JP6898736B2 - Hev核酸を検出するための組成物および方法 - Google Patents
Hev核酸を検出するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Description
本願は、2013年8月14日に出願された仮出願第61/865,848号および2014年2月18日に出願された仮出願第61/941,303号の米国特許法第119条(e)項の利益を主張する。これらの出願の各々の内容全体は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
E型肝炎ウイルス(HEV)は、Hepeviridae科に分類される一本鎖のプラス鎖RNAウイルスであり、Hepevirus属の唯一のメンバーであり、そのうち、哺乳動物HEVおよび鳥類HEVは2つの主要な公知の種である。Daltonら、Lancet Infect. Dis. 8巻:698〜709頁、2008年;Baylisら、J. Clin. Microbiol. 49巻:1234〜1239頁、2011年。哺乳動物HEVは、ブタおよび潜在的に他の哺乳動物がリザーバーとなり、ヒトにおける急性肝炎の主な原因である。Daltonら、前掲を参照されたい。ウイルスは、主に糞口経路を介して伝播し、発展途上国、特に衛生が貧弱で公衆衛生の基盤が脆弱な地域において、散発的な感染症および流行病に関連している。先進国において、HEV感染は稀であると考えられ、主に、ウイルスが流行している地域に旅行中に感染した個体において起こる。しかしながら、最近では、土地固有の感染症が、北米、ヨーロッパ、日本、ニュージーランドおよびオーストラリアを含めた先進地域においてより頻繁に報告されている。したがって、先進国における土地固有のE型肝炎は、以前に認識されていたものよりも一般的であり、A型肝炎よりも一般的であり得る。Daltonら、Lancet Infect. Dis. 8巻:698〜709頁、2008年。
したがって、高い特異性および感度で検体中のHEVの存在または非存在を検出するための組成物、キットおよび方法が必要である。このような組成物、キットおよび方法は、HEVの診断、血液または血漿供血におけるHEVの存在のスクリーニングおよび/もしくはモニタリング、または処置に対する患者の応答のモニタリングに特に有用である。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす。
(a)少なくとも1つの増幅オリゴマーは、
(i)配列番号63の配列に含有される約14個〜約23個の連続するヌクレオチドであり、配列番号26のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号26の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴマー、および
(ii)配列番号16のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号16の配列に含有される約14個〜約23個の連続するヌクレオチドである、標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴマー
から選択され;
(b)少なくとも1つの増幅オリゴマーは、配列番号47の配列に含有される約17個〜約28個の連続するヌクレオチドであり、配列番号25のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号25の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含む。
前記(b)の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24、または、配列番号24のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号56、または、配列番号56のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む。配列番号56の標的にハイブリダイズする配列を有する増幅オリゴマーを含む特定のバリエーションでは、配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である(すなわち、配列番号46、または配列番号46のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体)。
(i)
(A)配列番号54のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号54、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号53のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号53、および
(B)配列番号23、24、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号52、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号30、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号65、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(x)
(A)配列番号62、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xi)
(A)配列番号35、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xii)
(A)配列番号34、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xiii)
(A)配列番号33、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および(B)配列番号21、22、23、24、41、52、44、45、46または47、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(xiv)
(A)配列番号61、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体。
配列番号56の標的にハイブリダイズする配列を有する増幅オリゴマーを含む特定の実施形態では、配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である(すなわち、配列番号46、または配列番号46のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体)。特定のバリエーションでは、標的にハイブリダイズする配列AおよびBの該セットが、以下の通りのセット(i)〜(xiii)から選択される:
(i)
(A)配列番号54、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号53、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、45、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号30、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、56、48、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、23、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号65、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、24、45、56または50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号62、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、23、24、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(x)
(A)配列番号35、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xi)
(A)配列番号34、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xii)
(A)配列番号33、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(xiii)
(A)配列番号61、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体。
(i)
(A)配列番号48のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号48、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号49のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号49、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号21、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号22、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号23、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、52、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(x)
(A)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体。
配列番号56の標的にハイブリダイズする配列を有する増幅オリゴマーを含む特定の実施形態では、配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である(すなわち、配列番号46、または配列番号46のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体)。特定のバリエーションでは、標的にハイブリダイズする配列AおよびBの該セットが、以下のとおりのセット(i)〜(ix)から選択される:
(i)
(A)配列番号49のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号49、および
(B)配列番号29または31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29または31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、31、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号21、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号22、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号31、61、62、64または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号23、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号33、34、35、62、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号54、62または64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(ix)
(A)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号31、33、34、35、53、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体。
(a)
(i)配列番号63の配列に含有される約14個〜約23個の連続するヌクレオチドであり、配列番号26のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号26の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴマー、および
(ii)配列番号16のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号16の配列に含有される約14個〜約23個の連続するヌクレオチドである、標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴマー
から選択される少なくとも1つの増幅オリゴマー;
(b)配列番号47の配列に含有される約17個〜約28個の連続するヌクレオチドであり、配列番号25のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号25の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの増幅オリゴマー
を含む。
(i)
(A)配列番号54のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号54、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号53のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号53、および
(B)配列番号23、24、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号52、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号30、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号65、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(x)
(A)配列番号62、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xi)
(A)配列番号35、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xii)
(A)配列番号34、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xiii)
(A)配列番号33、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(xiv)
(A)配列番号61、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体。
配列番号56の標的にハイブリダイズする配列を有する増幅オリゴマーを含む特定の実施形態では、配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である(すなわち、配列番号46、または配列番号46のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体)。特定のバリエーションでは、標的にハイブリダイズする配列AおよびBの該セットは、以下の通りのセット(i)〜(xiii)から選択される:
(i)
(A)配列番号54、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号53、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、45、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号30、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、56、48、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、23、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号65、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、24、45、56または50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号62、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、23、24、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(x)
(A)配列番号35、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xi)
(A)配列番号34、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xii)
(A)配列番号33、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(xiii)
(A)配列番号61、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体。
(i)
(A)配列番号48のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号48、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号49のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号49、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号21、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号22、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号23、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、52、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(x)
(A)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体。
配列番号56の標的にハイブリダイズする配列を有する増幅オリゴマーを含む特定の実施形態では、配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である(すなわち、配列番号46、または配列番号46のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体)。特定のバリエーションでは、標的にハイブリダイズする配列AおよびBのセットは、以下のとおりのセット(i)〜(ix)から選択される:
(i)
(A)配列番号49のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号49、および
(B)配列番号29または31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29または31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、31、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号21、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号22、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号31、61、62、64または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号23、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号33、34、35、62、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号54、62または64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(ix)
(A)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号31、33、34、35、53、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
試料中のE型肝炎ウイルス(HEV)の存在または非存在を決定するための少なくとも2つのオリゴマーの組合せであって、該オリゴマーの組合せが、
HEV標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも2つの増幅オリゴマー
を含み、
(a)少なくとも1つの増幅オリゴマーは、
(i)配列番号63の配列に含有される約14個〜約23個の連続するヌクレオチドであり、配列番号26のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号26の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴマー、および
(ii)配列番号16のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号16の配列に含有される約14個〜約23個の連続するヌクレオチドである、標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴマー
からなる群から選択され;
(b)少なくとも1つの増幅オリゴマーは、配列番号47の配列に含有される約17個〜約28個の連続するヌクレオチドであり、配列番号25のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号25の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含む、
少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目2)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号13の配列に含有される約14個〜約20個のヌクレオチドである、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目3)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目4)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目5)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29および配列番号64のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29および配列番号64からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目6)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号16の配列に含有される15個〜17個のヌクレオチドであり、配列番号27のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号27の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目7)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目6に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目8)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号28のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号28の標的にハイブリダイズする配列を含む、項目6に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目9)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29および配列番号32のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29および配列番号32からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目8に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目10)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号31、配列番号62、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号31、配列番号62、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目11)
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号45、配列番号46、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号45、配列番号46、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51および配列番号56からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目12)
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号24および配列番号56からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目13)
配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である、項目11または12に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目14)
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号46のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号24および配列番号46からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目15)
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目16)
(a)(i)に記載の増幅オリゴマーおよび(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーを含む、項目1〜15のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目17)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目16に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目18)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号64、または配列番号64のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目17に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目19)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号62、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号62、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目17に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目20)
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号52、配列番号53および配列番号54のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号52、配列番号53および配列番号54からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目16〜19のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目21)
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号31および配列番号32のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号31および配列番号32からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目16〜19のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目22)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号64、または配列番号64のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、または配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目16に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目23)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号65、または配列番号65のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29または配列番号31、または、配列番号29または配列番号31のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目16に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目24)
(a)(ii)に記載の第1の増幅オリゴマーおよび(a)(ii)に記載の第2の増幅オリゴマーを含む、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目25)
前記(a)(ii)に記載の第1および第2の増幅オリゴマーのそれぞれが、配列番号16の配列に含有される15個〜17個のヌクレオチドであり、配列番号27のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号27の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目24に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目26)
前記(a)(ii)の第1および第2の増幅オリゴマーのそれぞれが、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目25に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目27)
前記(a)(ii)の第1および第2の増幅オリゴマーのそれぞれが、配列番号28のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号28の標的にハイブリダイズする配列を含む、項目25に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目28)
前記(a)(ii)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号29、または、配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号32、または、配列番号32のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目27に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目29)
(b)に記載の第1の増幅オリゴマーおよび(b)に記載の第2の増幅オリゴマーを含む、項目1〜28のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目30)
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号24および配列番号56からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目29に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目31)
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目29に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目32)
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24、または、配列番号24のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号56、または、配列番号56のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目29に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目33)
配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である、項目30または32に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目34)
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号23または配列番号51、または、配列番号23または配列番号51のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号45、または、配列番号45のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目29に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目35)
(a)(i)に記載の増幅オリゴマー、(a)(ii)に記載の増幅オリゴマー、(b)に記載の第1の増幅オリゴマー、および(b)に記載の第2の増幅オリゴマーを含む、項目1〜15のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目36)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号64、または、配列番号64のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、または、配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24、または、配列番号24のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号56、または、配列番号56のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目35に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目37)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、または、配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号65、または、配列番号65のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24、または、配列番号24のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号56、または、配列番号56のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目35に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目38)
配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である、項目36または37に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目39)
(a)(ii)に記載の第1の増幅オリゴマー、(a)(ii)に記載の第2の増幅オリゴマー、(b)に記載の第1の増幅オリゴマー、および(b)に記載の第2の増幅オリゴマーを含む、項目1〜15のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目40)
前記(a)(ii)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号29、または、配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号32、または、配列番号32のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24、または、配列番号24のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号46、または、配列番号46のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目39に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目41)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号24および配列番号56からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目42)
それぞれ第1、第2および第3の、標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1、第2および第3の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)配列番号65、配列番号29および配列番号24のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号65、配列番号29および配列番号24;
(ii)配列番号65、配列番号29および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号65、配列番号29および配列番号56;
(iii)配列番号29、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号24および配列番号56;
(iv)配列番号66、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号66、配列番号24および配列番号56;
(v)配列番号65、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号65、配列番号24および配列番号56;ならびに
(vi)配列番号62、配列番号29および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号62、配列番号29および配列番号56
からなる群から選択される、項目41に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目43)
それぞれ第1(A)および第2(B)の、標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1および第2の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)
(A)配列番号54のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号54、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号53のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号53、および
(B)配列番号23、24、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号52、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号30、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号65、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(x)
(A)配列番号62、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xi)
(A)配列番号35、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xii)
(A)配列番号34、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xiii)
(A)配列番号33、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(xiv)
(A)配列番号61、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体
からなる群から選択される、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目44)
それぞれ第1(A)および第2(B)の、標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1および第2の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)
(A)配列番号54、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号53、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、45、45、46または47、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号30、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、56、48、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、23、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号65、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、24、45、56または50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号62、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、23、24、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(x)
(A)配列番号35、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xi)
(A)配列番号34、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xii)
(A)配列番号33、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(xiii)
(A)配列番号61、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体
からなる群から選択される、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目45)
それぞれ第1(A)および第2(B)の、標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1および第2の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)
(A)配列番号48のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号48、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号49のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号49、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号21、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号22、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号23、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、52、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(x)
(A)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体
からなる群から選択される、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目46)
それぞれ第1(A)および第2(B)の標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1および第2の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)
(A)配列番号49のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号49、および
(B)配列番号29または31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29または31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、31、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号21、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号22、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号31、61、62、64または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号23、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号33、34、35、62、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号54、62または64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(ix)
(A)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号31、33、34、35、53、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体
からなる群から選択される、項目1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目47)
配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である、項目41〜46のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目48)
前記(b)に記載の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、前記標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーである、項目1〜47のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目49)
前記プロモーター配列がT7プロモーター配列である、項目48に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目50)
前記T7プロモーター配列が配列番号73に示される配列を有する、項目49に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目51)
長さが約14個〜約28個のヌクレオチドであり、配列番号39に含有される標的配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズするように構成されている、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、項目1〜50のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目52)
前記検出プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号37、配列番号55、配列番号67および配列番号71の相補体、DNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号37、配列番号55、配列番号67および配列番号71からなる群から選択される、項目51に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目53)
前記検出プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号37、配列番号67および配列番号71の相補体、DNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号37、配列番号67および配列番号71からなる群から選択される、項目51に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目54)
前記少なくとも1つの検出プローブオリゴマーが、その核酸主鎖の1つまたは複数の連結部に2’−メトキシ主鎖を含有する、項目51〜53のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目55)
長さが約14個〜約28個のヌクレオチドであり、配列番号39内に含有される標的配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズするように構成されている、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも2つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、項目1〜50のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目56)
それぞれの検出プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号37、配列番号55、配列番号67および配列番号71の相補体、DNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号37、配列番号55、配列番号67および配列番号71からなる群から個々に選択される、項目55に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目57)
前記少なくとも2つの検出プローブオリゴマーが、
配列番号55もしくはその相補体、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第1の検出プローブオリゴマー;および
配列番号67もしくはその相補体、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第2の検出プローブオリゴマー
を含む、項目55に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目58)
少なくとも3つの検出プローブオリゴマーを含む、項目55または56に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目59)
前記少なくとも3つの検出プローブオリゴマーが、
配列番号37もしくはその相補体、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第1の検出プローブオリゴマー;
配列番号67もしくはその相補体、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第2の検出プローブオリゴマー;および
配列番号71もしくはその相補体、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第3の検出プローブオリゴマー
を含む、項目58に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目60)
それぞれの検出プローブオリゴマーが、その核酸主鎖の1つまたは複数の連結部に2’−メトキシ主鎖を含有する、項目55〜59のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目61)
固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む捕捉プローブオリゴマーをさらに含み、該標的にハイブリダイズする配列が、配列番号4および配列番号42の相補体、DNA同等物、およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号4および配列番号42からなる群から選択される、項目1〜60のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目62)
配列番号4の20位の核酸塩基がアデニン(A)である、項目61に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目63)
配列番号4の19位の核酸塩基がシトシン(C)またはウラシル(U)である、項目62に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目64)
前記捕捉プローブオリゴマーが、配列番号3、配列番号7および配列番号43からなる群から選択される配列を有する、項目61に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目65)
固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも2つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含み、それぞれの、標的にハイブリダイズする配列が、配列番号4および配列番号42の相補体、DNA同等物、およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号4および配列番号42からなる群から個別に選択される、項目1〜60のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目66)
配列番号4の20位の核酸塩基がアデニン(A)である、項目65に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目67)
配列番号4の19位の核酸塩基がシトシン(C)またはウラシル(U)である、項目66に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目68)
少なくとも3つの捕捉プローブオリゴマーを含む、項目65に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目69)
前記3つの捕捉プローブオリゴマーが、
配列番号2もしくはその相補体、またはそのDNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第1の捕捉プローブオリゴマー;
配列番号6もしくはその相補体、またはそのDNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第2の捕捉プローブオリゴマー;および
配列番号42もしくはその相補体、またはそのDNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第3の捕捉プローブオリゴマー
を含む、項目68に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目70)
前記第1、第2および第3の捕捉プローブオリゴマーがそれぞれ配列番号3、配列番号7および配列番号43の配列を有する、項目69に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
(項目71)
項目1〜70のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せを含むキット。
(項目72)
項目1〜70のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せを含む反応混合物。
(項目73)
試料中のE型肝炎ウイルス(HEV)の存在または非存在を決定するための方法であって、
(1)HEVを含有することが疑われる試料を、HEV標的核酸の標的領域を増幅させるための少なくとも2つのオリゴマーと接触させるステップであって、該オリゴマーの組合せが、
(a)
(i)配列番号63の配列に含有される約14個〜約23個の連続するヌクレオチドであり、配列番号26のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号26の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴマー、および
(ii)配列番号16のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号16の配列に含有される約14個〜約23個の連続するヌクレオチドである、標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴマー
からなる群から選択される少なくとも1つの増幅オリゴマー;ならびに
(b)配列番号47の配列に含有される約17個〜約28個の連続するヌクレオチドであり、配列番号25のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号25の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの増幅オリゴマー
を含むステップ;
(2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、該試料中に存在する任意のHEV標的核酸が、増幅産物を生成するための鋳型として使用されるステップ;ならびに
(3)該増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより該試料中のHEVの存在または非存在を決定するステップ
を含む方法。
(項目74)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号13の配列に含有される約14個〜約20個のヌクレオチドである、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記(1)(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目76)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目77)
前記(1)(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29および配列番号64のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29および配列番号64からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目78)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号16の配列に含有される15個〜17個のヌクレオチドであり、配列番号27のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号27の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目79)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目78に記載の方法。
(項目80)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号28のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号28の標的にハイブリダイズする配列を含む、項目78に記載の方法。
(項目81)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29および配列番号32のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29および配列番号32からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号31、配列番号62、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号31、配列番号62、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目83)
前記(1)(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号45、配列番号46、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号45、配列番号46、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51および配列番号56からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目84)
前記(1)(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号24および配列番号56からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目85)
配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である、項目83または84に記載の方法。
(項目86)
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号46のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号24および配列番号46からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目87)
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目73に記載の方法。
(項目88)
前記HEVの標的領域を増幅させるための前記少なくとも2つのオリゴマーが、(1)(a)(i)に記載の増幅オリゴマーおよび(1)(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーを含む、項目73〜87のいずれかに記載の方法。
(項目89)
前記(1)(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目88に記載の方法。
(項目90)
前記(1)(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号64、または配列番号64のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号62、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号62、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目89に記載の方法。
(項目92)
前記(1)(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号52、配列番号53および配列番号54のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号52、配列番号53および配列番号54からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目88〜91のいずれかに記載の方法。
(項目93)
前記(1)(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号31および配列番号32のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号31および配列番号32からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記(1)(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号64、または配列番号64のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(1)(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、または配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目88に記載の方法。
(項目95)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号65、または配列番号65のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29または配列番号31、または、配列番号29または配列番号31のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目88に記載の方法。
(項目96)
前記HEV標的領域を増幅するための前記少なくとも2つのオリゴマーが、(a)(ii)に記載の第1および第2の増幅オリゴマーを含む、項目73に記載の方法。
(項目97)
前記(a)(ii)に記載の第1および第2の増幅オリゴマーのそれぞれが、配列番号16の配列に含有される15個〜17個のヌクレオチドであり、配列番号27のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、少なくとも配列番号27の配列を含む、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目96に記載の方法。
(項目98)
前記(a)(ii)の第1および第2の増幅オリゴマーのそれぞれが、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目97に記載の方法。
(項目99)
前記(a)(ii)の第1および第2の増幅オリゴマーのそれぞれが、配列番号28のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号28の標的にハイブリダイズする配列を含む、項目97に記載の方法。
(項目100)
前記(a)(ii)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号29、または、配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号32、または、配列番号32のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記HEV標的領域を増幅するための前記少なくとも2つのオリゴマーが、(1)(b)に記載の第1および第2の増幅オリゴマーを含む、項目73〜100のいずれかに記載の方法。
(項目102)
前記(1)(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号24および配列番号56からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目101に記載の方法。
(項目104)
前記(1)(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24、または、配列番号24のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(1)(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号56、または、配列番号56のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目101に記載の方法。
(項目105)
配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である、項目102または104に記載の方法。
(項目106)
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号23または配列番号51、または、配列番号23または配列番号51のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号45、または、配列番号45のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、項目101に記載の方法。
(項目107)
前記HEV標的領域を増幅させるための前記少なくとも2つのオリゴマーが、(1)(a)(i)に記載の増幅オリゴマー、(1)(a)(ii)に記載の増幅オリゴマー、(1)(b)に記載の第1の増幅オリゴマー、および(1)(b)に記載の第2の増幅オリゴマーを含む、項目73〜87のいずれかに記載の方法。
(項目108)
前記(1)(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号64、または、配列番号64のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(1)(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、または、配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(1)(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24、または、配列番号24のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(1)(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号56、または、配列番号56のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目107に記載の方法。
(項目109)
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29、または、配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号65、または、配列番号65のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24、または、配列番号24のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号56、または、配列番号56のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目107に記載の方法。
(項目110)
配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である、項目108または109に記載の方法。
(項目111)
前記HEV標的領域を増幅させるための前記少なくとも2つのオリゴマーが、(a)(ii)に記載の第1の増幅オリゴマー、(a)(ii)に記載の第2の増幅オリゴマー、(b)に記載の第1の増幅オリゴマー、および(b)に記載の第2の増幅オリゴマーを含む、項目73〜87のいずれかに記載の方法。
(項目112)
前記(a)(ii)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号29、または、配列番号29のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(a)(ii)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号32、または、配列番号32のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第1の増幅オリゴマーが、配列番号24、または、配列番号24のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)に記載の第2の増幅オリゴマーが、配列番号46、または、配列番号46のRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目111に記載の方法。
(項目113)
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含み;
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号24および配列番号56からなる群から選択される、標的にハイブリダイズする配列を含む、
項目73に記載の方法。
(項目114)
第1、第2および第3の、標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1、第2および第3の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)配列番号65、配列番号29および配列番号24のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号65、配列番号29および配列番号24;
(ii)配列番号65、配列番号29および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号65、配列番号29および配列番号56;
(iii)配列番号29、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号29、配列番号24および配列番号56;
(iv)配列番号66、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号66、配列番号24および配列番号56;
(v)配列番号65、配列番号24および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号65、配列番号24および配列番号56;ならびに
(vi)配列番号62、配列番号29および配列番号56のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号62、配列番号29および配列番号56
からなる群から選択される、項目113に記載の方法。
(項目115)
前記組み合わせが、それぞれ第1(A)および第2(B)の、標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1および第2の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)
(A)配列番号54のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号54、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号53のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号53、および
(B)配列番号23、24、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号52、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号30、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号65、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(x)
(A)配列番号62、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xi)
(A)配列番号35、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xii)
(A)配列番号34、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xiii)
(A)配列番号33、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(xiv)
(A)配列番号61、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および(B)配列番号21、22、23、24、45、56、48、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体
からなる群から選択される、項目73に記載の方法。
(項目116)
前記組み合わせが、それぞれ第1(A)および第2(B)の、標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1および第2の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)
(A)配列番号54、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号53、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、45、49、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号30、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号21、56、48、50または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、23、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号65、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45、56または51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、24、45、56または50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号62、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、23、24、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(x)
(A)配列番号35、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xi)
(A)配列番号34、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(xii)
(A)配列番号33、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号23、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(xiii)
(A)配列番号61、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号22、45または56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体
からなる群から選択される、項目73に記載の方法。
(項目117)
前記組み合わせが、それぞれ第1(A)および第2(B)の、標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1および第2の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)
(A)配列番号48のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号48、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号49のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号49、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、31、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号21、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号22、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号23、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、52、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ix)
(A)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(x)
(A)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、31、33、34、35、53、54、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体
からなる群から選択される、項目73に記載の方法。
(項目118)
前記組み合わせが、それぞれ第1(A)および第2(B)の標的にハイブリダイズする配列のセットを含む第1および第2の増幅オリゴマーのセットを含み、標的にハイブリダイズする配列の該セットが、
(i)
(A)配列番号49のRNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号49、および
(B)配列番号29または31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(ii)
(A)配列番号50、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29または31、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iii)
(A)配列番号51、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、31、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(iv)
(A)配列番号21、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(v)
(A)配列番号22、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号31、61、62、64または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vi)
(A)配列番号23、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号33、34、35、62、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(vii)
(A)配列番号24、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号54、62または64、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;
(viii)
(A)配列番号56、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号29、30、33、34、35、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体;ならびに
(ix)
(A)配列番号45、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体、および
(B)配列番号31、33、34、35、53、61、62、64、65または66、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体
からなる群から選択される、項目73に記載の方法。
(項目119)
配列番号56の1位の核酸塩基がグアニン(G)である、項目113〜118のいずれかに記載の方法。
(項目120)
前記(1)(b)に記載の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、前記標的にハイブリダイズする配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーである、項目73〜119のいずれかに記載の方法。
(項目121)
前記プロモーター配列がT7プロモーター配列である、項目120に記載の方法。
(項目122)
前記T7プロモーター配列が配列番号73に示される配列を有する、項目121に記載の方法。
(項目123)
ステップ(1)の前に、前記試料中の他の構成要素から前記HEV標的核酸を精製するステップをさらに含む、項目73〜122のいずれかに記載の方法。
(項目124)
前記精製するステップが、前記試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含み、該標的にハイブリダイズする配列が、配列番号4および配列番号42の相補体、DNA同等物、およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号4および配列番号42からなる群から選択される、項目123に記載の方法。
(項目125)
配列番号4の20位の核酸塩基がアデニン(A)である、項目124に記載の方法。
(項目126)
配列番号4の19位の核酸塩基がシトシン(C)またはウラシル(U)である、項目125に記載の方法。
(項目127)
前記精製するステップが、前記試料を少なくとも3つの捕捉プローブオリゴマーと接触させるステップを含む、項目124に記載の方法。
(項目128)
前記3つの捕捉プローブオリゴマーが、
配列番号2、またはそのDNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第1の捕捉プローブオリゴマー;
配列番号6、またはそのDNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第2の捕捉プローブオリゴマー;および
配列番号42、またはそのDNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第3の捕捉プローブオリゴマー
を含む、項目127に記載の方法。
(項目129)
前記第1、第2および第3の捕捉プローブオリゴマーがそれぞれ配列番号3、配列番号7および配列番号43の配列を有する、項目128に記載の方法。
(項目130)
前記検出するステップ(3)が、前記in vitroの核酸増幅反応物を、前記増幅産物の存在または非存在を決定する条件下で該増幅産物に特異的にハイブリダイズするように構成されている少なくとも1つの検出プローブオリゴマーと接触させ、それにより前記試料中のHEVの存在または非存在を決定することを含む、項目73〜129のいずれかに記載の方法。
(項目131)
長さが約14個〜約28個のヌクレオチドであり、配列番号39に含有される標的配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズするように構成されている、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも1つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、項目130に記載の方法。
(項目132)
前記検出プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号37、配列番号41、配列番号55、配列番号67および配列番号71の相補体、DNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号37、配列番号41、配列番号55、配列番号67および配列番号71からなる群から選択される、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記検出プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号37、配列番号67および配列番号71の相補体、DNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号37、配列番号67および配列番号71からなる群から選択される、項目131に記載の方法。
(項目134)
前記少なくとも1つの検出プローブオリゴマーが、その核酸主鎖の1つまたは複数の連結部に2’−メトキシ主鎖を含有する、項目131〜133のいずれかに記載の方法。
(項目135)
前記検出するステップが、前記in vitroの核酸増幅反応物を、長さが約14個〜約28個のヌクレオチドであり、配列番号39内に含有される標的配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズするように構成されている、標的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも2つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含む、項目130に記載の方法。
(項目136)
それぞれの検出プローブの標的にハイブリダイズする配列が、配列番号37、配列番号41、配列番号55、配列番号67および配列番号71の相補体、DNA同等物およびDNA/RNAキメラ体を含む、配列番号37、配列番号41、配列番号55、配列番号67および配列番号71からなる群から個々に選択される、項目135に記載の方法。
(項目137)
前記少なくとも2つの検出プローブオリゴマーが、
配列番号55もしくはその相補体、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第1の検出プローブオリゴマー;および
配列番号67もしくはその相補体、またはそのRNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第2の検出プローブオリゴマー
を含む、項目135に記載の方法。
(項目138)
前記検出するステップが、前記in vitroの核酸増幅反応物を少なくとも3つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含む、項目135または136に記載の方法。
(項目139)
前記少なくとも3つの検出プローブオリゴマーが、
配列番号37もしくはその相補体、またはそのDNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第1の検出プローブオリゴマー;
配列番号67もしくはその相補体、またはそのDNA同等物またはDNA/RNAキメラ体の、標的にハイブリダイズする配列を含む第2の検出プローブオリゴマー;および
配列番号71、またはそのDNA同等物またはDNA/RNA同等物の、標的にハイブリダイズする配列を含む第3の検出プローブオリゴマー
を含む、項目138に記載の方法。
(項目140)
それぞれの検出プローブオリゴマーが、その核酸主鎖の1つまたは複数の連結部に2’−メトキシ主鎖を含有する、項目135〜139のいずれかに記載の方法。
(項目141)
前記少なくとも1つの検出プローブオリゴマーが、
(a)化学発光標識;
(b)蛍光標識;
(c)クエンチャー;および
(d)(a)、(b)および(c)の1つまたは複数の組合せ
からなる群から選択される標識を含む、項目130〜140のいずれかに記載の方法。
(項目142)
前記少なくとも1つの検出プローブオリゴマーが前記化学発光標識を含む、項目141に記載の方法。
(項目143)
前記検出するステップ(3)が、ホモジニアス検出システムにおいて、前記増幅産物への標識された前記少なくとも1つの検出プローブオリゴマーのハイブリダイゼーションを検出する、項目141に記載の方法。
(項目144)
前記標識が、前記少なくとも1つの検出プローブオリゴマーの2つの核酸塩基間で連結された化学発光アクリジニウムエステル(AE)化合物である、項目143に記載の方法。
(項目145)
ステップ(2)の前記増幅反応が等温増幅反応である、項目73〜144のいずれかに記載の方法。
(項目146)
前記等温増幅反応が転写媒介性増幅(TMA)反応である、項目145に記載の方法。
他に定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用するとき、以下の用語および語句は、他に特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
本発明は、試料からC型肝炎ウイルス(HEV)核酸を増幅および検出するための組成物、キットおよび方法を提供する。好ましくは、試料は生物学的試料である。組成物、キットおよび方法は、HEV遺伝子型1、2、3および4の標的配列を含む、HEVゲノムの標的配列、またはそれらの相補的配列を認識するオリゴヌクレオチド配列を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、増幅オリゴヌクレオチドとして使用され得、これらは、機能が前述されている、プライマー、プロモータープライマー、ブロックされたオリゴヌクレオチドおよびプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを含んでもよい(例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,683,195号;同第4,683,202号;同第4,800,159号;同第5,399,491号;同第5,554,516号;同第5,824,518号;および同第7,374,885号を参照されたい)。他のオリゴヌクレオチドは、HEVの増幅された配列を検出するため、またはHEV標的核酸を捕捉するためのプローブとして使用され得る。
手法の原理
HEVアッセイは、単一チューブ内で行われる3つの主要なステップを伴った:試料調製;転写媒介性増幅(TMA)によるHEV RNAの標的増幅;およびハイブリダイゼーション保護アッセイ(HPA)による増幅産物(アンプリコン)の検出。
標的捕捉:鋳型が、本明細書に与えられる配列を有するE型肝炎ウイルス標的捕捉オリゴヌクレオチドを用いて捕捉されたことを除いて、核酸は、公開された国際特許出願第PCT/US2000/18685号に開示されている手法に本質的に従って、増幅前に検体処理および標的捕捉を受けた。注目すべきは、捕捉オリゴヌクレオチドは、アッセイの増幅反応または検出反応に関与しない。ウイルスを含有する試料は標的捕捉試薬と組み合わせて、核酸放出と、磁気ビーズ上に配置された捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションとを容易にした。インキュベーションは、試料からHEV核酸を捕捉するために行われた。インキュベーション後、磁気ビーズおよびいずれもの捕捉標的核酸は、洗浄ステップのために、10〜20分間、磁気洗浄ステーションに移された。次に、捕捉された標的核酸を増幅反応においてアッセイした。
実験I−組合せ増幅システム
目的は、異なるプライマーの組合せのうちのどれがより良好な性能を示すか、およびどの個々のプライマーが最も機能的に性能を発揮するかを確認するために、T7および非T7の対、ならびにいくつか個別的に試験することであった。標的捕捉反応は、標的捕捉オリゴマーとして配列番号76を用いて行った。検出反応は、AE標識検出プローブオリゴマーとして配列番号67を用いて行った。増幅オリゴマーの組合せを以下の表7に示す。先の実験において配列番号29+配列番号65および配列番号12プライマーが最もよく作用することを決定した後、この実験の大部分はこれらの特定のプライマーに焦点をあてた。また、いくつかのプライマーの濃度を増加させて試験を行い、システムにおける性能および機能を評価した。20コピー/mLのHEV IVT(8反復)およびBI0052陰性血清(2反復)でのパネルは各増幅システムについて試験した。
目的は、増幅試薬におけるT7と非T7との対および異なるプライマーの組合せを試験することであった。20c/mLのHEV IVTのパネルは、それぞれの増幅システムについて5反復で試験した。
目的は、新規なプローブオリゴ対を試験し、性能を評価することであった。また、プローブのそれぞれを、性能を評価するために個々に試験した。0(IC緩衝液のみ)と1,000コピー/mLのHEV IVTとにおけるパネルは、それぞれ、アッセイの陰性および陽性の較正因子として試験した。20コピー/mLのHEV IVTとBI0052陰性血清のパネルは、それぞれ試料として7反復で試験した。各パネルの種類は、各プローブの条件について試験した。
この実施例は、HEV増幅および検出アッセイに関する分析感度、交差反応性、特異性、および、さらにプローブ処方の評価を記載する。試薬は、実施例2において先に記載される通りである。これらの実験において使用するオリゴヌクレオチドおよび試料を以下の表14と15とに列挙する。
アッセイステップは、実施例2に記載されている通りに実施した。
分析感度
HEVアッセイの分析感度は、HEV RNA核酸増幅技術(NAT)に基づくアッセイの第一次世界保健機関(WHO)国際標準品(IS)(PEIコード6329/10)を用いて決定した。WHO ISは、北海道赤十字[日本赤十字(JRC)の一部]からポールエーリッヒ研究所(Langen、Germany)によって最初に得られた臨床分離株(GenBank受託番号AB630970)由来のHEV遺伝子型3aに基づく。
HEV特異的オリゴのインシリコBLAST分析は、C型肝炎ウイルス(HCV)を除いて、他の血液伝播病原体に対して配列の一致を示さなかった。HEVオリゴ配列番号64は、HCVエンベロープ遺伝子の一部(GenBank受託番号JQ063881における199〜213位)と100%同一性を示した。HEV特異的オリゴ配列(全部または一部)の残りの全てはHCVゲノム配列で見出されないため、これはいずれもの偽陽性の問題を引き起こさないことが予想される。これは、HEVアッセイにおいて非反応性を示したHCV陽性試料の試験によって支持される。試験した他の血液伝播ウイルス(ヒト免疫不全ウイルス1、B型肝炎ウイルスおよびウエストナイルウイルス)はまたHEVアッセイに関して非反応性であった。
HEVアッセイの特異性は、2,100個の関連のない凍結血漿検体について99.95%(95%スコアCI:99.73%〜99.99%)であると決定した。データは、凍結血漿検体におけるHEVアッセイの優れた特異性を示した。
HEVプローブオリゴの配列番号71は、配列番号55と比較して、HEV−3fについて検出シグナルの増加を示し[12、13]、HEV 3f感度を12.4c/mLの95%LODから10.2c/mLに増加させ、試験した他のHEV遺伝子型により匹敵するレベルまでRLUシグナルを増加させた。
この実施例は、血液ドナーにおけるHEV RNA有病率の決定、および上記されるようにオリゴヌクレオチドを用いたHEV増幅と検出アッセイの性能特性を記載する。
研究は、HEV WHO国際標準品(ポールエーリッヒ研究所(PEI)コード6329/10)および全4つの臨床的に関連するHEV遺伝子型(1〜4)のRNA転写物に対する分析感度、ならびに上記されるHEVアッセイ(「HEVアッセイ」)の臨床的特異性を示すために行った。血漿(核酸試験用)は、約10,000人の関連のないボランティアの全血液ドナーから収集した。試料は、自動化パンサーシステム(Hologic,Inc.、cat.no.303095)上でHEVアッセイを用いてHEV RNAについて試験した。TMAを用いて繰り返して反応性である試料をPCRおよび配列分析により確認した。
HEVアッセイは、WHO標準品を用いた7.9IU/mLと、HEV WHO標準品と同じ配列を有するHEV 3a RNA転写物を用いて14.4コピー/mLの95%検出限界(LOD)を示した(表20および21を参照されたい)。アッセイは、HEV1、2、3a、3b、3fおよび4cについてのRNA転写物を用いて、7.9〜17.7コピー/mLの範囲の95%LODを有する全4つのHEV遺伝子型を検出した(表23を参照されたい)。全9,998個の供血は、TMAアッセイを用いてHEV RNAについてスクリーニングした。3つのTMA反復反応性供血が同定され、PCRを用いて独立したアリコートを試験することによって陽性であることが確認された。1つの試料は、配列分析によって遺伝子型3fであると決定した。この研究に基づいて、これらの供血におけるHEV RNAの有病率は、3,333分の1または0.03%であると推定され、HEVアッセイの臨床的特異性は99.99%であると決定した(表22および表24を参照されたい)。
結果は、HEVアッセイが高感度であり、特異的であることを示し、全4つの臨床的に関連するHEVの遺伝子型を検出した。この研究用の10,000人近い個々の血液ドナーの試験により、3つのHEV RNA確認陽性供血が得られ、HEV RNA有病率が0.03%であった。本研究において実証された性能に基づいて、HEVアッセイは、HEV RNAに関する供血のスクリーニングに有用であり得る。
配列
11位のNはCであるまたは存在せず、16位のNはGであるまたは存在せず、17位のNはGであるまたは存在しない。一部の実施形態では、16位のNがGであり、17位のNが存在しない場合、1位のNはCである。
Claims (18)
- 試料中のE型肝炎ウイルス(HEV)の存在または非存在を決定するための少なくとも2つのオリゴマーの組合せであって、該オリゴマーの組合せが、
HEV標的核酸の標的領域を増幅するための、以下の(a)および(b)を含む少なくとも2つの増幅オリゴマー
を含み、
(a)少なくとも1つの増幅オリゴマーは、
(i)配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、オリゴマー、および
(ii)配列番号29〜31からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、オリゴマー
からなる群から選択され;そして
(b)少なくとも1つの増幅オリゴマーは、
(i)配列番号21〜24、45、46および48〜51からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、オリゴマー、および
(ii)オリゴマーの5’側にプロモーター配列が位置するプロモータープライマーであって、該オリゴマーは、配列番号21〜24、45、46および48〜51からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなり、該プロモーター配列は配列番号73の配列のポリヌクレオチドからなる、プロモータープライマー
からなる群から選択され、
ただし、該(a)の増幅オリゴマーが配列番号30の配列のポリヌクレオチドからなるオリゴマーからなり、該(b)の増幅オリゴマーが配列番号48および49からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドを含むオリゴマーからなる場合を除く、
少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。 - 前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29および配列番号64からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、
請求項1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。 - 前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号30および配列番号31からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29の配列のポリヌクレオチドからなる、請求項1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。 - 前記(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号31、配列番号62、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、請求項1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
- 前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24の配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24の配列のポリヌクレオチドからなるオリゴマーの5’側にプロモーター配列が位置するプロモータープライマーであり、かつ、前記プロモーター配列が、配列番号73の配列のポリヌクレオチドからなる、
請求項1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。 - 前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号46からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号46からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなるオリゴマーの5’側にプロモーター配列が位置するプロモータープライマーであり、かつ、前記プロモーター配列が、配列番号73の配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなるオリゴマーの5’側にプロモーター配列が位置するプロモータープライマーであり、かつ、前記プロモーター配列が、配列番号73の配列のポリヌクレオチドからなる、
請求項1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。 - (a)(i)に記載の増幅オリゴマーおよび(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーを含む、請求項1〜6のいずれかに記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
- 前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号64の配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号62、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、
請求項7に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。 - 前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29および配列番号31からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、
請求項7または8に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。 - 前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号64の配列のポリヌクレオチドからなる;
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29の配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号65の配列のポリヌクレオチドからなる;
前記(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29または配列番号31の配列のポリヌクレオチドからなる、
請求項7に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。 - (a)(ii)に記載の第1の増幅オリゴマーおよび(a)(ii)に記載の第2の増幅オリゴマーを含む、請求項1に記載の少なくとも2つのオリゴマーの組合せ。
- 試料中のE型肝炎ウイルス(HEV)の存在または非存在を決定するための方法であって、
(1)HEVを含有することが疑われる試料を、HEV標的核酸の標的領域を増幅させるための、以下の(a)および(b)を含む少なくとも2つのオリゴマーと接触させるステップであって、該オリゴマーの組合せが、
(a)
(i)配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、オリゴマー、および
(ii)配列番号29〜31からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、オリゴマー
からなる群から選択される少なくとも1つの増幅オリゴマー;ならびに
(b)
(i)配列番号21〜24、45、46および48〜51からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、オリゴマー、および
(ii)オリゴマーの5’側にプロモーター配列が位置するプロモータープライマーであって、該オリゴマーは、配列番号21〜24、45、46および48〜51からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなり、該プロモーター配列は配列番号73の配列のポリヌクレオチドからなる、プロモータープライマー
からなる群から選択される、少なくとも1つの増幅オリゴマー
を含むステップであって、
ただし、該(a)の増幅オリゴマーが配列番号30の配列のポリヌクレオチドからなるオリゴマーからなり、該(b)の増幅オリゴマーが配列番号48および49からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドを含むオリゴマーからなる場合を除く、ステップ;
(2)in vitro核酸増幅反応を行うステップであって、該試料中に存在する任意のHEV標的核酸が、増幅産物を生成するための鋳型として使用されるステップ;ならびに
(3)該増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより該試料中のHEVの存在または非存在を決定するステップ
を含む方法。 - 前記(1)(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29および配列番号64からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(1)(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29、配列番号30および配列番号31からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(1)(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号29の配列のポリヌクレオチドからなる、
請求項12に記載の方法。 - 前記(1)(a)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号31、配列番号62、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(1)(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24の配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(1)(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24の配列のポリヌクレオチドからなるオリゴマーの5’側にプロモーター配列が位置するプロモータープライマーであり、かつ、前記プロモーター配列が、配列番号73の配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(1)(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号46からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(1)(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号24および配列番号46からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなるオリゴマーの5’側にプロモーター配列が位置するプロモータープライマーであり、かつ、前記プロモーター配列が、配列番号73の配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(1)(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(1)(b)の少なくとも1つの増幅オリゴマーが、配列番号22、配列番号23、配列番号45、配列番号46および配列番号51からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなるオリゴマーの5’側にプロモーター配列が位置するプロモータープライマーであり、かつ、前記プロモーター配列が、配列番号73の配列のポリヌクレオチドからなる、
請求項12に記載の方法。 - 前記HEVの標的領域を増幅させるための前記少なくとも2つのオリゴマーが、(1)(a)(i)に記載の増幅オリゴマーおよび(1)(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーを含む、
請求項12〜14のいずれかに記載の方法。 - 前記(1)(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号64の配列のポリヌクレオチドからなる;あるいは
前記(1)(a)(i)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号62、配列番号65および配列番号66からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、
請求項15に記載の方法。 - 前記(1)(a)(ii)に記載の増幅オリゴマーが、配列番号29および配列番号31からなる群から選択される配列のポリヌクレオチドからなる、請求項15に記載の方法。
- 前記HEV標的領域を増幅するための前記少なくとも2つのオリゴマーが、(1)(a)(ii)に記載の第1および第2の増幅オリゴマーを含む、
請求項12に記載の方法。
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