CN107916302A - 戊型肝炎病毒检测试剂盒及其应用 - Google Patents

戊型肝炎病毒检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种包括：戊型肝炎病毒上游引物、戊型肝炎病毒下游引物、戊型肝炎病毒探针，所述戊型肝炎病毒探针的结构为5’‑第一荧光报告基团‑第一碱基序列‑荧光淬灭基团‑3’。本发明提供的戊型肝炎病毒试剂盒可以快速检测戊型肝炎病毒，检测结果准确可靠，可用于戊型肝炎病毒的快速诊断。

Description

戊型肝炎病毒检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种戊型肝炎病毒检测试剂盒及其应用。
背景技术
戊型肝炎(Hepatitis E)是一种经粪-口传播的急性传染病。自1955年印度由水源污染发生了第1次戊型肝炎大暴发以来，先后在印度、尼泊尔、苏丹、吉尔吉斯斯坦及我国新疆等地都有流行。1989年9月，东京国际HNANB及血液传染病会议正式命名了戊型肝炎，其病原体戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)在分类学上属于戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属。
戊型肝炎的传播途径和临床表现与甲型肝炎相似。HEV随病人粪便排出，通过日常生活接触传播，并可经污染的食物、水源引起散发或暴发流行。戊型肝炎发病高峰多在雨季或洪水后。HEV的潜伏期为2～11周，平均6周。临床患者多为轻中型肝炎，常为自限性，不发展为慢性HEV。HEV主要侵犯青壮年，65％以上发生于16～19岁年龄组，儿童感染表现亚临床型较多。戊型肝炎成人病死率高于甲型肝炎，尤其孕妇患戊型肝炎病情严重，在妊娠的后3个月发生感染病死率达20％。HEV感染后可产生免疫保护作用，防止同株甚至不同株HEV再感染。有人报告绝大部分患者康复后血清中抗HEV抗体持续存在4-14年。
戊型肝炎实验诊断可通过电镜从粪便中找病毒颗粒、逆转录PCR检测粪便或胆汁中HEV-RNA；或者用重组HEV-谷胱甘肽－S-转移酶融合蛋白作抗原，进行ELISA检查血清中抗HEV IgM，IgG抗体等。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种戊型肝炎病毒检测试剂盒及其应用。以实现对样本中的戊型肝炎病毒的快速检测以及戊型肝炎的快速诊断。
为实现上述目的及其他相关目的，第一方面，本发明提供了一种戊型肝炎病毒检测试剂盒，包括：戊型肝炎病毒上游引物、戊型肝炎病毒下游引物、戊型肝炎病毒探针，所述戊型肝炎病毒探针的结构为5’-荧光报告基团-第一碱基序列-荧光淬灭基团-3’。
于本发明的一个实施例中，所述戊型肝炎病毒检测试剂盒还包括内部对照品和/或阳性对照品。
于本发明的一个实施例中，所述戊型肝炎病毒上游引物的碱基序列如SEQ IDNO.1所示，具体为：5’-CTCGTGTTTCTGCCTATG-3’；所述戊型肝炎病毒下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-GGGTTGGTTGGATGAATA-3’。
于本发明的一个实施例中，所述第一碱基序列的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5’-TGAGAATCAACCCGGTCACCC-3’。
于本发明的一个实施例中，所述荧光报告基团为FAM，或HEX/VIC/JOE，或Cal Red610/ROX/TEXAS RED。
于本发明的一个实施例中，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
于本发明的一个实施例中，戊型肝炎病毒检测试剂盒还包括Taq酶和逆转录酶。
于本发明的一个实施例中，戊型肝炎病毒检测试剂盒还包括DEPC水。
第二方面，本发明还提供了第一方面所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒在制备用于检测戊型肝炎病毒的试剂中的用途。
进一步地，所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒用于制备检测粪便中的戊型肝炎病毒的试剂。
第三方面，本发明还提供了第一方面所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒在制备戊型肝炎诊断试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
可以快速检测戊型肝炎病毒，检测结果准确可靠，可用于戊型肝炎病毒的快速诊断。
附图说明
图1为戊型肝炎病毒检测试剂盒的灵敏度检测曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECμLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECμLARBIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODSIN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，SanDiego，1999；和METHODS IN MOLECμLAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
荧光RT-PCR技术是上世纪九十年代末才发展起来的新技术，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。目前已开发出利用荧光定量PCR技术针对甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎病毒的快速检测试剂盒。但尚无用该方法检测戊型肝炎病毒的相关技术。因此本发明实施例在荧光RT-PCR技术的基础上，建立了单管检测戊型肝炎病毒HEV的方法。
在本发明实施例中，采用Taqman荧光定量PCR原理，针对戊型肝炎病毒设计了特异性引物，用于扩增戊型肝炎病毒特异性核酸序列，同时设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，位于上下游引物之间。探针其5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明实施例采用的荧光定量PCR技术具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。
实施例1.戊型肝炎病毒检测试剂盒对标品中戊型肝炎病毒的检测
11、配制核酸荧光PCR检测混合液：
取戊型肝炎病毒上游引物0.5μl/test，下游引物0.5μl/test，探针0.1μl/test；内部对照品探针0.1μl/test；实时定量PCR(Realtime-PCR，RT-PCR)MIX 12.5μl/test；工艺用水4.3μl/test；混匀，得到戊型肝炎病毒核酸荧光PCR检测混合液。
其中，所述戊型肝炎病毒上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-CTCGTGTTTCTGCCTATG-3’；所述戊型肝炎病毒下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-GGGTTGGTTGGATGAATA-3’；所述戊型肝炎病毒探针的结构为5’-荧光报告基团-第一碱基序列-荧光淬灭基团-3’；其中，荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1，第一碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5’-TGAGAATCAACCCGGTCACCC-3’。在替换方案中，戊型肝炎病毒探针的荧光报告基团还可以为HEX/VIC/JOE，也可以为Cal Red 610/ROX/TEXASRED。内部对照品探针的荧光报告基团做相应调整。
内部对照品探针的荧光报告基团与戊型肝炎病毒探针的荧光报告基团不同，具体可以为HEX，在替代方案中所述内部对照品探针的荧光报告基团还可以为VIC/JOE。
RT-PCR MIX中含有dNTP、缓冲液等。
12、标本的核酸提取：
用商业化的病毒RNA抽提试剂盒提取标本中的总RNA。标本可以为疑似戊型肝炎患者的粪便。
13、配制PCR反应体系：
131、试剂配制：
取n×18μl步骤11制备的戊型肝炎病毒核酸荧光PCR检测混合液和n×1μl内部对照品，以及n×1μlRT-PCR酶(n为反应管数)，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。RT-PCR酶中包括热启动Taq酶和逆转录酶。
132、加样：
取步骤131制备的混合液20μl置于薄壁PCR管或PCR反应板中，然后将提取的标本的总RNA、阳性对照品、DEPC-H2O各5μl分别加入薄壁PCR反应管或PCR反应板中，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，离心数秒后立即进行PCR扩增反应。
133、PCR扩增：
将步骤132中的薄壁PCR管或PCR反应板置于定量荧光PCR仪上，循环参数可以为：
45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为25μl。
134、基线和阈值设定：
基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H2O检测荧光曲线的最高点。
135、质量控制：
阳性对照品和内部对照品须达到以下如表1所示的要求，否则实验无效。
表1
136、实验结果判断：
实验结果如表2所示。
表2
FAM通道Ct值 结果判断
1 UNDET或40 低于检测限，报告为阴性
2 ≤38 FAM通道报告为戊型肝炎病毒阳性，
3 38～40 复检一次,如仍为38～40,则报告为阴性
在实施例1中，使用荧光定量PCR实时定量检测戊型肝炎病毒，大大缩短检测时间，操作简便。特异性引物和和探针的设计保证了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的情况，检测结果准确可靠。
实施例2.戊型肝炎病毒检测试剂盒的灵敏度分析。
21、制备检测样品：
取1×107copies/ml的戊型肝炎病毒质粒(HEV-S1)按1：10、1：100、1：1000、1：10000稀释，获得HEV-S2(1×106copies/ml)、HEV-S3(1×105copies/ml)、HEV-S4(1×104copies/ml)、HEV-S5(1×103copies/ml)共5份作为戊型肝炎病毒检测样品。
22、配制试剂：
取实施例1中的步骤131制备的混合液20μl置于薄壁PCR管或PCR反应板中，然后将步骤12制备的各检测样品、阳性对照品、DEPC-H2O各5μl分别加入薄壁PCR反应管或PCR反应板中，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，离心数秒后立即进行PCR扩增反应。
23、PCR扩增：
将步骤132中的薄壁PCR管或PCR反应板置于定量荧光PCR仪上，循环参数可以为：
45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为25μl。
24、检测结果：
各检查样品的检测结果如表3所示。戊型肝炎病毒检测样品的灵敏度检测曲线如图1所示。
表3
戊型肝炎病毒 HEV-S1 HEV-S2 HEV-S3 HEV-S4 HEV-S5
结果 + + + + +
备注：+代表阳性结果，即检出了戊型肝炎病毒。
表3表明，对于戊型肝炎病毒，HEV-S1(1×107copies/ml)—HEV-S5(1×103copies/ml)均检测为阳性，表明该试剂盒检测戊型肝炎病毒的检测灵敏度能达到1×103copies/ml。
综上所述，本发明实施例提供的戊型肝炎病毒检测试剂盒利用荧光定量PCR实时定量检测戊型肝炎病毒，大大缩短检测时间，操作简便。特异性引物和和探针的设计保证了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的情况，检测结果准确可靠。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 杨兴林
<120> 戊型肝炎病毒检测试剂盒及其应用
<130> 174854
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgtgtttc tgcctatg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggttggttg gatgaata 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgagaatcaa cccggtcacc c 21

Claims (10)

1.一种戊型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，包括：戊型肝炎病毒上游引物、戊型肝炎病毒下游引物、戊型肝炎病毒探针，所述戊型肝炎病毒探针的结构为5’-荧光报告基团-第一碱基序列-荧光淬灭基团-3’。
2.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括内部对照品和/或阳性对照品。
3.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述戊型肝炎病毒上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-CTCGTGTTTCTGCCTATG-3’；
所述戊型肝炎病毒下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-GGGTTGGTTGGATGAATA-3’。
4.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述第一碱基序列的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5’-TGAGAATCAACCCGGTCACCC-3’。
5.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，或HEX/VIC/JOE，或Cal Red 610/ROX/TEXAS RED。
6.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
7.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括Taq酶和逆转录酶。
8.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括DEPC水。
9.权利要求1-8任一项所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒在制备用于检测戊型肝炎病毒的试剂中的用途。
10.权利要求1-8任一项所述的戊型肝炎病毒检测试剂盒在制备戊型肝炎诊断试剂中的用途。
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