JP3903059B2 - Hcv核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー - Google Patents
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Description
(a)前記試料を、本発明のプライマーを含むPCR反応混合物中において増幅条件下で、HCV核酸が存在する場合に増幅すべく処理し;及び
(b)HCV核酸の存在を示す増幅が起きたか否かを検出すること、
を含んでなる試料中のHCV核酸の存在の検出方法をも提供する。
“核酸”及び“オリゴヌクレオチド”なる用語は、プライマー類、プローブ類及び増幅または検出されるべきオリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌクレオチド(2−デオキシ−D−リボースを含む)について、またポリリボヌクレオチド(D−リボースを含む)について、並びに他のプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のNグリコシドであるポリヌクレオチドの何れかのタイプについて総称的である。“核酸”及び“オリゴヌクレオチド”なる用語の間で、長さにおける意図的な区別はなく、従って、これらの用語は、可換的に使用されるであろう。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。従ってこれらの用語は、二重鎖及び単鎖DNA、並びに二重鎖及び単鎖RNAを含む。
プライマー類のヌクレオチド配列は、5’から3’の方向で示して表1に掲げられている。上流プライマーを何れかの下流プライマーと共に用いる増幅は、HCVゲノムの5’非翻訳領域からの240塩基対の生成物を増幅する。該プライマーは、HCVゲノムの5’非翻訳領域内の比較的保存された領域にハイブリダイズし、他のウイルス由来またはヒトゲノムDNA由来の非標的配列の同時的増幅を伴うことなく、既知のHCV単離物由来の核酸の増幅を可能とする。
表1
HCV増幅プライマー
上流 SEQID NO
ST280A 1 5'-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
下流(RT)
ST778AA 2 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA
ST678A 3 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅工程は、この技術分野において周知であり、また米国特許第4,683,195号;4,683,202号;及び4,965,188号に記述されている。Perkin Elmer(Norwalk,CT)等の商業的販売者は、PCR試薬を販売し、またPCRプロトコールを発行している。本発明により提供される優位点の理解を容易にするために、PCRの要点を示す。
本発明の好ましい実施態様において、HCVゲノム核酸の増幅は、HCV検出アッセイの一部として実施される。増幅は、HCV核酸の量を検出可能な水準まで増大させる。PCR増幅核酸の検出方法は、この技術において周知である。例えば、増幅生成物の存在及び量は、この技術において周知のプロトコールを使用してゲル電気泳動を用い直接にアッセイされうる(例えば、Sambrook等、1989の前出文献参照)。
HCV RNAの増幅
HCV RNAの増幅を、下記のプロトコールを使用して実施した。
増幅を、合成RNAテンプレートの使用、及び臨床的試料から単離されたRNAの使用の両者にて実施した。合成テンプレートの使用は、各反応物に添加される標的RNA分子の数に亘って、調整を可能とした。合成RNAは、Young等、1993前出文献に記述されているように、HCV RNA転写ベクターを使用して、転写された。臨床的試料由来のHCV RNAの増幅のために、RNAをYoung等、1995前出文献に記述されているように、RNAを血清から単離した。
増幅を、100μlの反応体積にて実施した。各反応物は、以下の試薬を含んでいた。
HCV RNAテンプレート
400nMの各プライマー(特記しない限り)
1μMの標識プローブ
50mM ビシン(pH8.3)
100mM KOAc
200μM 各dATP、dCTP、dGTP及びdUTP
3.6mM Mn(OAc)2
8% グリセロール
20単位のrTth DNAポリメラーゼ*、並びに
2単位のUNG*
*Hoffmann−La Rocheにより製造及び開発され、Perkin Elmer、Norwalk、CTにより販売される。
反応前インキュベーション 50℃にて2分間;
逆転写 60℃にて30分間
2サイクル:
変性 95℃にて15秒間
アニール/伸長 60℃にて20秒間
46サイクル:
変性 90℃にて15秒間
アニール/伸長 60℃にて20秒間
保持 72℃にて15分間以上。
温度サイクルに次いで、反応物を分析前には−20℃に維持した。
増幅されたHCV核酸は、ゲル電気泳動、及び5’−ヌクレアーゼアッセイの両者により分析された。ゲル電気泳動は、増幅生成物の存在の容易に視覚的に確認すること、および生成した増幅生成物の相対量の大まかな評価を与える。5’−ヌクレアーゼアッセイは、生成した増幅生成物の量の正確な定量的評価を与えるために使用された。
増幅生成物の存在は、以下のようにしてゲル電気泳動により検出された。反応生成物をアガロースゲル(3% NuSieveTM及び1% SeaChemTM)並びに1X TBE(0.089M トリス、0.089M ほう酸、0.0025M EDTA二ナトリウム)操作緩衝溶液を使用して分画した。電気泳動を100ボルトにて約1時間実施した。電気泳動に続いて、存在する任意のDNAを染色するためにエチジウムブロマイド(0.5μg/ml)を添加した。ゲルを水中で大まかに脱色し、DNAのエチジウムブロマイド染色バンドをUV輻射を使用して可視化した。
上述したように、増幅は、フルオレセイン標識され、DNAポリメラーゼによる伸長を妨害すべく修飾されたHCV−特異的検出プローブの存在下で実施された。2個のプライマー結合部位の間に位置するHCV標的配列の領域に相補的なプローブは、プライマー伸長の間にrTth DNAポリメラーゼの5’−ヌクレアーゼ活性により切断される。増幅に続いて、残留する非切断プローブは反応混合物から分離され、次いで残留する切断プローブ断片の蛍光が、合成された増幅生成物の量を示すものとして測定される。
先行技術プライマーとの比較−ゲル電気泳動による分析
この例は、本発明のプライマーと、本プライマーに最も類似する先行技術に記載されたプライマーとの比較を記述する。比較されるプライマーの性質は、所定数の増幅サイクルにおいて生成される生成物の量として定義される増幅効率である。
プライマー配列の比較
上流 SEQID NO
ST280A 1 5'-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
KY80 4 5'-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT
下流
ST778AA 2 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA
ST678A 3 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA
KY78 5 5'-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT
(a)KY80(SEQ ID NO :4)及びKY78(SEQ ID NO :5)
(b)KY80(SEQ ID NO :4)及びST778AA(SEQ ID NO :2)
(c)ST280A(SEQID NO :1)及びST778AA(SEQ ID NO :2)
(d)ST280A(SEQID NO :1)及びST778AA(SEQ ID NO :2)
従来技術プライマーとの比較−5’−ヌクレアーゼ分析
この例は、例2に記述したプライマーの組合せを使用し、増幅生成物の分析が5’−ヌクレアーゼアッセイを使用して行われた増幅を記述するものである。増幅は、合成HCV RNAテンプレートを0、10、25、102、103、104、105及び106コピー含む試料並びに各プライマーについて400nMのプライマー濃度を使用して例1に記述されるのと同様に実施された。各プライマー対による増幅及び標的数の投入は、3組にて実施された。上記例2と同様に、下記のプライマーの組合せが使用された。
(a)KY80(SEQ ID NO :4)及びKY78(SEQ ID NO :5)
(b)KY80(SEQ ID NO :4)及びST778AA(SEQ ID NO :2)
(c)ST280A(SEQID NO :1)及びST778AA(SEQ ID NO :2)
従来技術プライマーとの比較:5’−ヌクレアーゼアッセイ
この例は、下記のプライマーの組合せを使用する増幅の比較を記述する。
(a)KY80(SEQ ID NO :4)及びKY78(SEQ ID NO :5)
(b)ST280A(SEQID NO :1)及びST678A(SEQ ID NO :3)
(c)ST280A(SEQID NO :1)及びST778AA(SEQ ID NO :2)
トリシン緩衝溶液中での増幅
上述の5’−ヌクレアーゼアッセイは、5’末端がフルオレセイン(FAM)にて標識され、DNAポリメラーゼによる伸長を阻止するために3’−OHに代えて3’−PO4を有するプローブを使用する。増幅は、やはりPerkin Elmer、Applied Biosystems Division(Foster City、CA)から入手されるヘキサクロロフルオレセイン(HEX)を使用しても実施される。FAM−標識プローブとは異なって、HEX−標識プローブは例1に記述されるビシン増幅緩衝溶液中では不安定であった。しかしながら、HEX−標識プローブが、トリシン増幅緩衝溶液中で安定であることが見い出された。
400nMの各プライマー
1μMのHEX−標識プローブ
200μM 各dATP、dCTP、dGTP及びdUTP
55mM トリシン(pH8.3)
90mM KOAc
3.0mM Mn(OAc)2
8% グリセロール
20単位のrTth DNAポリメラーゼ*、並びに
2単位のUNG*
*Hoffmann−La Rocheにより製造及び開発され、Perkin Elmer、Norwalk、CTにより販売される。
Claims (7)
- SEQ ID NO:2(ST778AA)の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー。
- C型肝炎ウイルス(HCV)核酸のポリメラーゼ連鎖反応増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、前記対がSEQ ID NO:2(ST778AA)の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを含む、上記オリゴヌクレオチドプライマー対。
- SEQ ID NO:4(KY80)及びSEQ ID NO:2(ST778AA)の配列からなる請求項2に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
- C型肝炎ウイルス(HCV)核酸の検出のためのキットであって、請求項2または3の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を含んでなる上記キット。
- C型肝炎ウイルス(HCV)核酸の増幅のための方法であって、請求項2または3の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用してポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含んでなる上記方法。
- 試料中のC型肝炎ウイルス(HCV)核酸の検出方法であって、
(a)前記試料を、SEQ ID NO:2(ST778AA)の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対を含んだポリメラーゼ連鎖反応増幅混合物中において、存在する場合にHCV核酸が増幅されるような増幅条件下において処理し;そして
(b)HCV核酸の存在を示す増幅が起こるかどうかを検出すること
を含んでなる上記方法。 - 前記プライマー対の配列が、SEQ ID NO:4(KY80)及びSEQ ID NO:2(ST778AA)からなる請求項6に記載の方法。
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