CN111560465A - 伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，特别涉及一种伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒及方法，用于猪病原的快速检测。针对伪狂犬病毒和猪戊型肝炎病毒的保守序列，分别设计PCR引物和荧光TaqMan探针，构成专门针对伪狂犬病毒和戊型肝炎病毒的引物组和探针组，组成二重荧光定量PCR检测试剂盒，用于伪狂犬病毒和猪戊型肝炎病毒的检测，该检测方法具有操作简便、敏感性高等优点，反应结束即可根据扩增曲线判定结果，实现同时检测和鉴别伪狂犬病毒和猪戊型肝炎病毒两种病原体，该方法既可以节约时间的成本，又可以减少污染，具有极高的应用价值。

Description

伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒及方法
技术领域
本发明属于动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，特别涉及一种伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒及方法。
背景技术
伪狂犬病毒(Pseudorabies viurse，PRV)是a-疱疹病毒亚科的一种高度接触性传染病。猪是唯一的自然宿主。该病可导致怀孕母猪的流产、死胎、木乃伊胎和种猪不育等症状；哺乳仔猪常出现神经症状和死亡；成年猪一般呈亚临床或隐性感染，成为病毒的贮存宿主，长期排毒。
戊型肝炎(Hepatitis E)是一种由戊型肝炎病毒(HEV)引起的急性病毒性肝炎，主要通过粪-口消化道传播。戊型肝炎呈全球分布，以暴发流行或散发感染的形式存在，在世界范围内，无论HEV在这个地区是否流行，猪感染HEV的现象非常普遍。HEV主要包括14个基因型，其中基因4型具有人兽共患的性质，在人群和猪群中主要以基因4型HEV感染为主。研究发现从猪体内分离的基因4型HEV能够感染人，反之亦然，并且基因4型HEV对人的致病性较其他基因型更强，危害也更大。对戊型肝炎病毒的快速准确诊断是临床上防治猪戊型肝炎病毒的关键。目前实验室诊断HEV和PRV的方法大致可分为2类：①血清学方法，如ELISA方法、血清中和实验、免疫荧光等；②分子生物学方法。血清学方法存在假阳性过多的问题和现象，并且不适于HEV和RPV感染的早期做出快速准确的诊断。
发明专利“猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒及引物和探针(公开号CN201610634845)”、发明专利“猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒(公开号CN201410217702)”描述了检测伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR方法，可以检测伪狂犬病毒但是没法同时检测戊型肝炎病毒。因此，发明一种伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒及检测方法，使其可以在一个PCR反应管中同时检测狂犬病毒和戊型肝炎病毒，减少操作流程，具有重要的实际应用价值。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒及方法，克服现有同时检测伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒检测技术方面存在的缺陷和不足，分别提供伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒的检测引物及探针，所述引物可快速准确的检测伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒。一个PCR反应可以同时检测两种病原，快速方便可用于猪病原鉴定，有利于开展流行病学调查，预防和控制疫情传播。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
本发明所述的伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒，其特征在于包括以下引物对和探针：
检测伪狂犬病野毒的引物对和探针RPV-Pro，所述检测伪狂犬病野毒的引物对包括SEQIDNO：1所示的上游引物RPV-F和SEQIDNO：2所示的下游引物RPV-R，所述探针RPV-Pro的序列为SEQIDNO：3所示；
检测猪戊型肝炎病毒的引物对和探针HEV-Pro，所述检测猪戊型肝炎病毒的引物对包括SEQIDNO：4所示的上游引物HEV-F和SEQIDNO：5所示的下游引物HEV-R，所述探针HEV-Pro的序列为SEQIDNO：6所示。
本发明分别根据伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒的特异性序列，分别进行比对找到特性序列设计PCR引物对、探针和PCR反应程序，从而实现对伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒的快速鉴定。所述PCR引物对和探针可用来特异性检测鉴定待测样品中是否含有伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒；因此，所述引物对及探针在同时检测或鉴定伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒中的应用，以及在伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒检测试剂盒中的应用，均应在本发明的保护范围之内。
作为优选的，所述上游引物RPV-F、下游引物RPV-R、探针RPV-Pro、上游引物HEV-F、下游引物HEV-R和探针HEV-Pro的终浓度为0.2mM到1mM。
作为优选的，所述探针RPV-Pro和探针HEV-Pro的5'标记的荧光基团为FAM、VIC、HEX中的一种，且各个探针的5'标记的荧光基团互不相同；所述探针RPV-Pro和探针HEV-Pro的3'标记的淬灭基团为BQ1、BQ2中的一种。
作为优选的，该试剂盒中还包括有酶液和反应缓冲液，所述酶液由DNA聚合酶、反转录酶组成。
作为优选的，该试剂盒中还包括有阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为用0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲盐水；所述阳性对照为伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒PCR扩增产物分别与克隆载体pMD-18-T vector连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD18-RPV和pMD18-HEV作为阳性对照。
本发明还提供了伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒的检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)提取待测样本核酸，选用商品化的病毒核酸提取试剂盒；
(2)配置扩增反应体系，体系为：17μLPCR扩增反应液，3μL待检病毒核酸模板，反应体系的总体积为20μL；
(3)荧光定量PCR扩增：将步骤(2)配制好的扩增反应体系进行一步法RT-PCR扩增反应，并进行信号采集；
(4)结果判定：分别在相应通道查看扩增曲线，根据扩增曲线判读结果；伪狂犬病野毒检测荧光曲线在第一通道查看，若该通道ct值小于36及S型荧光曲线说明伪狂犬病野毒检测结果为阳性；猪戊型肝炎病毒的检测荧光曲线在第二通道查看，若该通道ct值小于36及S型荧光曲线说明猪戊型肝炎病毒检测结果为阳性。
作为优选的，所述PCR扩增反应液包含10μL的2X One Step RT-PCR BufferⅢ，0.4μL的TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶，0.4μL的Pr imeScript RT Enzyme MixⅡ，各0.5μL权利要求1中所述的引物和探针，3.2μL的无菌水。用到的酶及Buffer属于商业化的试剂
作为优选的，所述扩增反应条件：42℃反转录5min；95℃预变性1min；94℃变性10s，60℃退火延伸20s并采集荧光信号40个反应循环。
本发明的优点在于：根据伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒基因组的特异性序列，分别进行比对找到特性序列设计PCR引物、探针，可以同时检测伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒，该技术可以在一个PCR反应中同时检测两种病原，减少操作流程，检测快速方便，同时采用一步法PCR扩增技术耗时短，实用性强，可用于猪病原快速鉴定，有利于开展流行病学调查，预防和控制疫情传播。
附图说明
图1是实施例2中伪狂犬病和猪戊型肝炎病毒核酸提取电泳图；
图2是实施例2中伪狂犬病野毒的PCR检测荧光曲线图；
图3是实施例2中猪戊型肝炎病毒PCR检测荧光曲线图；
图4是实施例2中4例伪狂犬病野毒PCR检测产物电泳图；
图5是实施例2中3例猪戊型肝炎病毒PCR检测产物电泳图；
图6是实施例2中狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒双重PCR检测荧光曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1：
一种伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒，包括有酶液和反应缓冲液，所述酶液由DNA聚合酶、反转录酶组成，还包括有阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为用0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲盐水；所述阳性对照为伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒PCR扩增产物分别与克隆载体pMD-18-T vector连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD18-RPV和pMD18-HEV作为阳性对照。还包括以下引物对和探针：
检测伪狂犬病野毒的引物对和探针RPV-Pro，所述检测伪狂犬病野毒的引物对包括SEQIDNO：1所示的上游引物RPV-F和SEQIDNO：2所示的下游引物RPV-R，所述探针RPV-Pro的序列为SEQIDNO：3所示；具体如下：
上游引物RPV-F：5’TTCCACTCGCAGCTCTTCTC 3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物RPV-R：5’ACACGTAGTACAGCAGGCAC 3’(SEQ ID NO.2)；
检测探针RPV-Pro:FAM GCGTGGTCTCGGACATGGGC BQ1(SEQ ID NO.3)。
检测猪戊型肝炎病毒的引物对和探针HEV-Pro，所述检测猪戊型肝炎病毒的引物对包括SEQIDNO：4所示的上游引物HEV-F和SEQIDNO：5所示的下游引物HEV-R，所述探针HEV-Pro的序列为SEQIDNO：6所示；具体如下：
上游引物HEV-F：5’CCGACAGAATTGATTTCGTCG 3’(SEQ ID NO.4)；
下游引物HEV-R：5’CTGCTGAGCGTTCTCGAC 3’(SEQ ID NO.5)；
检测探针HEV-Pro:HEX GTCTCAGCCAATGGCGAGCC BQ1(SEQ ID NO.6)。
所述上游引物RPV-F、下游引物RPV-R、探针RPV-Pro、上游引物HEV-F、下游引物HEV-R和探针HEV-Pro的终浓度为0.2mM到1mM。
探针RPV-Pro在5'端修饰的荧光基团是FAM，3'端修饰的猝灭基团是BQ1；探针HEV-Pro在5'端修饰的荧光基团是HEX，3'端修饰的猝灭基团是BQ1；荧光基团可以是FAM、VIC、HEX中的一种，但是本发明要求的权利不仅限于这3种固定荧光标记，也可以是其他荧光标记如TEXAS、RED等。探针在5'端修饰的荧光基团不同，3'端修饰的猝灭基团可以是相同，也可以是不同。
一种伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒的检测方法，按照以下步骤进行：
(1)待测样本病毒核酸的提取：采用商业化的病毒核酸提取试剂盒，实验中使用的是青岛英赛特生物科技有限公司核酸提取试剂盒。
(2)配置扩增反应体系，体系为：17μL PCR扩增反应液(10μL的2X One Step RT-PCR BufferⅢ，0.4μL的TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶，0.4μL的PrimeScript RT EnzymeMixⅡ，各0.5μL上文中所述的引物和探针，3.2μL的无菌水)，3μL待检病毒核酸模板，体系的总体积为20μL；具体可参照下表：
Figure BDA0002335501630000061
Figure BDA0002335501630000071
(3)荧光定量PCR扩增：在PCR反应管中用移液器吹打混匀后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。所述扩增反应条件：42℃反转录5min；95℃预变性1min；94℃变性10s，60℃退火延伸20s并采集荧光信号40个反应循环。
(4)结果判定：分别在相应通道查看扩增曲线，根据扩增曲线判读结果；伪狂犬病野毒检测荧光曲线在第一通道查看，若该通道ct值小于36及S型荧光曲线说明伪狂犬病野毒检测结果为阳性；猪戊型肝炎病毒的检测荧光曲线在第二通道查看，若该通道ct值小于36及S型荧光曲线说明猪戊型肝炎病毒检测结果为阳性。
实施例2：
一种伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒的检测方法，对4株伪狂犬病野毒和3株猪戊型肝炎病毒样本检测，其具体流程如下：
(1)样本病毒核酸提取：待提样本7例，包含4例伪狂犬病野毒和3例猪戊型肝炎病毒组织样本样，分别用商业化的病毒核酸提取试剂盒进行提取。图1为7例样本核酸提取电泳图,A1到A4为伪狂犬病野毒核酸电泳图，B1到B3为猪戊型肝炎病毒核酸电泳图，由图1可知7例样本核酸均提取成功。
(2)分别取3μL上一步提取好的病毒核酸和17μL实施例1中所述的PCR扩增反应液，加入到PCR反应管中并用移液器吹打混匀后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。荧光定量PCR仪运行的程序为42℃反转录5min；95℃预变性1min；94℃变性10s，60℃退火延伸20s并采集荧光信号40个反应循环。
(3)将阳性的伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒基因组进行混合后作为检测模板，取3uL模板和17μL的检测试剂盒中的PCR反应液，加入到PCR反应管中并用移液器吹打混匀，置于荧光定量PCR仪上进行反应。荧光定量PCR仪运行的程序为42℃反转录5min；95℃预变性1min；94℃变性10s，60℃退火延伸20s并采集荧光信号40个反应循环。
(4)结果分析：通过荧光扩增曲线图Ct值的大小来判断结果的阴阳性的，确定样品中是否含有伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒。当扩增曲线图Ct值≤36,并呈现明显指数增长时,结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值>36或无Ct值,结果表现为阴性；为了在判断检测结果阴阳性时具有参照，检测样本时需要给伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒双重荧光PCR检测试剂盒设置阴性对照。
本发明实施例中，用于检测伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒的荧光定量PCR仪包括但不限于：ABI系列、Bio-Rad系列、Rocheightcycler、杭州博日系列等。
在FAM通道查看伪狂犬病野毒的检测结果，4例伪狂犬病野毒的检测结果均为阳性如图2所示，其A0为阴性对照，3例猪戊型肝炎病毒检测结果同样为阳性如图3所示，其中B0为阴性对照。图4、图5分别为伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒PCR产物电泳图，电泳显示扩增出目的条带，检测结果与预期一致，说明该试剂盒可以单独检测伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒。
把伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒的基因组混合后作为模板，同时检测两种病毒如图6所示，A为伪狂犬病野毒和B为猪戊型肝炎病毒的检测结果均为阳性，C为阴性对照。说明试剂盒可以同时检测伪狂犬病野毒和和猪戊型肝炎病毒，具有双重检测能力，检测结果符合预期。
序列表
<110> 龙岩学院
福建梅花山华南虎繁育研究所
青岛英赛特生物科技有限公司
<120> 伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒及方法
<141> 2019-12-25
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttccactcgc agctcttctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acacgtagta cagcaggcac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gcgtggtctc ggacatgggc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccgacagaat tgatttcgtc g 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ctgctgagcg ttctcgac 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtctcagcca atggcgagcc 20

Claims (8)

1.伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒，其特征在于包括以下引物对和探针：
检测伪狂犬病野毒的引物对和探针RPV-Pro，所述检测伪狂犬病野毒的引物对包括SEQIDNO：1所示的上游引物RPV-F和SEQIDNO：2所示的下游引物RPV-R，所述探针RPV-Pro的序列为SEQIDNO：3所示；
检测猪戊型肝炎病毒的引物对和探针HEV-Pro，所述检测猪戊型肝炎病毒的引物对包括SEQIDNO：4所示的上游引物HEV-F和SEQIDNO：5所示的下游引物HEV-R，所述探针HEV-Pro的序列为SEQIDNO：6所示。
2.根据权利要求1所述的伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒，其特征在于：所述上游引物RPV-F、下游引物RPV-R、探针RPV-Pro、上游引物HEV-F、下游引物HEV-R和探针HEV-Pro的终浓度为0.2mM到1mM。
3.根据权利要求1或2所述的伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒，其特征在于：所述探针RPV-Pro和探针HEV-Pro的5'标记的荧光基团为FAM、VIC、HEX中的一种，且各个探针的5'标记的荧光基团互不相同；所述探针RPV-Pro和探针HEV-Pro的3'标记的淬灭基团为BQ1、BQ2中的一种。
4.根据权利要求1所述的伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还包括有酶液和反应缓冲液，所述酶液由DNA聚合酶、反转录酶组成。
5.根据权利要求1所述的伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还包括有阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为用0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲盐水；所述阳性对照为伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒PCR扩增产物分别与克隆载体pMD-18-T vector连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD18-RPV和pMD18-HEV作为阳性对照。
6.一种权利要求要求1所述的伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒的检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)提取待测样本核酸，选用商品化的病毒核酸提取试剂盒；
(2)配置扩增反应体系，体系为：17μLPCR扩增反应液，3μL待检病毒核酸模板，反应体系的总体积为20μL；
(3)荧光定量PCR扩增：将步骤(2)配制好的扩增反应体系进行一步法RT-PCR扩增反应，并进行信号采集；
(4)结果判定：分别在相应通道查看扩增曲线，根据扩增曲线判读结果；伪狂犬病野毒检测荧光曲线在第一通道查看，若该通道ct值小于36及S型荧光曲线说明伪狂犬病野毒检测结果为阳性；猪戊型肝炎病毒的检测荧光曲线在第二通道查看，若该通道ct值小于36及S型荧光曲线说明猪戊型肝炎病毒检测结果为阳性。
7.根据权利要求6所述的伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增反应液包含10μL的2X One Step RT-PCR BufferⅢ，0.4μL的TaKaRaEx Taq HS DNA聚合酶，0.4μL的PrimeScript RT Enzyme MixⅡ，各0.5μL权利要求1中所述的引物和探针，3.2μL的无菌水。
8.根据权利要求6所述的伪狂犬病野毒和猪戊型肝炎病毒qPCR试剂盒的检测方法，其特征在于所述扩增反应条件：42℃反转录5min；95℃预变性1min；94℃变性10s，60℃退火延伸20s并采集荧光信号40个反应循环。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6432408B1 (en) * 1997-07-18 2002-08-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Swine hepatitis E virus and uses thereof
CN1710101A (zh) * 2005-06-23 2005-12-21 武汉大学 一种检测猪伪狂犬病毒荧光定量pcr试剂盒及应用
CN101122563A (zh) * 2007-08-28 2008-02-13 浙江省医学科学院 戊型肝炎病毒荧光定量pcr检测方法
CN101962689A (zh) * 2010-10-28 2011-02-02 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量pcr鉴别检测方法
CN103952500A (zh) * 2014-05-21 2014-07-30 广东温氏食品集团股份有限公司 猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒
CN104789697A (zh) * 2015-03-20 2015-07-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种同时检测csfv、prrsv、prv、pcv2的四色荧光定量pcr方法及其试剂盒
CN108504778A (zh) * 2018-04-20 2018-09-07 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6432408B1 (en) * 1997-07-18 2002-08-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Swine hepatitis E virus and uses thereof
CN1710101A (zh) * 2005-06-23 2005-12-21 武汉大学 一种检测猪伪狂犬病毒荧光定量pcr试剂盒及应用
CN101122563A (zh) * 2007-08-28 2008-02-13 浙江省医学科学院 戊型肝炎病毒荧光定量pcr检测方法
CN101962689A (zh) * 2010-10-28 2011-02-02 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量pcr鉴别检测方法
CN103952500A (zh) * 2014-05-21 2014-07-30 广东温氏食品集团股份有限公司 猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒
CN104789697A (zh) * 2015-03-20 2015-07-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种同时检测csfv、prrsv、prv、pcv2的四色荧光定量pcr方法及其试剂盒
CN108504778A (zh) * 2018-04-20 2018-09-07 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙彦琴等: "猪流行性腹泻病毒与猪伪狂犬病病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用", 《中国畜牧兽医》 *
邱蜜蜜等: "猪戊型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用", 《中国兽医学报》 *
郭晓秋等: "猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与初步应用", 《中国兽医杂志》 *
闫蕾等: "猪戊型肝炎病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 *

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