实施例1:
1.检测探针与检测引物的设计与选择
1.1检测引物与检测探针的设计
1.1.1检测引物和检测探针设计原则
根据TaqMan荧光探针PCR检测方法,确定了以下引物和探针设计原则:
(1)引物和探针的长度:每条引物长度为18~25个碱基,荧光探针长度为20~30个碱基。
(2)引物和探针中GC%要求在30%~70%,且荧光探针的Tm值应高于引物的Tm值5℃以上。
(3)引物和探针自身、引物和探针之间的3'端尽可能避免碱基配对。
(4)引物和探针自身、引物和探针之间尽可能避免6对以上的连续碱基配对。
(5)选用的引物和探针要求设计在靶基因中的保守区,和其它物种无交叉反应。探针位于一对引物之间的区域。
1.1.2引物和探针的设计
遵循上述设计原则,对基因III型戊型肝炎病毒序列(Genebank登陆号为:KU513561.1)结合其它基因型戊型肝炎病毒序列进行分析,针对病原体设计三组引物和探针。探针的5’端标记有荧光报告基团FAM,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ-1。
将设计的引物和探针分别命名为:引物HEV-F1(如SEQ ID NO.1所示)和HEV-R1(如SEQ ID NO.2所示)及对应的探针HEV-P1(如SEQ ID NO.3所示)。引物HEV-F2(如SEQ IDNO.4所示)和HEV-R2(如SEQ ID NO.5所示)及对应的探针HEV-P2(如SEQ ID NO.6所示)。引物HEV-F3(如SEQ ID NO.7所示)和HEV-R3(如SEQ ID NO.8所示)及对应的探针HEV-P3(如SEQ ID NO.9所示)。
1.2阳性对照品的建立
本发明的阳性对照品为化学合成的含目的扩增片段序列的质粒。
将合成的质粒分别命名为HEV-Z1(携带有以HEV-F2和HEV-R2作为引物,基因III型戊型肝炎病毒作为模板扩增的如SEQ ID NO.10所示的序列、HEV-Z2(含有以HEV-F2和HEV-R2作为引物,基因III型戊型肝炎病毒作为模板扩增的目的扩增片段)、HEV-Z3(含有以HEV-F3和HEV-R3作为引物,基因III型戊型肝炎病毒作为模板扩增的目的扩增片段)。
将浓度为1×1012copies/mL的质粒HEV-Z1、HEV-Z2和HEV-Z3分别稀释100000倍,分别得到浓度为1×107copies/mL的质粒HEV-Z1、HEV-Z2和HEV-Z3,然后分别进行10倍梯度稀释,得到质粒浓度为1×107copies/mL、1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL的阳性对照品。
1.3引物和探针的选择
用步骤1.1.2设计的三组引物和对应的探针对稀释好的对应的阳性对照品进行实时荧光逆转录PCR扩增。具体为:以HEV-F1和HEV-R1作为引物,HEV-P1作为探针,梯度稀释的质粒HEV-Z1作为模板进行实时荧光逆转录PCR扩增;以HEV-F2和HEV-R2作为引物,HEV-P2作为探针,梯度稀释的质粒HEV-Z2作为模板进行实时荧光逆转录PCR扩增;以HEV-F3和HEV-R3作为引物,HEV-P3作为探针,梯度稀释的质粒HEV-Z3作为模板进行实时荧光逆转录PCR扩增。确定最佳引物/探针组。
1.3.1检测样本
取步骤1.2中梯度稀释的3组质粒分别作为各自对应的引物/探针的检测样本(模板)。
1.3.2 PCR反应体系
根据实验室以往的研究经验,将PCR反应体系配置为25μL体系,其反应体系见表3:
表3实时荧光逆转录PCR反应体系
a:分组
共3组,即3组不同的引物/探针组合,每组检测4个对应梯度稀释的阳性对照品,每个检测做2个复孔。
组1:以HEV-F1和HEV-R1作为引物,HEV-P1为探针,浓度为1×107copies/mL、1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL的HEV-Z1质粒作为模板。
组2:以HEV-F2和HEV-R2作为引物,HEV-P2为探针,浓度为1×107copies/mL、1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL的HEV-Z2质粒作为模板。
组3:以HEV-F3和HEV-R3作为引物,HEV-P3为探针,浓度为1×107copies/mL、1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL的HEV-Z3质粒作为模板。
b:实时荧光逆转录PCR反应条件设置
根据试验以往研究经验,将实时荧光逆转录PCR反应条件设置为:45℃10min;95℃15min;95℃15s,60℃1min(荧光采集),40cycles。
1.3.3检测结果
表4戊型肝炎病毒检测结果
注:“+”表示检测结果为阳性,“-”表示检测结果为阴性。
由检测结果(表4)和扩增曲线图(图1~图3)可知,本实施例设计的3组引物及对应的探针,均符合要求,且引物HEV-F1/HEV-R1以及探针HEV-P1的检测灵敏度最高,为最优组合。
2.实时荧光逆转录PCR反应体系的优化
2.1引物/探针用量研究
将步骤1.3中确定的最优引物/探针组合(引物HEV-F1/HEV-R1以及探针HEV-P1)分别作为引物和探针,以HEV-Z1质粒作为模板来确定反应体系中引物/探针的用量。
2.1.1引物/探针用量
1)引物/探针用量分组
根据实验室以往的研究经验,设置3组,分别为:
组1:引物HEV-F1/HEV-R1各0.5μL;探针HEV-Z1 0.2μL。
组2:引物HEV-F1/HEV-R1各0.5μL;探针HEV-Z1 0.1μL。
组3:引物HEV-F1/HEV-R1各0.5μL;探针HEV-Z1 0.05μL。
2)反应体系设置
根据实验室以往的研究经验,PCR反应体系配置为25μL体系,3组的反应体系设置见表5。
表5 3组实时荧光逆转录PCR反应体系
2.1.2检测样本
以HEV-F1和HEV-R1为引物,HEV-P1为探针,取步骤1.2中制备的梯度稀释的浓度为1×107copies/mL、1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL的HEV-Z1质粒作为检测样本(模板)。每组样本重复2次。
2.1.3反应条件
根据试验以往研究经验,将PCR反应条件设置为:45℃10min;95℃15min;95℃15s,60℃1min(荧光采集),40cycles。
2.1.4检测结果及扩增曲线
表6检测结果
由上述检测结果(表6)和扩增曲线图(图4)可以看出:只有组2的各样本检测阳性率均为100%,组2的引物/探针用量为本发明试剂盒内的引物/探针的最佳用量。
2.1.5结论
根据以上的研究结果,确定引物和探针用量分别为:各引物在反应体系中的终浓度为0.4μM;探针在体系中的终浓度为0.08μM。
2.2镁离子用量研究
按照步骤2.1中确定的引物/探针的用量来确定最佳的镁离子用量。
2.2.1镁离子用量
1)镁离子用量分组
根据实验室以往的研究经验,设置3组,分别为:组1:Mg2+在反应体系中的终浓度为3mM。组2:Mg2+在反应体系中的终浓度为2.5mM。组3:Mg2+在反应体系中的终浓度为2mM。
2)反应体系设置
表7 3组实时荧光逆转录PCR反应体系
2.2.2检测样本
以HEV-F1和HEV-R1为引物,HEV-P1为探针,取步骤1.2中的梯度稀释的浓度为1×107copies/mL、1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL的HEV-Z1质粒作为检测样本(模板)。每组样本重复2次。
2.2.3反应条件
根据试验以往研究经验,将PCR反应条件设置为:45℃10min;95℃15min;95℃15s,60℃1min(荧光采集),40cycles。
2.2.4检测结果及扩增曲线
表8检测结果
由上述检测结果(表8)和扩增曲线图(图8)可以看出:组1和组2各样本检测阳性率均为100%。但是Mg2+浓度过高时,可能会影响其特异性,因此我们选择Mg2+浓度较低的组2作为最佳的镁离子浓度。
2.2.5结论
根据以上的研究结果,确定镁离子在反应体系中的终浓度为2.5μM。
2.3反应条件研究
按照步骤2.1中确定的引物/探针用量和步骤2.2中确定的镁离子用量来确定最佳的反应条件。
2.3.1反应条件分组:
反应条件1:45℃10min;95℃15min;95℃15s,58℃1min(荧光采集),40cycles。
反应条件2:45℃10min;95℃15min;95℃15s,60℃1min(荧光采集),40cycles。
反应条件3:45℃10min;95℃15min;95℃15s,62℃1min(荧光采集),40cycles。
2.3.2检测样本
以HEV-F1和HEV-R1为引物,HEV-P1为探针,取步骤1.2中制备的梯度稀释的浓度为1×107copies/mL、1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL的HEV-Z1质粒作为检测样本(模板)。
2.3.3 PCR反应体系设置
根据步骤2.1和2.2确定的最佳引物/探针用量及镁离子用量,PCR反应体系设置见表9。
表9实时荧光逆转录PCR反应体系
2.3.4检测结果及扩增曲线
表10检测结果
注:“+”表示检测结果为阳性,“-”表示检测结果为阴性。
由上述检测结果(表10)和扩增曲线图(图6~8)可以看出:反应条件2中全部样品检测均为阳性,因此我们选择反应条件2的反应参数作为检测试剂盒的反应条件。
2.4试剂盒内阴性、阳性对照品研究
确定试剂盒内的阴性、阳性对照品,保证结果真实可靠。
2.4.1阳性对照品
1)样品:将浓度为1×107copies/mL、1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL的HEV-Z1质粒等体积混合作为阳性对照品。
2)分组:共2组,每组每个样本做2个重复。组1:正常组:正常反应混合液,即现配制的反应混合液(不加模板)。组2:模拟失控组:反应混合液失效或效能下降,即反应混合液(不加模板)37℃放置7天。
2.4.2阴性对照品
1)样品:阴性对照品(DEPC-ddH2O)1份。
2)分组:共2组,每组每个样本做2个重复。组1:正常组:正常反应混合液,即现配制的反应混合液(不加模板)。组2:模拟失控组:正常反应混合液(不加模板),取1μL阳性对照品加入到反应混合液中。
2.4.3反应体系及条件设置
2.4.3.1根据步骤2.1和2.2确定的最佳引物/探针用量及镁离子用量,反应体系设置见表11。
表11实时荧光逆转录PCR反应体系
2.4.3.2 PCR反应条件设置:45℃10min;95℃15min;95℃15s,60℃1min(荧光采集),40cycles。
2.4.4 PCR检测
用正常组和模拟失控组的PCR反应体系,检测阳性对照品和阴性对照品。
2.4.5检测结果
2.4.5.1阳性对照品检测结果
表12阳性对照品检测结果
注:“+”表示检测结果为阳性,“-”表示检测结果为阴性。
2.4.5.2阴性对照品检测结果
表13阴性对照品检测结果
注:“+”表示检测结果为阳性,“-”表示检测结果为阴性。
2.4.5.3结论
从上述的表12和表13数据可知,模拟失控组的结果都是不正常的,而模拟失控组的抽提试剂或检测试剂的确是配制不正确,因此说明这种质量检验方法可以监控产品的质量。
产品中的质控方法用阳性对照品和阴性对照来监控结果的可靠性,意义如下:
(1)阳性对照品可以监控试剂的有效性以及操作的正确性等;
(2)阴性对照可以监控试剂、模板、环境等的阳性污染。
3试剂盒性能研究
3.1灵敏度实验
3.1.1阳性质粒稀释
经计算,HEV-Z1质粒原液的DNA拷贝数浓度为1×1012copies/mL。将原液分别按表14进行稀释。
表14质粒浓度
3.1.2分组
以稀释好的阳性质粒为检测样本(模板),每个浓度样本重复2次。
3.1.3反应体系
表16实时荧光逆转录PCR反应体系
3.1.4反应条件
45℃10min;95℃15min;95℃15s,60℃1min(荧光采集),40cycles。
3.1.5检测结果及扩增曲线
表17检测结果
由上述检测结果(表17)和扩增曲线图(图9)可以看出:样本浓度为1×103copies/mL时,阳性检出率为100%;当样本浓度为5×102copies/mL时,样本阳性率为0%。因此,我们选择1×103copies/mL作为本发明的戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测试剂盒的分析灵敏度。
3.2特异性实验
以HEV-F1/HEV-R1作为引物,HEV-P1作为探针,分别对基因I型、II型、III型和IV型戊型肝炎病毒及猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、烟草花叶病毒和流感病毒进行实时荧光逆转录PCR扩增,每种样本重复2次。
3.2.1反应体系
表18实时荧光逆转录PCR反应体系
3.2.2反应条件
45℃10min;95℃15min;95℃15s,60℃1min(荧光采集),40cycles。
3.2.3检测结果及扩增曲线
表19检测结果
由上述检测结果(表19)和扩增曲线图(图10)可以看出:基因I型、II型、III型和IV型戊型肝炎病毒的检测结果均为阳性,猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、烟草花叶病毒和流感病毒的检测结果均为阴性,说明本发明的检测试剂盒能够同时检测四种不同基因型戊型肝炎病毒,且具有高度的特异性。
4.研制总结
通过对引物/探针的序列设计与选择、引物探针用量、镁离子用量、反应条件和阴/阳性对照品等的研究,确定了本发明的戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测试剂盒的最佳引物/探针组、扩增体系和反应条件,并对其进行了分析灵敏度和特异性的分析。
4.1引物和探针的设计与选择:通过生物信息学分析及实验验证,最终戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测试剂盒最终的引物/探针,具体序列见表1。
4.2反应体系
4.2.1对试剂盒主要反应体系中的引物/探针用量、镁离子用量的研究,确定了最终的反应体系(见表20)。
表20实时荧光逆转录PCR反应体系
4.2.2通过反应条件的研究,确定本试剂盒的最终反应条件为:45℃10min;95℃15min;95℃15s,60℃1min(荧光采集),40cycles。
4.2.3通过对试剂盒内阴性、阳性对照品的研究,确定了试剂盒内的质控品设置:阳性对照品为携带如SEQ ID NO.10所示序列的质粒;阴性对照品为DEPC-ddH2O。
5.试剂盒灵敏度和特异性性能评估
经研究,确定本试剂盒的分析灵敏度为1×103copies/mL,且具有很好的特异性。
序列表
<110> 广州机场出入境检验检疫局综合技术服务中心
<120> 戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
<160> 10
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgcttttgc ctatgctg 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttggttgg atgaatatag g 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agaatcaacc ctgtcacc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcccggtcag ccgtctgg 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgaccgggt tgattctcag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggttccggc ggtggtttct 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaatgctcag caggataagg gt 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agctcggagg acagaaaaag g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccgcatgaca tcgacctcgg g 21
<210> 10
<211> 148
<212> DNA
<213> 基因III型戊型肝炎病毒
<400> 10
gtgcttttgc ctatgctgcc cgcgccaccg gccggtcagc cgactggccg ccgtcgtggg 60
cggcgcagcg gcagtgccgg cagtggtttc tggggtgaca gggttgattc tcagcccttc 120
gccctcccct atattcatcc aaccaacc 148