CN101962689B

CN101962689B - 一种食品中戊型肝炎病毒的四重荧光定量pcr鉴别检测方法

Info

Publication number: CN101962689B
Application number: CN 201010523637
Authority: CN
Inventors: 张晓峰; 帅江冰; 吴姗; 陈笑梅; 何永强
Original assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Zhejiang Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Zhejiang Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority date: 2010-10-28
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2030-10-28
Also published as: CN101962689A

Abstract

目前对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测疫区的流行情况以阻断该病的传播。本发明公开了一种通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，其特征在于针对HEVORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针；四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测。本发明保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点，四重荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现鉴别诊断的目的，为传染源调查、传播环境、病毒溯源等工作奠定基础。

Description

一种食品中戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种人血清、动物血清及其产品、食品以及环境中通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法。

背景技术

戊型肝炎(Hepatitis E)由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起，是一种经粪-口传播、以黄疸为主的急性传染病，患病孕妇的病死率更可高达21％。自1955年印度发生第一次大暴发以来，戊型肝炎已在亚洲、非洲与拉丁美洲的很多国家广泛流行。近年来该病亦在日本等发达国家散发流行。我国是戊型肝炎高发的国家，新疆、辽宁、山东等省均有大量流行，极大的危害人类健康。有证据显示，戊型肝炎是一种动物源性疾病，被感染的家养或野生动物可直接传播或通过污染水源传播本病。有研究表明，猪源戊型肝炎病毒可以感染恒河猴和黑猩猩等灵长类动物，而人戊型肝炎病毒在实验条件下也能成功感染猪等动物；血清学调查则发现与猪频繁接触的人群(如饲养员、兽医、屠工)中戊型肝炎病毒的抗体水平明显高于正常人群。日本亦有人因食用了未煮熟的猪肝和鹿肉而引起急性戊肝的报道，提示了猪戊型肝炎病毒在公共卫生和食品安全方面存在的重大意义。

HEV是无包膜的单股正链RNA病毒，其基因组长约7.5kb，有3个开放阅读框。根据HEV各分离株的基因组序列分析，可将其分为4个主要的基因型。I型主要发生于亚非多数国家；II型分离于墨西哥；III型发生于美国和一些欧洲国家；IV型发生于亚洲。其中I型和II型只能感染人，III型和IV型则为人畜共患，可感染人、猪和其它动物。在我国流行的HEV主要为由I型和IV型。但有研究表明，上海地区猪场中已有III型HEV毒株的流行。

迄今为止，对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测疫区的流行情况以阻断该病的传播。这就需要建立一种通用的、高度敏感、特异和快速的检测方法用于HEV的诊断。同时，HEV主要经污染的水源和环境传播，高度敏感的病原检测技术也将有助于分子流行病学调查和病毒溯源。而目前可同时快速鉴定戊型肝炎病毒各个基因型的方法尚无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，利用TaqMan探针技术建立I、II、III和IV型HEV的多重荧光快速分型检测体系，以期填补技术空白。

为此，本发明采用如下的技术方案：一种不同基因型戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法，其特征在于针对HEV ORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针：

所述的扩增引物序列为：

HEV-F TATTCATCCAACCAACCCCTT，

HEV-R GTCDCGCCAAGYGGAGC，

该引物为针对不同基因型HEV ORF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C。

所述的TaqMan探针序列为：

I-P CY5-TGTCACCGCTGCGGCCG-BHQ3，

II-P ROX-AGACGTTGCCGCTGCGTCC-BHQ2，

III-P HEX-TTTCACAAYCCGGGGCTGGA-BHQ1，

IV-P FAM-CGCATCTGACATWCCARCCGC-BHQ1，

四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列种Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T，R代表碱基A或G。

PCR鉴别检测方法的步骤如下：

1)将待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后加入30μL DEPC水溶解。

2)在PCR反应管中按下表所述配置反应体系：

3)将PCR反应管置于ABI7500、Roche LightCycler480、Qiagen Rotor Gene 6000等荧光定量PCR仪中，并按下述反应条件进行检测：

第一阶段：42℃，30min；

第二阶段：95℃，3min；

第三阶段：95℃，10s，60℃，45s，45个循环；

并于第三阶段60℃时同时采集不通通道的荧光信号。

4)阴性对照CT值应显示为0或≥40.0，阳性对照的CT值应≤30.0，否则视实验失败，需重做。检测样品CT值≤35.0，结果有效，可直接报告样品阳性。检测样品35.0＜CT值＜40.0，需进行一次重复实验，若CT值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照CT值为零，可报告样品阳性，否则报告样品阴性。检测样品CT值为零，报告样品阴性。

本发明通过对已发表的不同基因型HEV毒株全序列进行分析后，针对HEVORF3序列设计一对保守引物，能同时扩增不同基因型HEV毒株，进一步针对此扩增区域的变异区设计四条型特异性探针，分别标记有不同的荧光基团，用于对4种不同基因型的一步法鉴别诊断。基于TaqMan探针的荧光定量PCR保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点。四重荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现鉴别诊断的目的，为传染源调查、传播环境、病毒溯源等工作奠定基础。

下面通过实施例和说明书附图对本发明进行详细描述。

附图说明

图1本发明荧光定量PCR方法敏感性(图1A)及其标准曲线分析(图1B)：I型HEV通道，模板浓度依次为2×10²-10⁸拷贝。

图2本发明荧光定量PCR方法敏感性(图2A)及其标准曲线分析(图2B)：II型HEV通道，模板浓度依次为2×10²-10⁸拷贝。

图3本发明荧光定量PCR方法敏感性(图3A)及其标准曲线分析(图3B)：III型HEV通道，模板浓度依次为2×10²-10⁸拷贝。

图4本发明荧光定量PCR方法敏感性(图4A)及其标准曲线分析(图4B)：IV型HEV通道，模板浓度依次为2×10²-10⁸拷贝。

具体实施方式

1材料和方法

1.1HEV多重荧光定量PCR方法的建立

1.1.1引物及探针的设计合成

通过已发表的不同基因型HEV毒株全序列进行分析后，针对HEV ORF3序列设计一对保守引物，能同时扩增不同型HEV毒株。同时针对此扩增区域的变异区分别设计四条型特异性探针，分别标记有不同的荧光基团，用于HEV的一步法荧光定量PCR检测(表1)：

表1引物及探针序列

^a兼并引物中D代表碱基A、G或T；Y代表碱基T或C；W代表碱基A或T；R代表碱基A或G

1.1.2荧光定量PCR反应条件优化

利用HEV阳性RNA模板作为检测样品，对引物和探针浓度从0.05～0.6μmol/L进行优化，并对退火温度等反应条件进行优化，筛选出最佳的荧光定量PCR反应条件。

1.1.3荧光定量PCR标准曲线分析及敏感性试验

将2×10²-10⁸拷贝/μL的四种基因型HEV阳性RNA模板分别混合，进行荧光定量PCR，设3个重复，以确定四重荧光定量PCR方法的标准曲线及其检测限。并与普通套式PCR方法的检测灵敏度进行比较优化。

1.1.4干扰性试验

将四型HEV病毒RNA模板按不同浓度混合，并利用建立的分型体系进行检测，以确定四种病毒的探针、引物之间是否存在相互干扰现象。

1.1.5特异性及重复性试验

利用本发明建立的荧光定量检测方法，对其它主要的猪传染性病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)等进行检测，以确定该方法的特异性。以10²～10⁶拷贝的标准品进行检测，每个样品3个重复，通过计算标准差(SD)和变异系数(CV)来验证荧光定量PCR的批内重复性。同时进行方法的批间重复性分析，即10²～10⁶拷贝的每个标准品分别检测3次，并计算标准差(SD)和变异系数(CV)。

1.2样品采集和处理

人或动物血清样本采集后-76℃保存备用，用于HEV核酸的荧光定量PCR检测。环境拭子、产品或猪粪便等样品采集后制成20％的悬液(w/v)，10000r/min离心20min，小心吸取上清，-76℃保存备用。

1.3RNA提取及HEV的荧光定量检测

将样品上清按TRIZOL Reagent使用说明提取RNA，最后加入30μL DEPC水溶解，利用所建立的荧光定量PCR方法进行HEV的检测。

2结果

2.1荧光定量PCR反应条件优化

不同的引物和探针终浓度配比试验结果结合仪器要求，荧光定量PCR反应最佳退火温度为60℃，最终反应条件为：第一阶段：42℃，30min；第二阶段：95℃，3min；第三阶段：95℃，10s，60℃，45s，45个循环；并于第三阶段60℃时同时采集不通通道的荧光信号。20μL的反应体系中上下游引物及四种型特异性探针的最适终浓度为分别0.6μmol/L和0.25μmol/L。反应体系如下表；

表2荧光定量PCR反应体系

2.2HEV荧光定量PCR检测方法灵敏度分析

以10倍系列稀释的四种型HEV阳性RNA混合液(2×10²-10⁸拷贝)为模板进行定量扩增并分析其标准曲线(图1-图4)。结果表明本发明的荧光定量方法对于不同基因型的HEV都具有较高的扩增效率(97.15％-98.78％)。而且该方法对不同基因型模板的检测下限均可达10²拷贝，具有很高的灵敏度。其对高浓度模板也具有很好的检测效果，表明此方法具有很广的线性范围，适用于临床不同条件、多种样品的检测。而常规套式PCR最低仅能检出含量为5×10²～5×10³的模板，因此荧光定量PCR方法相比于普通PCR，其检测灵敏度要高10-100倍。

2.3抗干扰试验

将四种基因型HEV模板按不同浓度混合后进行多重荧光定量PCR检测，不同浓度组合均能同时扩增出四种基因型HEV，不产生干扰。

2.4荧光定量PCR检测体系的特异性和稳定性

进一步对该方法的特异性和稳定性进行分析。结果显示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)等对照在该体系中不同信号通道检测均为阴性，表明该方法特异性强，与其他主要传染性病原无交叉反应性。

对不同含量的各基因型阳性样品(10²～10⁶拷贝)进行荧光定量检测，每个样品3个重复，结果表明各通道检测变异系数(CV)为0.04％～0.63％(表3，Green通道)，具有良好的批内稳定性。同时进行方法的批间重复性分析，即10²～10⁶拷贝的每个标准品分别检测3次，不同浓度模板3次试验平均CT值间变异系数介于0.12％和1.26％，说明该方法也具有很高的批间稳定性。

表3Green通道荧光定量PCR体系稳定性分析

2.5不同地区人群及猪群中HEV核酸检测

利用一步法荧光定量PCR对浙江省内抗体阳性的人血清样本及采集自浙江、上海、江苏等不同地区规模化猪场的样品进行HEV病毒核酸的四重荧光定量检测。其中，77份HEV抗体阳性的人血清样本仅有2份为IV型HEV核酸阳性，阳性率为2.6％。而18个不同地区猪场的273份猪粪便样品中有55份检测到IV型HEV核酸(阳性率20.5％)，一份样品为III型HEV阳性。且所有地区的猪场均能检测到猪HEV核酸，地区覆盖率100％，表明猪HEV已经在规模化猪场中广泛存在。

序列表

<110>浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>一种食品中戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>primer bind

<222>(1)...(21)

<400>1

tattcatccaaccaacccctt 21

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>primerbind

<222>(1)...(17)

<400>2

gtcdcgccaagyggagc 17

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>primer bind

<222>(1)...(17)

<400>3

tgtcaccgctgcggccg 17

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>primer bind

<222>(1)...(19)

<400>4

agacgttgccgctgcgtcc 19

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>primer bind

<222>(1)...(20)

<400>5

tttcacaayccggggctgga 20

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>primer bind

<222>(1)...(21)

<400>6

cgcatctgacatwccarccgc 21

Claims

1.一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法，用于食品中戊型肝炎病毒的鉴别，其特征在于针对HEV ORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针：

所述的扩增引物序列为：

HEV-F TATTCATCCAACCAACCCCTT，

HEV-R GTCDCGCCAAGYGGAGC，

该引物为针对不同基因型HEV ORF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C；

所述的TaqMan探针序列为：

I-P CY5-tgtcaccgctgcggccg-BHQ3，

II-P ROX-agacgttgccgctgcgtcc-BHQ2，

III-P HEX-TTTCACAAYCCGGGGCTGGA-BHQ1，

IV-P FAM-cgcatctgacatWccaRccgc-BHQ1，

四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列中Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T，R代表碱基A或G；

PCR鉴别检测方法的步骤如下：

1）将来源于食品的待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后加入30μL DEPC水溶解；

2）在PCR反应管中配置反应体系，体系的总体积为25μl，其组成如下：10μl荧光定量PCR Mix，1.2 μl浓度为10μM的HEV-F，1.2 μl浓度为10μM的HEV-R，0.5μl浓度为10μM的I-P，0.5μl浓度为10μM的II-P，0.5μl浓度为10μM的III-P，0.5μl浓度为10μM的IV-P，8 μl HEV阳性RNA模板，双蒸水补至25μl；

3）将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，反应条件如下：第一阶段：42℃，30 min；第二阶段：95℃，3 min；第三阶段：95℃，10 s，60 ℃，45 s，45个循环，

并于第三阶段60℃时同时采集不通通道的荧光信号；

4）阴性对照CT值应显示为0或≥40.0，阳性对照的CT值应≤30.0，否则视实验失败，需重做；检测样品CT值≤35.0，结果有效，直接报告样品阳性；检测样品35.0<CT值<40.0，需进行一次重复实验，若CT值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照CT值为零，报告样品阳性，否则报告样品阴性；检测样品CT值为零，报告样品阴性。