CN103773841A - 防止扩增过程中高分子量产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于扩增和检测可存在于生物样品中的核酸目标的改进的方法，包含用于产生扩增子的引物对和对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中至少一个引物在5’末端用与目标序列不互补的聚N序列修饰。防止或部分或完全抑制在扩增过程中的高分子量产物的形成。本发明进一步提供适当修饰的引物和包含所述引物的试剂盒用于防止或抑制在核酸目标的扩增和检测过程中的高分子量产物形成的用途。

Description

防止扩增过程中高分子量产物的方法
技术领域
本发明属于体外诊断领域，涉及改进的用于扩增和检测生物样品中可存在的核酸目标的方法，包括用于产生扩增子的至少一个引物对和对于所述扩增子特异性的可检测的探针，其中至少一个引物在5’末端用与目标序列不互补的聚N序列修饰。所述改进具体基于的事实为，防止或部分或全部抑制在扩增过程中除所设计的扩增子之外的副产物(即高分子量产物的)的形成。如果本发明在诊断类型的应用中使用，则避免假阴性或假阳性结果。本发明进一步提供适当修饰的引物和包含所述引物的试剂盒用于防止或抑制在扩增和检测核酸目标过程中高分子量产物形成的用途。
背景技术
在分子诊断领域，核酸的扩增和检测非常重要。核酸扩增和检测的诊断应用的实例是病毒例如人类乳头状瘤病毒(HPV)、西尼罗河病毒(WNV)的检测，或对人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和/或丙型肝炎病毒(HCV)的存在进行的血液捐献物的常规筛查。所述扩增和检测技术也适于细菌核酸目标或肿瘤学标志物的分析等。
对于扩增和检测核酸目标最突出和广泛使用的方法是利用聚合酶酶类的聚合酶链式反应(PCR, US 4.683.195和US 4.683.202)。相关重要的改进是，如在PCR过程中利用携带报告基团或标记物的修饰的寡核苷酸对扩增产物的实时检测，所述修饰的寡核苷酸已知为水解或5'-核酸酶探针，例如在COBAS® TaqMan®(US 5.210.015和US 5.487.972)上的商业测定中所使用的。其它改进的扩增和检测方法已知为分子信标技术(WO 95/13399)或利用包含小沟结合物(minor groove binder，MGB)部分的寡核苷酸的方法(WO 03/062445和WO 2006/135765)。
进一步已知多种引物(在这些引物的至少一种的5'末端包含添加的具有高GC含量的寡核苷酸)的使用显示在扩增效率中的改进(Q. Liu等, Genome Research vol. 7 (1997), p. 389-398; WO 01/94638; US 2004/0110182)。对于例如其5'末端已添加GGAC单元的引物，经过大约12到40个PCR循环后扩增产物的最终数量明显高于未修饰的引物。
Afonina等(BioTechniques vol. 43(3) (2007), p. 1-3; WO 2006/135765)描述通过使用具有在5'末端随机分散的，短的腺嘌呤和胸腺嘧啶丰富的片段的引物和小沟结合物(MGB)荧光水解探针，增加实时PCR荧光信号并从而获得改进的扩增效率。
并且，在一些PCR测定中，副产物，像高分子量产物的形成，可以对扩增效率具有实质性的影响，如产生假阳性或假阴性结果。具体而言对于低滴度样品，由于高分子量扩增产物的形成而预期检测信号的减少或信号丢失，导致假阴性结果。当进行更多的PCR循环时，扩增效率通常更加减少。
在定量PCR反应中，经常添加内部验证和定量标准品并且共扩增。其作为制备和扩增过程的对照并对抑制效果进行补偿。内部标准品的扩增过程中高分子量产物的形成可以导致抑制信号和无效标准，使得由内部验证和定量标准品对照的PCR反应无效。然而，现有技术中，例如WO 2008/064687或WO 2012/032510中描述的含尾部的引物不适于防止或抑制扩增子的高分子量产物的形成，扩增反应进行越长或者PCR循环进行越多，所述扩增子的高分子量产物产生越多。所述含尾部的引物更能够减少基于所应用引物的非特异性扩增产物的形成。
假阳性结果的来源是“遗留污染(carryover contamination)”，其中来自先前PCR反应的PCR产物(扩增子)污染后续的PCR测定。污染物可以通过技术员、设备或甚至经由气溶胶传递。高分子量产物比单个扩增子对污染防止措施像尿嘧啶-DNA糖基化酶(US 6.713.294)更有抗性，并从而显著地增加遗留污染的风险。在真正的阴性样品中，其中不存在目标核酸，污染物产生假阳性结果。在真正的阳性样品中，其中存在目标核酸，污染物与真正的目标共扩增。该共扩增可以歪曲定量测定的结果，而其中真正的目标的准确量必须被确定。
因此，本领域有需要以提供用于核酸目标的简单和可靠的扩增和检测的方法。具体存在需要以提供致力于抑制高分子量副产物的适当的改进的方法。
发明内容
本发明涉及用于扩增和检测可存在于生物样品中的核酸目标的新方法和用途，包括用于产生扩增子的至少一个引物对和对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中至少一个引物在5’末端用与目标序列不互补的聚N序列修饰。所述改进具体基于以下事实，即，防止或部分或完全抑制在扩增过程中高分子量产物的形成，并从而由此避免如假阴性或假阳性结果。从而，本发明的一个主题是：
用于扩增和检测生物样品中的核酸目标的方法，其中防止或抑制扩增过程中高分子量产物的形成，所述方法包括下列步骤：
a) 使所述样品中的核酸与扩增试剂接触，所述扩增试剂至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷单体、用于产生扩增子的延长的正向引物或延长的反向引物和对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中所述延长的正向引物或所述反向引物的至少一种包含添加到所述引物的5'末端的与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)；
b) 将所述核酸与所述扩增试剂在足以使扩增反应发生的一段时间和条件下孵育；并
c) 经由所述可检测的探针或DNA结合染料检测所述扩增子。
本发明进一步涉及用于扩增和检测可存在于生物样品中的核酸目标的新方法和用途，包括用于产生扩增子的至少一个引物对和对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中两条引物均在5’末端用与目标序列不互补的聚N序列修饰。所述改进具体基于以下事实，即，防止或部分或完全抑制在扩增过程中高分子量产物的形成，并从而由此避免如假阴性或假阳性结果。从而，本发明的一个主题是：
用于扩增和检测生物样品中的核酸目标的方法，其中防止或抑制扩增过程中高分子量产物的形成，所述方法包含下列步骤：
a) 使所述样品中的核酸与扩增试剂接触，所述扩增试剂至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷单体、用于生成扩增子的延长的正向引物和延长的反向引物和对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中所述延长的正向引物和反向引物各自包含添加到所述引物的5'末端的与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)；
b) 在足以使扩增反应发生的一段时间和条件下孵育所述核酸和所述扩增试剂；并
c) 经由所述可检测的探针或DNA结合染料检测所述扩增子。
本发明进一步的一个主题是：
用于防止或抑制PCR扩增过程中高分子量产物形成的方法，所述方法包括下列步骤：
a) 使生物样品中的核酸与扩增试剂接触，所述扩增试剂至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷单体、用于产生扩增子的延长的正向引物和/或延长的反向引物和对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中所述延长的正向引物和/或反向引物的至少一种包含添加到所述引物的5'末端的与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)；
b) 在足以使扩增反应发生的一段时间和条件下孵育所述核酸和所述扩增试剂；并
c) 经由所述可检测的探针或DNA结合染料检测所述扩增子。
根据本发明的方法添加了对本领域的若干改进：通过防止或抑制在PCR过程中高分子量产物的形成，因为荧光抑制被避免而使扩增子的后续检测更加可靠。这应用于目标和/或内部标准品两者的扩增。高分子量产物，而不是扩增子，导致在后续PCR反应中的荧光抑制。本发明方法特别是有利于以下样品的检测：其中不存在核酸目标或当应用通常至少20个PCR循环时仅含低滴度量的核酸目标。在一些该实施方案中，PCR循环在多于30个循环后终止，有时多于40个，优选多于50个和最优选多于60个循环后终止。对于大部分这些样品，扩增反应在50个循环之前不终止。在存在来自先前的PCR反应的低水平的污染的条件下，该PCR反应的抑制甚至更加显著。
通过使用延长的引物以阻止或抑制高分子量产物形成的根据本发明的方法还可以用于其中不需要用于检测的探针或DNA结合染料的扩增方法。
根据本发明的表述“聚N序列”指多核苷酸序列，其可以含有所有5种天然碱基：腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)，或这些天然碱基的仅四、三、二或一种。根据本发明的聚N序列包含至少两个或更多相同的碱基，例如，(A)m、(T)m、(G)m、(C)m、(U)m，其中m具体是数目2到10，或不同的碱基，例如(AT)n、(AG)n、(AC)n、(TA)n、(UA)n、(GA)n或(CG)n，其中n具体是数目1到5，并且通常总共不多于50个核苷酸。优选地，所述聚N序列由衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)的一种类型的核苷酸或两种不同的核苷酸组成。聚N序列可以添加到至少一种所使用的引物上。添加到两种或更多种引物的聚N序列可以是相同或不同的。在本发明的一些实施方案中，正向引物和反向引物包含相同的聚N序列。
根据一个实施方案，本发明提供上述方法，其中步骤a)中所述的聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根据本发明使用以下聚N序列，所述聚N序列包含100%的衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)的一种类型核苷酸或两种不同核苷酸，并且长度总共2到10个核苷酸或4到6个核苷酸。根据本发明具体使用包含4到6个连续腺苷碱基(A)的聚N序列尾。聚N尾还可以包含修饰的核苷酸，像烷基化的核苷酸例如N4-乙基-dC、N6-甲基-dA或2'-O-甲基-核苷酸等，只要所修饰的寡核苷酸(引物)具有在扩增反应中与其互补物杂交和作为模板的能力。
并且，本发明提供试剂盒，其用于通过任何上述方法扩增和检测生物样品中的目标核酸。所述试剂盒包含至少一种聚合酶，例如热稳定的聚合酶、至少四种不同的三磷酸核苷或其它核苷单体、用于产生至少一种扩增子的至少一种延长的正向引物和/或至少一种延长的反向引物，以及至少一种对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中所述延长的正向引物和反向引物的至少一种包含添加到所述引物的5'末端的与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)。根据本发明的试剂盒具体是那些其中所述聚N序列包含长度为2到10个核苷酸的聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C、聚G序列的试剂盒。聚N序列可以连接到至少一种所使用的引物上。连接到两种或更多种引物的聚N序列可以是相同或不同的。在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒包含含有相同的聚N序列的正向引物和反向引物。试剂盒可以进一步包含额外的引物和探针、酶类像尿嘧啶-N-糖基化酶、适配体、缓冲液组分和去垢剂等。
为了帮助理解本发明，下面定义若干术语。
“生物样品”可以是天然来源的任何样品。“生物样品”例如衍生自人并且是体液或身体的组织。在本发明的一个实施方案中，“生物样品”是血液。
术语“核苷”指由连接到糖，例如核糖或脱氧核糖的C-1'碳的碱基组成的化合物。核苷的碱基部分通常是杂环碱基，例如，嘌呤或嘧啶。
术语“核苷酸”指作为单体单元或在多核苷酸内的核苷的磷酸酯。“核苷5'-三磷酸”指具有连接到糖5'-碳位置的三磷酸酯基团的核苷酸，并且有时表示为“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”。修饰的核苷酸是任何核苷酸(如ATP、TTP、UTP、GTP或CTP)，其已被化学修饰，典型地通过修饰碱基、糖或磷酸部分。修饰的核苷酸包括，例如但不限于，碱基部分例如N4-乙基胞苷、N6-甲基腺苷、N6-叔丁基苯甲基腺苷或N4-叔丁基苯甲基胞苷、5-甲基胞苷、6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤，或糖修饰例如2'-O-甲基-核糖和2'-氟-或2'-氨基-2'-脱氧核糖等。如本文所使用，术语“核苷酸类似物”指非天然存在的任何核苷酸。
表述“其它核苷单体”指除了标准的三磷酸核苷之外的磷酸活化的核苷，其可以在酶促多核苷酸合成中采用，作为例如四磷酸核苷等。
术语“目标核酸”和“目标区域”指所要扩增、检测或另外分析的核酸区域。与引物或探针杂交的序列可以称为“目标序列”。
术语“核酸”和“寡核苷酸”指引物、探针和所要检测的寡聚体片段，并应当对多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)，对多核糖核苷酸(包含D-核糖)和对任何其它类型的多核苷酸是通用的，其是嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷。术语“核酸”和“寡核苷酸”之间在长度上没有意向的差异，并且这些术语将互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双和单链DNA，以及双和单链RNA，以及RNA和DNA的双链。
寡核苷酸的准确大小取决于很多因素和寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何合适的方法制备，包括，例如适当序列的克隆和限制性处理和直接化学合成，通过方法例如Narang等, 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99的磷酸三酯法；Brown等, 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage等, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862的亚磷酰胺法；和US 4.458.066中描述的固体支持法。合成方法的综述提供在Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187中。
术语“扩增(amplification)”、“扩增(amplifying)”等一般指导致分子或相关分子集合的拷贝数目增加的任何过程。当其应用于多核苷酸分子时，扩增指产生多核苷酸分子或多核苷酸分子的部分的多个拷贝，典型地从小量的多核苷酸(例如，病毒基因组)开始，其中所扩增的材料(扩增子、PCR扩增子)典型地是可检测的。多核苷酸的扩增包括各种化学和酶促过程。在聚合酶链式反应(反转录PCR，PCR)、链置换扩增(SDA)反应、转录介导的扩增(TMA)反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)反应或连接酶链式反应(LCR)过程中从一个或几个拷贝的模板RNA或DNA分子产生多个DNA拷贝，是扩增的形式。扩增不限于起始分子的严格复制。例如，使用反转录PCR从样品中有限量的病毒RNA产生多个cDNA分子，是扩增的形式。并且，在转录过程中从单个DNA分子产生多个RNA分子，也是扩增的形式。
术语“扩增子”指在具体目标核酸的扩增之后产生的多核苷酸分子(或共同地，多种分子)。用于产生扩增子的扩增方法可以是任何合适的方法，最典型地，例如通过使用PCR方法。扩增子典型地但不专有地是DNA扩增子。扩增子可以是单链的或双链的，或在以任何浓度比的其混合物中。
术语“高分子量产物”指扩增子的寡聚体(或多聚体或多联体)并因此包含对引物、探针和DNA结合染料的多个结合位点。随着更多PCR循环进行，这些具有约1000个碱基对到10000个碱基对的高分子量产物形成增加，具体是因为扩增子非特异性地充当引物。
术语“杂交”指由两条单链核酸由于互补碱基配对而形成双链体结构。杂交可以在完全互补的核酸链之间或包含小的错配区域的“基本上互补的”核酸链之间发生。只有完全互补的核酸链可以杂交的条件称作“严格杂交条件”或“序列特异性杂交条件”。在较低严格杂交条件下可以获得基本上互补的序列的稳定的双链体。根据本领域提供的指导(参见，例如Sambrook等, 2nd Edition 1989, Part 1-3, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)，核酸技术领域的技术人员可以经验性地考虑多种变量包括，例如寡核苷酸的长度和碱基对浓度、离子强度和错配碱基对的发生率，从而确定双链体稳定性。
通常，将严格条件选择为，在规定的离子强度和pH值，对于特定序列比热解链点(Tm)低约5℃。Tm是50%的双链体解离的温度(在规定的离子强度和pH)。放松杂交条件的严格性将允许序列错配被容忍；容忍的错配程度可以通过杂交条件的适当调整来控制。
术语“引物”指寡核苷酸，无论天然的或合成的，其能够在诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下充当RNA或DNA合成的起始点，所述条件即，在存在四种不同三磷酸核苷和用于聚合的试剂(即，DNA聚合酶或反转录酶)的情况下，在适当缓冲液中和在适当的温度下。引物优选为单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的适当的长度取决于引物意向的用途，但典型地在从15到35个核苷酸的范围。短引物分子通常需要更低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板核酸的准确的序列，但必须足够互补以与模板杂交。引物可以掺入额外特征，所述特征增加结合到目标序列的特异性(例如修饰的核苷酸，像EP 0 866 071和EP 1 201 768中描述的3'末端烷基化的核苷酸)，或者允许检测或固定化引物但不改变引物充当RNA或DNA合成的起始点的基本性质。例如，引物可以在5'端包含额外的核酸序列，其不杂交到目标核酸，但其促进所扩增产物的克隆和/或根据本发明抑制或防止高分子量产物的形成。与模板足够互补以杂交的引物的区域在本文中称作杂交区域。
如本发明所使用的术语“延长的引物”或“聚N延长的引物”指在5'端包含额外的多核苷酸序列(聚N)的引物，所述额外的多核苷酸序列可以包含所有五种天然碱基：腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)和胸苷(T)，或这些天然碱基的仅四、三、二或一种。具体而言，根据本发明的聚N序列分别包含至少两个或更多相同的碱基，例如，(A)m、(T)m、(G)m、(C)m或(U)m，其中m是数目2到10，或不同的碱基，例如(AT)n、(AG)n、(AC)n、(TA)n、(UA)n、(GA)n或(CG)n，其中n分别是数目1到5，并且通常总共不多于50个核苷酸。聚N序列可以例如包括聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根据本发明在大部分情况下应用如下聚N序列，所述聚N序列包含100%的衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)的一种类型核苷酸或两种不同核苷酸，并且长度总共2到10个核苷酸，或4到6个核苷酸。根据本发明，使用至少一种适当延长的引物。添加到至少两种延长的引物的每一种的聚N序列可以是相同或不同的。
根据本发明的表述“聚N序列”指由衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)的一种类型的核苷酸或两种不同的核苷酸组成的多核苷酸序列。聚N序列包含至少两个或更多相同的碱基，例如，(A)m、(T)m、(G)m、(U)m、(C)m，其中m具体是数目2到10，或不同的碱基，例如(AT)n、(AG)n、(AC)n、(TA)n、(UA)n、(GA)n或(CG)n，其中n具体是数目1到5，并且通常总共不多于50个核苷酸。添加到两种或更多种所使用的引物的聚N序列可以是相同或不同的。在本发明的具体实施方案中，正向引物和反向引物包含聚N序列，所述聚N序列可以是相同或不同的。聚N尾还可以包含修饰的核苷酸，像烷基化的核苷酸例如N4-乙基-dC、N6-甲基-dA或2'-O-甲基-核苷酸等，只要所修饰的寡核苷酸(引物)具有在扩增反应中与其互补物杂交和作为模板的能力。在一些实施方案中，无论正向或反向引物，仅一种引物包含该聚N尾都可以是有用的。
在一个实施方案中，本发明提供上述方法，其中步骤a)中所述的聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根据本发明使用以下聚N序列，所述聚N序列包含100%的衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)的一种类型的核苷酸或两种不同核苷酸，并且长度总共2到10个核苷酸。根据本发明也使用在长度上包含4到6个核苷酸的聚N序列。根据本发明具体使用包含四到六个连续腺苷(A)碱基的序列尾。
如本文所用，“上游”引物指其延长产物是编码链的子序列的引物。“下游”引物指其延长产物是互补的非编码链的子序列的引物。
如本文所用，“正向”引物指在PCR中从在反义链3'端的起始密码子向在模板DNA (核酸目标) 5'端的终止密码子延伸的引物，而“反向”引物指从在有义链5'端的终止密码子向在模板DNA 3'端的起始密码子延伸的引物。正向引物通常设计以退火到起始密码子上游的模板DNA，而反向引物设计以退火到终止密码子下游的模板DNA的区域。
如本文所用，术语“探针”指由于互补碱基配对而与目标核酸的序列形成双链体结构的寡核苷酸。探针用于检测或捕获目标核酸。探针优选为单链寡脱氧核糖核苷酸。探针典型地将由“杂交区域”组成，或包含“杂交区域”，所述“杂交区域”优选由对应目标序列的区域的10到50个核苷酸、更优选15到35个核苷酸组成。
“对应”指至少基本上与指定的核酸或其互补物互补。探针不需要反映模板核酸的准确的序列，但必须足够互补以在所选杂交条件下与目标杂交。探针寡核苷酸可以包含，或结合，额外特征，所述额外特征允许检测或固定化探针，但不显著改变杂交区域的杂交特征。例如，探针可以通过掺入一种或更多种标记的核苷酸或通过结合一种或更多种分离的可检测的部分而被标记。标记的核苷酸或可检测的部分包含例如，但不限于荧光染料，像荧光素、罗丹明、香豆素和花菁，或淬灭染料，像黑洞猝灭剂(Black Hole Quenchers)，如来自Biosearch Technologies Inc., Novato, CA的BHQ-2。探针可以是如技术人员已知的例如水解或5'-核酸酶探针、分子信标探针、包含小沟结合剂的探针或杂交探针等。
如本文所用，如果在寡核苷酸和目标序列之间存在的错配的数目少于在寡核苷酸和非目标序列之间存在的错配的数目，则寡核苷酸引物或探针是对于目标序列“特异性的”。杂交条件可以选择为，在该杂交条件下只有存在的错配的数目不多于在寡核苷酸和非目标序列之间存在的错配的数目，才形成稳定的双链体。在该条件下，目标特异性寡核苷酸仅能与目标序列形成稳定的双链体。因此，在适当的严格杂交条件下目标特异性探针的使用使能够检测特异的目标序列。类似地，在适当的严格扩增条件下目标特异性引物的使用使能够特异性扩增那些包含目标引物结合位点的目标序列。
术语“热稳定的聚合酶酶类”指这样的酶，其对热相对稳定并催化三磷酸核苷聚合以形成与目标序列的核酸链之一互补的引物延伸产物。如应用于酶的术语“热稳定的”，具体指在升高的温度(如，在55℃或更高)保留其生物活性，或在加热和冷却的重复循环后保留其生物活性的酶。聚合酶酶类在引物的3'端起始合成并向模板的5'端的方向进行直至合成终止。纯化的热稳定的聚合酶酶类更充分地描述在如US 4.889.818中，并可商购获得，例如从Roche Diagnostics GmbH/德国商购获得。
术语给定的核酸的“互补物”具体指反向平行的多核苷酸链，其意味着与给定的核酸具有相同长度并精确地互补的核酸。例如序列5'-AGTTC-3'与序列5'-GAACT-3'互补。术语“完全互补”或“100%互补”等指在反向平行链间具有完美的沃森-克里克碱基配对的互补序列(在多核苷酸双链体中没有错配)。但是，互补性不需要是完美的；稳定的双链体，例如，可以包含错配的碱基对或未配对的碱基。术语“部分互补性”、“部分互补”、“不完全互补性”或“不完全互补”等指在反向平行的多核苷酸链间低于100%完美的任何碱基比对(例如，在多核苷酸双链体中存在至少一个错配或未配对的碱基)。因此，核酸的互补物指单个唯一定义的序列。
术语“可检测的”、“标记”或“报告物”以其最宽泛的意义，指可检测的，或允许与其相关联的部分或性质的检测的任何部分或性质。例如，包含标记的多核苷酸是可检测的(并在一些方面称作为探针)。理想地，标记的多核苷酸允许包含多核苷酸的杂交复合物的检测。在一些方面，例如标记连接(共价地或非共价地)于多核苷酸。在各个方面，标记可以，可替换地或以组合地：(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰由第二标记提供的可检测的信号，例如FRET；(iii)稳定化杂交，例如双链体形成；(iv)赋予捕获功能，例如疏水亲和性，抗体/抗原，离子络合，或(v)改变物理属性，例如电泳迁移率、疏水性、亲水性、溶解性，或层析行为。标记在其结构和其作用机制方面广泛地变化。
标记的实例包括但不限于，荧光标记(包括，例如淬灭剂或吸收剂)、非荧光标记、比色标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、质量修饰基团、抗体、抗原、生物素、半抗原、酶(包括，例如，过氧化物酶，磷酸酶等)等。为了进一步阐释，荧光标记可以包括带负电的染料，例如荧光素家族的染料，或电中性的染料，例如罗丹明家族的染料，或带正电的染料，例如花菁家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括，例如，德克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA是可商购获得的，从例如Perkin-Elmer, Inc. (Wellesley, MA, USA)商购获得，德克萨斯红是可商购获得的，从例如Life Technologies (Molecular Probes, Inc.) (Grand Island, NY)商购获得。花菁家族的染料包括，例如CY2、CY3、CY5、CY5.5和CY7，并且是可商购获得的，从例如GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ, USA)商购获得。
术语“DNA结合染料”或“DNA插入染料”指能结合到双链核酸并在结合后发射荧光信号的染料分子，例如可从Life Technologies (Grand Island，NY)获得的SYBRGREEN I和SYBRGOLD或来自Roche Diagnostics (德国)的Lightcycler 480 Resolight。
术语“FRET”(荧光共振能量转移)和等效术语通常指两种染料分子的电子状态间动态的距离依赖性的相互作用，其中能量从供体分子转移到受体分子而没有从供体分子发射光子。FRET的效率取决于染料间分子间间隔的倒数，使在与生物大分子尺度相容的范围内有效。通常，FRET允许共定位分子或单分子内构象变化的成像、动力学分析和/或定量，并具有超过传统光学显微镜限制的空间分辨率。通常，FRET需要，(a)供体和受体分子必须非常接近(典型地，如10-100 Å)，(b)受体的吸收谱必须与供体的荧光发射谱重叠，并且(c)供体和受体跃迁偶极取向必须大致平行。
在大多数FRET应用中，供体和受体染料是不同的，在这种情况下FRET可以通过受体的敏化荧光的出现或通过供体荧光的淬灭来检测。在一些情况下，供体和受体是相同的，并且FRET可以通过所获得的荧光去极化来检测。单供体/受体分子在FRET系统中的使用描述于例如，Packard和Komoriya的US 7.312.302中。
FRET已变为重要技术，用于研究多种表征为分子接近性的变化的生物学现象。FRET技术现在普遍存在于很多生物学实验室，并且已适合于在很多生物学系统中使用，包括但不限于，核酸杂交的检测、实时PCR测定和SNP检测、蛋白结构和构象、蛋白复合物的空间分布和组装、受体/配体相互作用、免疫测定、探测单分子相互作用、核酸结构和构象、用于检测突变的引物延伸测定、自动DNA测序、脂质分布和转运、膜融合测定(膜融合的脂质-混合测定)、膜电位检测、荧光蛋白酶底物(fluorogenic protease substrates)和用于环化AMP和锌的指示剂。
术语“水解探针”或“5'-核酸酶探针”表示用于根据本发明的大多数应用并用于PCR反应中(即在COBAS® TaqMan®系统上)的探针。这些水解或5'-核酸酶探针由单链杂交探针组成，其通常用两种荧光部分标记。根据荧光共振能量转移(FRET)的原理，当第一个荧光部分由适当波长的光激发时，所吸收的能量转移到第二个荧光部分。第二个荧光部分通常是淬灭剂分子，其还可以是非荧光淬灭剂，像BHQ-2。以这种形式使用的典型的荧光染料是例如，FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan 500和CY5.5等。在PCR反应退火步骤过程中，标记的杂交探针结合到目标核酸(即，扩增产物)并在后续的延长阶段中被TaqDNA聚合酶或如技术人员已知的另一种合适的聚合酶，例如ZO5聚合酶的5'到3’核酸外切酶活性降解。其结果是，被激发的荧光部分和淬灭剂部分变得在空间上彼此分离。结果是，在不存在淬灭剂的情况下激发第一荧光部分后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。在LightCycler®和TaqMan®技术两种检测方式中，发射信号的强度都可以与原初目标核酸分子的数目相关联。
表述“丙型肝炎病毒的类型”指基于其基因组组织(例如，系统发生分析)的丙型肝炎病毒(HCV)的分类。HCV分离物的分类入特定类型的类别反映其与其它HCV分离物的基因组相关性，和其与其它HCV分离物的相对少的相关性。本文所用的HCV分型命名法与广泛采用的由Simmonds等(2005) “Consensus Proposals for a Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes”, Hepatology 42, No.4: 962-973修订和提出的命名法一致。Simmonds等(2005)的系统将已知HCV分离物分成六(6)种HCV基因型之一，称为基因型1到6。每个基因型进一步细分成称为亚型的分组，其反映相同基因型的毒株之间的相关性。HCV亚型通过在基因型后小写罗马字母书写，例如亚型1a、亚型1c、亚型6a等。在单个分离物内发现的基因变体称为准种(quasi species)。全世界已知包括所有6种基因型的大约100个HCV亚型；亚型的数目不是静态的；随着更多的HCV分离物被研究和测序，有可能识别出额外的亚型(以及可能的基因型)。
术语“病毒类型”可以指基因型或亚型。注意，如本文所用，术语“HCV类型”可以指HCV基因型或HCV亚型。术语“HCV分型”指将实验的(例如，未知类型) HCV分配到已知基因型(例如，1、2、3、4、5或6，或其子集)，或将实验的HCV分配到已知亚型(例如，1a、1b、1c、2a、2b、2c等，或其子集)。相反，还注意到，如本领域通常使用，术语“HCV基因分型”最经常指将HCV分配到HCV的任何亚型之一，例如，最典型地，1a、1b、1c、2a、2b、2c等。但是，如本文所用，术语“基因分型”指仅分配到1、2、3、4、5或6。
术语“试剂盒”用于指促进样品的处理、方法、测定、分析或操作的物品的组合。试剂盒可以包含描述如何使用试剂盒的书面说明书、方法所需的化学试剂或酶类、引物和探针，以及任何其它组分。在一些实施方案中，本发明提供了用于使用实时(RT)-PCR的“闭管”检测的试剂盒。这些试剂盒可以包括，例如，但不限于用于样品收集的试剂(例如，血样的收集)、用于RNA和/或DNA的收集和纯化的试剂(例如从血液)、用于扩增和检测的试剂(任选地包括反转录酶活性)、适用于反转录和第一链和第二链cDNA合成以产生一种或多种扩增子的引物(但至少一种正向引物和/或一种反向延长的引物)、尿嘧啶-DNA糖基化酶、热稳定的DNA依赖性的DNA聚合酶和(脱氧核糖)三磷酸核苷。在一些实施方案中，包含反转录酶活性和热稳定的DNA依赖性的DNA聚合酶活性的酶是同样的酶，例如栖热菌属种(Thermus sp.)ZO5聚合酶或嗜热链球菌(Thermus thermophilus)聚合酶。
分子生物学和核酸化学的常规技术，其在现有技术内，在文献中被充分解释，参见，例如，
Figure 294613DEST_PATH_IMAGE001
Figure 211753DEST_PATH_IMAGE002
Figure 427709DEST_PATH_IMAGE003
。
原则上，所有类型的核酸目标都可以使用本发明方法扩增和检测。然而，该方法具体应用于测试包含高目标的样品或对照，其中通过在较早的PCR循环中形成的扩增子的聚合，在PCR反应中产生高分子量产物。根据本发明的高目标核酸的实例是病毒例如人类乳头状瘤病毒(HPV)、西尼罗河病毒(WNV)的核酸，或那些用于对人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎(HBV)和/或丙型肝炎(HCV)的存在进行的血液捐献物的常规筛查的核酸。然而，本发明的方法也适于细菌目标或肿瘤学标志物的分析等。
具体而言，丙型肝炎病毒(HCV)感染是正在增长的世界性的关注点。HCV感染经常是持续性的，并引起慢性肝病，表现为肝硬化和肝细胞癌症。在美国，HCV是肝脏移植的主要原因。世界范围内，每年报告大约一百万新的HCV感染，仅在美国，估计四百万人被感染并且每年发生30000例新的感染。
目前，在美国每年HCV导致估计8000到10000例死亡。如果没有改进的诊断和治疗方法的开发，预期世界范围内该数字会在接下来的几年里显著增加。
HCV基因组是高度多态的，并且已经表征了很多毒株(称为基因型和亚型)。不同的病毒类型与不同的疾病结果和对治疗方案的不同反应性相关。
HCV基因组结构/组织与黄病毒科(Flaviviridae)的基因组结构/组织最为相似。与大部分黄病毒蛋白的已知功能一致，HCV蛋白的N-末端很可能是结构蛋白(包括C (衣壳/核心)，E1和E2包膜蛋白)，并且C末端非结构蛋白，包括N2 (金属蛋白酶)、NS3 (丝氨酸蛋白酶/螺旋酶)、NS4和NS5(NS5B RNA聚合酶)被认为是在病毒复制中发挥作用。
原型HCV分离物(现在称为HCV 1a)的表征和鉴定之后，鉴定了(并继续鉴定)来自世界各地的其它分离物。序列比较揭示这些独特的分离物可以彼此不同，达到在HCV基因组的全长范围多至35%的核苷酸非同一性的程度(Okamoto等(1992) Virology 188:331-341)。在整个病毒基因组观察到序列可变性，并有一些区域显示比其它区域更多的可变性。例如，通常在5'-UTR区观察到高序列保守性；相反，一些区域包括包膜(E)区域，显示高可变核苷酸序列。
知道在感染中存在的病毒基因型(和/或亚型)为临床医生提供用于确定对感染患者的最佳疗程的重要指示物。然而，可以区分日益增加数目的已知HCV类型的简单的诊断方法的开发已成为挑战。
用于扩增和检测目标核酸的本发明方法，其中目标核酸是病毒核酸，优选HCV，是优选的根据本发明的实施方案。
因此，本发明提供改进的寡核苷酸引物(延长的引物)，其能够对存在于大部分迄今已知类型的HCV的基因组中的高序列保守区域，例如5'UTR区域，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。本发明还提供了改进的寡核苷酸探针，其能够通过杂交检测HCV核酸。
本发明的引物的重要优点是它们能够扩增所有HCV类型，而没有同时扩增非目标序列。因此，所述引物使能够从源自世界所有区域的样品中检测HCV的所有类型的HCV检测分析成为可能。
因此，本发明的一个目标是用于扩增和检测生物样品中的核酸目标，例如HCV的核酸的方法，其中防止或抑制扩增过程中高分子量产物的形成，所述方法包括下列步骤：
a) 使所述样品中的核酸与扩增试剂接触，所述扩增试剂至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷单体、用于生成扩增子的延长的正向引物和/或延长的反向引物，和对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中所述延长的正向引物是第一HCV特异性寡核苷酸并且所述反向引物是第二HCV特异性寡核苷酸，所述引物的至少一种包含添加到所述引物的5'末端并与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)；
b) 在足以使扩增反应发生的一段时间和条件下孵育所述核酸和所述扩增试剂；并
c) 经由所述可检测的探针或DNA结合染料检测所述扩增子。
在本发明的具体实施方案中，所述方法包括在5'端包含聚N序列的引物，所述聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。聚N序列，其包含100%的一种定义的选择的核苷酸或两种定义的选择的核苷酸，像腺苷(A)、胸苷(T)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)并且总共2到10个核苷酸。根据本发明具体应用在长度上包含4到6个核苷酸的聚N序列。根据本发明最具体使用包含4到6个连续腺苷(A)核苷酸的聚N序列。
根据本发明的HCV特异性引物是，例如寡核苷酸，像如下序列的包含聚N的引物：用作正向引物的
Figure 760601DEST_PATH_IMAGE005
和用作反向引物的
Figure 574974DEST_PATH_IMAGE007
。根据本发明也可以使用在3'末端核苷酸进一步修饰，例如在腺苷的环外氨基烷基化的引物。
本发明的另一个目标是用于防止或抑制PCR扩增过程中的高分子量产物形成的方法，所述方法包括下列步骤：
a) 使生物样品中的核酸与扩增试剂接触，所述扩增试剂至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷单体、用于生成扩增子的延长的正向引物和/或延长的反向引物和对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中所述延长的正向引物和所述反向引物均对所要确定的核酸目标，例如HCV是特异性的，所述引物的至少一种包含添加到所述引物的5'末端并与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)；
b) 在足以使扩增反应发生的一段时间和条件下孵育所述核酸和所述扩增试剂；并
c) 经由所述可检测的探针或DNA结合染料检测所述扩增子。
在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在5'端包含聚N序列的引物，所述聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根据本发明使用以下聚N序列，所述聚N序列包含100%的一种定义的选择的核苷酸或两种定义的选择的核苷酸，像腺苷(A)、胸苷(T)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)，并且长度总共2到10个核苷酸。根据本发明具体应用在长度上包含4到6个核苷酸的适当的聚N序列。根据本发明最具体使用包含四到六个连续腺苷(A)碱基和/或胸苷(T)碱基的聚N序列。
根据本发明的HCV特异性引物是，例如寡核苷酸，像如下序列的包含聚N的引物：用作正向引物的
Figure 397436DEST_PATH_IMAGE008
和用作反向引物的
Figure 602152DEST_PATH_IMAGE009
。
具体而言，根据本发明使用寡核苷酸引物对来扩增HCV核酸，其中所述引物对选自：
Figure 801053DEST_PATH_IMAGE010
.
和任何所述正向引物(SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、19或21)与任何反向引物(SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、20或22)的任何组合。根据本发明的一个实施方案，一种或多种额外引物可以添加到要使用于HCV扩增的引物对，具体而言第二目标特异性反向引物，例如序列CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT (SEQ ID NO: 32)。
具体而言，根据本发明使用至少由引物SEQ ID NO: 1和引物SEQ ID NO: 2、引物SEQ ID NO: 3和引物SEQ ID NO: 4、引物SEQ ID NO: 5和引物SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10或引物SEQ ID NO: 15和引物SEQ ID NO: 16组成的引物对。并且，具体而言，根据本发明使用由引物SEQ ID NO: 1与引物SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 32，引物SEQ ID NO: 3与引物SEQ ID NO: 4 和SEQ ID NO: 32，引物SEQ ID NO: 5与引物SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 32，引物SEQ ID NO: 9与引物SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 32，或引物SEQ ID NO: 15与引物SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 32组成的引物组。根据本发明使用的另一对5'-聚N延长的引物包括以下序列的包含聚N的引物：AAACCCACTCTATGTCCGGTC (SEQ ID NO:23)和TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG (SEQ ID NO:24)。根据本发明使用的又一对5'-聚N延长的引物包括以下序列的包含聚N的引物：GTACGCCGGAATTGCCGGAAA (SEQ ID NO:25)和CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT (SEQ ID NO:26)。根据本发明的引物对可以包括至少一个额外引物，具体而言第二目标特异性反向引物。引物可以在3'-末端区域包含修饰的核苷酸，例如烷基化的核苷酸，像N4-乙基-dC、N6-甲基-dA、N4-叔丁基苯甲基-dC和N6-叔丁基苯甲基-dA以及2'-O-甲基-dU等。
本发明的寡核苷酸探针杂交到HCV基因组的区域，该区域包含在使用本发明引物扩增的区域内。探针能够在单组杂交条件下特异性检测来自所有类型的HCV核酸。当用于检测用本发明的引物扩增的HCV核酸时，探针的特异性进一步增加HCV检测的特异性，由此将假阳性的可能性减少到最小。
在一个实施方案中本发明提供了用于检测HCV核酸的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括HCV特异性核酸序列、可检测标记，例如荧光部分和任选地淬灭部分。根据本发明的探针可以，例如由下述组成：子序列FCGGAATTGCCAGGACGACCGGP (SEQ ID NO: 27)或其互补物，其中F是荧光染料如例如6-羧基-荧光素并且P是3'末端磷酸基团，或子序列CGGTGTACTCACCGTTCCGCAGACCACTATGGCTCT (SEQ ID NO: 28)或其互补物，包含花菁家族的荧光染料如例如连接到5'末端的CY5和3'末端磷酸基团，或子序列FCGGTGTACTCACCGQTTCCGCAGACC ACTATGP (SEQ ID NO: 29)或其互补物，其中F是荧光染料如例如6-羧基-荧光素，Q是非荧光淬灭剂像BHQ-2并且P是3'末端磷酸基团，或子序列GGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAG (SEQ ID NO: 30)或其互补物，包含至少荧光染料如例如CY5和/或荧光素，例如FAM，和3'末端磷酸基团。在本发明的具体实施方案中，探针选自GGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAG (SEQ ID NO: 30)，包含至少荧光染料如例如CY5和/或荧光素，例如FAM，和3'末端磷酸基团，CGGTGTACTCACCGTTCCGCAGACCACTATGGCTCT (SEQ ID NO: 28)或其互补物，包含至少荧光染料如例如CY5和/或荧光素，例如FAM，和3'末端磷酸基团，FCGGAATTGCCAGGACGACCGGP (SEQ ID NO: 27)，其中F是6-羧基-荧光素并且P是3'末端磷酸基团，FCGGTGTACTCACCGQTTCCGCAGACCACTATGP (SEQ ID NO: 29)，其中F是6-羧基-荧光素，Q是BHQ-2并且P是3'末端磷酸基团，和这些探针序列各自的互补物。
根据本发明的所有探针序列可以用技术人员已知的可选的染料标记，并可以在寡核苷酸探针的不同位置标记。
本发明的另一方面涉及用于从所有已知HCV类型扩增基因区域的方法，其包括使用至少本发明的延长的正向引物和/或延长的反向引物进行PCR，并使用本发明的探针或所述探针各自的互补物检测扩增的DNA。本发明的引物和探针或所述探针各自的互补物使用于HCV核酸的特异性检测的特别简单和快速方法成为可能。
本发明的另一方面涉及用于扩增和检测HCV核酸的试剂盒，其包含至少两种本发明的HCV特异性延长的扩增引物。这些试剂盒可以包括额外的试剂，例如本发明的探针。所述试剂盒还可以包括一种或多种扩增试剂，例如聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、适配体、缓冲盐、去垢剂、三磷酸核苷和其它组分，像例如甘油和/或DMSO。
通常应用于根据本发明的方法的核酸技术是聚合酶链式反应(PCR)，用于扩增核酸的特异性序列的方法，使得对以先前不可检测的低量存在于样品中的核酸的快速检测成为可能(参见US 4.683.195；4.683.202和4.965.188)。检测扩增的核酸的优选的方法是通过与序列特异性寡核苷酸探针杂交(参见Saiki等, 1986, Nature 324:163-166)。
所述检测方法可以包括但不限于结合或插入特异性染料，如溴化乙锭、SYBRGREEN或Lightcycler 480 Resolight，其插入双链DNA并之后改变其荧光。具体而言，检测步骤实时进行。通过使用可商购获得的实时PCR设备(例如LightCycler®或COBAS® TaqMan®)，PCR扩增和扩增产物的检测可以组合在单个封闭的试管中，并具有显著减少的循环时间(例如EP 0 912 760、EP 1 033 411；EP 0 543 942、EP 0 919 565)。由于检测与扩增同时发生，实时PCR方法排除对扩增产物操作的需要，并消除扩增产物间交叉污染的风险。实时PCR大大减少转换时间并且是在临床实验室中对传统PCR技术的有吸引力的替代。作为如在LightCycler®技术(例如EP 0 912 760、EP 1 033 411)中使用的实时PCR的替代，根据本发明优选应用水解或5'-核酸酶探针技术。如使用COBAS® TaqMan®实现的此技术，利用由两种荧光部分标记的单链水解探针。根据荧光共振能量转移(FRET)的原理，当第一个荧光部分由适当波长的光激发时，所吸收的能量转移到第二个荧光部分。第二个荧光部分通常是淬灭剂分子，其还可以是非荧光淬灭剂，像BHQ-2。以这种形式使用的典型的荧光染料是例如，FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan 500和CY5.5等。在PCR反应退火步骤过程中，标记的杂交探针结合到目标核酸(即，扩增产物)并在后续的延长阶段中被Taq DNA聚合酶或如技术人员已知的另一种合适的聚合酶，例如ZO5聚合酶的5'到3’核酸外切酶活性降解。其结果是，被激发的荧光部分和淬灭剂部分变得在空间上彼此分离。结果是，在不存在淬灭剂的情况下激发第一荧光部分后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。在使用LightCycler®和COBAS® TaqMan®分析仪的两种检测方式中，发射信号的强度都可以与原初目标核酸分子的数目相关联。根据本发明具体使用水解或5'-核酸酶探针。
作为FRET的替代，可以使用双链DNA结合染料例如荧光DNA结合染料(例如SYBRGREEN I®或SYBRGOLD®，可从Life Technologies (Molecular Probes)获得，或Lightcycler 480 Resolight，可从德国Roche Diagnostics GmbH获得)检测扩增产物。与双链核酸相互作用后，这些荧光DNA结合染料在用光在合适的波长激发后发射荧光信号。双链DNA结合染料例如核酸插入染料也可以使用(如上述)。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线用于验证扩增产物的存在。
在本发明的另一个实施方案中，防止扩增产物的遗留污染，例如源自更早的PCR反应的扩增子和高分子量产物(聚合的扩增子)。防止遗留污染的普遍和有效的方式涉及尿嘧啶-DNA糖基化酶，缩写为“UDG”或“UNG”(EC 3.2.2.3)的使用。这些包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶识别在单链或双链DNA中存在的尿嘧啶并切割尿嘧啶碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键，留下无碱基位点，参见例如US 6.713.294。这些酶很好地降解包含尿嘧啶的小尺寸的扩增子，但对包含尿嘧啶的大尺寸的高分子量产物(聚合的扩增子)的效率较低。因此，污染后，高分子量产物可以作为后续PCR反应的目标，可能导致在阴性样品中的假阳性测试结果或在阳性样品中不准确的滴度。并且，污染和尿嘧啶-DNA糖基化酶的不完全降解可以导致后续PCR反应中信号抑制，并从而导致假阴性结果或无效测试结果，这是由于聚合的扩增子及其多种的引物和探针结合序列耗尽了引物和探针的混合物。因此，在PCR中防止高分子量产物对于在目标阴性和阳性样品中获得正确的测试结果是至关重要的。
然而，用于扩增和检测生物样品中的目标核酸的本发明方法具体在存在尿嘧啶-DNA糖基化酶的情况下进行。在存在尿嘧啶-DNA糖基化酶的情况下，进一步改进对扩增过程中来自先前的PCR反应的污染性高分子量产物的防止和抑制。根据本发明具体合适的是组合使用尿嘧啶-DNA糖基化酶和至少一种包含含有多个腺苷(A)和/或胸苷(T)核苷酸的聚N尾的引物。
最优化用于控制扩增反应中的遗留污染的尿嘧啶-N-DNA糖基化酶(UNG)的制备已被公开，例如在US 6.187.575中。使用UNG以防止遗留污染也已描述，参见Longo等“Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reaction” (1990) Gene, 93:125-128。在US 6.287.823和6.518.026和US 2003/0077637中描述了使用UNG控制遗留污染的现有技术方法。
一般来说，此类方法涉及两个步骤。首先，PCR测定必须包括dUTP，从而扩增子(其是潜在的遗留污染物)包含尿嘧啶。该方法涉及用dUTP替换扩增反应中一些或所有的dTTP。可选地(或另外)，一个或多个尿嘧啶碱基可以掺入扩增引物中。然而应当注意，如果引物中的尿嘧啶离5'端太近，则该方法在防止后续扩增方面效率较低。dUTP的使用不干扰PCR测定。含尿嘧啶的扩增子产生后，其可以通过标准方法检测和分析，尽管存在替换胸腺嘧啶的尿嘧啶。
接下来，后续的PCR添加尿嘧啶-N-DNA糖基化酶。方便地，UNG在包含所有PCR组分的标准反应混合物中是有活性的。这使得能够将UNG加入组装的PCR反应中，或甚至PCR预混物中。在热循环开始之前，将反应混合物在PCR预混物的背景下对UNG活性最优的温度下(约40℃到50℃)或在UNG有活性的温度范围内孵育。如果存在来自先前反应的包含尿嘧啶的污染物，UNG将切掉尿嘧啶留下无碱基位点。已知具有无碱基位点的DNA在高温在高pH条件下是不稳定的。当热循环开始时，这些DNA被降解。高温还使UNG酶失活，允许产生新的包含尿嘧啶的DNA扩增子。
根据本发明具体应用的是组合使用包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶与引物，所述引物中的至少一种正向引物和/或至少一种反向引物在3'末端包含聚N尾，所述尾包含多个腺苷(A)和/或胸苷(T)核苷酸并且长度是2到10个核苷酸。
本发明的另一个目标是用于通过任何上述方法扩增和检测生物样品中的目标核酸的试剂盒。所述试剂盒包括至少一种包含DNA聚合酶活性的酶，具体是热稳定的DNA聚合酶、至少一种包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶、任选包含反转录酶活性的酶、至少四种不同的三磷酸核苷或其它核苷单体、用于产生至少一种扩增子的至少一种聚N序列延长的正向引物和/或至少一种聚N序列延长的反向引物，其中所述延长的正向引物和/或延长的反向引物包含添加到所述引物的5'末端并与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)；以及至少一种对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，以及各自的缓冲液。所述试剂盒进一步包含用于例如样品制备的试剂、内部对照、额外引物和探针、适配体、去垢剂和缓冲液组分等。根据本发明使用的适配体是短的、单链DNA-或RNA-寡核苷酸(25-70个碱基)，其通过其3D结构结合特定分子(即，蛋白，ZO5 DNA聚合酶)
Figure 400978DEST_PATH_IMAGE012
Figure 591526DEST_PATH_IMAGE013
Figure 328538DEST_PATH_IMAGE014
。
具体合适的试剂盒是其中所述聚N序列包含长度为2到10个核苷酸的聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C、聚G序列的试剂盒。聚N序列可以连接到至少一种引物的5'端并且在使用两种或更多5'端延长引物的情况下，可以是相同或不同的。根据本发明的具体实施方案是使用在5'端包含相同聚N序列的引物。具体而言，根据本发明使用包含四到六个连续腺苷(A)碱基的聚N序列。
附图说明
图 1 ：未延长的参考引物的结果：在经过60和30到60个PCR循环后，在用于高阳性对照(HPC)的PCR反应中的高分子量产物(HMWP，聚合的扩增子，少或未迁移进4%琼脂糖凝胶)的形成；对于PCR反应进行琼脂糖凝胶分析，分析经过60个循环后的HPC的12份重复，或各自经过30、40、50和60个循环后的三份重复；所使用的引物：SEQ ID NO:1和2 (4%琼脂糖凝胶)。
图 2 ：具有2个G的5'延长的引物的结果：经过30、40、50和60个循环后，用于高阳性对照的PCR反应中的HMWP显著减少；所使用的引物：SEQ ID NO:13和14，每个用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3'端修饰(4%琼脂糖凝胶)。
图 3 ：具有4个T的5'延长的引物的结果：经过30、40、50和60个循环后，用于高阳性对照的PCR反应中的HMWP显著减少；所使用的引物：SEQ ID NO:9和10，每个用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3'端修饰(4 %琼脂糖凝胶)。
图 4 ：具有4个A的5'延长的引物的结果：经过30、40、50和60个循环后，用于高阳性对照的PCR反应中无HMWP；所使用的引物：SEQ ID NO:3和4，每个用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3'端修饰(4%琼脂糖凝胶)。
图 5 ：具有6个A的5'延长的引物的结果：经过30、40、50和60个循环后，用于高阳性对照的PCR反应中无HMWP；所使用的引物：SEQ ID NO:5和6，每个用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3'端修饰(4%琼脂糖凝胶)。
图 6 ：具有8个A的5'延长的引物的结果：经过30、40、50和60个循环后，用于高阳性对照的PCR反应中无HMWP (但轻微形成引物二聚体)；所使用的引物：SEQ ID NO:7和8，每个用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3'端修饰(4%琼脂糖凝胶)。
图 7 ：具有2个AT的5'延长的引物的结果：经过30、40、50和60个循环后，用于高阳性对照的PCR反应中无HMWP；所使用的引物：SEQ ID NO:15和16，每个用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3'端修饰(4%琼脂糖凝胶)。
图 8 ：在5'端用三或四种不同碱基延长的引物(所谓的混合的悬垂变体，例如分别是GACTTA和CTCTAA)的结果：经过50和60个PCR循环后，在用于高阳性对照的PCR反应中适度形成HMWP；经过30、40、50和60个循环后，对PCR反应进行琼脂糖凝胶分析；所用的引物：SEQ ID NO:17和18，每个用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3'端修饰(4%琼脂糖凝胶)。
实施例
所有实验在等效实验条件下进行(即，使用相同的预混组合物、相同的引物浓度、相同的样品制备概况、相同的热循环概况并且每份凝胶分析相同量的扩增子)。从而如下进行实验：由根据本发明的修饰的引物替换预混物中的参考引物。除非在图中另有说明，通常以5份重复测试HPC，并且PCR循环在30、40、50、60个循环后终止；扩增产物在4%琼脂糖凝胶上分析。
实施例1：
样品材料：
用于实验的HPC (高阳性对照)由约5E+06 IU/mL的高滴度样品组成，所述样品包括在阴性人血浆中被壳的(armored) HCV RNA材料。被壳的RNA由被囊化在MS2细菌噬菌体外壳蛋白中的非感染性的体外转录的目标区域的HCV RNA组成(供应商即Ambion)，并包含HCV引物和探针结合区域。人血浆对于HCV RNA、HIV-1 RNA和HBV DNA是非反应性的。如果使用高滴度阳性HCV患者样品也获得类似结果。
核酸提取
对于核酸提取，每个反应使用1mL样品材料。除非在图中另有说明，通常每个实验条件测试样品材料的5份重复。核酸提取方法是现有技术并且为技术人员所知
Figure 789606DEST_PATH_IMAGE015
Figure 219450DEST_PATH_IMAGE016
Figure 398759DEST_PATH_IMAGE017
。可选地，可以使用可商购获得的核酸提取试剂盒，即高纯度病毒核酸试剂盒(Roche Diagnostics)或COBAS® AmpliPrep总核酸分离试剂盒(TNAI) (Roche Diagnostics)。
在此处所述实验中，核酸提取基于COBAS® AmpliPrep总核酸分离试剂盒(TNAI) (Roche Diagnostics)。样本制备试剂由磁性玻璃颗粒悬浮物、裂解试剂、蛋白酶试剂、洗脱缓冲液和清洗试剂组成。在核提取前将定量标准品RNA加入样本。通过与蛋白酶和离液裂解/结合缓冲液(其释放核酸并保护所释放的HCV RNA免于血清或血浆中的RNA酶)一起孵育裂解被壳的HCV颗粒和定量标准品RNA被壳的颗粒。随后，HCV RNA和定量标准品RNA结合到磁性玻璃颗粒上。未结合的物质例如盐、蛋白和其它细胞杂质通过清洗磁性颗粒去除。吸收的核酸在升高的温度下用水缓冲液洗脱。
PCR反应混合物
由根据本发明的修饰的引物替换预混物中的参考引物。以大批次制备不含正向引物和反向引物的预混物。对于每个实验，用如图1-8中所规定的延长的引物或参考引物补充此不完全的预混物。
表1：预混物组合物
Figure 673882DEST_PATH_IMAGE018
*每个实验中不同。
将50 μL包含核酸的洗脱物加入到PCR管中的35 μL预混物和15 μL的18 mM醋酸锰中，并上样到COBAS® TaqMan®48分析仪。
PCR反应：
表2：应用的热循环步骤
Figure 255037DEST_PATH_IMAGE019
*如图1-8所示，每个实验PCR分别在30、40、50和60个循环后终止。
琼脂糖凝胶分析：
如技术人员所知进行琼脂糖凝胶分析
Figure 590203DEST_PATH_IMAGE020
Figure 319125DEST_PATH_IMAGE021
Figure 834157DEST_PATH_IMAGE022
。5 μL扩增子与5 μL琼脂糖凝胶上样缓冲液混合并应用到4%琼脂糖凝胶。溴化乙锭染色后在UV下显现DNA。结果图片显示于下面的图1-8。
实施例2：
显示的结果也通过下列步骤实现：使用可商购获得的测定，例如COBAS® AmpliPrep / COBAS® TaqMan® HCV测试(由Roche Diagnostics制造)用于从高阳性试剂盒对照中提取HCV RNA。使用COBAS® AmpliPrep设备自动进行样本制备并且使用例如COBAS® TaqMan®分析仪或COBAS® TaqMan® 48分析仪自动进行扩增/检测。测试基于三个主要过程：(1)制备样本以从人EDTA血浆或血清和对照(其在COBAS® AmpliPrep设备上第二管中提供)中分离RNA；(2)反转录目标RNA和定量标准品/内部对照RNA以产生互补DNA (cDNA)和(3)PCR扩增目标cDNA和定量标准品/内部对照cDNA，并同时通过对目标和对定量标准品/内部对照特异性的双标记的检测探针的切割在COBAS® TaqMan®分析仪上检测所产生的扩增子。
样本制备试剂由磁性玻璃颗粒悬浮物、裂解试剂、蛋白酶试剂、洗脱缓冲液和清洗试剂组成。通过与蛋白酶和离液裂解/结合缓冲液(其释放核酸并保护所释放的HCV RNA免于血清或血浆中的RNA酶)一起孵育而裂解HCV颗粒以及定量标准品/内部对照颗粒。随后，HCV RNA和定量标准品RNA结合到磁性玻璃颗粒上。未结合的物质例如盐、蛋白和其它细胞杂质通过清洗磁性颗粒去除。吸收的核酸在升高的温度下用水缓冲液洗脱。将样本或对照洗脱物加到预混物并转移到COBAS® TaqMan分析仪®或COBAS® TaqMan® 48分析仪用于扩增和检测。
对于此处显示的实验，根据下面给出的信息用延长的引物修饰COBAS® AmpliPrep / COBAS® TaqMan® HCV测试预混物，并且在COBAS® AmpliPrep设备上使用带有修饰的预混物的试剂匣。预混物包含对HCV RNA和定量标准品/内部对照RNA二者特异性的引物和探针对。引物结合位点由HCV目标和定量标准品/内部对照共享。引物和目标探针定位于HCV基因组的5'-非翻译区域的高度保守部分。使用目标特异性和定量标准品特异性双标记的寡核苷酸探针进行HCV目标和定量标准品的检测，所述探针允许独立地鉴定HCV目标扩增子和HCV定量标准品扩增子。HCV定量标准品通过COBAS® AmpliPrep以已知拷贝数自动加到每个样本，并在整个样本制备、反转录、扩增和检测步骤中与HCV目标一起完成(carry through)。定量标准品必须在HCV目标阴性和阳性样本中给出阳性信号以使得能够确定滴度。在部分抑制或阻止的反应中，定量标准品与目标受到类似的影响，并因此允许正确的滴度确定。最终，定量标准品监测HCV目标阴性反应的抑制效果，但由于其更高浓度，监测是不严格的。
表3：预混物组合物
*每个实验中不同。
以大批次制备不含正向引物和反向引物的预混物。对于每个实验，用如图中所示的延长的引物补充此不完全的预混物。这些补充的预混物变体装填入试剂匣，并上样到COBAS® AmpliPrep。
将COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV测试试剂盒的HPC作为样本测试。在COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®上开始用于提取和扩增/检测的自动过程。如所需要的，PCR经过30、40、50或60个循环后停止，并且在4%琼脂糖凝胶上分析5 μL扩增产物。
Figure IDA0000398250790000011
Figure IDA0000398250790000021
Figure IDA0000398250790000031
Figure IDA0000398250790000041
Figure IDA0000398250790000051
Figure IDA0000398250790000061

Claims (19)

1.用于扩增和检测样品中的核酸目标的方法，其中防止或抑制扩增过程中高分子量产物的形成，所述方法包括下列步骤：
a) 使所述样品中的核酸与扩增试剂接触，所述扩增试剂至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷单体、用于产生至少一种扩增子的至少一种延长的正向引物和/或至少一种延长的反向引物，和至少一种对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，其中所述延长的正向引物和/或反向引物的至少一种包含添加到所述引物的5'末端的与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型的核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)；
b) 将所述核酸与所述扩增试剂在足以使扩增反应发生的条件下孵育一段时间，其中所述扩增反应在50个循环之前不终止；和
c) 经由所述可检测的探针或DNA结合染料检测所述扩增子。
2.根据权利要求1的方法，其中所述聚N序列由聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列或其混合物组成，并且长度为2到10个核苷酸。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述聚N序列在长度上由4到6个核苷酸组成。
4.根据权利要求1的方法，其中所述目标核酸是病毒核酸。
5.根据权利要求1的方法，其中所述病毒核酸是HCV的核酸。
6.根据权利要求1的方法，其中步骤b)在存在包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶的情况下进行。
7.根据权利要求1-6的方法，其中所述添加到所述引物5'末端的与目标序列不互补的聚N序列由一种类型的核苷酸或两种不同核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)或胸苷(T)，并且孵育步骤b)在存在包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶的情况下进行。
8.根据权利要求1-7的方法，其中至少一种所述延长的正向引物包括下列的序列之一：
Figure 290905DEST_PATH_IMAGE001
和/或至少一种所述延长的反向引物包括下列的序列之一：
Figure 270362DEST_PATH_IMAGE002
Figure 50100DEST_PATH_IMAGE003
。
9.根据权利要求1-8的方法，其中至少一种所述可检测的探针包括下列的序列之一：
(SEQ ID NO:27)、(SEQ ID NO:28)、(SEQ ID NO:29)、(SEQ ID NO:30)和这些序列各自的互补序列或子序列。
10.用于防止或抑制PCR扩增过程中的高分子量产物形成的方法，所述方法包括下列步骤：
a) 将样品中的核酸与扩增试剂接触，所述扩增试剂至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷单体、用于产生至少一种扩增子的至少一种延长的正向引物和/或至少一种延长的反向引物，和对于所述扩增子特异性的至少一种可检测的探针或DNA结合染料，其中所述延长的正向引物和/或反向引物包含添加到所述引物的5'末端的与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型的核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)；
b) 将所述核酸与所述扩增试剂在足以使扩增反应发生的条件下孵育一段时间，其中所述扩增反应在50个循环之前不终止；和
c) 经由所述可检测的探针或DNA结合染料检测所述扩增子。
11.根据权利要求10的方法，其中所述聚N序列由聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列或其混合物组成，并且长度为2到10个核苷酸。
12.根据权利要求10或11的方法，其中所述聚N序列在长度上由4到6个核苷酸组成。
13.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述目标核酸是病毒核酸。
14.根据权利要求11-13中任一项的方法，其中所述病毒核酸是HCV的核酸。
15.根据权利要求11-14中任一项的方法，其中步骤b)在存在包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶的情况下进行。
16.根据权利要求11-15中任一项的方法，其中至少一种所述延长的正向引物包括下列的序列之一：
Figure 445309DEST_PATH_IMAGE004
和/或至少一种所述延长的反向引物包括下列的序列之一：
Figure 393728DEST_PATH_IMAGE006
。
17.根据权利要求11-16中任一项的方法，其中至少一种所述可检测的探针包括下列的序列之一：
(SEQ ID NO:27)、(SEQ ID NO:28)、(SEQ ID NO:29)、(SEQ ID NO:30)和这些序列各自的互补序列或子序列。
18.至少一种延长的正向引物和/或至少一种延长的反向引物在用于防止或抑制PCR扩增过程中的高分子量产物形成中的用途，所述至少一种延长的正向引物和/或至少一种延长的反向引物各自包含添加到各引物的5'末端的聚N序列，所述聚N序列由一种类型的核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)，所述PCR扩增在50个循环前不终止。
19.用于扩增和检测样品中的目标核酸的试剂盒，其中防止或抑制扩增过程中高分子量产物的形成，所述试剂盒包括：
(a) 至少一种包含DNA聚合酶活性的酶，
(b) 至少一种包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶，
(c) 三磷酸核苷或其它核苷单体，
(d) 用于产生至少一种扩增子的至少一种延长的正向引物和/或至少一种延长的反向引物，和
(e) 至少一种对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料，
其中所述延长的正向引物和/或反向引物的至少一种包含添加到所述引物的5'末端的与目标序列不互补的聚N序列，所述聚N序列由一种类型的核苷酸或两种不同的核苷酸组成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鸟苷(G)，并且长度为4到10个核苷酸。
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