: 2)
ЗКССЗ (ЗЕО ІЮ МО: 4)
Всі праймери біотинували на 5-кінці для виявлення методом зворотного дот-блотинга на мікролунковому 15 планшеті. Послідовності додаткових, не описаних вище праймерів, приведені нижче в орієнтації 5-53".
Праймери, що ініціюють синтез проти ходу транскрипції:
ЗК462 (ЗЕО ІЮ МО: 5) АСТТОСАССАСАТСААОСАСССАТОСАААТ
Праймери, що ініціюють синтез по ходу транскрипції:
ЗК431 (5БО І МО: 6) ТОСТАТОТСАСТТоСССтТТОоСстТТетТетТ 20 ЗКІБ1 (ЗЕО І МО: 7) ТОСТАТОТСАСТТССССТТОСТТОСТоСтТ
Ампліфікація.
Реакцію ампліфікації А проводили з використанням реагентів і умов з набору
АМРИИСОК НІМ-1 МОМІТОК Теві.
Реакцію ампліфікації Б проводили в об'ємах по 100мкл, що містять наступні реагенти: Га 25 РНК-матриця ВІЛ-1
РНК КС і) 5ОММ біцин, рН 8,3 111мМ К(ОАс)
З, бмМ Мп(ОАс)» Ге 30 500мМкМ дУтТФ
З00мМкМ кожного з ДАТФ, ДЦТФі дГТФ і.
БоМмкМ дІФ «І 1596- ний гліцерин 0,2мкМ кожного біотинованого праймера - 35 2 одиниці урацил-ДНК-гликозилази (УДГ) " «Її одиниць ДНК-полімерази г " " Виробництво і розробка фірми Нойтанп-І а Косне і продаж фірмою Регкіп ЕІтег (Могмаїк, СТ).
Реакції ампліфікації В і Г здійснювали практично при таких же умовах, які використовувалися в реакції Б, « але з наступними змінами: 100мММ К(ОАс) - с 500мМкМ кожного з ДАТФ, ДЦДТФі дГтФ ц 7,595 -ний гліцерин и"? 10 одиниць УДГ
Реакції ампліфікації Д і Е здійснюють практично при таких же умовах, які використовувалися в реакціях В і
Г, але за винятком того, що концентрація гліцерину, що використовується, становила 1095. Невеликі відмінності «г» в реакційних сумішах були результатом попередньої оптимізації умов ампліфікації для кожної пари праймерів.
Реакції ампліфікації Б-Е проводили в ДНК-термокоміркі типу ТС9600 (фірма Регкіп ЕІтег, МогмаїЇК, СТ) з і використанням наступного температурного профілю:
ЧК» інкубація перед реакцією: БОС протягом 2 хвилин і зворотна транскрипція: 607С протягом 30 хвилин;
Кз 4 циклу: Денатурація: 95"7С протягом 10 секунд,
Відпал: 557С протягом 10 секунд і
Подовження: 72"7С протягом 10 секунд; 26 циклів: Денатурація: 907С протягом 10 секунд,
Відпал: 607С протягом 10 секунд і
Ф) Подовження: 72"7С протягом 10 секунд; ко остаточне подовження: 727 протягом 15 хвилин. во Виявлення апліфікованого продукту з допомогою гібридизації із зондом.
Ампліфіковані продукти виявляли з використанням реагентів і протоколів з набору АМРІІСОК НІМ-1
МОМІТОК Тезі. Початкову концентрацію мішені, що оцінюється, обчислювали відповідно до даного опису.
Результати.
При використанні кількісного методу АМРІЇСОК НІМ-1 МОМІТОК Теві початкову концентрацію мішені 65 оцінюють шляхом порівняння сигналу, генерованого після ампліфікації мішені, з сигналом, генерованим після ампліфікації КС відомої концентрації. Оскільки відома концентрація КС являє собою концентрацію перед ампліфікацією, а сигнали, що порівнюються, являють собою сигнали, отримані після ампліфікації, то зміни у відносній ефективності ампліфікації повинні впливати на оцінку початкової концентрації невідомої мішені. При кількісній оцінці з допомогою АМРІЇСОК НІМ-1 МОМІТОК Теві використовують калібрування, засноване на ефективності ампліфікації підтипа В ВІЛ-1. Відомо, що інші підтипи ВІЛ-1 можуть ампліфікуватися з більш низькою ефективністю, і, отже, концентрація мішені, що оцінюється може бути занижена в порівнянні з істинною.
У даному експерименті до кожної реакційної суміші додавали РНК-мішень у відомій концентрації. Таким чином, відносна ефективність ампліфікації для кожного ізолята може бути визначена шляхом порівняння концентрацій мішені, що оцінюються. Оскільки при кількісній оцінці в наборі АМРИСОК НІМ-1 МОМІТОК Тезі використовують 70 калібрування, засноване на ефективності ампліфікації підтипа В ВІЛ-1, як еталон використали концентрацію мішені підтипа В (клон 105-1), що оцінюється. Для кожного ізолята концентрацію мішені підтипа В (клан 105-1), що оцінюється, співвідносили з концентрацією мішені для ізолята, що оцінюється, отримуючи міру відносної ефективності ампліфікації. Ця відносна ефективність ампліфікації приведена нижче в таблиці. Символ "-- означає, що реакцію не проводили. 070-О : клоніпдтиті А БІ в| где, зл) вм тлрепятяов, за Аля спзииивов, пал А рзя сляизолов, паз, А вв тайипятвов, во дяетя о овид отв, пз) вія 24) твоя, вв 10 сч появ с 73 Свв тя, оте ові овололов о зви 009 овололов, пов ЕБЮтаввл ВИ вОВ, ж вро) ово, сч зо пол) за ово тя, сови) в ле; -28| гів тв о 083 ві ов -овововов, « лом) в зав поврвовозі ча
Результати показують, що при використанні набору АМРІ ІЇСОК НІМ-1 МОМІТОК Тевзі (реакція А) різні ізоляти «І
ВІЛ-1 ампліфікувались з істотно різною ефективністю. Деякі з ізолятів, включаючи ізолят підтипа Е, клон 110-5, ампліфікувались з ефективністю принаймні приблизно в 500 раз більш низької, ніж ефективність ампліфікації клану 105-1 підтипа В.
Хоч не всі ізоляти були досліджені, застосування пари праймерів 5К145 (5ЕО ІЮО МО: 1) і 5К151 (ЗЕО ІЮ МО: « 20 7) (реакція Б) дозволило істотно вирівняти ефективність ампліфікації. Однак клан 110-5 підтипа Е як і раніше 8 с ампліфікувався з ефективністю принаймні приблизно в 500 раз більш низької, ніж ефективність ампліфікації й клона 105-1 підтипа В. "» Застосування праймерів 5К145 (ЗЕО ІЮ МО: 1) ії ЗКСС1 (ЗЕО ІЮО МО: 3) (реакція В) дозволило ампліфікувати всі ізоляти, включаючи ізолят підтипа Е, клон 110-5, з ефективністю приблизно в З рази меншої, ніж ефективність ампліфікації клона 105-1 підтипа В. Добавлення праймера ЗК145М2 (ЗЕО П) МО: 2) (реакція Г) ще «» більш поліпшило ефективність ампліфікації ізолята 110-5, зробивши її практично рівного такого для еталонного штаму підтипа В. Аналогічно цьому застосування праймерів ЗК145 (ЗЕО ІЮ МО: 1) ії ЗКССЗ (5ЕО ІЮ МО: 4) і (реакція Д) дозволило ампліфікувати всі ізоляти, включаючи ізолят підтипа Е, клон 110-5, з ефективністю «їз» приблизно в 5 раз менше, ніж ефективність ампліфікації клона 105-1 підтипа В.
Добавлення праймера ЗК145М2 (5ЕО ІО МО: 2) (реакція Е) ще більш поліпшило ефективність ампліфікації о ізолята 110-5, зробивши її практично рівної ефективності для еталонного штаму підтипа В.
Кз Приклад З.
Кількісна оцінка ВІЛ-1 в клінічних зразках.
У цьому прикладі ЗО клінічних зразків, отриманих від пацієнтів з Сенегалу з позитивною серологічною реакцією, аналізували на присутність РНК ВІЛ-1. Підтипи, присутні в клінічних зразках, не визначали. Однак підтипи А ії ОО є звичайними для цього регіону Африки, тому потрібно було чекати, що деякі з цих клінічних іФ) зразків або не будуть ампліфікуватися зовсім, або будуть ампліфікуватися неефективно при використанні ко АМРИІСОК НІМ-1 МОМІТОК Тевзі. Зразки готували таким чином. Зразки плазми (80 - 250мкл) об'єднували в конічній центрифужної пробірці об'ємом 1,5мл з 20мкл 0,2595 (маси/об'єм) червоних полістиролових мікросфер бр типу Езвіарог (фірма Вапоз І арогайогіев, Іпс., Сагтеї, ІМ) і центрифугували протягом 1 ч при 253009 при 4"7С.
Супернатант відсмоктували і дебрис ресуспендували в 250мкл лізуючого буфера (5Омкл лізючого буфера містить б,/мкл Збод/мл КМазіп (фірма Рготеда, Мадізоп, М/І); 0,б7мкл 100мММ дитиотреїтола (ДТТ); 2мкл 1096-ного МР40О (фірма Ріегсе, Коскібга, І); 0,25мкл 4мг/мл роїу-гА РНК; і 40,4мкл обробленої ЮОерс Но»).
Дебриси інкубували при кімнатній температурі протягом принаймні 1бхв і інтенсивно перемішували для 65 забезпечення повного змішання.
Ампліфікації здійснювали в реакційних сумішах об'ємом 100мкл, що містять 5Омкл розчину вірусного лізата і
БОмкл 2-кратній суміші ампліфікованих реагентів, складеної таким чином, щоб кінцева концентрація реагенту відповідала вказаній вище. У кожну реакційну суміш у вигляді частини сумі|лі реагентів додавали приблизно 100 копій відповідного КС. Виявлення апліфікованого продукту здійснювали з використанням реагентів і протоколів
АМРИСОК НІМ-1 МОМІТОК Тевзі, як описано вище.
Ампліфікації кожного зразка проводили з наступними комбінаціями праймерів.
Комбінації праймерів, що порівнюються 70 Реакція Комбінація праймерів
А ЗК462 (ВЕС О МО: 5)
ЗКА31 (ВЕС О МО: 6)
Б ЗК145 (ЗЕ ІО МО: 1)
ЗКССІ (ЗЕО ІО МО: 3)
В 8К145 (ЗЕО І МО: 1) і ЗК145М2 (ЗЕ І МО: 2)
ЗКССІ (ЗЕО ІО МО: 3)
Результати, виражені у вигляді кількості копій ВІЛ-1-матриці на мл плазми, узагальнені нижче. бкхозв 00800 сво овоо| оо й см
Сркхтвг 0016020 овово ваза отвво о
Свкмтв»| отв ловго 4300 вон,
Сркхтєе 00 злдо| тою; ввет| 0 тодо сч з
Фо - в зв « « и з с . г» 4 ї. - омімовт; 01000 з
Фо» нн їз | дян дю міют| о зало вно 2520 овво, 59 о Результати свідчать про те, що комбінації праймерів Б і В по даному винаходу дозволяють ампліфікувати о більшу кількість клінічних зразків. Комбінації праймерів Б і В дозволяють ампліфікувати всі з ЗО зразків, крім одного. У протилежність цьому при використуванні АМРІЇСОК НІМ-1 МОМІТОК Теві не вдалося 60 ампліфікувати 6 із 29 зразків. Ампліфікація зразка МІН 053 з використанням АМРИІСОК НІМ-1 МОМІТОК Теві привела до отримання сильного сигналу від мішені, але не вдалося генерувати сигнал КС. Тому не вдалося оцінити кількісно цей зразок, і він позначений символом "-" в приведеній вище таблиці.
Крім того, для значної кількості зразків кількість копій, виявлених з використанням як комбінації праймерів Б, так і В, було значно вище, ніж така, що виявлено з використанням АМРИЇСОК НІМ-1 МОМІТОК Тевзі. бо Враховуючи варіабельність ефективності ампліфікації, яка показана вище в прикладі 2, можна передбачити, що більш низькі виявлені концентрації матриці, отримані з використанням АМРИСОК НІМ-1 МОМІТОК Тезі, ймовірно є результатом істотно більш низької ефективності ампліфікації.
Вірусна РНК не була виявлена в зразку МІМ 067. Однак невідомо, чи є це слідством невиявленої варіабельності послідовності-мішені, що служить перешкодою для гібридизації праймера або зонда, або це зумовлене якою-небудь іншою причиною.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ. п) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ: () ЗАЯВНИК: 70 (Є) КРАЇНА: Швейцарія (Р) ПОШТОВИЙ КОД (21Р): СН-407О (б) ТЕЛЕФОН: 061 688 37 82 (н) ТЕЛЕФАКС: 061 688 13 95 () ТЕЛЕКС: 962292/965542 Піг сп (Її) НАЗВА ВИНАХОДУ: Праймери для виявлення ВІЛ-1 (ії) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 7 (м) ФОРМА УЯВЛЕННЯ ДЛЯ КОМП'ЮТЕРА: (А) ТИП НОСІЯ: флоппи-диск (В) КОМП'ЮТЕР: Арріе Масіпіози (С) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: Зузієт 7.1 (Масіпіові) (6) ПРОГРАМНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ: Ууога 5.1 (мі) ДАНІ ПРО ПРІОРИТЕТНУ ЗАЯВКУ: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: 60-037744 (В) ДАТА ПОДАННЯ: 17.01.97 се (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІДОВНІСТЬ 5ЕО ІО МО: 1: о () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 30 пара основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАНЦЮГА: одноланцюгова с (6) ТОПОЛОГІЯ: лінійна со (ії) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 1: -
АСТОООСОСА САТСААОССАС ССАТЄСАААТ ї-
Зо (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІДОВНІСТЬ 5ЕО ІО МО: 2: « () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 30 пара основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота « (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАНЦЮГА: одноланцюгова 50 (6) ТОПОЛОГІЯ: лінійна З с (ії) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) :з» (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 2:
АСТООООБОСА САССАСОСАС СААТФСАААТ їз (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІДОВНІСТЬ ЕС ІО МО: 3: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: -і (4!) ДОВЖИНА: 28 пара основ їх (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАНЦЮГА: одноланцюгова і95) (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна з (ії) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕ ІЮ МО: 3:
ТАСТАСТАСТ ТОСТОСТАТО ТСАСТТОС
(2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІДОВНІСТЬ 5ЕО ІО МО: 4:
Ф) () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: ке (А) ДОВЖИНА: 26 пара основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота 6о (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАНЦЮГА: одноланцюгова (6) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ії) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 4:
ТОААОООСТАС ТАСТАСТТСС ТОСТАТ б5 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІДОВНІСТЬ ЗЕО ІО МО: 5:
() ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 30 пара основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАНЦЮГА: одноланцюгова (с) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ії) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮ МО: 5:
АСТТОСАССА САТСААССАС ССАТОСААДАТ
(2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІДОВНІСТЬ ЗЕО ІО МО: 6: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 27 пара основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАНЦЮГА: одноланцюгова (с) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ії) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮ МО: 8:
ТОСТАТСТСА СТТОСССТТОо СТТСТСТ (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІДОВНІСТЬ ЗЕО ІО МО: 7: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 27 пара основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота с (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАНЦЮГА: одноланцюгова о (с) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ії) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 7:
ТОСТАТСТСА СТТОСССТТОо СТТСТСТ с со
Claims (16)
- « Формула винаходу ча 35 1. Олігонуклеотидний праймер, призначений для ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту « людини типу 1 (ВІЛ-1), де вказаний олігонуклеотидний праймер ЗКОС1 включає нуклеотидну послідовність
- 2. Олігонуклеотидний праймер, призначений для ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту 40 людини ВІЛ-1, де вказаний олігонуклеотидний праймер 5КОССЗ включає нуклеотидну послідовність - с й ТОААСОСТАСТАСТАСТТССТОСТАТ. т"
- 3. Пара олігонуклеотидних праймерів, що складається з праймеру 5К145 з нуклеотидною послідовністю 45 АВТО ОООбАСАТСААОСАОССАТОСАДАТ ве та праймеру 5КСОСТ1 з нуклеотидною послідовністю -І в ТАСТАСТАОТТОСТОСТАТОТСАСТТОС. о 50
- 4. Набір олігонуклеотидних праймерів, що складається з пари олігонуклеотидних праймерів за п. З та праймеру 5К145М2 з нуклеотидною послідовністю Іо АСТОООСОбАСАССАСОСАССААТОСАААТ '
- 5. Пара олігонуклеотидних праймерів, що складається з праймеру 5К145 з нуклеотидною послідовністю АСТОБОООбАСАТСААОСАОССАТОСАААТ о та праймеру 5КОССЗ з нуклеотидною послідовністю іме) ТОДАСОСТАСТАСТАСТТССТОСТАТ. 6о
- 6. Набір олігонуклеотидних праймерів, що складається з пари олігонуклеотидних праймерів за п. 5 та праймеру 5К145М2 з нуклеотидною послідовністю
- 7. Набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини ВіІЛ-1, який включає бо олігонуклеотидний праймер за п. 1.
- 8. Набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини ВіІЛ-1, який включає олігонуклеотидний праймер за п. 2.
- 9. Набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини ВІЛ-1, який включає пару олігонуклеотидних праймерів за п. 3.
- 10. Набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини ВІЛ-1, який включає набір олігонуклеотидних праймерів за п. 4.
- 11. Набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини ВІЛ-1, який включає пару олігонуклеотидних праймерів за п. 5. 70
- 12. Набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини ВІЛ-1, який включає набір олігонуклеотидних праймерів за п. 6.
- 13. Спосіб ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини ВІЛ-1, який включає здійснення полімеразної ланцюгової реакції з використанням праймера ЗКСОС1 з нуклеотидною послідовністю з» ТАСТАСТАСТТССТОСТАТОТСАСТТОС або праймера ЗКССЗ з нуклеотидною послідовністю ТОААОООТАСТАСТАОТТССТОСТАТ.
- 14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що при полімеразній ланцюговій реакції додатково Використовують праймер 5К145 з нуклеотидною послідовністю
- 15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що при полімеразній ланцюговій реакції додатково використовують праймер 5К145М2 з нуклеотидною послідовністю с АСТОООООСАСАССАСОСАОСААТОСАААТ. о
- 16. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що при полімеразній ланцюговій реакції додатково використовують праймер 5К145М2 з нуклеотидною послідовністю сч з» АбТОООБОбАСАССАСОСАССААТОСАААТ. со « Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2002, М 7, 15.07.2002. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і Зо науки України. М ші с ;» щ» -І щ» о 50 Ко) Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3774497P | 1997-01-17 | 1997-01-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA47432C2 true UA47432C2 (uk) | 2002-07-15 |
Family
ID=21896067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA98010265A UA47432C2 (uk) | 1997-01-17 | 1998-01-16 | Олігонуклеотидний праймер, призначений для ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини типу 1 (віл-1) (варіанти), пара олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 (варіанти), спосіб ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5908743A (uk) |
| EP (1) | EP0854197B1 (uk) |
| JP (1) | JP2838084B2 (uk) |
| KR (1) | KR100257438B1 (uk) |
| CN (1) | CN1208469C (uk) |
| AT (1) | ATE345400T1 (uk) |
| AU (1) | AU693066B1 (uk) |
| BR (1) | BRPI9800337B8 (uk) |
| CA (1) | CA2222769C (uk) |
| CZ (1) | CZ288064B6 (uk) |
| DE (1) | DE69836395T2 (uk) |
| DK (1) | DK0854197T3 (uk) |
| ES (1) | ES2276436T3 (uk) |
| HK (1) | HK1010896A1 (uk) |
| HU (1) | HU223384B1 (uk) |
| IL (1) | IL122906A (uk) |
| NO (1) | NO323157B1 (uk) |
| PL (1) | PL191989B1 (uk) |
| RU (1) | RU2186112C2 (uk) |
| TW (1) | TW400386B (uk) |
| UA (1) | UA47432C2 (uk) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19850186A1 (de) * | 1998-10-30 | 2000-05-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV |
| DE19900511C2 (de) * | 1999-01-08 | 2001-03-15 | Deutsches Krebsforsch | Molekularbiologische Marker für die analytische Elektronenmikroskopie |
| US6245511B1 (en) * | 1999-02-22 | 2001-06-12 | Vialogy Corp | Method and apparatus for exponentially convergent therapy effectiveness monitoring using DNA microarray based viral load measurements |
| AU7104200A (en) * | 2000-09-01 | 2002-03-22 | Gen Probe Inc | Amplification of hiv-1 sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| US6582920B2 (en) | 2000-09-01 | 2003-06-24 | Gen-Probe Incorporated | Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| US6770752B2 (en) | 2001-01-09 | 2004-08-03 | Becton, Dickinson And Company | Sequences for detection of HIV-1 |
| EP1317960A1 (en) * | 2001-12-06 | 2003-06-11 | PamGene B.V. | System and method for analyzing a blood sample and disposable cartridge for use in this system or method |
| US7820030B2 (en) * | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| WO2006130165A2 (en) | 2004-09-02 | 2006-12-07 | Vialogy Corp. | Detecting events of interest using quantum resonance interferometry |
| KR101450497B1 (ko) | 2004-09-14 | 2014-10-13 | 아고스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | 병원체의 균주 독립성 증폭 및 그에 대한 백신 |
| CN100340673C (zh) * | 2005-02-03 | 2007-10-03 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 人类免疫缺陷病毒hiv－1核酸扩增－荧光定量检测试剂盒 |
| CN101144771B (zh) * | 2006-09-11 | 2012-05-30 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒 |
| EP2140033B1 (en) | 2007-03-28 | 2012-10-10 | Signal Diagnostics | System and method for high resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations |
| WO2009017743A2 (en) | 2007-07-30 | 2009-02-05 | Argos Therapeutics, Inc. | Improved primers and probes for the amplification and detection of hiv gag, rev and nef polynucleotides |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US10113206B2 (en) * | 2010-02-24 | 2018-10-30 | Grifols Therapeutics Inc. | Methods, compositions, and kits for determining human immunodeficiency virus (HIV) |
| EP2643460B1 (en) * | 2011-06-15 | 2017-07-26 | Grifols Therapeutics Inc. | Methods, compositions, and kits for determining human immunodeficiency virus (hiv) |
| US10370707B2 (en) | 2013-10-09 | 2019-08-06 | Fluoresentric, Inc. | Multiplex probes |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5386022A (en) * | 1985-03-28 | 1995-01-31 | Hoffman-La Roche Inc. | Primes and probes for the amplification and detection of aids associated nucleic acids |
| US5389512A (en) * | 1988-10-07 | 1995-02-14 | Hoffman-La Roche Inc. | Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction |
| US5695926A (en) * | 1990-06-11 | 1997-12-09 | Bio Merieux | Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support |
| AU686616B2 (en) * | 1993-03-26 | 1998-02-12 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
| JP3026843B2 (ja) * | 1993-07-23 | 2000-03-27 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 核酸増幅の促進法 |
| WO1995014109A1 (en) * | 1993-11-19 | 1995-05-26 | U.S. Department Of The Army | High through-put quantitative polymerase chain reaction for hiv clinical specimens |
| US5665545A (en) * | 1994-11-28 | 1997-09-09 | Akzo Nobel N.V. | Terminal repeat amplification method |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5702926A (en) * | 1996-08-22 | 1997-12-30 | Becton, Dickinson And Company | Nicking of DNA using boronated nucleotides |
-
1997
- 1997-12-17 CA CA002222769A patent/CA2222769C/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-08 EP EP98100196A patent/EP0854197B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 ES ES98100196T patent/ES2276436T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 AT AT98100196T patent/ATE345400T1/de active
- 1998-01-08 DK DK98100196T patent/DK0854197T3/da active
- 1998-01-08 DE DE69836395T patent/DE69836395T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-09 CN CNB981039111A patent/CN1208469C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-09 US US09/004,949 patent/US5908743A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-12 IL IL12290698A patent/IL122906A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-01-14 HU HU9800053A patent/HU223384B1/hu active IP Right Grant
- 1998-01-16 CZ CZ1998149A patent/CZ288064B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 BR BRPI9800337A patent/BRPI9800337B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 PL PL324327A patent/PL191989B1/pl unknown
- 1998-01-16 KR KR1019980001164A patent/KR100257438B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 UA UA98010265A patent/UA47432C2/uk unknown
- 1998-01-16 NO NO19980212A patent/NO323157B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 AU AU52099/98A patent/AU693066B1/en not_active Expired
- 1998-01-16 RU RU98100921/13A patent/RU2186112C2/ru active
- 1998-01-17 TW TW087100609A patent/TW400386B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-01-19 JP JP10007466A patent/JP2838084B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-09 HK HK98111846A patent/HK1010896A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2181196B1 (en) | Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids | |
| US11993804B2 (en) | Generic sample preparation | |
| UA47432C2 (uk) | Олігонуклеотидний праймер, призначений для ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини типу 1 (віл-1) (варіанти), пара олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір олігонуклеотидних праймерів (варіанти), набір для виявлення нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 (варіанти), спосіб ампліфікації нуклеїнової кислоти вірусу імунодефіциту людини віл-1 | |
| US9416398B2 (en) | Generic buffer for amplification | |
| EP2598654B2 (en) | Generic sample preparation | |
| JPH09163991A (ja) | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー | |
| CA2802567C (en) | Control nucleic acids for multiple parameters | |
| JP3909010B2 (ja) | 高度ダイナミックレンジを有する定量的多重ｐｃｒ | |
| US9234250B2 (en) | Control nucleic acids for multiple parameters | |
| US20210363517A1 (en) | High throughput amplification and detection of short rna fragments | |
| JP2009000063A (ja) | 改良されたノロウイルスｒｎａ検出方法 | |
| JP2022110152A (ja) | 診断方法及び組成物 | |
| EP2598653B1 (en) | Generic pcr | |
| US9175332B2 (en) | Generic PCR | |
| US20170283888A1 (en) | Use of rnase h for the selective amplification of viral dna | |
| CN117043355A (zh) | 用于新发传染病的即时需求诊断的保护性等温核酸扩增(pina)方法 |