ES2324125T3 - Cebadores y sondas de acidos nucleicos para detectar vih-1 y vih-2. - Google Patents
Cebadores y sondas de acidos nucleicos para detectar vih-1 y vih-2. Download PDFInfo
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Abstract
Conjunto de cebador/sonda 1 (SEC ID Nº 2, 3 y 4) para detectar VIH-1.
Description
Cebadores y sondas de ácidos nucleicos para
detectar VIH-1 y VIH-2.
La presente invención hace referencia a
oligonucleótidos y métodos para detectar VIH-1.
Los virus clasificados como VIH contienen ARN
como su información genética y la infectividad del VIH depende de
la capacidad del virus para insertar su información genética en el
ADN de un hospedador. Para insertar su información genética y, por
tanto, infectar con éxito a un hospedador, un virus VIH debe
convertir su material genético (ARN) a ADN para que la información
genética del VIH sea compatible con la del hospedador.
Aparentemente, el VIH es exitoso convirtiendo su ARN en ADN, dada
la prevalencia del SIDA. Sin embargo, aunque el virus pueda
convertir con éxito ARN a ADN, la conversión rara vez es exacta. En
otras palabras, la copia de ADN del ARN viral no siempre es exacta
y puede divergir del ARN viral en varios pares de bases. Por tanto,
aunque un hospedador pueda estar infectado inicialmente con una
única partícula viral, después de varias rondas de replicación, el
hospedador puede estar infectado con una población de virus
genéticamente diversa.
Aunque el VIH no está uniformemente clasificado,
en general se acepta que VIH-1 y
VIH-2 son virus distintos. Dentro de cada una de
estas clasificaciones virales existen varios grupos o subtipos. Por
ejemplo, dentro de la clasificación de VIH-1, se
encuentra el "grupo M", que se clasifica adicionalmente en los
subtipos A-F, y el "grupo O". Por el
contrario, VIH-2 contiene los subtipos
A-E. Los subtipos de VIH-1 y de
VIH-2 se subdividen adicionalmente todavía en
categorías demasiado numerosas para mencionarlas en este contexto.
Sin embargo, vale la pena mencionar que todas estas divisiones se
basan en la varianza genética entre los virus y, de acuerdo con la
teoría taxonómica, muchos de estos virus son la progenie de un único
virus. Por tanto, los numerosos tipos y subtipos demuestran la
naturaleza altamente mutable del VIH y la variabilidad genética del
genoma del VIH.
La variabilidad genética del virus puede
atribuirse a la ineficacia con la que el virus convierte su ARN en
ADN, como se mencionó anteriormente. Otra teoría relativa a la
variabilidad genética del virus, es que los hospedadores pueden
infectarse con múltiples poblaciones diferentes de VIH (que, como se
mencionó anteriormente, pueden surgir de una infección por un único
virus) y, en el transcurso de la replicación y empaquetamiento de
la información genética viral, fragmentos de un genoma viral pueden
recombinarse con fragmentos de otro genoma viral. Por tanto,
después del empaquetamiento del genoma recombinado, se forma un
virus genéticamente distinto. Independientemente de la forma por la
que el virus muta, está claro que los virus conocidos como VIH
tienen genomas que son altamente mutables y están, por tanto,
constantemente cambiando. Esto ofrece a los que buscan métodos de
detección del virus basados en su información genética una diana en
constante cambio.
Aunque se conoce que ciertas regiones del genoma
del VIH están conservadas, esto no quiere decir que estas regiones
sean inmunes a mutaciones, particularmente, si las mutaciones en
estas regiones no afectan a la estructura de la proteína codificada
por estas regiones. Por tanto, el desarrollo de reactivos y métodos
para detectar VIH basados en su información genética es un desafío
continuo.
La presente invención proporciona un conjunto de
cebador/sonda 1 (SEC. ID. Nº 2, 3 y 4) para detectar
VIH-1 (es decir, los diversos subtipos de
VIH-1).
La presente invención, además, proporciona un
método de detección del VIH en una muestra que comprende los pasos
de (a) formar una mezcla de reacción que comprende reactivos de
amplificación de ácido nucleico, conjunto de cebador/sonda 1 (SEC
ID Nº 2, 3 y 4) y una muestra que contiene una secuencia diana del
VIH; (b) someter la mezcla a condiciones de amplificación para
generar al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico
complementaria a la secuencia diana; (c) hibridar la sonda con la
secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia diana;
para así formar un híbrido que comprenda la sonda y la secuencia de
ácido nucleico complementaria a la secuencia diana; y (d) detectar
el híbrido como indicativo de la presencia de VIH en la muestra.
El formato preferido de RT PCR comprenderá los
mismos pasos que los mencionados anteriormente, pero los reactivos
de amplificación comprenderán una enzima con actividad transcriptasa
inversa. Además, de acuerdo con cualquiera de los métodos
proporcionados en este documento, el paso (b) puede repetirse
múltiples veces, preferiblemente entre 10 y 100, para incrementar
el número de copias de la secuencia diana. Los especialistas en la
técnica entenderán que el paso (b) puede repetirse a través de
termociclado de la mezcla de reacción.
En una realización preferida, los reactivos de
amplificación incluyen una enzima con actividad transcriptasa
inversa y el método además, comprende el paso, después del paso (a)
y previo al paso (b), de formación de un ADNc de un genoma de
VIH.
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La presente invención, además, proporciona un
kit que comprende el conjunto de cebador/sonda 1 (SEC ID Nº 2, 3 y
4) y agentes de amplificación, preferiblemente en el que los
reactivos de amplificación comprenden una enzima con actividad
transcriptasa inversa.
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Como se indica más arriba, el método y kit de la
invención emplean un conjunto de cebador/sonda (SEC ID Nº 2, 3 y 4)
para detectar VIH-1. Aunque en este documento se
indican otros conjuntos de cebador/sonda con propósitos
comparativos, no son realizaciones de la presente invención.
Los conjuntos de cebador/sonda proporcionados en
este documento comprenden dos cebadores y, al menos, una sonda.
Estos conjuntos de cebador/sonda pueden emplearse de acuerdo con las
técnicas de amplificación de ácidos nucleicos. Por tanto, los
cebadores de cualquier conjunto de cebador/sonda particular pueden
emplearse para amplificar una secuencia diana. En la mayoría de los
casos, la sonda hibrida con las copias de la secuencia diana
generada por uno de los cebadores y, generalmente, facilita la
detección de cualquiera de las copias de la secuencia diana
generada en el transcurso de la reacción de amplificación. Todos los
conjuntos de cebador/sonda pueden emplearse de acuerdo con los
procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar
específica y sensiblemente VIH-1 del grupo M y O,
así como los diversos subtipos de VIH-2. En la Tabla
1, abajo, se presentan conjuntos de cebador/sonda para detectar
subtipos de VIH-1 y en la Tabla 2, abajo, se
presentan conjuntos de cebador/sonda para detectar subtipos de
VIH-2.
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Como se refirió anteriormente, los cebadores
incluidos en los conjuntos de cebador/sonda pueden usarse para
cebar síntesis de copias de una secuencia diana del
VIH-1 en el caso de las SEC ID Nº 2, 3, 5, 6, 8, 9,
12 y 13; y copias de una secuencia diana VIH-2 en
el caso de las SEC ID Nº 16, 17, 19, 20, 23 y 24. Las restantes SEC
ID Nº (SEC ID Nº 4, 7, 10, 11, 14, 18, 21 y 22) hibridan con los
productos de amplificación de una o ambas secuencias cebadoras
encontradas en el mismo conjunto de cebador/sonda. Por ejemplo, el
conjunto de cebador/sonda 6 es específico para
VIH-2 en la medida en que las SEC. ID. Nº 19 y 20
actúan como cebador en la síntesis de la secuencia diana del
VIH-2 y que las SEC. ID. Nº 21 y 22 hibridan con los
productos de amplificación producidos por las SEC. ID. Nº 19 y 20.
Por tanto, las secuencias sonda son también específicas para los
diversos subtipos de VIH-1 y de
VIH-2.
Las secuencias cebadoras comprenden,
generalmente, ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico
(ARN). Las secuencias sonda, por el contrario, pueden comprender
ARN o ADN o análogos de ácidos nucleicos tales como análogos de
ácidos nucleicos sin carga incluyendo, pero no exclusivamente,
ácidos nucleicos peptídicos (ANP) que se recogen en la solicitud de
patente internacional WO 92/20702 o análogos morfolino descritos en
las patentes de Estados Unidos nº 5.185.444, 5.034.506 y 5.142.047
incorporadas como referencia en este documento. Dichas secuencias
pueden sintetizarse rutinariamente usando una diversidad de técnicas
actualmente disponibles. Por ejemplo, una secuencia de ADN puede
sintetizarse usando la química convencional de
nucleótido-fosforamidita y los instrumentos
disponibles de Applied Biosystems, Inc, (Foster City, CA); DuPont,
(Wilmington, DE); o Milligen, (Bedford, MA). De la misma forma, y
cuando se desee, las secuencias pueden marcarse usando metodologías
bien conocidas en la técnica tales como las que se describen en las
solicitudes de patente de Estados Unidos nº 5.464.746; 5.424.414; y
4.948.882, todas ellas incorporadas como referencia en este
documento.
El término "marcador" tal y como se utiliza
en este documento hace referencia a la molécula o fracción que
tiene la propiedad o característica que permite la detección. Un
marcador puede ser directamente detectable, por ejemplo,
radioisótopos, fluoróforos, quimioluminóforos, enzimas, partículas
coloidales, micropartículas fluorescentes y similares; o un
marcador puede ser detectable indirectamente, como, por ejemplo,
miembros específicos de unión. Se entenderá que los marcadores
directamente detectables pueden requerir componentes adicionales
tales como, por ejemplo, sustratos, reactivos iniciadores de
reacción, luz y similares para posibilitar la detección del
marcador. Cuando se usan marcadores indirectamente detectables,
normalmente se usan en combinación con un "conjugado". Un
conjugado es, típicamente, un miembro de unión específica que se ha
sido unido o acoplado a un marcador de detección directa. Las
técnicas químicas de acoplamiento para la síntesis de un conjugado
son bien conocidas y pueden incluir, por ejemplo, cualquier medio
químico y/o físico que no interfiera con la propiedad específica de
unión del miembro específico de unión o con las propiedades de
detección del marcador. Tal y como se utiliza en este documento,
"miembro específico de unión" hace referencia a un miembro de
un par de unión, por ejemplo, dos moléculas distintas donde una de
las dos a través de, por ejemplo, uniones químicas o físicas se une
específicamente a la otra. Además de pares de unión específica
antígeno-anticuerpo, otros pares de unión
específica incluyen, pero no exclusivamente, avidina y biotina;
haptenos y anticuerpos específicos para estos haptenos; secuencias
complementarias de nucleótidos; cofactores o sustratos enzimáticos
y enzimas; y similares.
El término "muestra de ensayo" usado en
este documento hace referencia a cualquier cosa susceptible de
contener una secuencia diana para VIH. La muestra de ensayo es o
puede proceder de cualquier fuente biológica, como por ejemplo,
sangre, fluido de lentes oculares, líquido cefalorraquídeo, leche,
líquido ascítico, fluido sinovial, fluido peritoneal, líquido
amniótico, tejido, caldos de fermentación, cultivos celulares y
similares. La muestra puede usarse (i) directamente como se obtiene
de la fuente o (ii) siguiendo un pretratamiento para modificar el
carácter de la muestra. Así, la muestra de ensayo puede pretatarse
antes del uso, por ejemplo, preparando plasma sanguíneo, lisado
celular o partículas virales, preparando líquido a partir de
material sólido, diluyendo fluidos viscosos, filtrando líquidos,
destilando líquidos, concentrando líquidos, inactivando componentes
interferentes, añadiendo reactivos, purificando ácidos nucleicos y
similares.
El término "secuencia diana" usado en este
documento hace referencia a una secuencia de ácidos nucleicos que
se detecta, amplifica o ambas cosas usando los conjuntos de
cebador/sonda proporcionados en este documento. Adicionalmente,
aunque el término secuencia diana se refiere, en ocasiones, a
monocatenario, los especialistas en la técnica reconocerán que la
secuencia diana puede en realidad ser bicatenaria. Así, en los casos
en los que la secuencia diana es bicatenaria, las secuencias
cebadoras de la presente invención amplificarán las dos hebras de
la secuencia diana.
Como se mencionó anteriormente, las secuencias
cebadoras de cualquier conjunto de cebador/sonda en particular (por
sí mismos o con oligonucleótidos adicionales) pueden usarse como
cebadores de amplificación de acuerdo con procedimientos de
amplificación de ácidos nucleicos bien conocidos en la técnica.
Dichas reacciones incluyen, pero no exclusivamente, la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) descrita en las patentes de Estados
Unidos 4.683.195 y 4.683.202, la reacción en cadena de la ligasa
(LCR) descrita en el documento
EP-A-320 308, y gap LCR (GLCR)
descrita en la patente de Estados Unidos con nº de serie 5.427.930,
incorporadas como referencia en este documento. Genéricamente,
estas reacciones de amplificación ejemplificadas generan múltiples
copias de una secuencia diana de ADN.
De acuerdo con la presente invención, la
secuencia diana podría, en efecto, ser ADN; por otro lado, gracias
a la naturaleza ribonucleica del genoma del VIH, los conjuntos de
cebador/sonda podrían emplearse de acuerdo con un formato "RT
PCR" que se describe en las patentes de Estados Unidos nº
5.322.770 y 5.310.652, incorporadas como referencia en este
documento. En resumen, el formato RT PCR proporciona un método para
transcribir una hebra de ADN a partir de una secuencia diana de
ARN. La hebra de ADN copiada, transcrita a partir del ARN diana, se
denomina comúnmente "ADN" que, posteriormente, puede servir
como molde para la amplificación por cualquiera de los métodos
mencionados anteriormente. El proceso de generación de ADNc comparte
muchos de los principios de hibridación y extensión en torno a
otros métodos de amplificación tales como PCR, pero la enzima
empleada debe tener actividad transcriptasa inversa. Las enzimas que
tienen actividad transcriptasa inversa, así como el proceso RT PCR,
son bien conocidos y, por tanto, no precisan mayor discusión.
Adicionalmente, son también conocidos otros métodos para la
síntesis de ADNc e incluyen la solicitud de patente de Estados
Unidos con nº de serie 08/356.287 de propiedad común, presentada el
22 de febrero de 1995, incorporada como referencia en este
documento.
De acuerdo con una realización preferida, los
conjuntos de cebador/sonda se emplean en la reacción de
amplificación "PCR de hibridación de oligonucleótidos"
(también denominada en este documento "OH PCR"), como se
describe en la solicitud de patente de Estados Unidos con nº de
serie 08/514.704, presentada el 14 de agosto de 1995, incorporada
como referencia en este documento. En resumen, los reactivos
empleados en el método preferido comprenden al menos un conjunto de
cebador/sonda (denominados en este documento conjuntos de
cebador/sonda 1-8), así como otro reactivos para
llevar a cabo una reacción de amplificación. "Otros reactivos para
llevar a cabo una reacción de amplificación" o "reactivos de
amplificación de ácidos nucleicos" incluyen reactivos que son
bien conocidos y pueden incluir, pero no exclusivamente, una enzima
con actividad polimerasa; cofactores enzimáticos tales como
magnesio; sales; dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD); y
desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) tales como, por ejemplo,
desoxiadenina trifosfato, desoxiguanina trifosfato, desoxicitosina
trifosfato y desoxitimina trifosfato.
El método preferido generalmente comprende los
pasos de (a) formar una mezcla de reacción que contiene reactivos
de amplificación de ácidos nucleicos, al menos un conjunto de
cebador/sonda de la presente invención y una muestra de ensayo
susceptible de contener una secuencia diana; (b) someter la mezcla a
condiciones de amplificación para generar al menos una copia de una
secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia diana;
(c) hibridar la sonda con la secuencia de ácido nucleico
complementaria a la secuencia diana, para así formar un híbrido que
comprenda la sonda y la secuencia de ácido nucleico complementaria a
la secuencia diana; y (d) detectar el híbrido como indicio de la
presencia de la secuencia diana (VIH) en la muestra. Se entenderá
que el paso (b) del anterior método puede repetirse varias veces
antes del paso (c) por termociclado de la mezcla de reacción entre
10 y 100 veces, más típicamente entre 20 a 60 veces, como es bien
conocido en la técnica.
Las condiciones de amplificación se definen,
generalmente, como condiciones que promueven el alineamiento y la
extensión de una o más secuencias de ácido nucleico. Es bien
conocido en la técnica que dicho alineamiento depende, de manera
bastante predecible, de varios parámetros incluyendo la temperatura,
fuerza iónica, longitud de la secuencia, complementariedad y
contenido en G:C de las secuencias. Por ejemplo, la disminución de
la temperatura en el entorno de las secuencias de ácido nucleico
complementarias promueve el alineamiento. Para cualquier conjunto
dado de secuencias, la temperatura de fusión, o Tm, puede estimarse
por cualquiera de varios métodos conocidos. Típicamente, las
aplicaciones de diagnóstico utilizan temperaturas de hibridación
próximas a la temperatura de fusión (por ejemplo, dentro de 10ºC).
La fuerza iónica o concentración "salina" también influye en
la temperatura de fusión, ya que los cationes pequeños tienden a
estabilizar la formación de dúplex anulando la carga negativa del
esqueleto fosfodiéster. Las concentraciones salinas típicas dependen
de la naturaleza y valencia del catión, pero son de fácil
comprensión para los especialistas en la técnica. De forma similar,
se sabe que un alto contenido en G:C y una elevada longitud de
secuencia estabilizan la formación de dúplex, ya que los
apareamientos G:C implican 3 enlaces de hidrógeno mientras que los
apareamientos A:T sólo implican dos y, además, las secuencias más
largas tienen más enlaces de hidrógeno que mantienen unidas a las
secuencias. En consecuencia, un alto contenido en G:C y secuencias
de mayor longitud influyen en las condiciones de hibridación
elevando la temperatura de fusión.
Una vez que se han seleccionado las secuencias
para una aplicación de diagnóstico dada, se conocerán el contenido
en G:C y la longitud y se tendrán en cuenta para determinar
precisamente qué condiciones de hibridación se realizarán. Como
típicamente se optimiza la fuerza iónica para la actividad
enzimática, el único parámetro que queda por variar es la
temperatura. Por lo general, se selecciona una temperatura de
hibridación próxima o igual a la Tm de los cebadores o de la sonda.
Así, la obtención de condiciones de hibridación adecuadas para un
conjunto de cebador/sonda particular es una práctica común para un
especialista en la técnica.
De acuerdo con el método OH PCR, es preferible
seleccionar cebadores, sondas y condiciones de reacción tales que
la secuencia sonda tenga una temperatura de fusión menor que las
secuencias cebadoras, de modo que, después de someter la mezcla de
reacción a condiciones de amplificación, se produzcan copias de la
secuencia diana o de su complementaria (denominada como alternativa
amplicón) a una temperatura por encima de la Tm de la sonda.
Después de sintetizar dichas copias, se desnaturalizan y la mezcla
se enfría para dar lugar a la formación de híbridos entre las
sondas y cualquiera de las copias de la secuencia diana o de su
complementaria. Preferiblemente, la velocidad de disminución de la
temperatura desde la temperatura de desnaturalización hasta una
temperatura a la que las sondas se unirán a copias monocatenarias
es bastante rápida, por ejemplo, entre aproximadamente 8 y
aproximadamente 15 minutos, preferiblemente menor de 2 minutos.
Dicho enfriamiento rápido favorece la formación de híbridos entre
las copias de la secuen-
cia diana y la sonda en lugar de, por ejemplo, la formación de híbridos entre hebras complementarias del amplicón.
cia diana y la sonda en lugar de, por ejemplo, la formación de híbridos entre hebras complementarias del amplicón.
En casos en los que se emplean marcadores para
detectar productos de secuencias cebadoras, las secuencias
cebadoras se marcan con un marcador de captura o un marcador de
detección. La secuencia sonda se usa para hibridar con la secuencia
generada por la secuencia cebadora y, normalmente, hibrida con una
secuencia que no incluye la secuencia cebadora. De forma similar a
la secuencia cebadora, la secuencia sonda se marca también con un
marcador de captura o de detección con la salvedad de que, cuando el
cebador se marca con un marcador de captura, la sonda se marca con
un marcador de detección y viceversa. Los marcadores de detección
tienen la misma definición que los "marcadores" previamente
definidos y los "marcadores de captura" se usan normalmente
para separar productos de extensión, y las sondas asociadas con
cualquiera de dichos productos, de otros reactivos de
amplificación. Miembros específicos de unión (como se han definido
previamente) son adecuados para este propósito. Además, las sondas
usadas de acuerdo con este método se bloquean preferiblemente en sus
extremos 3' para que no se extiendan en condiciones de hibridación.
Los métodos para prevenir la extensión de una sonda son bien
conocidos y son una cuestión de elección para los especialistas en
la técnica. Típicamente, la adición de un grupo fosfato al extremo
3' de la sonda bastará para bloquear la extensión de la sonda.
Después de la formación de híbridos de secuencia
copia/sonda, los marcadores diferenciales (por ejemplo, marcadores
de captura y detección) en la secuencia copia y la secuencia sonda
pueden usarse para separar y detectar dichos híbridos.
Preferiblemente, la detección se lleva a cabo de acuerdo con los
protocolos usados por la instrumentación Abbott LCx® comercialmente
disponible (Abbott Laboratories; Abbott Park, IL).
Como se discutió previamente, la secuencia diana
puede ser ADN o la secuencia diana puede estar incrustada dentro
del genoma de VIH y, por tanto, la secuencia diana puede estar en
forma de ARN. En los casos en los que la secuencia diana es parte
del genoma de VIH, es preferible incluir una enzima con actividad
transcriptasa inversa como parte de los llamados reactivos de
amplificación de ácidos nucleicos para hacer posible la producción
de ADNc para su posterior amplificación. De acuerdo con esta
realización, las secuencias cebadoras también sirven como cebadores
para la síntesis de ADNc. Aunque la invención contempla distintos
pasos de producción de ADNc y, posteriormente, de amplificación y
detección de secuencias amplificadas de ADNc, se entenderá que
estos procesos pueden tener lugar simultáneamente en una única
mezcla de reacción de amplificación.
De acuerdo con otra realización,
VIH-1 y VIH-2 pueden detectarse
simultáneamente en una única reacción usando una combinación de dos
conjuntos de cebador/sonda (es decir, uno seleccionado de los
conjuntos de cebador/sonda específicos de VIH-1 y
el otro seleccionado de los conjuntos de cebador/sonda específicos
de VIH-2). Por ejemplo, una muestra de ensayo
podría ponerse en contacto con conjuntos de cebador/sonda 1 y 8
junto con reactivos de amplificación, que pueden o no incluir una
enzima con actividad transcriptasa inversa, para amplificar y
detectar la presencia de VIH-1 y de
VIH-2 en una muestra de ensayo.
Los oligonucleótidos de la presente invención
también pueden proporcionarse como parte de un kit útil para
detectar VIH-1. Los kits comprenden uno o más
recipientes adecuados que contienen el conjunto de cebador/sonda de
acuerdo con la presente invención, una enzima que tiene actividad
polimerasa, desoxinucleótidos trifosfato y, opcionalmente, una
enzima que tiene actividad transcriptasa inversa. Normalmente, al
menos una secuencia lleva un marcador, pero la detección es posible
sin esto.
Los siguientes ejemplos demuestran la detección
de varios subtipos de VIH-1 y VIH-2
usando los conjuntos de cebador/sonda proporcionados en este
documento. Estos cebadores y sondas de ADN que comprenden los
conjuntos de cebador/sonda se identifican como SECUENCIA ID Nº 2,
SECUENCIA ID Nº 3, SECUENCIA ID Nº 4, SECUENCIA ID Nº 5, SECUENCIA
ID Nº 6, SECUENCIA ID Nº 7, SECUENCIA ID Nº 8, SECUENCIA ID Nº 9,
SECUENCIA ID Nº 10, SECUENCIA ID Nº 11, SECUENCIA ID Nº 12,
SECUENCIA ID Nº 13, SECUENCIA ID Nº 14, SECUENCIA ID Nº 16,
SECUENCIA ID Nº 17, SECUENCIA ID Nº 18, SECUENCIA ID Nº 19,
SECUENCIA ID Nº 20, SECUENCIA ID Nº 21, SECUENCIA ID Nº 22,
SECUENCIA ID Nº 23, SECUENCIA ID Nº 24. Las secuencias SECUENCIA ID
Nº 2, SECUENCIA ID Nº 3, SECUENCIA ID Nº 4, SECUENCIA ID Nº 5,
SECUENCIA ID Nº 6, SECUENCIA ID Nº 7, SECUENCIA ID Nº 8, SECUENCIA
ID Nº 9, SECUENCIA ID Nº 10, SECUENCIA ID Nº 11, SECUENCIA ID Nº
12, SECUENCIA ID Nº 13, SECUENCIA ID Nº 14 son específicas para
VIH-1. Una secuencia diana representativa de
VIH-1 (subtipo B, cepa MN) se denomina en este
documento SEC ID Nº 1. Las secuencias SECUENCIA ID Nº 16, SECUENCIA
ID Nº 17, SECUENCIA ID Nº 18, SECUENCIA ID Nº 19, SECUENCIA ID Nº
20, SECUENCIA ID Nº 21, SECUENCIA ID Nº 22, SECUENCIA ID Nº 23 y
SECUENCIA ID Nº 24 son específicas para VIH-2. Una
secuencia diana representativa de VIH-2 (subtipo A,
cepa NIH-Z) se denomina en este documento SEC ID Nº
15. Todos los cebadores y sondas son secuencias consenso derivadas
de 31 VIH-1 del grupo M (subtipos A, B y D) y
aislados del grupo O y 14 aislados de VIH-2 de cada
uno de los subtipos A y B para las secuencias del
VIH-2.
En los siguientes ejemplos, las SEC ID Nº 2, SEC
ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 8, SEC ID
Nº 9, SEC ID Nº 12 y SEC ID Nº 13 se usan como cebadores consenso de
amplificación específicos para la secuencia diana de
VIH-1. La SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 10,
SEC ID Nº 11 y SEC ID Nº 14 se usan como sondas consenso de
hibridación interna para el producto de amplificación del
VIH-1. La SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 19,
SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 23 y SEC ID Nº 24 se usan como cebadores de
amplificación consenso específicos para la secuencia diana de
VIH-2 y las SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 21 y SEC ID Nº
22 se usan como sondas consenso de hibridación interna para el
producto de amplificación de VIH-2.
A. Cebadores consenso para
VIH-1 y para VIH-2. Se
diseñaron cebadores consenso para detectar todos los subtipos
conocidos de VIH-1 y VIH-2 por PCR
con hibridación de oligonucleótidos. Estos cebadores fueron las SEC
ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 8, SEC ID
Nº 9, SEC ID Nº 12 y SEC ID Nº 13 para VIH-1, y SEC
ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 19, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 23 y
SEC ID Nº 24 para VIH-2. Las secuencias de los
cebadores se sintetizaron usando la metodología estándar de síntesis
de oligonucleótidos y se haptenizaron con adamantino en sus
extremos 5' usando acoplamiento con cianoetil fosforamidita
convencional como se describe en la patente de Estados Unidos nº
5.424.414 incorporada como referencia en este documento.
B. Sondas consenso de VIH-1 y
VIH-2. Se diseñaron sondas consenso para
hibridarlas con la secuencia diana amplificada de VIH por
hibridación de oligonucleótidos. Estas sondas fueron las SEC ID Nº
4, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 11 y SEC ID Nº 14 para
VIH-1, y las SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 21 y SEC ID Nº
22 para VIH-2. Se sintetizaron secuencias sonda
usando la metodología convencional de síntesis de oligonucleótidos,
se haptenizaron con 2 carbazoles en el extremo 5' usando la química
de acoplamiento de cianoetil fosforamidita convencional como se
describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.464.746 (incorporada
como referencia en este documento) y se bloquearon con fosfato en
el extremo 3'.
Se ha notificado que el subtipo B de
VIH-1 es la cepa más común de VIH-1
encontrada en Europa y Estados Unidos, por lo que se usó para
evaluar la sensibilidad de los diferentes conjuntos consenso de
cebador/sonda de VIH-1. Se aisló ARN a partir de
viriones de subtipo B de VIH-1 purificado en
gradiente (VIH-1_{MN,} Advanced Biotechnologies
Inc. Columbia, MD) usando el procedimiento de extracción de ARN de
Qiagen y la metodología de columna descrita por el fabricante
(Qiagen, Frankfurt, Germany). El ARN se cuantificó en copias de ARN
por mililitro y se diluyó en ARN ribosomal a 1 ng/\mul hasta
niveles adecuados para la detección.
Se evaluaron cuatro conjuntos de cebador/sonda
consenso distintos para VIH-1: en el conjunto nº 1
se usaron las SEC ID Nº 2 y 3 como cebadores y la SEC ID Nº 4 como
sonda, en el conjunto nº 2 se usaron las SEC ID Nº 5 y 6 como
cebadores y la SEC ID Nº 7 como sonda, en el conjunto nº 3 se usaron
las SEC ID Nº 8 y 9 como cebadores y las SEC ID Nº 10 y 11 como
sondas, en el conjunto nº 4 se usaron las SEC ID Nº 12 y 13 como
cebadores y la SEC ID Nº 14 como sonda. Todas las secuencias se
prepararon como se describe en el ejemplo 1.
Las diluciones del ARN de VIH-1
purificado se sometieron a transcripción inversa, se amplificaron
por PCR y se detectaron usando los cuatro conjuntos de
cebador/sonda consenso de VIH-1 en reacciones
separadas. La RT PCR se llevó a cabo usando Bicine 50 mM, pH 8,25,
acetato potásico 115 mM, EDTA 0,5 mM, glicerol al 8%, albúmina de
suero bovino (BSA) a 10 \mug/ml y azida sódica al 0,02%. La
polimerasa recombinante de Thermus thermophilus se utilizó a
una concentración de 5 unidades/reacción, con dNTP (dATP, dGTP, dTTP
y dCTP) presentes a una concentración final de 0,15 mM cada uno.
Los cebadores se usaron a una concentración de 500 nM cada uno, y
las sondas a una concentración de 10 nM cada una. Se usó una
concentración final de MnCl_{2} 2,5 mM en un volumen total de
reacción de 0,2 ml, con un volumen de muestra de 25 a 50 \mul. El
control negativo estaba compuesto por 100 ng de ARN ribosomal por
reacción.
Las mezclas de reacción se sometieron a
transcripción inversa y se amplificaron en un termociclador
Perkin-Elmer 480. Las mezclas de reacción
primeramente se incubaron a 62ºC durante 30 minutos para transcribir
de manera inversa el ARN, seguido de 30 segundos a 94ºC. Después se
inició la amplificación por PCR a través de un protocolo
"touchdown" o "step-down" específico para
ayudar a la rigurosidad de la reacción en las primeras etapas de la
amplificación. Esto utilizó 8 ciclos como sigue: 1 ciclo de 70ºC
durante 80 segundos, a continuación 94ºC durante 30 segundos
seguido de un ciclo de 69ºC durante 80 segundos, después 94ºC
durante 30 segundos, seguido de 1 ciclo de 68ºC durante 80
segundos, luego 94ºC durante 30 segundos seguido de 1 ciclo de 67ºC
durante 80 segundos, luego 94ºC durante 30 segundos seguido de 1
ciclo de 66ºC durante 80 segundos, luego 94ºC durante 30 segundos
seguido de un ciclo de 65ºC durante 80 segundos, luego 94ºC durante
30 segundos seguido de un ciclo de 64ºC durante 80 segundos, luego
94ºC durante 30 segundos seguido de un ciclo de 63ºC durante 80
segundos y después 94ºC durante 30 segundos. Se consiguió una mayor
amplificación con 35 ciclos, siendo cada uno de 62ºC durante 80
segundos y posteriormente 94ºC durante 30 segundos. Después de que
las mezclas de reacción se termociclaran, las mezclas se
mantuvieron a 97ºC durante 15 minutos y la hibridación
olido-sonda se consiguió disminuyendo la
temperatura a 4ºC antes de que transcurrieran 2 minutos. Las
muestras se mantuvieron a 4ºC hasta la detección de productos de
reacción.
Los productos de reacción se detectaron en el
sistema Abbott LCx® (disponible en Abbott Laboratories, Abbott
Park, IL). Una suspensión de micropartículas recubiertas de
anticuerpo anticarbazol y un conjugado de anticuerpo
anti-adamantano/fosfatasa alcalina (todos ellos
disponibles comercialmente en Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)
se usaron en conjunto con el LCx® para capturar y detectar los
productos de reacción. El sustrato enzimático usado fue
metil-umbeliferil-fosfato (MUP),
midiéndose la proporción de conversión de MUP en MU
(metil-umbeliferona) y presentándose como
cuentas/segundo/segundo (c/s/s).
Los datos de este experimento se presentan en la
Tabla 3 y muestran la detección de VIH-1 de subtipo
B a concentraciones tan bajas como 10 moléculas/ensayo (mol/ensayo)
usando los conjuntos de cebador/sonda 1, 2 y 3 para
VIH-1, y la detección de 100 moléculas/ensayo
usando el conjunto de cebador/sonda 4 para
VIH-1.
Para evaluar la sensibilidad de los diferentes
conjuntos consenso de cebador/sonda para VIH-2 se
usó VIH-2 del subtipo A. Se aisló ARN a partir de
viriones de subtipo A de VIH-2 purificado por
gradiente (VIH-2_{NIHZ,} Advanced Biotechnologies
Inc., Columbia, MD) usando el procedimiento de extracción de ARN de
Qiagen y la metodología de columna descrita por el fabricante
(Qiagen, Frankfurt, Germany). Se purificó ARN a partir de viriones
que inicialmente se cuantificaron por microscopía electrónica. El
ARN purificado resultante se diluyó en ARN ribosomal a 1 ng/\mul
hasta niveles apropiados para la detección.
Se evaluaron tres conjuntos consenso de
cebador/sonda diferentes para VIH-2: el conjunto nº
5 usó las SEC ID Nº 16 y 17 como cebadores y la SEC ID Nº 18 como
sonda, el conjunto nº 6 usó las SEC ID Nº 19 y 20 como cebadores y
la SEC ID Nº 22 como sonda (aunque también podría haberse empleado
la SEC ID Nº 21 como sonda en solitario o en combinación con la SEC
ID Nº 22) y el conjunto nº 7 usó las SEC ID Nº 20 y 23 como
cebadores y la SEC ID Nº 21 como sonda. Todas las secuencias se
prepararon como se describe en el Ejemplo 1.
Las mezclas de reacción se prepararon, se
sometieron a transcripción inversa, se amplificaron y se detectaron
usando los tres conjuntos consenso de cebador/sonda para
VIH-2 en reacciones separadas, como se describe en
el Ejemplo 2.
Los resultados presentados en la Tabla 4
muestran la detección de VIH-2 hasta concentraciones
tan bajas como 1 molécula/ensayo usando los conjuntos consenso de
cebador/sonda 5 y 6 para VIH-2 y, la detección de
100 moléculas/ensayo usando el conjunto de cebador/sonda 7 para
VIH-2.
La divergencia genética del VIH es el aspecto
más desafiante de la detección. Existe la necesidad de ensayos que
detecten de forma precisa todos los subtipos, incluyendo el subtipo
más divergente "O". Se obtuvieron muestras de suero de Digene
(Silver Spring, MD) de los subtipos A-F de
VIH-1, y dos aislados de VIH-1 del
subtipo O. Se extrajo y purificó ARN viral de cada uno de los
aislados usando columnas Qiagen y la metodología descrita por el
fabricante (Qiagen, Frankfurt, Germany). Se cuantificó el ARN en
copias de ARN viral por mililitro y se realizaron 10 diluciones en
serie en ARN ribosomal a 1 ng/\mul para la detección. La Tabla 5
muestra la cantidad de ARN (moléculas/ensayo) usado por reacción a
cada dilución de muestra para cada subtipo.
Los cuatro conjuntos consenso de cebador/sonda
diferentes para VIH-1 se usaron en reacciones
separadas para transcribir de forma inversa, amplificar y detectar
el ARN de la muestra de los distintos subtipos de
VIH-1 como se describe en el Ejemplo 2. El subtipo
O se ensayó sólo con el conjunto nº 1 de cebador/sonda para
VIH-1. Las Tablas 6 a 9 mostradas a continuación
muestran los resultados de este examen.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto nº 1 de cebador/sonda para
VIH-1 detectó todos los subtipos de
VIH-1 ensayados en la Tabla 6 anterior, incluyendo
la amplia divergencia de los subtipos O, en un intervalo de
sensibilidad entre 100 y 1 molécula/ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto de cebador/sonda nº 2 detectó todos
los subtipos de VIH-1 ensayados en la Tabla 7
anterior con una sensibilidad similar a la del conjunto de
cebador/sonda nº 1.
El conjunto de cebador/sonda nº 3 detectó 5 de
los 6 subtipos de VIH-1 ensayados en la Tabla 8
anterior con una sensibilidad de aproximadamente 200
moléculas/ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto de cebador/sonda nº 4 detectó 4 de
los 6 subtipos de VIH-1 ensayados en la Tabla 9
anterior con una sensibilidad de entre 2000 y 200 mol/ensayo.
Se evaluó la especificidad de los conjuntos nº 1
y nº 2 de cebador/sonda para VIH-1 frente a ARN
extraído y purificado a partir de VIH-1 de subtipo
B (cepas MN y 3B) y muestras de suero de VIH-2 como
en el Ejemplo 4. Los dos conjuntos consenso de cebador/sonda de
VIH-1 diferentes se usaron en reacciones separadas
para transcribir de forma inversa, amplificar y detectar diluciones
1:10 del ARN de la muestra como se describe en el Ejemplo 2. Como
se muestra en la Tabla 10, ambos conjuntos de cebador/sonda para
VIH-1 detectan los dos ARN de
VIH-1, pero no detectan ARN de suero de
VIH-2, indicando que los conjuntos de cebador/sonda
para VIH-1 son específicos para detectar
VIH-1 y no reaccionan de forma cruzada y detectan
VIH-2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se examinó la especificidad del
conjunto nº 5 de cebador/sonda para VIH-2 frente a
ARN aislado a partir de VIH-1 purificado en
gradiente como en el Ejemplo 2. Las diluciones del ARN de
VIH-1 purificado se sometieron a transcripción
inversa, se amplificaron por PCR y se detectaron como en el Ejemplo
2 usando el conjunto nº 5 de cebador/sonda consenso de
VIH-2, usándose el conjunto nº 1 de cebador/sonda
consenso de VIH-1 en reacciones separadas como
control. Los resultados, mostrados en la Tabla 11, indican que el
conjunto nº 5 de cebador/sonda consenso de VIH-2 no
reacciona de manera cruzada con el ARN de VIH-1 ni
lo detecta.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para permitir el ensayo de VIH-1
y VIH-2 en una sola reacción en vez de en dos
reacciones separadas, tendrían que usarse conjuntos de
cebador/sonda para VIH-1 y para
VIH-2 en la misma reacción. La posibilidad de hacer
esto se ensayó mezclando conjuntos de cebador/sonda para
VIH-1 y para VIH-2 y usándolos para
detectar ARN purificado de VIH-1 o de
VIH-2.
Se purificaron ARN de VIH-1 y 2
y se cuantificaron como en los Ejemplos 2 y 3 respectivamente. El
conjunto de cebador/sonda nº 1 para VIH-1 y el
conjunto de cebador/sonda nº 8 para VIH-2, que
consistían en las SEC ID Nº 16 y 24 como cebadores y en las SEC ID
Nº 18 como sondas, preparados como se describe en el Ejemplo 1, se
usaron juntos o separados para la transcripción inversa, la
amplificación y la detección de las diluciones de ARN purificado de
VIH-1 y de VIH-2 como se describe en
el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 12.
Aunque hubo una disminución logarítmica de 1 a
1,5 en la detección de VIH-2 cuando se usaron los
conjuntos de cebador/sonda para VIH-1 y para
VIH-2 en la misma mezcla de reacción, la
sensibilidad se mantuvo aceptable a aproximadamente 10 moléculas
por reacción. De manera importante, la detección de
VIH-1 no se alteró por la inclusión del conjunto de
cebador/sonda para VIH-2 junto con el conjunto de
cebador/sonda para VIH-1 en las mezclas de reacción
de VIH-1, manteniéndose la sensibilidad a
aproximadamente 10 moléculas por reacción.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: P. Kroeger
\hskip3,9cm K. Abravaya
\hskip3,9cm J. Gorzowski
\hskip3,9cm R. Hoenle
\hskip3,9cm C. Esping
\hskip3,9cm J. Moore
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS PARA DETECTAR VIH-1 Y VIH-2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Abbott Laboratories
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 100 Abbott Park Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Abbott Park
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Illinois
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: 60064-3500
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: MacIntosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: System 7.0.1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Microsoft Word 5.1a
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Paul D. Yasger
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 37.477
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE EXPEDIENTE: 6127.US.01
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 847/938-3508
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 847/938-2623
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2348 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN genómico (VIH-1)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTCCCTACA ATCCCCAAAG TCAAGGAGT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTGCACTGT ACCCCCCAAT CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAGTAC AAATGGCA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGCAGAAA CTTTCTATGT AGATGG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATATTGTGA GTCTGTTACT ATGTTTACT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGGAAAAGC AGGATATG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTACAGTAT TAGTAGGACC TACACCTGT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCATTGTT TAACTTTTGG GCCATCCA
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTAGTCCTA TTGAAACTGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAAGCCCCA TAGCC
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTAGTATAA ACAATGAGAC ACCAGG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCTACAT ACAAGTCATC CATGTA
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATGGAAAG GATCACCA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2689 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN genómico (VIH-2)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTGATGGCA GTTCATTGCA TGAATTTTAA AAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCACAGCT GATCTCTGCC TTCTCTG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGAACAAGA AATACAATTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCAATTCT CTCTTTGGAA AAGACC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAATGTTGAT TGGGGTATCT CCTGTC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAAAAATAG TAGGGGG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAGTAGCAG GAATAGA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATAGTAGC AGGAATAGAG TTAGG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAGCTGAT CTCTGCCTTC TCTGTAATAG AC
\hfill32
Claims (6)
1. Conjunto de cebador/sonda 1 (SEC ID Nº 2, 3 y
4) para detectar VIH-1.
2. Un método para detectar VIH en una muestra,
comprendiendo dicho método los pasos de:
(a) formar una mezcla de reacción que comprende
reactivos de amplificación de ácidos nucleicos, conjunto 1 de
cebador/sonda (SEC ID Nº 2, 3 y 4), y una muestra de ensayo que
contiene una secuencia diana de VIH;
(b) someter la mezcla a condiciones de
amplificación para generar al menos uno copia de una secuencia de
ácido nucleico complementaria a la secuencia diana;
(c) hibridar la sonda con la secuencia de ácido
nucleico complementaria a la secuencia diana, para formar así un
híbrido que comprenda la sonda y la secuencia de ácido nucleico
complementaria a la secuencia diana; y
(d) detectar el híbrido como una indicación de
la presencia de VIH en la muestra de ensayo.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
dichos reactivos de amplificación incluyen una enzima que tiene
actividad transcriptasa inversa y dicho método comprende además el
paso, después del paso (a) y antes del paso (b), de formar un ADNc
a partir de un genoma de VIH.
4. En el método de la reivindicación 2, en el
que el paso (b) se repite entre 10 y 100 veces.
5. Un kit que comprende:
- \quad
- conjunto 1 de cebador/sonda (SEC ID Nº 2, 3 y 4); y
- \quad
- reactivos de amplificación.
6. El kit de la reivindicación 5 en el que los
reactivos de amplificación comprenden una enzima que posee
actividad transcriptasa inversa.
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