CN101122563A - 戊型肝炎病毒荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种涉及生物工程领域的检测方法，特别是用于定量检测临床标本中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)滴度的荧光定量PCR检测方法。本发明包括如下步骤：病毒特异性定量PCR引物和探针设计；标准分子的构建；病毒样本RNA的提取；样本RNA的cDNA合成；荧光定量PCR检测方法的建立和优化。本发明的检测灵敏度可达10°数量级的病毒拷贝，具有良好的稳定性和特异性，可用于大批量的样本检测，并可对样本的病毒载量进行准确定量。

Description

戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明是一种涉及生物工程领域的检测方法，特别是用于定量检测临床标本中戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)引起的一种急性、自限性疾病。病毒主要通过粪-口途径传播，广泛流行于发展中国家，主要侵犯青壮年，孕妇感染后死亡率可达20％以上，构成严重的公共卫生问题。我国为戊型肝炎的高发区，控制该病刻不容缓。目前，对戊型肝炎的诊断除临床症状外，通常采用ELISA法检测血清中抗HEV-IgG抗体。但是，目前ELISA检测灵敏度及特异性较低，漏检率高，给戊型肝炎的诊治带来困难。而实时荧光定量PCR作为一种新的技术已经广泛应用于疾病诊断，因此迫切需要建立一种灵敏、稳定、特异性强的荧光定量PCR方法，用于戊型肝炎的临床诊断及HEV定量检测。建立该方法将为戊型肝炎的早期诊断，病程中粪便和血清中病毒载量的消长规律、抗病毒药物筛选、感染动物模型的研究提供方法；为戊肝的抗病毒治疗效果的评价提供技术平台；为戊型肝炎的流行病学监测、致病机理的研究提供技术支持；还可用于监测戊型肝炎流行区水体的HEV污染状况，以及食品及生物制品的HEV检测，进一步提高我国的戊型肝炎防治水平。

荧光定量PCR技术具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、无污染、实时和准确等特点，已经广泛应用于病原体检测、单核苷酸多态性(SNP)测定及突变分析、基因表达分析、肿瘤基因检测等方面的研究。在病毒检测方面，它不仅能对病毒定性，更能快速、准确地定量病毒核酸，使研究病毒负荷和疾病进展的关系成为可能，从而可以动态地研究在整个病程中病毒载量的消长规律，并可对抗病毒治疗的效果和耐药变异毒株的出现作出评估，为抗病毒药物的筛选以及研究工作提供有效的技术平台。目前，在国内外荧光定量PCR技术广泛应用于疾病的临床诊断，定量检测乙型肝炎病毒、艾滋病病毒、巨细胞病毒、结核杆菌等各种病原体的商品化试剂盒已经面世，但是尚无HEV荧光定量PCR试剂盒问世。

戊型肝炎的实验室诊断常用酶联免疫法检测血清抗HEV-IgG和IgM，逆转录PCR方法检测粪便和血清中病毒RNA。但是，ELISA检测戊型肝炎特异性抗体的敏感度有限，而且所用抗原不尽相同，导致检出率差异较大，随着人们发现的HEV基因型的日益增多，需要合成更多的抗原检测试剂，以降低漏检率。而由于临床样本中的病毒含量非常低，常规RT-PCR方法灵敏度不够，易产生漏检。本发明采用绝对定量技术，建立灵敏、稳定、特异性强的荧光定量PCR检测HEV的方法，适用于戊型肝炎的临床诊断。

荧光PCR定量检测HEV方法的建立，将给戊型肝炎的诊断技术带来巨大飞跃；为抗病毒药物筛选、感染动物模型、患者发病过程中粪便和血清中病毒载量消长规律等方面的研究提供方法；为戊肝的抗病毒治疗效果的评价提供技术平台；为戊型肝炎的流行病学监测、致病机理的研究提供技术支持；还可用于监测戊型肝炎流行区水体的HEV污染状况，以及食品及生物制品的HEV检测，进一步提高我国的戊型肝炎防治水平。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种HEV病毒的荧光定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度可达10⁰数量级，较传统的RT-PCR和RT-nPCR方法具有更高的灵敏度，且操作简便，可进行大批量的样本分析，并对HEV进行定量，从而为戊型肝炎病毒的检测和监控提供有效方法。

本发明通过对Genbank中HEV全序列进行生物信息学分析，选取HEVORF2基因的保守区段为靶目标，应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一对PCR引物和Taqman探针。本发明所述的HEV特异性定量检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为151bp。

引物和探针序列为：

上游引物：HEV-1(+)：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT；

下游引物：HEV-2(-)：AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG；

Taqman探针序列：5’-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3’。

本发明包括如下步骤：

1.通过生物信息学分析，选择HEV ORF2基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

GAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTA

TTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTT

TCTGTCCTCCGAGCT；

2.应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一对病毒特异性定量PCR引物和Taqman探针设计。探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

上游引物：HEV-1(+)：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT；

下游引物：HEV-2(-)：AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG；

Taqman探针序列：5’-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3’

3.构建和制备质粒定量标准品pET28a-ORF2。

根据确定的PCR引物，利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体pET-28a中，构建的重组质粒pET28a-ORF2作为检测HEV滴度的定量标准品。

4.样本中戊型肝炎病毒的分离浓缩，及其病毒RNA的提取

样本用聚乙二醇(PEG)和氯化钠(NaCl)进行浓缩，以提高检测的灵敏度。

5.对提取的样本RNA进行逆转录反应，获得样本cDNA

6.戊型肝炎病毒特异性定量检测方法的优化和建立

经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过临床样品的检测应用评估。对建立的方法进行灵敏度、稳定性、特异性以及对临床标本的有效性进行综合评价。

(1).灵敏度：用灭菌双蒸水分别将质粒定量标准品pET28a-ORF2稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies/μl，采用经优化后的体系进行检测，验证所建立的方法的灵敏度。本检测方法在10⁰～10⁸copies/reaction数量级范围内具有良好的线性关系，相关系数R＝0.9995，其检测范围可达9个数量级，其灵敏度可到10拷贝以下。

(2).稳定性：我们从批间重复和批内重复两个方面进行评价。批内重复性：选取同一份标本，设10个平行反应管同时进行反应，检验其C_T值的变异系数。

批间重复性：选取2个不同浓度的重组质粒标准品，一周内重复检测5次，检测其C_T值的变异系数。

(3).特异性：本研究选择了7个标本进行检测，3份RT-nPCR检测呈阳性的人的粪便标本，3份健康标本以及1份甲型肝炎病毒标本。Trizol提取的标本RNA溶于无RNase的DEPC-H₂O中，并按常规方法合成cDNA第一链。cDNA产物应用建立的Real-time PCR方法进行定量检测。定量结果显示3份阳性标本的病毒载量分别为：3.8×10²、5.4×10²和1.1×10³copies/mg，其余标本均为阴性结果。

本发明采用Taqman探针定量PCR进行戊型肝炎病毒的特异性检测，具有以下优点和效果：

1.与传统的定量方法相比，此实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、高稳定性等特点。直接对PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线。特异性好。由于Taqman法采用杂交的方式对目标分子进行甄别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，具有特异性好，假阳性率低等特点。

2.本发明建立的基于Taqman探针的荧光定量PCR方法具有灵敏度高，检测范围广的特点。在10⁰～10⁸拷贝范围内有极好的线性关系(R＝0.9995)，检测范围可以达到9个数量级，达到国际先进水平。其检测灵敏度可到10个拷贝以下，具有极高的灵敏度，适合检测低病毒含量的实验标本。

3.稳定性和重复性高：其批内重复性检测的C_T值变异系数(CV)为1.49％，批内重复性检测的C_T值变异系数(CV)为1.98％和2.23％。

4.操作简单，自动化程度高。基于Taqman探针的定量技术在同一反应管内同时进行多重反应。反应过程中无需开盖，避免污染，扩增和检测同步完成，操作简单，易于实现自动化。

本发明采用的荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量的优点，克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了实验时间，简化了实验操作，而且荧光检测的结果由电脑软件分析，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。同时，本发明中采用的阳性对照是根据戊型肝炎病毒的保守序列设计构建的标准质粒分子，使得阳性标准品的来源可靠，避免了阳性毒株在每次实验中的使用。

附图说明

图1为荧光定量PCR敏感度检测的荧光信号图(从左至右的标准品浓度分别为10⁰～10⁸copies/μl)。

图2.戊型肝炎病毒绝对定量的标准曲线，y＝-3.257*log(conc)+45.819

(注：conc表示反应体系中的标准质粒拷贝数)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1：

设计引物和Taqman探针

实验步骤：

在Genbank中收集HEV全序列并进行生物信息学分析，选取序列保守区段作为设计引物和探针的候选区段，重点分析比对流行于我国的HEV全序列(EMBL登录号：AB108537、AJ272108、D11092、L08816、L25547和M94177)，确定位于ORF2的高保守区域作为PCR扩增的靶基因序列。应用primer express软件和primer premier5.0软件，设计一对PCR引物和Taqman探针，探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。引物和探针位于ORF2区域，目的扩增片段为151bp。戊型肝炎病毒特异性定量PCR引物指的是：长度为21bp的寡核苷酸链。

引物和探针序列为：

上游引物：HEV-1(+)：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT；

下游引物：HEV-2(-)：AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG；

Taqman探针序列：5’-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3’。

实施例2：

定量标准品的构建与制备

实验步骤

1.定量标准品的构建

利用RT-PCR方法克隆得到含有靶序列的HEV基因片段，重组到载体pET-28a中，并进行DNA序列测定。构建的重组质粒作为定量标准品，命名为pET28a-ORF2。

2.定量标准品的制备

质粒pET28a-ORF2用碱裂法进行提取纯化，根据紫外分光光度计测定的OD₂₆₀、OD₂₈₀和OD₂₃₀值计算质粒浓度，检测质粒的纯度，并根据阿伏伽德罗常数换算成拷贝数。

计算公式如下：

质粒浓度(μg/μl)＝OD₂₆₀×稀释倍数×50/1000

质粒拷贝数＝A*N/1000M

A：代表质粒浓度(μg/μl)；

M：代表质粒分子量；

N：代表阿伏伽德罗常数(6.02×10²³/mol)

实施例3：

病毒样本中病毒的分离与浓缩

实验步骤

1.病毒提取和浓缩

(1).用PH 7.4的PBS与戊肝患者急性期的粪便标本充分振荡混匀，制成10％的粪便悬液。若样品病毒含量较高，直接继续步骤2；若病毒含量较低则继续以下步骤：

(2).4℃，8000rpm离心10min后取上清；

(3).4℃，12000rpm继续离心15min，取上清；

(4).上清中加入加适量PEG 6000和氯化钠，4℃静置过夜；

(5).4℃，12000rpm离心15min后获得沉淀，沉淀用Trizol提取RNA。

2.病毒核酸提取

(1).每150μl的10％的粪便悬液或每1ml的病毒悬液沉淀物加1ml Trizol，充分混匀裂解；

(2).加200μl氯仿，振荡混匀30s；

(3).4℃，12000rpm离心5min，上清转入无RNA酶的1.5ml离心管中；

(4).加入等体积异丙醇，室温放置5min；

(5).4℃，12000rpm离心5min，小心弃上清；

(6).加入700μl 70％的乙醇洗涤沉淀一次；

(7).重复步骤(6)一次；

(8).沉淀室温干燥；

(9).加入30μl含RNasin(2U/μl)的DEPC-H₂O，充分溶解提取的病毒核酸。

实施例4：

样本RNA的逆转录

实验步骤

1.取核酸样品5μl、负链引物1.5μl及DEPC-H₂O 3.5μl，轻轻混匀；

2.70℃作用5min，立即冰浴2min；

3.加入5×逆转录Buffer 6μl，10mmol/L dNTP 2μl，RNasin 1μl(80U/μl)，M-MLV逆转录酶1μl(200U/μl)，DEPC-H₂O 10μl，温和混匀后42℃反应30min(注：逆转录反应体系见表1)；

4.90℃作用30s灭活逆转录酶，获得cDNA；

5.cDNA产物采用建立的实时荧光PCR反应体系进行定量检测。

表1.逆转录反应体系

反应试剂	体积(μl)	终浓度
			5×逆转录Buffer	6	1×Buffer
引物	1.5	1μmol/μl
			dNTP	2	0.67mmol/μl
RNasin	1	2.67U/μl
			M-MLV逆转录酶	1	6.67U/μl
核酸模板	5
			DEPC-H2O	13.5
总体积	30

实施例5：

戊型肝炎病毒特异性定量PCR方法的优化和建立

实验步骤

1.绝对定量标准曲线的建立

(1).质粒标准品制备

质粒pET28a-ORF2用碱裂法进行提取纯化，根据紫外分光光度计测定的OD₂₆₀、OD₂₈₀和OD₂₃₀值计算质粒浓度，检测质粒的纯度，并根据阿伏伽德罗常数换算成拷贝数。

(2).定量PCR反应条件优化

通过对反应体系中不同浓度的Mg²⁺、定量PCR引物、Taqman探针、dNTP等的实验结果进行比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增荧光信号曲线、反应效率接近于1的反应体系。本发明使用的荧光定量PCR仪为Corbett research公司的Rotor Gene3000。荧光检测的程序设置在每个循环第二步结束时检测荧光信号，检测波长为：510nm。

定量PCR循环采用两步法，退火和延伸同步进行。

循环条件为：

循环数(Cycles)	温度(℃)	时间
			1	94℃	3min
40	94℃	10sec
			60℃	30sec

反应体系的筛选：

试剂	浓度选择
		Mg2+	3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L
定量PCR引物	0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L
		Taqman探针	50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L
dNTP	0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L

经优化后的定量PCR反应体系(25μl反应体系)：

反应试剂	体积(μl)	终浓度
			5×Real-Time PCR Buffer	5	1×Buffer
MgCl2(25mmol/L)	5	5mmol/L
			dNTP(10mmol/L)	0.75	0.3mmol/L
上游引物(20μmol/L)	0.5	0.4μmol/L
			下游引物(20μmol/L)	0.5	0.4μmol/L
Taqman探针(20μmol/L)	0.125	150nmol/L
			Ex Taq HS(5U/μl)	0.125	0.025U/μl
模板	5
			H2O	补水至总体积25μl

(3).绝对定量的扩增标准曲线建立

用灭菌双蒸水10倍梯度稀释质粒定量标准品pET28a-ORF2。稀释后质粒浓度分别为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies/μl。采用经优化后的反应体系进行反应，反应条件为：94℃预变性3min；94℃10s，60℃30s，共40个循环。检测结束后利用荧光PCR自带的软件(Rotor gene version 6.0.38)，根据噪声情况设定和调整基线和阈值，绘制标准曲线(图1)。

本检测方法在10⁰～10⁸copies/reaction数量级范围内具有良好的线性关系，相关系数R＝0.9995，其检测范围可达9个数量级，其灵敏度可到10拷贝以下(图2)。

检测反应管中病毒cDNA拷贝数的计算公式：conc＝10^{(-0.307×CT+14.069)}；

样品中病毒浓度的计算公式：

样品病毒载量(copies/mg)＝conc×样品稀释度/YM(注：conc代表检测体系中的病毒拷贝数；Y代表cDNA合成效率；M代表样品质量：mg)。

2.稳定性分析

从批间重复性和批内重复性两个方面进行评价建立的荧光定量PCR反应体系的稳定性。

(1).批内重复性检验：

选取同一份标本，按照实施例II和实施例III所述的方法提取病毒核酸并进行逆转录反应。采用经优化的反应体系和反应条件设置10个平行反应管同时进行反应，利用统计学方法检验其C_T值的变异系数。批内重复性检测的C_T值变异系数(CV)为1.49％。

(2).批间重复性检验：

选取2个不同浓度的质粒标准品，采用实施例IV所述的反应体系和条件，一周内重复检测5次，利用统计学方法检验其C_T值的变异系数。批间重复性C_T值的变异系数(CV)分别为1.98％和2.23％。表明本发明建立的检测方法具有良好的稳定性和重复性。

3.特异性分析

为检验建立的荧光定量PCR方法的适用性，本研究选择了7个标本进行检测：3份RT-nPCR检测呈阳性的人的粪便标本，3份健康标本以及1份甲型肝炎病毒标本。按照实施例II和实施例III所述的方法提取病毒核酸并获得一链cDNA模板，采用经优化的反应体系进行定量检测。对上述标本的定量结果显示，3份阳性标本的病毒载量分别为：3.8×10²、5.4×10²和1.1×10³copies/mg，其余标本无扩增信号均为阴性结果。

4.检测结果判定及病毒的定量

(1).阳性对照的C_T值应小于30.0，阴性对照的C_T值应大于35.0。阳性模板为质粒定量标准品pET28a-ORF2，阴性模板为无菌双蒸水；

(2).若C_T值小于30.0，且呈现典型的扩增曲线，则判断为阳性结果，表明检测样品中含有HEV病毒核酸；

(3).若C_T值大于35.0或无扩增信号，则判断为阴性结果，表明检测样品种无HEV病毒核酸；

(4).若C_T值在30.0～35.0之间，则视为可疑结果，样本需重复检测一次。若结检测果仍在此范围内，则判断为阴性结果；

(5).结果呈阳性的样本，根据其C_T值以及建立的定量的标准曲线计算样本内的HEV病毒载量。

计算公式如下：

待测样品病毒滴度(copies/mg)＝10^{(-0.307×CT+14.069)}X/YM

(X：代表样品稀释度；Y：代表cDNA合成效率；M：代表样品质量mg)。

Claims (6)

1.一种戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征在于检测方法步骤如下：

(1).病毒特异性定量PCR引物和探针设计，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，在Genbank中检索戊型肝炎病毒全序列，通过生物信息学比对分析，选取序列保守片段，应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一对PCR引物和Taqman探针，探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA，引物和探针位于戊型肝炎病毒ORF2区域，目的扩增片段为151bp，扩增序列为：

GAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCT

引物和探针序列为：

上游引物：HEV-1(+)：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT；

下游引物：HEV-2(-)：AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG；

Taqman探针序列：5’-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3’；

(2).定量标准品的构建

根据确定的PCR引物，利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体pET-28a中，构建的重组质粒pET28a-ORF2作为检测戊型肝炎病毒滴度的定量标准品；

(3).样本中戊型肝炎病毒的分离及其RNA的提取，并针对病毒含量较低的样本用聚乙二醇和氯化钠进行浓缩，提高检测的灵敏度；

(4).对提取的样本RNA进行逆转录反应，获得样本cDNA；

(5).定量检测方法的优化和建立

通过筛选不同的Mg²⁺浓度、引物浓度、Taqman探针浓度，选择具有高灵敏度、合适反应效率的反应体系和反应条件。并通过对反应体系的灵敏度、稳定性和特异性等指标对建立的荧光定量PCR方法进行综合评价；

(6).经过对临床标本的检测进行应用评估，验证建立的荧光定量PCR的可靠性。

2.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，

其特征在于标准阳性模板核苷酸序列为：

GAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCT

3.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征是所述的病毒特异性定量探针，指的是长度为21 bp的寡聚核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征是所述的探针序列为CCGCATGACATCGACCTCGGG。

5.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征是所述的探针5’端标记的荧光报告基团是FAM。

6.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征是所述的3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

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