JP2838084B2 - Ｈｉｖ−１の検出のためのプライマー - Google Patents
Ｈｉｖ−１の検出のためのプライマーInfo
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- JP2838084B2 JP2838084B2 JP10007466A JP746698A JP2838084B2 JP 2838084 B2 JP2838084 B2 JP 2838084B2 JP 10007466 A JP10007466 A JP 10007466A JP 746698 A JP746698 A JP 746698A JP 2838084 B2 JP2838084 B2 JP 2838084B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分子生物学及び核
酸化学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒ
ト免疫不全ウィルスタイプ１（ＨＩＶ−１）を検出する
ための方法及び試薬に関する。従って、本発明は、一般
的に医学、特に医学診断の分野、及び分子生物学の分野
に適用される。
酸化学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒ
ト免疫不全ウィルスタイプ１（ＨＩＶ−１）を検出する
ための方法及び試薬に関する。従って、本発明は、一般
的に医学、特に医学診断の分野、及び分子生物学の分野
に適用される。
【０００２】
【従来の技術】核酸の特定の配列を増幅するための方
法、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、こ
れまで検出できないほど小量である、サンプルに存在す
る核酸の急速な検出を可能にする（アメリカ特許第４，
６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；及び第
４，９６５，１８８号を参照のこと）。ＰＣＲの開発及
び適用は、文献において広範囲に記載されている。
法、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、こ
れまで検出できないほど小量である、サンプルに存在す
る核酸の急速な検出を可能にする（アメリカ特許第４，
６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；及び第
４，９６５，１８８号を参照のこと）。ＰＣＲの開発及
び適用は、文献において広範囲に記載されている。
【０００３】たとえば、広範囲のＰＣＲ関連のトピック
スは、PCR Technology-principlesand applications fo
r DNA amplification, 1989, (ed. H.A.Erlich) Stockt
onPress, New York, NY ; PCR Protocols : A guide to
methods and Applications, 1990 (ed. M.A.Innisな
ど.,) Academic Press, San Diego, CA ; 及びPCR Stra
tagies, 1995, (ed. M.A.Innisなど.) Academic Press,
San Diego, CAに論ぜられている。商業上の提供者、た
とえばPerkin Elmer (Norwalk, CT)は、ＰＣＲ試薬を市
販し、そしてＰＣＲプロトコールを公開している。
スは、PCR Technology-principlesand applications fo
r DNA amplification, 1989, (ed. H.A.Erlich) Stockt
onPress, New York, NY ; PCR Protocols : A guide to
methods and Applications, 1990 (ed. M.A.Innisな
ど.,) Academic Press, San Diego, CA ; 及びPCR Stra
tagies, 1995, (ed. M.A.Innisなど.) Academic Press,
San Diego, CAに論ぜられている。商業上の提供者、た
とえばPerkin Elmer (Norwalk, CT)は、ＰＣＲ試薬を市
販し、そしてＰＣＲプロトコールを公開している。
【０００４】ＨＩＶ−１核酸を増幅し、そして検出する
ためへのＰＣＲ及びプローブハイブリダイゼーションの
使用は、Kwok, 1992, Ann.Med. 24 : 211-214；及びCo
utlee など., 1991, Mol.Cell.Probes ５：241-259 に
再考されている。ＰＣＲに基づくＨＩＶ−１検出アッセ
イは、たとえばアメリカ特許第５，００８，１８２号及
び第５，１７６，７７５号；Kellogg and Kwok, 1990,
PCR Protocols : A Guide to Methods and Application
s, (ed. Innis など.), Academic Press, SanDiego, CA
: 337-347 ; Holodniyなど., 1991, J.Inf.Dis. 163 :
802-865 ; Jockson など., 1991, AIDS ５：1463-1467
; 及びMulderなど., 1994, J.Clin.Microbiol. 32
(2) : 292-300に記載されている。
ためへのＰＣＲ及びプローブハイブリダイゼーションの
使用は、Kwok, 1992, Ann.Med. 24 : 211-214；及びCo
utlee など., 1991, Mol.Cell.Probes ５：241-259 に
再考されている。ＰＣＲに基づくＨＩＶ−１検出アッセ
イは、たとえばアメリカ特許第５，００８，１８２号及
び第５，１７６，７７５号；Kellogg and Kwok, 1990,
PCR Protocols : A Guide to Methods and Application
s, (ed. Innis など.), Academic Press, SanDiego, CA
: 337-347 ; Holodniyなど., 1991, J.Inf.Dis. 163 :
802-865 ; Jockson など., 1991, AIDS ５：1463-1467
; 及びMulderなど., 1994, J.Clin.Microbiol. 32
(2) : 292-300に記載されている。
【０００５】ＨＩＶ−１の増幅及び検出のための市販の
キットは、Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ)から市販さ
れている。AmplicorTM HIV-1 Test は、ＨＩＶ−１プロ
ウィルスＤＮＡの検出のためのインビトロアッセイであ
る。AMPLICOR HIV-1 MONITOR TM Test は、ＨＩＶ−１
ＲＮＡの定量化のためのインビトロアッセイである。Ａ
ｍｐｌｉｃｏｒアッセイの両者は、Mulderなど., 1994,
J.Clin.Microbiol.32 (2) : 292-300に記載され、そし
てAmplicor HIV-1プライマーとして本明細書に言及され
るプライマー対ＳＫ４６２（配列番号５）及びＳＫ４３
１（配列番号６）を用いてＨＩＶ−１核酸を増幅する。
キットは、Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ)から市販さ
れている。AmplicorTM HIV-1 Test は、ＨＩＶ−１プロ
ウィルスＤＮＡの検出のためのインビトロアッセイであ
る。AMPLICOR HIV-1 MONITOR TM Test は、ＨＩＶ−１
ＲＮＡの定量化のためのインビトロアッセイである。Ａ
ｍｐｌｉｃｏｒアッセイの両者は、Mulderなど., 1994,
J.Clin.Microbiol.32 (2) : 292-300に記載され、そし
てAmplicor HIV-1プライマーとして本明細書に言及され
るプライマー対ＳＫ４６２（配列番号５）及びＳＫ４３
１（配列番号６）を用いてＨＩＶ−１核酸を増幅する。
【０００６】ＨＩＶ−１は、相当のゲノム配列変動性を
示す。ＨＩＶ−１ ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子の核酸配列
の系統分類分析は、Myers など., 1993, Human Retrovi
rusand AIDS 1993, Los Alamos National Laboratory,
Los Alamos, NM （引用により本明細書に組込まれる）
に記載される。Ｍグループ内に、サブタイプＡ−Ｊが同
定されている。
示す。ＨＩＶ−１ ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子の核酸配列
の系統分類分析は、Myers など., 1993, Human Retrovi
rusand AIDS 1993, Los Alamos National Laboratory,
Los Alamos, NM （引用により本明細書に組込まれる）
に記載される。Ｍグループ内に、サブタイプＡ−Ｊが同
定されている。
【０００７】当業者に知られている分子生物学及び核酸
化学の従来の技法は、文献に説明されている。たとえ
ば、Sambrookなど., 1989, Molecular Cloning-A Labor
atoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold S
pring Harbor, New York ; Oligonucleotide Synthesis
(M.J.Gait, ed., 1984) ; Nucleic Acid Hybridizatio
n (B.D.Hames and S.J.Higgins. eds., 1984)；及び一
連のMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.)を
参照のこと。
化学の従来の技法は、文献に説明されている。たとえ
ば、Sambrookなど., 1989, Molecular Cloning-A Labor
atoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold S
pring Harbor, New York ; Oligonucleotide Synthesis
(M.J.Gait, ed., 1984) ; Nucleic Acid Hybridizatio
n (B.D.Hames and S.J.Higgins. eds., 1984)；及び一
連のMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.)を
参照のこと。
【０００８】以前に記載されたｇａｇ遺伝子プライマ
ー、特にAmplicor HIV-1プライマー、ＳＫ４６２（配列
番号５）及びＳＫ４３１（配列番号６）を用いて増幅で
きないか又は効果的に増幅できない多くのヒト免疫不全
ウィルスタイプ１（ＨＩＶ−１）グループＭ単離物が同
定されている。それらの単離物は、Amplicor HIV-1プラ
イマーのプライマー結合部位を包含する領域内にこれま
で見出されていない配列変性性を示す。
ー、特にAmplicor HIV-1プライマー、ＳＫ４６２（配列
番号５）及びＳＫ４３１（配列番号６）を用いて増幅で
きないか又は効果的に増幅できない多くのヒト免疫不全
ウィルスタイプ１（ＨＩＶ−１）グループＭ単離物が同
定されている。それらの単離物は、Amplicor HIV-1プラ
イマーのプライマー結合部位を包含する領域内にこれま
で見出されていない配列変性性を示す。
【０００９】Amplicor HIV-1プライマーにより増幅でき
るすべての単離物の他に、それらの新しく発現された単
離物からの効果的な増幅を可能にする改良されたプライ
マーを供給することが本発明の目的である。さらに、本
発明のプライマーは、新たな一定した効率を伴ってすべ
ての既知のＨＩＶ−１グループのＭ単離物からの増幅を
可能にする。本発明の１つの観点は、新たな一定した効
率を伴って及び非標的配列の同時増幅を伴わないで、サ
ブタイプＡ−ＧからのＨＩＶ−１グループＭ単離物から
ｇａｇ遺伝子の領域のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増
幅を可能にする改良されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーに関する。
るすべての単離物の他に、それらの新しく発現された単
離物からの効果的な増幅を可能にする改良されたプライ
マーを供給することが本発明の目的である。さらに、本
発明のプライマーは、新たな一定した効率を伴ってすべ
ての既知のＨＩＶ−１グループのＭ単離物からの増幅を
可能にする。本発明の１つの観点は、新たな一定した効
率を伴って及び非標的配列の同時増幅を伴わないで、サ
ブタイプＡ−ＧからのＨＩＶ−１グループＭ単離物から
ｇａｇ遺伝子の領域のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増
幅を可能にする改良されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーに関する。
【００１０】特に、本発明は、ＳＫＣＣ１（配列番号
３）及びＳＫＣＣ３（配列番号４）から成る群から選択
される、ヒト免疫不全ウィルスタイプ１（ＨＩＶ−１）
核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーに関
する。好ましくは、それらのプライマーの個々は、ＳＫ
１４５（配列番号１）及びＳＫＣＣ１（配列番号３）か
ら成る一対のオリゴヌクレオチドプライマー又はＳＫ１
４５（配列番号１）及びＳＫＣＣ３（配列番号４）から
成る一対のオリゴヌクレオチドプライマーと組合され
る。
３）及びＳＫＣＣ３（配列番号４）から成る群から選択
される、ヒト免疫不全ウィルスタイプ１（ＨＩＶ−１）
核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーに関
する。好ましくは、それらのプライマーの個々は、ＳＫ
１４５（配列番号１）及びＳＫＣＣ１（配列番号３）か
ら成る一対のオリゴヌクレオチドプライマー又はＳＫ１
４５（配列番号１）及びＳＫＣＣ３（配列番号４）から
成る一対のオリゴヌクレオチドプライマーと組合され
る。
【００１１】さらなる態様において、それらの対のプラ
イマーは、オリゴヌクレオチドプライマーＳＫ１４５
（配列番号１）、ＳＫＣＣ１（配列番号３）及びＳＫ１
４５Ｍ２（配列番号２）から成る一組のオリゴヌクレオ
チドプライマー又はオリゴヌクレオチドプライマーＳＫ
１４５（配列番号１）、ＳＫＣＣ３（配列番号４）及び
ＳＫ１４５Ｍ２（配列番号２）から成る一組のオリゴヌ
クレオチドプライマーにおいてプライマーＳＫ１４５Ｍ
２（配列番号２）と組合され得る。
イマーは、オリゴヌクレオチドプライマーＳＫ１４５
（配列番号１）、ＳＫＣＣ１（配列番号３）及びＳＫ１
４５Ｍ２（配列番号２）から成る一組のオリゴヌクレオ
チドプライマー又はオリゴヌクレオチドプライマーＳＫ
１４５（配列番号１）、ＳＫＣＣ３（配列番号４）及び
ＳＫ１４５Ｍ２（配列番号２）から成る一組のオリゴヌ
クレオチドプライマーにおいてプライマーＳＫ１４５Ｍ
２（配列番号２）と組合され得る。
【００１２】本発明のさらなる観点は、本発明のプライ
マーを用いてＰＣＲを実施することを含んで成る、ＨＩ
Ｖ−１グループＭサブタイプからｇａｇ遺伝子の領域を
増幅するための改良された方法に関する。本発明のさら
なる観点は、本発明の増幅プライマーを含むキットに関
する。それらのキットは、追加の試薬、たとえば検出プ
ローブ、又は１又は複数の増幅試薬、たとえばポリメラ
ーゼ、緩衝液及びヌクレオシド三リン酸を含むことがで
きる。
マーを用いてＰＣＲを実施することを含んで成る、ＨＩ
Ｖ−１グループＭサブタイプからｇａｇ遺伝子の領域を
増幅するための改良された方法に関する。本発明のさら
なる観点は、本発明の増幅プライマーを含むキットに関
する。それらのキットは、追加の試薬、たとえば検出プ
ローブ、又は１又は複数の増幅試薬、たとえばポリメラ
ーゼ、緩衝液及びヌクレオシド三リン酸を含むことがで
きる。
【００１３】本発明の理解を助けるために、いくつかの
用語が下記に定義される。用語“核酸”及び“オリゴヌ
クレオチド”とは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２
−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオ
チド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリンもしくはピリ
ミジン塩基又は修飾されたプリン又はピリミジン塩基の
Ｎグリコシドであるいづれか他のタイプのポリヌクレオ
チドを意味する。用語“核酸”と“オリゴヌクレオチ
ド”との間に長さに関して意図された区別は存在せず、
そしてそれらの用語は交換可能的に使用されるであろ
う。それらの用語は、分子の一次構造体のみを意味す
る。従って、それらの用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮ
Ａ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを包含する。
用語が下記に定義される。用語“核酸”及び“オリゴヌ
クレオチド”とは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２
−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオ
チド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリンもしくはピリ
ミジン塩基又は修飾されたプリン又はピリミジン塩基の
Ｎグリコシドであるいづれか他のタイプのポリヌクレオ
チドを意味する。用語“核酸”と“オリゴヌクレオチ
ド”との間に長さに関して意図された区別は存在せず、
そしてそれらの用語は交換可能的に使用されるであろ
う。それらの用語は、分子の一次構造体のみを意味す
る。従って、それらの用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮ
Ａ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを包含する。
【００１４】オリゴヌクレオチドは、Narangなど., 197
9, Meth.Enzymol. 68 : 90-99のホスホトリエステル
法；Brown など., 1979, Meth.Enzymol. 68 : 109-151
のジエチルホスホラミジット法；及びアメリカ特許第
４，４５８，０６６号の固体支持法による、適切な配列
のクローニング及び制限酵素処理、及び直接的な化学合
成を包含するいづれか適切な方法により調製され得る。
合成法の総説は、Goodchild, 1990, Bioconjugate Chem
istry １ (3) : 165-187に提供される。
9, Meth.Enzymol. 68 : 90-99のホスホトリエステル
法；Brown など., 1979, Meth.Enzymol. 68 : 109-151
のジエチルホスホラミジット法；及びアメリカ特許第
４，４５８，０６６号の固体支持法による、適切な配列
のクローニング及び制限酵素処理、及び直接的な化学合
成を包含するいづれか適切な方法により調製され得る。
合成法の総説は、Goodchild, 1990, Bioconjugate Chem
istry １ (3) : 165-187に提供される。
【００１５】用語“ハイブリダイゼーション”とは、相
補的塩基対合による２つの一本鎖核酸による複合体の形
成を意味する。ハイブリダイゼーションは、十分に相補
的な核酸鎖間に、又はミスマッチのマイナー領域を含む
“実質的に相補的な”核酸鎖間で生じることができる。
十分に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズするであろ
う条件は、“緊縮ハイブリダイゼーション条件”又は
“配列特異的ハイブリダイゼーション条件”として言及
される。実質的に相補的な配列の安定した複合体は低い
緊縮ハイブリダイゼーション条件下で達成され得；許容
されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条
件の適切な調整により調節され得る。
補的塩基対合による２つの一本鎖核酸による複合体の形
成を意味する。ハイブリダイゼーションは、十分に相補
的な核酸鎖間に、又はミスマッチのマイナー領域を含む
“実質的に相補的な”核酸鎖間で生じることができる。
十分に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズするであろ
う条件は、“緊縮ハイブリダイゼーション条件”又は
“配列特異的ハイブリダイゼーション条件”として言及
される。実質的に相補的な配列の安定した複合体は低い
緊縮ハイブリダイゼーション条件下で達成され得；許容
されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条
件の適切な調整により調節され得る。
【００１６】核酸技法の当業者は、多くの変数、たとえ
ばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃度、イオン強
度、及びミスマッチされる塩基対の発生率を、当業界に
より提供されるガイドに従って、実験的に考慮して複合
体の安定性を決定することができる（たとえば、Sambro
okなど., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manu
al, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har
bor, New York ; 及びWetmur, 1991, Critical Reviews
in Biochem. and Mol.Biol. 26 (3/4) : 227-259を参
照のこと）。
ばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃度、イオン強
度、及びミスマッチされる塩基対の発生率を、当業界に
より提供されるガイドに従って、実験的に考慮して複合
体の安定性を決定することができる（たとえば、Sambro
okなど., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manu
al, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har
bor, New York ; 及びWetmur, 1991, Critical Reviews
in Biochem. and Mol.Biol. 26 (3/4) : 227-259を参
照のこと）。
【００１７】用語“プライマー”とは、核酸鎖に対して
相補的なプライマー延長生成物の合成が誘発される条件
下で、すなわち適切な緩衝液中、４種の異なったヌクレ
オシド三リン酸及び重合のための剤（たとえばＤＮＡポ
リメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で及び適切な温度
で、ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる、
天然又は合成のいづれかのオリゴヌクレオチドを意味す
る。プライマーは好ましくは、一本鎖オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、プ
ライマーの意図された使用に依存するが、しかし典型的
には、１５〜３５個のヌクレオチドの範囲である。
相補的なプライマー延長生成物の合成が誘発される条件
下で、すなわち適切な緩衝液中、４種の異なったヌクレ
オシド三リン酸及び重合のための剤（たとえばＤＮＡポ
リメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で及び適切な温度
で、ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる、
天然又は合成のいづれかのオリゴヌクレオチドを意味す
る。プライマーは好ましくは、一本鎖オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、プ
ライマーの意図された使用に依存するが、しかし典型的
には、１５〜３５個のヌクレオチドの範囲である。
【００１８】短いプライマー分子は一般的に、鋳型との
十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためによ
り低い温度を要する。プライマーは、鋳型核酸の正確な
配列に対して影響を及ぼさないが、しかし鋳型とハイブ
リダイズするために十分に相補的であるべきである。プ
ライマーは、そのプライマーの検出又は固定化を可能に
するが、しかしＤＮＡ合成の開始点として作用するプラ
イマーの基本的性質を変更しない追加の特徴を含むこと
ができる。たとえば、プライマーは、標的核酸に対して
ハイブリダイズしないが、しかし増幅された生成物のク
ローニングを促進する、５′端での追加の核酸配列を含
むことができる。ハイブリダイズするために鋳型に対し
て十分に相補的であるプライマーの領域が、ハイブリダ
イジング領域として本明細書に言及される。
十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためによ
り低い温度を要する。プライマーは、鋳型核酸の正確な
配列に対して影響を及ぼさないが、しかし鋳型とハイブ
リダイズするために十分に相補的であるべきである。プ
ライマーは、そのプライマーの検出又は固定化を可能に
するが、しかしＤＮＡ合成の開始点として作用するプラ
イマーの基本的性質を変更しない追加の特徴を含むこと
ができる。たとえば、プライマーは、標的核酸に対して
ハイブリダイズしないが、しかし増幅された生成物のク
ローニングを促進する、５′端での追加の核酸配列を含
むことができる。ハイブリダイズするために鋳型に対し
て十分に相補的であるプライマーの領域が、ハイブリダ
イジング領域として本明細書に言及される。
【００１９】本明細書において使用される場合、“上
流”のプライマーとは、その延長生成物がコード鎖の後
続物（subsequence ）であるプライマーを意味する。
“下流”のプライマーとは、その延長生成物が相補的非
コード鎖の後続物（subsequence）であるプライマーを
意味する。用語“標的配列”、“標的領域”、及び“標
的核酸”とは、増幅され、検出され、又はそうでなけれ
ば分析される予定である核酸の領域を意味する。
流”のプライマーとは、その延長生成物がコード鎖の後
続物（subsequence ）であるプライマーを意味する。
“下流”のプライマーとは、その延長生成物が相補的非
コード鎖の後続物（subsequence）であるプライマーを
意味する。用語“標的配列”、“標的領域”、及び“標
的核酸”とは、増幅され、検出され、又はそうでなけれ
ば分析される予定である核酸の領域を意味する。
【００２０】本明細書で使用される場合、プライマー
は、そのプライマーと標的配列との間に存在するミスマ
ッチの数が該プライマーとサンプル中に存在するかもし
れない非標的配列との間に存在するミスマッチの数より
も少ない場合、標的配列に対して“特異的”である。
は、そのプライマーと標的配列との間に存在するミスマ
ッチの数が該プライマーとサンプル中に存在するかもし
れない非標的配列との間に存在するミスマッチの数より
も少ない場合、標的配列に対して“特異的”である。
【００２１】存在するミスマッチの数がプライマーと標
的配列との間に存在するミスマッチの数よりも多くない
場合にのみ安定した複合体が形成されるハイブリダイゼ
ーション条件が選択され得る。そのような条件下で、標
的−特異的プライマーは、標的配列と共にのみ安定した
複合体を形成することができる。従って、適切な緊縮増
幅条件下での標的−特異的プライマーの使用は、標的プ
ライマー結合部位を含む配列の特異的増幅を可能にす
る。同様に、適切な緊縮ハイブリダイゼーション条件下
での標的−特異的プローブの使用は、特異的標的配列の
検出を可能にする。
的配列との間に存在するミスマッチの数よりも多くない
場合にのみ安定した複合体が形成されるハイブリダイゼ
ーション条件が選択され得る。そのような条件下で、標
的−特異的プライマーは、標的配列と共にのみ安定した
複合体を形成することができる。従って、適切な緊縮増
幅条件下での標的−特異的プライマーの使用は、標的プ
ライマー結合部位を含む配列の特異的増幅を可能にす
る。同様に、適切な緊縮ハイブリダイゼーション条件下
での標的−特異的プローブの使用は、特異的標的配列の
検出を可能にする。
【００２２】用語“増幅反応混合物”とは、増幅反応を
実施するために必要な試薬を含む溶液を意味し、そして
典型的には、適切な緩衝液中にプライマー、熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び二価金属カチオンを
含む。反応混合物は、それが反応を実施するために必要
なすべての試薬を含む場合、「完全」として言及され、
そしてそれが必要な試薬のサブセットのみを含む場合、
「不完全」として言及される。
実施するために必要な試薬を含む溶液を意味し、そして
典型的には、適切な緩衝液中にプライマー、熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び二価金属カチオンを
含む。反応混合物は、それが反応を実施するために必要
なすべての試薬を含む場合、「完全」として言及され、
そしてそれが必要な試薬のサブセットのみを含む場合、
「不完全」として言及される。
【００２３】便利のため、貯蔵安定性のため、又は成分
濃度の適用依存的調整を可能にするために、それぞれが
全成分のサブセットを含有する複数の別個の溶液とし
て、反応成分が日常的に貯蔵されること、及び反応成分
が完全な反応混合物を形成するように反応の前、混合さ
れることは、当業者により理解されるであろう。さら
に、反応成分が市販のために別々に包装され、そして有
用な市販のキットが本発明のプライマーを包含する反応
成分のいづれかのサブセットを含むことができること
は、当業者により理解されるであろう。
濃度の適用依存的調整を可能にするために、それぞれが
全成分のサブセットを含有する複数の別個の溶液とし
て、反応成分が日常的に貯蔵されること、及び反応成分
が完全な反応混合物を形成するように反応の前、混合さ
れることは、当業者により理解されるであろう。さら
に、反応成分が市販のために別々に包装され、そして有
用な市販のキットが本発明のプライマーを包含する反応
成分のいづれかのサブセットを含むことができること
は、当業者により理解されるであろう。
【００２４】ＨＩＶ−１増幅プライマー 本発明のプライマーは、ＨＩＶ−１グループのＭサブタ
イプからの核酸の増幅を可能にする。本発明のプライマ
ーは、新しく発見される単離物を包含する、グループＭ
に属するサブタイプＡ−Ｇのすべての単離物からのｇａ
ｇ遺伝子の核酸の増幅をほとんど領域からの一定した効
率を伴って可能にすることにおいて、これまで記載され
て来たプライマーよりも有意な改良点を示す。前記プラ
イマーのヌクレオチド配列は、下記に提供されており、
ここで配列は５′側から３′側の方向に左側から右側に
示される。
イプからの核酸の増幅を可能にする。本発明のプライマ
ーは、新しく発見される単離物を包含する、グループＭ
に属するサブタイプＡ−Ｇのすべての単離物からのｇａ
ｇ遺伝子の核酸の増幅をほとんど領域からの一定した効
率を伴って可能にすることにおいて、これまで記載され
て来たプライマーよりも有意な改良点を示す。前記プラ
イマーのヌクレオチド配列は、下記に提供されており、
ここで配列は５′側から３′側の方向に左側から右側に
示される。
【００２５】
【表１】
【００２６】本発明の下流プライマーは、本明細書に開
示される上流プライマーのいづれかと共に使用され得
る。本発明の下流プライマーは、好ましくは上流プライ
マーＳＫ１４５（配列番号１）と共に、場合によって
は、上流プライマーＳＫ１４５Ｍ２（配列番号２）と一
緒に使用され得る。上流プライマーＳＫ１４５（配列番
号１）は、Kellogg and Kwok, 1990, PCT Protocols :
A Guide to Methods and Applications, (ed. Innis な
ど.), Academic Press, San Diego, CA : 337-347に記
載されている。第２の上流プライマー、ＳＫ１４５Ｍ２
（配列番号２）は、ＳＫ１４５（配列番号１）と同じ領
域でハイブリダイズするが、しかし、サブタイプＡ及び
Ｅの一定のＨＩＶ−単離物のヌクレオチド配列とより密
接に適合するよう企画されている。例において示される
ように、両上流プライマーの使用は特定のサブタイプの
増幅の効率の平等化を助けることができる。
示される上流プライマーのいづれかと共に使用され得
る。本発明の下流プライマーは、好ましくは上流プライ
マーＳＫ１４５（配列番号１）と共に、場合によって
は、上流プライマーＳＫ１４５Ｍ２（配列番号２）と一
緒に使用され得る。上流プライマーＳＫ１４５（配列番
号１）は、Kellogg and Kwok, 1990, PCT Protocols :
A Guide to Methods and Applications, (ed. Innis な
ど.), Academic Press, San Diego, CA : 337-347に記
載されている。第２の上流プライマー、ＳＫ１４５Ｍ２
（配列番号２）は、ＳＫ１４５（配列番号１）と同じ領
域でハイブリダイズするが、しかし、サブタイプＡ及び
Ｅの一定のＨＩＶ−単離物のヌクレオチド配列とより密
接に適合するよう企画されている。例において示される
ように、両上流プライマーの使用は特定のサブタイプの
増幅の効率の平等化を助けることができる。
【００２７】増幅 増幅は、ＨＩＶ−１グループのＭサブタイプの増幅を可
能にするが、しかし非標的配列の増幅を回復する有意に
緊縮な条件下で行なわれる。好ましい増幅反応条件は、
Mulderなど., 1994, J.Clin.Microbiol. 32 (2) : 292
-300に、及びAMPLICOR HIV-1 MONITOR Test の生成物挿
入において記載されている。その正確な条件は、本発明
の決定的な観点ではない。増幅条件の最適化は、通常、
本明細書に提供されるガイドに基づいて実施され得る。
能にするが、しかし非標的配列の増幅を回復する有意に
緊縮な条件下で行なわれる。好ましい増幅反応条件は、
Mulderなど., 1994, J.Clin.Microbiol. 32 (2) : 292
-300に、及びAMPLICOR HIV-1 MONITOR Test の生成物挿
入において記載されている。その正確な条件は、本発明
の決定的な観点ではない。増幅条件の最適化は、通常、
本明細書に提供されるガイドに基づいて実施され得る。
【００２８】本発明のプライマー及び方法は、ＨＩＶ−
１プロウィルスＤＮＡ又はＨＩＶ−１ ＲＮＡのいづれ
かを検出するために使用され得る。逆転写／ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてのＲＮＡの増幅
は、当業界において良く知られており、そしてアメリカ
特許第５，３２２，７７０号及び第５，３１０，６５２
号；Myers and Gelfand, 1991, Biochemistry 30 (31)
: 7661-7666 ; 及びYoung など., 1993, J.Clin.Micro
biol. 31 (4) : 882-886に記載されている。ＨＩＶ−
１ ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、Mulderなど., 1994,
J.Clin.Microbiol.32 (2) : 292-300及びHolodniyな
ど., 1991, J.Inf.Dis. 163 : 802-865に記載されてい
る。
１プロウィルスＤＮＡ又はＨＩＶ−１ ＲＮＡのいづれ
かを検出するために使用され得る。逆転写／ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてのＲＮＡの増幅
は、当業界において良く知られており、そしてアメリカ
特許第５，３２２，７７０号及び第５，３１０，６５２
号；Myers and Gelfand, 1991, Biochemistry 30 (31)
: 7661-7666 ; 及びYoung など., 1993, J.Clin.Micro
biol. 31 (4) : 882-886に記載されている。ＨＩＶ−
１ ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、Mulderなど., 1994,
J.Clin.Microbiol.32 (2) : 292-300及びHolodniyな
ど., 1991, J.Inf.Dis. 163 : 802-865に記載されてい
る。
【００２９】ＨＩＶ−１ ＤＮＡ及びＲＮＡの増幅のた
めに適切なサンプル分離法は、文献に記載されている。
使用される特定の方法は、本発明の決定的な観点ではな
い。当業者は、本明細書に提供されるガイドに基づい
て、適切なサンプル調製法を選択し、そして最適化する
ことができる。ＨＩＶ−１プロウィルスＤＮＡの検出に
使用するための好ましいサンプル調製法は、Casareale
など., 1992, PCR Methods and Applications ２ : 149
-153及びButcher and Spadoro, 1992, Clin.Immunol.Ne
wsletter 12 : 73-76に記載されている。
めに適切なサンプル分離法は、文献に記載されている。
使用される特定の方法は、本発明の決定的な観点ではな
い。当業者は、本明細書に提供されるガイドに基づい
て、適切なサンプル調製法を選択し、そして最適化する
ことができる。ＨＩＶ−１プロウィルスＤＮＡの検出に
使用するための好ましいサンプル調製法は、Casareale
など., 1992, PCR Methods and Applications ２ : 149
-153及びButcher and Spadoro, 1992, Clin.Immunol.Ne
wsletter 12 : 73-76に記載されている。
【００３０】ＨＩＶ−１プロウィルスＤＮＡの検出のた
めの好ましいサンプル調製キットは、Amplicor HIV-1 T
est の一部として市販されている。血漿中のＨＩＶ−１
ＲＮＡの検出に使用するための好ましいサンプル調製
法は、Mulderなど., 1994, J.Clin.Microbiol. 32 (2)
: 292-300に記載されている。ＨＩＶ−１ ＲＮＡの検
出及び／又は定量化のための好ましいサンプル調製キッ
トは、AMPLICOR HIV-1MONITOR Test の一部として市販
されている。
めの好ましいサンプル調製キットは、Amplicor HIV-1 T
est の一部として市販されている。血漿中のＨＩＶ−１
ＲＮＡの検出に使用するための好ましいサンプル調製
法は、Mulderなど., 1994, J.Clin.Microbiol. 32 (2)
: 292-300に記載されている。ＨＩＶ−１ ＲＮＡの検
出及び／又は定量化のための好ましいサンプル調製キッ
トは、AMPLICOR HIV-1MONITOR Test の一部として市販
されている。
【００３１】増幅された生成物の分析 本発明の増幅プライマー及び方法は、増幅された核酸を
使用するいづれの用途のためにも適切である。たとえ
ば、ＨＩＶ−１配列のクローニング及び／又は配列決定
は、本発明のプライマーの使用により促進される。ＰＣ
Ｒ増幅された核酸を検出するための方法は、当業界にお
いて良く知られている。増幅された核酸を分析するため
に使用される方法は、本発明の決定的な観点ではなく、
そしていづれかの適切な方法が使用され得る。好ましく
は、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅は、ウィルス負荷を定量
化するために例に記載されるようにして使用される。
使用するいづれの用途のためにも適切である。たとえ
ば、ＨＩＶ−１配列のクローニング及び／又は配列決定
は、本発明のプライマーの使用により促進される。ＰＣ
Ｒ増幅された核酸を検出するための方法は、当業界にお
いて良く知られている。増幅された核酸を分析するため
に使用される方法は、本発明の決定的な観点ではなく、
そしていづれかの適切な方法が使用され得る。好ましく
は、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅は、ウィルス負荷を定量
化するために例に記載されるようにして使用される。
【００３２】増幅された核酸を検出するための方法の例
は、ゲル電気泳動による増幅生成物の分析、及び相補的
オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリゼイゼーショ
ンによる検出を包含する。標的−プローブハイブリダイ
ゼーションを検出するための適切なアッセイ形態は、当
業界において良く知られており、そしてドット−ブロッ
ト及び逆ドット−ブロットアッセイ形を包含する。
は、ゲル電気泳動による増幅生成物の分析、及び相補的
オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリゼイゼーショ
ンによる検出を包含する。標的−プローブハイブリダイ
ゼーションを検出するための適切なアッセイ形態は、当
業界において良く知られており、そしてドット−ブロッ
ト及び逆ドット−ブロットアッセイ形を包含する。
【００３３】ドット−ブロット形においては、増幅され
た標的ＤＮＡが固体支持体、たとえばナイロン膜上に固
定される。その膜−標的物複合体が、適切なハイブリダ
イゼーション条件下でラベルされたプローブと共にイン
キュベートされ、ハイブリダイズされていないプローブ
が適切な緊縮条件下で洗浄により除去され、そして前記
膜が、結合したプローブの存在についてモニターされ
る。ＰＣＲ増幅生成物のドット−ブロット検出は、たと
えばSaiki など., 1986, Nature 324 : 163-166及びア
メリカ特許第５，４６８，６１３号に記載されている。
た標的ＤＮＡが固体支持体、たとえばナイロン膜上に固
定される。その膜−標的物複合体が、適切なハイブリダ
イゼーション条件下でラベルされたプローブと共にイン
キュベートされ、ハイブリダイズされていないプローブ
が適切な緊縮条件下で洗浄により除去され、そして前記
膜が、結合したプローブの存在についてモニターされ
る。ＰＣＲ増幅生成物のドット−ブロット検出は、たと
えばSaiki など., 1986, Nature 324 : 163-166及びア
メリカ特許第５，４６８，６１３号に記載されている。
【００３４】逆ドット−ブロット形においては、プロー
ブが固体支持体、たとえばナイロン膜上に固定され、そ
して増幅された標的ＤＮＡがラベルされる。標的ＤＮＡ
は典型的には、ラベルされたプライマーの組込みによ
り、増幅の間、ラベルされる。一方の又は両方のプライ
マーがラベルされ得る。膜−プローブ複合体が、適切な
ハイブリダイゼーション条件下で、ラベルされそして増
幅された標的ＤＮＡと共にインキュベートされ、ハイブ
リダイズされていない標的ＤＮＡが適切な緊縮条件下で
洗浄により除去され、そして次に、フィルターが、結合
した標的ＤＮＡの存在についてモニターされる。逆ドッ
ト−ブロット法は、たとえばSaiki など.,1989, Proc.N
atl.Acad.Sci. USA 86：6230及びアメリカ特許第５，
４６８，６１３号に記載されている。
ブが固体支持体、たとえばナイロン膜上に固定され、そ
して増幅された標的ＤＮＡがラベルされる。標的ＤＮＡ
は典型的には、ラベルされたプライマーの組込みによ
り、増幅の間、ラベルされる。一方の又は両方のプライ
マーがラベルされ得る。膜−プローブ複合体が、適切な
ハイブリダイゼーション条件下で、ラベルされそして増
幅された標的ＤＮＡと共にインキュベートされ、ハイブ
リダイズされていない標的ＤＮＡが適切な緊縮条件下で
洗浄により除去され、そして次に、フィルターが、結合
した標的ＤＮＡの存在についてモニターされる。逆ドッ
ト−ブロット法は、たとえばSaiki など.,1989, Proc.N
atl.Acad.Sci. USA 86：6230及びアメリカ特許第５，
４６８，６１３号に記載されている。
【００３５】あるいは、逆ドット−ブロットアッセイ
は、多くのプローブハイブリダイゼーション部位又はウ
ェルを有する固体支持体を用いて実施され得る。たとえ
ば、マイクロウェルプレートは、本発明の方法の大規模
な臨床用途において特に有用である。プローブは、受動
的な結合により、又はマイクロウェルプレートに付着す
るタンパク質中間体、たとえばウシ血清アルブミンを通
して、マイクロウェルプレートに固定され得る（Tungな
ど., 1991, Bioconjugate Chem. ２ : 464-465を参照の
こと）。
は、多くのプローブハイブリダイゼーション部位又はウ
ェルを有する固体支持体を用いて実施され得る。たとえ
ば、マイクロウェルプレートは、本発明の方法の大規模
な臨床用途において特に有用である。プローブは、受動
的な結合により、又はマイクロウェルプレートに付着す
るタンパク質中間体、たとえばウシ血清アルブミンを通
して、マイクロウェルプレートに固定され得る（Tungな
ど., 1991, Bioconjugate Chem. ２ : 464-465を参照の
こと）。
【００３６】マイクロウェルプレートにおいて実施され
る逆ドット−ブロット法は、アメリカ特許第５，２３
２，８２９号；Loeffelholz など., 1992, J.Clin.Micr
obiol.30 (11) : 2847-2851 ; Jackson など., 1991, A
IDS ５ : 1463-1467 ; Mulder など., 1994, J.Clin.Mi
crobiol. 32 (2) : 292-300 ; the Amplicor HIV-1Tes
t製品挿入物；及びAMPLICOR HIV-1 MONITOR Test 製品
挿入物に記載されている。
る逆ドット−ブロット法は、アメリカ特許第５，２３
２，８２９号；Loeffelholz など., 1992, J.Clin.Micr
obiol.30 (11) : 2847-2851 ; Jackson など., 1991, A
IDS ５ : 1463-1467 ; Mulder など., 1994, J.Clin.Mi
crobiol. 32 (2) : 292-300 ; the Amplicor HIV-1Tes
t製品挿入物；及びAMPLICOR HIV-1 MONITOR Test 製品
挿入物に記載されている。
【００３７】好ましくは、増幅された生成物の検出及び
／又は定量化は、Amplicor HIV-1 Test 又はAMPLICOR H
IV-1 MONITOR Test の試薬及びプロトコールを用いて、
マイクロウェルプレート上に固定されたオリゴヌクレオ
チドプローブとのハイブリダイゼーションにより行なわ
れる。ＨＩＶ−１ ＲＮＡを定量化するためへの本発明
の方法の使用も例に記載されている。あるいは、ＢＳＡ
−接合されたプローブが磁気微粒子に結合される。結合
されたプローブは、ラベルされた増幅生成物に溶液中で
ハイブリダイズされ、そしてその得られるものが溶液か
ら磁気的に除去される。その磁気的に固定されたハイブ
リダイゼーション複合体は、上記方法におけるようにし
て検出される。
／又は定量化は、Amplicor HIV-1 Test 又はAMPLICOR H
IV-1 MONITOR Test の試薬及びプロトコールを用いて、
マイクロウェルプレート上に固定されたオリゴヌクレオ
チドプローブとのハイブリダイゼーションにより行なわ
れる。ＨＩＶ−１ ＲＮＡを定量化するためへの本発明
の方法の使用も例に記載されている。あるいは、ＢＳＡ
−接合されたプローブが磁気微粒子に結合される。結合
されたプローブは、ラベルされた増幅生成物に溶液中で
ハイブリダイズされ、そしてその得られるものが溶液か
ら磁気的に除去される。その磁気的に固定されたハイブ
リダイゼーション複合体は、上記方法におけるようにし
て検出される。
【００３８】５′−ヌクレアーゼアッセイとして言及さ
れるもう１つの適切なアッセイ方法は、アメリカ特許第
５，２１０，０１５号及び第５，４８７，９７２号、及
びHolland など., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88
: 7276-7280に記載される。５′−ヌクレアーゼアッセ
イにおいては、プローブがＤＮＡ合成のためのプライマ
ーとして作用するのを妨げるための変性されているラベ
ルされた検出プローブが、増幅の間、反応混合物に添加
される。
れるもう１つの適切なアッセイ方法は、アメリカ特許第
５，２１０，０１５号及び第５，４８７，９７２号、及
びHolland など., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88
: 7276-7280に記載される。５′−ヌクレアーゼアッセ
イにおいては、プローブがＤＮＡ合成のためのプライマ
ーとして作用するのを妨げるための変性されているラベ
ルされた検出プローブが、増幅の間、反応混合物に添加
される。
【００３９】個々の合成段階の間、すなわちプライマー
延長の間、標的ＤＮＡにハイブリダイズするいづれかの
プローブが、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼの５′から３′へのエキソヌクレアー
ゼ活性により分解される。次に、プローブからの分解生
成物が検出される。従って、プローブ分解生成物の存在
は、プローブと標的ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーシ
ョンが生じ、そして増幅反応が生じたことを示す。アメ
リカ特許第５，４９１，０６３号及び第５，５７１，６
７３号は、増幅と同時に生じるプローブの分解を検出す
るための改良された方法を記載する。
延長の間、標的ＤＮＡにハイブリダイズするいづれかの
プローブが、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼの５′から３′へのエキソヌクレアー
ゼ活性により分解される。次に、プローブからの分解生
成物が検出される。従って、プローブ分解生成物の存在
は、プローブと標的ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーシ
ョンが生じ、そして増幅反応が生じたことを示す。アメ
リカ特許第５，４９１，０６３号及び第５，５７１，６
７３号は、増幅と同時に生じるプローブの分解を検出す
るための改良された方法を記載する。
【００４０】上記アッセイ形は、典型的には、ハイブリ
ッド複合体の検出を促進するためにラベルされたオリゴ
ヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドは、分光、
光化学、生化学、免疫化学又は化学的手段により検出で
きるラベルを組込むことによってラベルされ得る。有用
なラベルは、32Ｐ、螢光色素、電子密集試薬、酵素（Ｅ
ＬＩＳＡＳにおいて通常使用されるような）、ビオチ
ン、又は抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用でき
るハプテン及びタンパク質を包含する。本発明のラベル
されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを合
成するための上記技法を用いて合成され、そしてラベル
され得る。
ッド複合体の検出を促進するためにラベルされたオリゴ
ヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドは、分光、
光化学、生化学、免疫化学又は化学的手段により検出で
きるラベルを組込むことによってラベルされ得る。有用
なラベルは、32Ｐ、螢光色素、電子密集試薬、酵素（Ｅ
ＬＩＳＡＳにおいて通常使用されるような）、ビオチ
ン、又は抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用でき
るハプテン及びタンパク質を包含する。本発明のラベル
されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを合
成するための上記技法を用いて合成され、そしてラベル
され得る。
【００４１】反応混合物における二本鎖ＤＮＡの合計量
の上昇をモニターすることによりＨＩＶ−１核酸の増幅
を検出するためのもう１つの方法は、Higuchi など., 1
992,Bio／Technology 10 : 413-417 : Higuchiなど.,
1993, Bio／Technology 11: 1026-1030；及びヨーロッ
パ特許公開第５１２，３３４号に記載される。二本鎖標
的ＤＮＡの検出は、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）及び他
のＤＮＡ結合ラベルが、二本鎖ＤＮＡに結合される場合
に示す高められた螢光に依存する。ＤＮＡ結合ラベルが
増幅反応混合物に添加される。標的配列の増幅は、二本
鎖ＤＮＡの増加をもたらし、これが螢光の検出可能な上
昇をもたらす。
の上昇をモニターすることによりＨＩＶ−１核酸の増幅
を検出するためのもう１つの方法は、Higuchi など., 1
992,Bio／Technology 10 : 413-417 : Higuchiなど.,
1993, Bio／Technology 11: 1026-1030；及びヨーロッ
パ特許公開第５１２，３３４号に記載される。二本鎖標
的ＤＮＡの検出は、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）及び他
のＤＮＡ結合ラベルが、二本鎖ＤＮＡに結合される場合
に示す高められた螢光に依存する。ＤＮＡ結合ラベルが
増幅反応混合物に添加される。標的配列の増幅は、二本
鎖ＤＮＡの増加をもたらし、これが螢光の検出可能な上
昇をもたらす。
【００４２】本発明はまた、キット、すなわち本発明を
実施するための有用な成分を含んで成る複数容器単位に
も関する。有用なキットは、ＨＩＶ−１核酸のＰＣＲ増
幅のためのプライマーを含む。キットはまた、増幅され
たＨＩＶ−１核酸を検出するための手段、たとえばオリ
ゴヌクレオチドプローブも含むことができる。多くの場
合、プローブは適切な支持膜に固定されている。キット
のための他の任意の成分は、たとえばプライマー延長生
成物の合成を触媒するための試薬、基質ヌクレオシド三
リン酸、ラベルするために使用される手段（たとえば、
アビジン−酵素接合体及び酵素基質、及びラベルがビオ
チンの場合、色原体）、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーシ
ョン反応のための適切な緩衝液、及び本発明を実施する
ための説明書を包含する。
実施するための有用な成分を含んで成る複数容器単位に
も関する。有用なキットは、ＨＩＶ−１核酸のＰＣＲ増
幅のためのプライマーを含む。キットはまた、増幅され
たＨＩＶ−１核酸を検出するための手段、たとえばオリ
ゴヌクレオチドプローブも含むことができる。多くの場
合、プローブは適切な支持膜に固定されている。キット
のための他の任意の成分は、たとえばプライマー延長生
成物の合成を触媒するための試薬、基質ヌクレオシド三
リン酸、ラベルするために使用される手段（たとえば、
アビジン−酵素接合体及び酵素基質、及びラベルがビオ
チンの場合、色原体）、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーシ
ョン反応のための適切な緩衝液、及び本発明を実施する
ための説明書を包含する。
【００４３】
【実施例】下記に示される本発明の例は、例示的であっ
て、本発明を限定するものではない。例１ ．定量標準の作製 AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test を用いて実施されるよう
なウィルス負荷の定量化は、同じプライマー対を用いて
増幅されるが、しかし別のプローブを用いて検出される
定量標準（ＱＳ）を用いる。ＱＳは、既知の対照シグナ
ルを提供するために既知濃度で試験サンプルに添加され
る。広範囲の標的物濃度のためには、増幅された標的物
又は増幅されたＱＳから生成されるシグナルは、その存
在する量に比例する。標的物のコピー数は、既知のＱＳ
から生成されるシグナルに対する、未知の標的物の増幅
から生成されるシグナルの比較から計算される。
て、本発明を限定するものではない。例１ ．定量標準の作製 AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test を用いて実施されるよう
なウィルス負荷の定量化は、同じプライマー対を用いて
増幅されるが、しかし別のプローブを用いて検出される
定量標準（ＱＳ）を用いる。ＱＳは、既知の対照シグナ
ルを提供するために既知濃度で試験サンプルに添加され
る。広範囲の標的物濃度のためには、増幅された標的物
又は増幅されたＱＳから生成されるシグナルは、その存
在する量に比例する。標的物のコピー数は、既知のＱＳ
から生成されるシグナルに対する、未知の標的物の増幅
から生成されるシグナルの比較から計算される。
【００４４】本発明のプライマーは、AMPLICOR HIV-1 M
ONITOR Test (the Amplicor QS) に含まれるＱＳ内に十
分には包含されない領域を増幅する。従って、新規ＱＳ
が、本発明のプライマーと共に使用するために作製され
た。その新規ＱＳは、ＳＫＣＣ１（配列番号３）及びＳ
ＫＣＣ３（配列番号４）の結合部位を包含するようAmpl
icor QS 配列を延長することによって、Amplicor QS か
ら構成された。その得られるＱＳは、AMPLICOR HIV-1 M
ONITOR Test に使用されるＱＳ−特異的プローブを用い
て検出できる。そこからＱＳ ＲＮＡが転写される、新
規ＱＳ配列を含むプラスミドの作製は、下記標準技法を
用いて実施され得る。
ONITOR Test (the Amplicor QS) に含まれるＱＳ内に十
分には包含されない領域を増幅する。従って、新規ＱＳ
が、本発明のプライマーと共に使用するために作製され
た。その新規ＱＳは、ＳＫＣＣ１（配列番号３）及びＳ
ＫＣＣ３（配列番号４）の結合部位を包含するようAmpl
icor QS 配列を延長することによって、Amplicor QS か
ら構成された。その得られるＱＳは、AMPLICOR HIV-1 M
ONITOR Test に使用されるＱＳ−特異的プローブを用い
て検出できる。そこからＱＳ ＲＮＡが転写される、新
規ＱＳ配列を含むプラスミドの作製は、下記標準技法を
用いて実施され得る。
【００４５】AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test から得られ
るAmplicor QS は、下記例２に実質的に記載されるよう
な条件下で、ＳＫ１４５（配列番号１）及びＳＫ１５１
（配列番号７）を用いて増幅される。その増幅は、ＳＫ
１４５（配列番号１）及びＳＫ１５１（配列番号７）の
ためのプライマー結合部位を含み、そしてＱＳ−特異的
プローブの結合部位を含む内部配列を保持するＤＮＡ生
成物を生成する。
るAmplicor QS は、下記例２に実質的に記載されるよう
な条件下で、ＳＫ１４５（配列番号１）及びＳＫ１５１
（配列番号７）を用いて増幅される。その増幅は、ＳＫ
１４５（配列番号１）及びＳＫ１５１（配列番号７）の
ためのプライマー結合部位を含み、そしてＱＳ−特異的
プローブの結合部位を含む内部配列を保持するＤＮＡ生
成物を生成する。
【００４６】次に、得られる増幅された生成物を、ＳＫ
ＣＣ１（配列番号３）のプライマー結合部位を包含する
よう延長し、そして生成物のクローニングを可能にする
ためにリンカーを添加する。これは、ＨｉｎｄIII リン
カー及びＳＫＣＣ１（配列番号３）を含むよう５′端で
延長されるＳＫ１４５（配列番号１）を用いて前記生成
物を再増幅することによって達成される。適切な増幅条
件は、Kellogg and Kwok, 1990, PCR Protocols : A Gu
id to Methods and Applications, (ed. Innisなど.,),
Academic Press, San Diego, CA : 337-347に記載され
るが、但し、より低いアニーリング／延長温度（たとえ
ば４２℃）が、ＳＫＣＣ１（配列番号３）のハイブリダ
イゼーションを可能にするために使用される。
ＣＣ１（配列番号３）のプライマー結合部位を包含する
よう延長し、そして生成物のクローニングを可能にする
ためにリンカーを添加する。これは、ＨｉｎｄIII リン
カー及びＳＫＣＣ１（配列番号３）を含むよう５′端で
延長されるＳＫ１４５（配列番号１）を用いて前記生成
物を再増幅することによって達成される。適切な増幅条
件は、Kellogg and Kwok, 1990, PCR Protocols : A Gu
id to Methods and Applications, (ed. Innisなど.,),
Academic Press, San Diego, CA : 337-347に記載され
るが、但し、より低いアニーリング／延長温度（たとえ
ば４２℃）が、ＳＫＣＣ１（配列番号３）のハイブリダ
イゼーションを可能にするために使用される。
【００４７】次に、得られる増幅された生成物を、ＳＫ
ＣＣ３（配列番号４）のプライマー結合部位を包含する
ようさらに延長し、そして生成物のクローニングを可能
にするために他の端で第２のリンカーを付加する。これ
は、上記と同じ増幅条件を用いて、ＸＢａＩリンカーを
包含するよう５′端で延長されるＳＫＣＣ３（配列番号
４）と一緒に、上記のようにＨｉｎｄIII リンカーを包
含するよう５′端で延長されるＳＫ１４５（配列番号
１）を用いて、生成物を増幅することによって達成され
る。
ＣＣ３（配列番号４）のプライマー結合部位を包含する
ようさらに延長し、そして生成物のクローニングを可能
にするために他の端で第２のリンカーを付加する。これ
は、上記と同じ増幅条件を用いて、ＸＢａＩリンカーを
包含するよう５′端で延長されるＳＫＣＣ３（配列番号
４）と一緒に、上記のようにＨｉｎｄIII リンカーを包
含するよう５′端で延長されるＳＫ１４５（配列番号
１）を用いて、生成物を増幅することによって達成され
る。
【００４８】次に、増幅された生成物を、プラスミド中
に挿入する。その増幅されたＤＮＡ及びプラスミドｐＳ
Ｐ６４（Pramega, Madison, WI）を、ＨｉｎｄIII 及び
ＸＢａＩにより別々に消化し、そして次に、標準の方法
を用いて連結する。コンピテント細胞を組換えプラスミ
ドにより形質転換し、そして正しい挿入体を含むクロー
ンを得る。得られる組換えプラスミド中のクローン化さ
れた挿入体を、プライマー又はプローブ結合部位中に突
然変異が導入されていないことを決定するために、配列
決定すべきである。ＱＳ ＲＮＡを、MEGA script TM S
P6キット（Ambion, Inc., Austin, TX）を用いて、ＱＳ
配列を含む組換えプラスミドから転写する。
に挿入する。その増幅されたＤＮＡ及びプラスミドｐＳ
Ｐ６４（Pramega, Madison, WI）を、ＨｉｎｄIII 及び
ＸＢａＩにより別々に消化し、そして次に、標準の方法
を用いて連結する。コンピテント細胞を組換えプラスミ
ドにより形質転換し、そして正しい挿入体を含むクロー
ンを得る。得られる組換えプラスミド中のクローン化さ
れた挿入体を、プライマー又はプローブ結合部位中に突
然変異が導入されていないことを決定するために、配列
決定すべきである。ＱＳ ＲＮＡを、MEGA script TM S
P6キット（Ambion, Inc., Austin, TX）を用いて、ＱＳ
配列を含む組換えプラスミドから転写する。
【００４９】例２．ＨＩＶ−１ ＲＮＡの定量化 この例は、種々のＨＩＶ−１単離物からの増幅の相対的
効率の評価を記載する。比較のために、増幅をまた、AM
PLICOR HIV-1 MONITOR Test Kit を用いて行なった。Ｈ
ＩＶ−１単離物を、ＨＩＶ−１陽性臨床サンプルから得
た。ｇａｇ遺伝子の領域を、標準技法を用いてクローン
化し、そして配列決定し、そしてクローン化されたＨＩ
Ｖ−１のサブタイプを、その配列に基づいて決定した。
多くのそれらのＨＩＶ−１単離物を新規であるものとし
て発見した。この例のためには、ヌクレオチド配列に基
づいて、AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test のためには問題
があるものとして予測される特定の単離物を選択した。
さらに、グループＭサブタイプに存在する配列変動を示
す単離物を用いた。
効率の評価を記載する。比較のために、増幅をまた、AM
PLICOR HIV-1 MONITOR Test Kit を用いて行なった。Ｈ
ＩＶ−１単離物を、ＨＩＶ−１陽性臨床サンプルから得
た。ｇａｇ遺伝子の領域を、標準技法を用いてクローン
化し、そして配列決定し、そしてクローン化されたＨＩ
Ｖ−１のサブタイプを、その配列に基づいて決定した。
多くのそれらのＨＩＶ−１単離物を新規であるものとし
て発見した。この例のためには、ヌクレオチド配列に基
づいて、AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test のためには問題
があるものとして予測される特定の単離物を選択した。
さらに、グループＭサブタイプに存在する配列変動を示
す単離物を用いた。
【００５０】標的核酸 個々の単離物からのＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子の領域を
含むプラスミドを作製し、そしてＨＩＶ−１ ＲＮＡ鋳
型を、Holodniyなど., 1991, J.Inf.Dis. 163: 802-865
に実質的に記載されるようにして、転写した。個々の鋳
型のストック液を製造し、そして鋳型の濃度をアッセイ
した。ストック液を、個々の反応に添加される鋳型の濃
度が同じであるように、評価された相対濃度に基づいて
希釈した。反応に添加される鋳型のコピーの絶対数は約
４０００〜８０００であった。
含むプラスミドを作製し、そしてＨＩＶ−１ ＲＮＡ鋳
型を、Holodniyなど., 1991, J.Inf.Dis. 163: 802-865
に実質的に記載されるようにして、転写した。個々の鋳
型のストック液を製造し、そして鋳型の濃度をアッセイ
した。ストック液を、個々の反応に添加される鋳型の濃
度が同じであるように、評価された相対濃度に基づいて
希釈した。反応に添加される鋳型のコピーの絶対数は約
４０００〜８０００であった。
【００５１】定量化標準 例１に記載されるようなＱＳを、既知の濃度、典型的に
は、１００のコピー／反応で、個々の反応混合物中に導
入した。プライマー 反応Ａ−Ｆを、次のプライマーの組合せを用いて行なっ
た。
は、１００のコピー／反応で、個々の反応混合物中に導
入した。プライマー 反応Ａ−Ｆを、次のプライマーの組合せを用いて行なっ
た。
【００５２】
【表２】
【００５３】すべてのプライマーを、逆ドット−ブロッ
トマイクロウェルプレート形においての検出を可能にす
るために５′端でビオチニル化した。上記に記載されな
い追加のプライマーの配列を下記に提供し、これは５′
側から３′側の方向に示されている。
トマイクロウェルプレート形においての検出を可能にす
るために５′端でビオチニル化した。上記に記載されな
い追加のプライマーの配列を下記に提供し、これは５′
側から３′側の方向に示されている。
【００５４】
【表３】
【００５５】増幅 増幅反応Ａを、AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test の試薬及
び条件を用いて行なった。増幅反応Ｂを、次の試薬を含
む１００μｌの体積において実施した：
び条件を用いて行なった。増幅反応Ｂを、次の試薬を含
む１００μｌの体積において実施した：
【００５６】
【表４】
【００５７】増幅反応Ｃ及びＤを、反応Ｂにおいて実質
的に使用されるような条件下で実施したが、但し、次の
変更を伴った：
的に使用されるような条件下で実施したが、但し、次の
変更を伴った：
【００５８】
【表５】
【００５９】増幅反応Ｅ及びＦを、反応Ｃ及びＤにおい
て実質的に使用されるような条件下で行なったが、但
し、１０％の濃度のグリセロールを用いた。反応混合物
における少々の差異は、個々のプライマー対のための増
幅条件の前の最適化に起因した。増幅反応Ｂ−Ｆを、次
の温度プロフィールを用いて、ＴＣ９６００ＤＮＡ熱サ
イクラー（Perkin Elmer, Norwalk, CT ）で実施した：
て実質的に使用されるような条件下で行なったが、但
し、１０％の濃度のグリセロールを用いた。反応混合物
における少々の差異は、個々のプライマー対のための増
幅条件の前の最適化に起因した。増幅反応Ｂ−Ｆを、次
の温度プロフィールを用いて、ＴＣ９６００ＤＮＡ熱サ
イクラー（Perkin Elmer, Norwalk, CT ）で実施した：
【００６０】
【表６】
【００６１】プローブハイブリダイゼーションによる増
幅された生成物の検出 増幅された生成物を、AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test の
試薬及びプロトコールを用いて検出した。推定される初
期標的物濃度を、本明細書に記載されるようにして計算
した。
幅された生成物の検出 増幅された生成物を、AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test の
試薬及びプロトコールを用いて検出した。推定される初
期標的物濃度を、本明細書に記載されるようにして計算
した。
【００６２】結果 AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test 定量化法においては、初
期標的物濃度は、既知濃度のＱＳの増幅の後に生成され
るシグナルに対する、標的物の増幅の後に生成されるシ
グナルの比較から見積もられる。ＱＳの既知濃度は予備
増幅値であるが、ところが比較されるシグナルは後−増
幅シグナルであるので、増幅の相対的効率の変化は、未
知の標的物の初期濃度の評価に影響を及ぼすであろう。
AMPLICORHIV-1 MONITOR Test 定量化を、ＨＩＶ−１サ
ブタイプＢの増幅効率に基づいて検量する。他のＨＩＶ
−１サブタイプは低い効率を伴って増幅され得、そして
結果的に、推定される標的物濃度は真の濃度の過小評価
であることが知られている。
期標的物濃度は、既知濃度のＱＳの増幅の後に生成され
るシグナルに対する、標的物の増幅の後に生成されるシ
グナルの比較から見積もられる。ＱＳの既知濃度は予備
増幅値であるが、ところが比較されるシグナルは後−増
幅シグナルであるので、増幅の相対的効率の変化は、未
知の標的物の初期濃度の評価に影響を及ぼすであろう。
AMPLICORHIV-1 MONITOR Test 定量化を、ＨＩＶ−１サ
ブタイプＢの増幅効率に基づいて検量する。他のＨＩＶ
−１サブタイプは低い効率を伴って増幅され得、そして
結果的に、推定される標的物濃度は真の濃度の過小評価
であることが知られている。
【００６３】本発明の実験においては、標的ＲＮＡを、
既知濃度で個々の反応に添加した。従って、個々の単離
物のための相対的増幅効率を、評価された標的物濃度を
比較することによって決定することができる。AMPLICOR
HIV-1 MONITOR Test 定量化はＨＩＶ−１サブタイプＢ
の増幅効率に基づいて検量されるので、サブタイプＢ
（クローン１０５−１）の推定される標的物濃度が対照
として使用された。個々の単離物のためには、サブタイ
プＢ（クローン１０５−１）のための推定される標的物
濃度が、相対的増幅効率の測定を提供するために、単離
物のための推定される標的物濃度により割り算された。
それらの相対的増幅効率は、下記表に報告されている。
“--- ”の記入は、反応が実施されなかったことを示
す。
既知濃度で個々の反応に添加した。従って、個々の単離
物のための相対的増幅効率を、評価された標的物濃度を
比較することによって決定することができる。AMPLICOR
HIV-1 MONITOR Test 定量化はＨＩＶ−１サブタイプＢ
の増幅効率に基づいて検量されるので、サブタイプＢ
（クローン１０５−１）の推定される標的物濃度が対照
として使用された。個々の単離物のためには、サブタイ
プＢ（クローン１０５−１）のための推定される標的物
濃度が、相対的増幅効率の測定を提供するために、単離
物のための推定される標的物濃度により割り算された。
それらの相対的増幅効率は、下記表に報告されている。
“--- ”の記入は、反応が実施されなかったことを示
す。
【００６４】
【表７】
【００６５】前記結果は、AMPLICOR HIV-1 MONITOR Tes
t （反応Ａ）が、効率における有意な変動を伴って、異
なったＨＩＶ−１単離物を増幅したことを示す。いくつ
かの単離物、たとえばサブタイプＥ単離物、クローン１
１０−５は、サブタイプＢ、クローン１０５−１の増幅
の効率よりも少なくとも約５００倍低い効率を伴って増
幅された。
t （反応Ａ）が、効率における有意な変動を伴って、異
なったＨＩＶ−１単離物を増幅したことを示す。いくつ
かの単離物、たとえばサブタイプＥ単離物、クローン１
１０−５は、サブタイプＢ、クローン１０５−１の増幅
の効率よりも少なくとも約５００倍低い効率を伴って増
幅された。
【００６６】すべての単離物が試験されたわけではない
が、プライマー対ＳＫ１４５（配列番号１）及びＳＫ１
５１（配列番号７）の使用（反応Ｂ）は、増幅効率の均
等性を有意に改良すると思われた。しかしながら、サブ
タイプＥ単離物、クローン１１０−５は、サブタイプ
Ｂ、クローン１０５−１の増幅の効率よりも約５００倍
低い効率を伴って、まだ、増幅された。
が、プライマー対ＳＫ１４５（配列番号１）及びＳＫ１
５１（配列番号７）の使用（反応Ｂ）は、増幅効率の均
等性を有意に改良すると思われた。しかしながら、サブ
タイプＥ単離物、クローン１１０−５は、サブタイプ
Ｂ、クローン１０５−１の増幅の効率よりも約５００倍
低い効率を伴って、まだ、増幅された。
【００６７】ＳＫ１４５（配列番号１）及びＳＫＣＣ１
（配列番号３）の使用（反応Ｃ）は、サブタイプＢ、ク
ローン１０５−１の増幅の効率の約３倍以内の効率で、
サブタイプＥ単離物、クローン１１０−５を包含するす
べての単離物の増幅を可能にした。ＳＫ１４５Ｍ２（配
列番号２）の添加（反応Ｄ）は、サブタイプＢ対照株の
効率と実質的に同等であるように単離物１１０−５の増
幅の効率をさらに改良した。
（配列番号３）の使用（反応Ｃ）は、サブタイプＢ、ク
ローン１０５−１の増幅の効率の約３倍以内の効率で、
サブタイプＥ単離物、クローン１１０−５を包含するす
べての単離物の増幅を可能にした。ＳＫ１４５Ｍ２（配
列番号２）の添加（反応Ｄ）は、サブタイプＢ対照株の
効率と実質的に同等であるように単離物１１０−５の増
幅の効率をさらに改良した。
【００６８】同様に、ＳＫ１４５（配列番号１）及びＳ
ＫＣＣ３（配列番号４）の使用（反応Ｅ）は、サブタイ
プＢ、クローン１０５−１の増幅の効率の約５倍以内の
効率を伴って、サブタイプＥ単離物、クローン１１０−
５を包含するすべての単離物の増幅を可能にした。ＳＫ
１４５Ｍ２（配列番号２）の添加（反応Ｆ）は、サブタ
イプＢ対照株の効率に実質的に同等であるように単離物
１１０−５の増幅の効率をさらに改良した。
ＫＣＣ３（配列番号４）の使用（反応Ｅ）は、サブタイ
プＢ、クローン１０５−１の増幅の効率の約５倍以内の
効率を伴って、サブタイプＥ単離物、クローン１１０−
５を包含するすべての単離物の増幅を可能にした。ＳＫ
１４５Ｍ２（配列番号２）の添加（反応Ｆ）は、サブタ
イプＢ対照株の効率に実質的に同等であるように単離物
１１０−５の増幅の効率をさらに改良した。
【００６９】例３．臨床サンプルにおけるＨＩＶ−１の
定量化 この例においては、セネガルからの血清陽性患者から得
られた３０の臨床サンプルを、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの存
在についてアッセイした。その臨床サンプルに存在する
サブタイプは測定されなかった。しかしながら、サブタ
イプＡ及びＤはアフリカのこの地域において通常である
ので、臨床サンプルのいくつかは増幅されないか、又は
AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test を用いて効果的に増幅さ
れないだろうことが予測された。
定量化 この例においては、セネガルからの血清陽性患者から得
られた３０の臨床サンプルを、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの存
在についてアッセイした。その臨床サンプルに存在する
サブタイプは測定されなかった。しかしながら、サブタ
イプＡ及びＤはアフリカのこの地域において通常である
ので、臨床サンプルのいくつかは増幅されないか、又は
AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test を用いて効果的に増幅さ
れないだろうことが予測された。
【００７０】サンプルを次の通りにして調製した。血漿
検体（８０〜２５０μｌ）を、１．５mlの円錐形遠心分
離管において０．２５％（ｗ／ｖ）の赤色Ｅｓｔａｐｏ
ｒポリスチレン微小球体（Bangs Laboratories, Inc.,
Carmel, IN ）２０μｌと共に組合し、そして２５，３
００×ｇで１時間、４℃で遠心分離した。上清液をアス
ピレートし、そしてペレットを２５０μｌの溶解緩衝液
（５０μｌの溶解緩衝液は、６．７μｌの３００／μｌ
ＲＮａｓｉｎ（Promega, Madison, WI）；０．６７μ
ｌの１００mM ＤＴＴ；２μｌの１０％ ＮＰ４０（Pi
erce, Rockford, IL）；０．２５μｌの４mg／mlポリ−
ｒＡ ＲＮＡ；及び４０．４μｌのＤｅｐｃ−処理され
た水の溶液に等しい）に再懸濁した。ペレットを室温で
少なくとも１５分間インキュベートし、そして混合を確
かにするために回転せしめた。
検体（８０〜２５０μｌ）を、１．５mlの円錐形遠心分
離管において０．２５％（ｗ／ｖ）の赤色Ｅｓｔａｐｏ
ｒポリスチレン微小球体（Bangs Laboratories, Inc.,
Carmel, IN ）２０μｌと共に組合し、そして２５，３
００×ｇで１時間、４℃で遠心分離した。上清液をアス
ピレートし、そしてペレットを２５０μｌの溶解緩衝液
（５０μｌの溶解緩衝液は、６．７μｌの３００／μｌ
ＲＮａｓｉｎ（Promega, Madison, WI）；０．６７μ
ｌの１００mM ＤＴＴ；２μｌの１０％ ＮＰ４０（Pi
erce, Rockford, IL）；０．２５μｌの４mg／mlポリ−
ｒＡ ＲＮＡ；及び４０．４μｌのＤｅｐｃ−処理され
た水の溶液に等しい）に再懸濁した。ペレットを室温で
少なくとも１５分間インキュベートし、そして混合を確
かにするために回転せしめた。
【００７１】増幅を、最終試薬濃度が上記のようになる
よう配合された増幅試薬の２×混合物５０μｌ及びウィ
ルス溶解物の溶液５０μｌを含む１００μｌの反応にお
いて行なった。適切なＱＳの約１００のコピーを、試薬
混合物の一部として、個々の反応に添加した。増幅され
た生成物の検出を、上記のようにして、AMPLICOR HIV-1
MONITOR Test の試薬及びプロトコールを用いて実施し
た。個々のサンプルの増幅は、次のプライマーの組合せ
を用いて実施された。
よう配合された増幅試薬の２×混合物５０μｌ及びウィ
ルス溶解物の溶液５０μｌを含む１００μｌの反応にお
いて行なった。適切なＱＳの約１００のコピーを、試薬
混合物の一部として、個々の反応に添加した。増幅され
た生成物の検出を、上記のようにして、AMPLICOR HIV-1
MONITOR Test の試薬及びプロトコールを用いて実施し
た。個々のサンプルの増幅は、次のプライマーの組合せ
を用いて実施された。
【００７２】
【表８】 ＨＩＶ−１鋳型のコピー／ml血漿で表わされる結果が下
記に要約される。
記に要約される。
【００７３】
【表９】
【００７４】前記結果は、本発明のプライマー、組合せ
Ｂ及びＣが、多くの臨床サンプルからの増幅を可能にし
たことを示す。プライマー組合せＢ及びＣは、３０種の
サンプルのうち１つを除いて他のすべてのサンプルから
の増幅を可能にした。対照的に、AMPLICOR HIV-1 MONIT
OR Test は、２９種のサンプルのうち６種のサンプルの
増幅に失敗した。AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test を用い
てのサンプルＭＩＨ０５３の増幅は、強い標的物シグナ
ルをもたらしたが、しかしＱＳシグナルの生成には失敗
した。従って、そのサンプルは定量化できず、そして上
記表においては、“＋”として示されている。
Ｂ及びＣが、多くの臨床サンプルからの増幅を可能にし
たことを示す。プライマー組合せＢ及びＣは、３０種の
サンプルのうち１つを除いて他のすべてのサンプルから
の増幅を可能にした。対照的に、AMPLICOR HIV-1 MONIT
OR Test は、２９種のサンプルのうち６種のサンプルの
増幅に失敗した。AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test を用い
てのサンプルＭＩＨ０５３の増幅は、強い標的物シグナ
ルをもたらしたが、しかしＱＳシグナルの生成には失敗
した。従って、そのサンプルは定量化できず、そして上
記表においては、“＋”として示されている。
【００７５】さらに、有意な数のサンプルのためには、
プライマー組合せＢ又はＣのいづれかを用いて推定され
るコピー数は、AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test を用いて
推定されたコピー数よりも、有意に高かった。上記、例
２に示される増幅効率変動性に基づけば、AMPLICOR HIV
-1 MONITORを用いて得られる鋳型濃度の低い推定値が、
たぶん、有意に低い増幅効率をもたらした。ウィルスＲ
ＮＡは、サンプルＭＩＮ０６７には検出されなかった。
しかしながら、これがプライマーハイブリダイゼーショ
ン又はプローブハイブリダイゼーションのいづれかによ
り妨害される、標的配列における見知の変動性による
か、又はいくつかの他の原因によるものなのかは知られ
ていない。
プライマー組合せＢ又はＣのいづれかを用いて推定され
るコピー数は、AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test を用いて
推定されたコピー数よりも、有意に高かった。上記、例
２に示される増幅効率変動性に基づけば、AMPLICOR HIV
-1 MONITORを用いて得られる鋳型濃度の低い推定値が、
たぶん、有意に低い増幅効率をもたらした。ウィルスＲ
ＮＡは、サンプルＭＩＮ０６７には検出されなかった。
しかしながら、これがプライマーハイブリダイゼーショ
ン又はプローブハイブリダイゼーションのいづれかによ
り妨害される、標的配列における見知の変動性による
か、又はいくつかの他の原因によるものなのかは知られ
ていない。
【００７６】配列表 （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号１： AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT 30
【００７７】（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２： AGTGGGGGGA CACCAGGCAG CAATGCAAAT 30
【００７８】（２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３： TACTAGTAGT TCCTGCTATG TCACTTCC 28
【００７９】（２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４： TGAAGGGTAC TAGTAGTTCC TGCTAT 26
【００８０】（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号５： AGTTGGAGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT 30
【００８１】（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号６： TGCTATGTCA GTTCCCCTTG GTTCTCT 27
【００８２】（２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号７： TGCTATGTCA CTTCCCCTTG GTTCTCT 27
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シャーリー イー クオク アメリカ合衆国，カリフォルニア 94583，サン ラモン，ロモンド サー クル 611 (72)発明者 シーダ ユ ル アメリカ合衆国，カリフォルニア 95104，カパーティノ，リンデンブルッ ク レーン 19875 (56)参考文献 特開 平４−152899（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−225760（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−242898（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−502654（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−502251（ＪＰ，Ａ) 米国特許5665545（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C12Q 1/70 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (15)
- 【請求項１】 ＳＫＣＣ１（配列番号３）及びＳＫＣＣ
３（配列番号４）から成る群から選択される、ヒト免疫
不全ウィルスタイプ１（ＨＩＶ−１）核酸の増幅のため
のオリゴヌクレオチドプライマー。 - 【請求項２】 ＳＫ１４５（配列番号１）及びＳＫＣＣ
１（配列番号３）から成る一対のオリゴヌクレオチドプ
ライマー。 - 【請求項３】 請求項２記載の一対のオリゴヌクレオチ
ドプライマー及びＳＫ１４５Ｍ２（配列番号２）から成
る一組のオリゴヌクレオチドプライマー。 - 【請求項４】 ＳＫ１４５（配列番号１）及びＳＫＣＣ
３（配列番号４）から成る一対のオリゴヌクレオチドプ
ライマー。 - 【請求項５】 請求項４記載の一対のオリゴヌクレオチ
ドプライマー及びＳＫ１４５Ｍ２（配列番号２）から成
る一組のオリゴヌクレオチドプライマー。 - 【請求項６】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを含んで成る、ヒト免疫不全ウィルスタイプ１
（ＨＩＶ−１）核酸を検出するためのキット。 - 【請求項７】 請求項２記載の一対のオリゴヌクレオチ
ドプライマーを含んで成る、ヒト免疫不全ウィルスタイ
プ１（ＨＩＶ−１）核酸を検出するためのキット。 - 【請求項８】 請求項３記載の一組のオリゴヌクレオチ
ドプライマーを含んで成る、ヒト免疫不全ウィルスタイ
プ１（ＨＩＶ−１）核酸を検出するためのキット。 - 【請求項９】 請求項４記載の一対のオリゴヌクレオチ
ドプライマーを含んで成る、ヒト免疫不全ウィルスタイ
プ１（ＨＩＶ−１）核酸を検出するためのキット。 - 【請求項１０】 請求項５記載の一組のオリゴヌクレオ
チドプライマーを含んで成る、ヒト免疫不全ウィルスタ
イプ１（ＨＩＶ−１）核酸を検出するためのキット。 - 【請求項１１】 ＳＫＣＣ１（配列番号３）又はＳＫＣ
Ｃ３（配列番号４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実
施することを含んで成る、ヒト免疫不全ウィルスタイプ
１（ＨＩＶ−１）核酸を増幅するための方法。 - 【請求項１２】 前記ポリメラーゼ連鎖反応がＳＫ１４
５（配列番号１）及びＳＫＣＣ１（配列番号３）を用い
て実施される請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 前記ポリメラーゼ連鎖反応がまた、Ｓ
Ｋ１４５Ｍ２（配列番号２）を用いて実施される請求項
１２記載の方法。 - 【請求項１４】 前記ポリメラーゼ連鎖反応がまた、Ｓ
Ｋ１４５（配列番号１）及びＳＫＣＣ３（配列番号４）
を用いて実施される請求項１１記載の方法。 - 【請求項１５】 前記ポリメラーゼ連鎖反応がまた、Ｓ
Ｋ１４５Ｍ２（配列番号２）を用いて実施される請求項
１１記載の方法。
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