CN104321443A - Hev测定 - Google Patents

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CN104321443A CN201380020435.6A CN201380020435A CN104321443A CN 104321443 A CN104321443 A CN 104321443A CN 201380020435 A CN201380020435 A CN 201380020435A CN 104321443 A CN104321443 A CN 104321443A
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T.W.迈尔斯
N.纽顿
E.拉斯曼
J.桑菲利珀
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H.维尔茨
X.吴
K.K.Y.扬
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Abstract

本申请公开了同时扩增HEV的基因型1,2,3和/或4的方法，其包括用与HEV的5’UTR区部分重叠的单一的非-简并正向引物和至少一种反向引物扩增HEV的基因型1,2,3和/或4。

Description

HEV测定
本发明涉及用于检测HEV感染的诊断试验，引物组，寡核苷酸组和试剂盒。
HEV感染引起戊型肝炎(hepatitis E)，一种急性病。HEV是无包被的、单链、正义RNA病毒，其属于肝病毒科(Hepeviridae)。引起人类感染的有四种主要的基因型，基因型1,2,3和4。HEV诊断试验对于已经排除了引起急性肝炎的其他因素的人们而言至关重要。
HEV的不同区域已在基于核酸的HEV试验设计中应用。通常使用HEV的ORF2和ORF3，通过核酸扩增检测HEV。JP04080995和JP04127722中提议将具有多简并位点的简并引物用于嵌套引物扩增法，所述方法基于部分定位于HEV的5’UTR区的引物的。
发明概述
本发明涉及同时扩增可能存在于生物样品中的HEV基因型1,2,3和/或4的方法，该方法包括步骤：
(a)分离生物样品中的核酸；
(b)利用一种非-简并正向引物和至少一种非-简并反向引物扩增步骤(a)中分离的核酸，其中，所述的正向和反向引物能扩增HEV的基因型1,2,3和4，
其中，所述正向引物的核酸序列包含Seq ID NO:6，所述的一种或以上反向引物的核酸序列包含选自SEQ ID NO:7-14的序列。
一方面，本发明涉及引物组，其包括正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:6，其中至少一种反向引物的核酸序列，或所述反向引物选自SEQ ID NO:7-14。
一方面，本发明涉及寡核苷酸组，其中，所述组由上述的引物组和一种探针组成，其中，所述的探针包含SEQ ID NO:15-19或其互补序列的至少20个连续的核苷酸。
一方面，本发明涉及上述的引物组或寡核苷酸组在同时检测可能存在于生物样品中的基因型1,2,3和/或4中的用途。
一方面，本发明涉及试剂盒，其包含依赖模板的DNA聚合酶，核苷酸，以及上述的引物组或寡核苷酸组。
附图简述
图1提供由液体样品分离核酸的工艺流程。
发明详述
本发明涉及同时扩增可能存在于生物样品中的HEV基因型1,2,3和/或4的方法，该方法包括步骤：
(a)分离生物样品中的核酸；
(b)利用一种非-简并正向引物和至少一种非-简并反向引物扩增步骤(a)中分离的核酸，其中，所述的正向和反向引物能扩增HEV的基因型1,2,3和4，
其中，所述正向引物的核酸序列包含Seq ID NO:6，一种或以上反向引物的核酸序列包含选自SEQ ID NO:7-14的序列。
在一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列包含Seq ID NO:6，所述的至少一种反向引物的核酸序列选自SEQ ID NO:7-14。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:6，所述两种反向引物的混合物的核酸序列包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成，所述反向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:7。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成，所述反向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:13。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成，所述反向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:11。
本发明的方法的有益之处在于，能够在单一反应中同时、有效地扩增HEV的基因型1,2,3和4。
一个具体实施方案中，所述核酸通过结合于固相被分离。
一个具体实施方案中，所述方法还包括使经扩增的核酸与探针在足以使得所述的探针结合于经扩增的核酸的条件下接触。在一个具体实施方案中，所述的探针包含SEQ ID NO:15-19或25的核酸序列或其互补序列的中的至少22-35个连续的核苷酸。在一个具体实施方案中，所述探针的核酸序列由选自SEQ ID NO:15-19或25或其互补序列的序列组成。在一个具体实施方案中，所述探针的核酸序列由选自SEQ ID NO:15-18或25或其互补序列的序列组成。在一个具体实施方案中，所述的探针包含与所述探针的5’端偶联的荧光团，和猝灭剂，其中，所述的荧光团和猝灭剂之间的间隔包含至少9个核苷酸。
本发明的方法的其他具体实施方案如下所述。
本发明还涉及同时扩增可能存在于生物样品中的HEV基因型1,2,3和/或4的方法，该方法包括步骤：
(a)分离所述样品中的核酸；
(b)利用一种非-简并正向引物和至少一种非-简并反向引物扩增步骤(a)中分离的核酸，其中，所述的正向和反向引物能扩增HEV的基因型1,2,3和4，
其中，所述正向引物的核酸序列包含Seq ID NO:6，一种或以上反向引物的核酸序列包含选自SEQ ID NO:7-14的序列，和
(c)检测在步骤(b)中获得的、经扩增的核酸作为生物样品中存在HEV的基因型1,2,3和4的至少一种的指示。
本申请所用的术语“检测”指对与存在所述经扩增的核酸相关联的信号的检测。检测可以是定量的或定性的。对经扩增的核酸的检测指示在生物样品中存在HEV基因型1,2,3和/或4的至少一种。
本申请所用的术语“同时检测”指在单一反应混合物中检测HEV不同基因型的方法设计。这需要所述方法中所用的引物和探针序列能够同时地产生针对可能存在于所述样品中的全部待测基因型的合理检测信号。当然，如果仅有一种基因型存在于所述样品中，该方法将仅检测这一种基因型，即使其能够在单一反应中检测GT1,GT2,GT3和/或GT4中的一种以上。
同时检测几种基因型(以下简称作GT)常常需要使用简并引物和探针，以保证全部待检测的基因型被检测出来，除非是有高度保守区域，其适合于设计用于扩增的非-简并引物和探针、允许全部基因型被检测出。这种区域并不是总能被发现。现有技术中发现了非5’UTR的区域，如适合设计用于检测HEV的测定的衣壳区。以上引述的现有技术建议使用来自5’UTR区的、用于嵌套引物法的简并引物，其中一些包含3个以上简并位点，并且是高度简并的。对高度简并引物的要求以及必需实施嵌套PCR显示现有技术中所公开的基于5’UTR检测的方法，不如应用来自ORF2或ORF3的保守区的引物序列的方法灵敏。本申请所用的术语“5’UTR”相应于靶序列，引物和扩增子，其至少部分地与HEV的所述5’UTR序列重叠。
术语“生物样品”指能够用于诊断测定靶核酸的材料，其通常衍生自生物源。在一些具体实施方案中，所述的生物样品来自人，是体液。在本发明的一个具体实施方案中，所述的生物样品是人的血液，血浆，血清，尿，唾液，汗液，拭子，移吸的粪便，或脊髓液。所述的生物样品也可以是能从中提取核酸的组织。
本申请所用的术语”非-简并”指其中的每个位置由单一的核苷酸，即A,G,T或C定义的引物或探针核酸。所述的非-简并引物或探针是通过现有技术中已知的方法化学合成的，并且可以是经纯化的。
本申请所用的术语“简并”指其中的具体位置不是由单一的，特定核苷酸定义的引物或探针核酸。因此，在这种简并位置中，所述的引物或探针序列可以是至少两个不同的核苷酸中的一个。这种位置通常代表靶核酸基因型中的差异。简并序列也可以表示多个非-简并的单个序列的混合物，为本发明的目的，在至少两个位置中有差异。
使用非-简并引物和探针具有若干有益之处。一个有益之处在于使用非-简并引物检测四种基因型，在简并引物组合物中不同序列之间竞争导致的错误引导(mispriming)的风险，以及扩增的灵敏度均有改善。因此，为了鉴定多个基因型使用至少单一的非-简并正向或反向引物是可取的。在所述正向引物是非-简并的情况下，所述的互补引物——反向引物可包含一种非-简并引物，或者当所述反向引物是非-简并的情况下，所述的正向引物可包含一种非-简并引物。
本申请所用的术语“引物”和”探针”指寡核苷酸序列。在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指由大量的核苷酸以它们的单体单元形式形成的组分。术语“寡核苷酸”还包括经修饰的寡核苷酸，即所述的引物和/或探针包含经修饰的核苷酸或非-核苷酸化合物。术语“引物”还指在扩增反应中所用的、与靶序列退火的寡核苷酸。术语“探针”还指与靶核酸杂交的寡核苷酸，或用于定性或定量检测目的的扩增子。
就探针而言，修饰可包括染料，如FAM,HEX,JA270,CY5,CY5.5,CoμMarin等，和/或猝灭剂分子。染料分子可能与接头相偶联。但是，此类染料也可能存在于引物中。其他示例性的修饰包括3’端的磷酸基团。这种染料分子和/或猝灭剂分子可用于靶定核酸的检测。
对引物通常的修饰包括对其3’核苷酸的修饰以防止形成非特异性的扩增产物，如引物二聚体。此类修饰是本领域所公知的，包括作为非限定性示例的叔丁基苄基-dA或-丁基苄基-dC。此类修饰也包括在术语“引物”中。
由此，可以理解本申请所用的术语”正向引物”指引发核酸正义链的引物，其允许聚合酶沿着靶核酸的一条链的方向延伸，可以理解术语”反向引物”指引发核酸反义链的引物，其允许聚合酶沿着所述靶核酸的互补链的方向延伸，由此获得一端具有正向引物序列及其互补序列，在另一端具有反向引物序列及其互补序列的双链扩增子。在起始进行反转录(RT)步骤的反应中，所述的反向引物也作为用于反转录的RT引物。RT-PCR是本领域公知的技术。在一个具体实施方案中进行了RT步骤。
在一个具体实施方案中，使用了一种非-简并正向引物和至少一种非-简并反向引物。作为选择地，使用了一种非-简并反向引物和至少一种非-简并正向引物。在另一具体实施方案中，使用了一种非-简并正向引物和两种非-简并反向引物的混合物。作为选择地，使用了两种非-简并正向引物的混合物和一种非-简并反向引物。在一个具体实施方案中，所述的两种非-简并引物仅在单一核苷酸位置不同。其有益之处在于，可以在单一反应中弥补(becompensated for)不同基因型核苷酸序列中的差异，并将所述基因型检测出来，同时避免使用具有一个以上简并位置的引物的不利之处。
由此，可以理解，如果使用一种正向的和至少一种反向引物，则使用了单一的正向引物序列，同时可以使用一种或以上的反向引物序列。如果使用两种反向引物，则使用两种反向引物的混合物。作为选择地，如果使用一种反向引物和至少一种正向引物，则使用了单一的反向引物，同时可以使用一种或以上的正向引物。如果使用两种反向引物，则使用两种反向引物的混合物。
术语“扩增”指由靶核酸产生大量的核酸分子，其中，引物与靶核酸分子上的特定位点杂交，以提供聚合酶延伸的起始位点。扩增可通过本领域中任何公知的方法进行，例如但不限于：标准的PCR，长PCR(long PCR)，热起动PCR，qPCR，RT-PCR和等温扩增。一个PCR的实施方案是实时PCR，其是本领域公知的，将扩增和检测相结合。
在所述方法的一个方面中，正向引物的核酸序列选自SEQ ID NO:1-6，至少一种反向引物的核酸序列选自SEQ ID NO:7-14。这些正向和反向引物的不同组合所得的命中率(hit rates)如表3中所示。表5和表8示出本申请中所描述的、用于检测HEV基因型GT1,GT2,GT3和GT4的引物和探针序列。在一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列是SEQ ID NO:1,2,3,4或6。在更具体的实施方案中，所述正向引物的核酸序列是SEQ ID NO:2,3,4或6。在更具体的实施方案中，所述正向引物的核酸序列是SEQ ID NO:3,4或6。在更具体的实施方案中，所述正向引物的核酸序列是SEQ ID NO:6。
在具体的实施方案中，所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO:7,8,9,10,11,13或14组成。在更具体的实施方案中，所述反向引物的核酸序列是SEQ ID NO:8,9,10,11,13或14。在更具体的实施方案中，所述反向引物的核酸序列是SEQ ID NO:9,10,11,13或14。在更具体的实施方案中，所述两种反向引物的核酸序列由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成，所述反向引物的核酸序列由SEQ IDNO:11组成。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ IDNO:6组成，所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO:13组成。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成，所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO:7组成。
一方面，可能存在的GT1,GT2,GT3和/或GT4中的至少两个可在单一反应中被同时检测出来。在一个具体实施方案中，至少可能存在的GT1,GT2,GT3和GT4可在单一反应中被同时检测出来。在另外的具体实施方案中，可能存在的GT1,GT2,GT3和GT4可在单一反应中被同时检测出来。
一方面，所述的方法还包含分离所述的核酸，其中，在步骤(b)之前分离所述核酸，其中，经分离的核酸在步骤(b)中进行扩增。
术语“分离核酸”指从细胞或病毒颗粒释放核酸，已知称为裂解，然后富集所述的核酸。这种分离使得靶核酸与用于扩增的引物的接触几率提高，还可去除可能存在于样品中的后续扩增反应的潜在抑制剂。在一个具体实施方案中，通过与固相结合分离所述核酸。一种有用的结合核酸的过程需要选择性地使核酸结合于离液盐溶液中的结合颗粒(如磁性颗粒)的玻璃表面，并将所述的核酸与污染物，例如琼脂糖，蛋白质或细胞碎片分离。在一些具体实施方案中，所述颗粒的玻璃使利用WO 96/41811中所述的凝胶溶液(gel sol)加工，然后干燥并压缩。
在一个具体实施方案中，所述方法在步骤(b)和(c)之间，还包括(b1)使经扩增的核酸与探针，在足以使得所述探针与经扩增的核酸相结合的条件下，接触，
并且在步骤(c)中的检测包含
检测经扩增的靶核酸与所述探针的结合产物，作为所述生物样品中存在HEV基因型1,2,3和/或4中的至少一种的指示。
在具体的实施方案中，所述探针具有非-简并核酸序列。这也具有避免杂交过程中的错误引发或简并探针的探针分子之间的干扰的有益效果，并使得检测的灵敏度得以提高。所述的探针必需能够与利用正向和反向引物扩增产生的扩增子的序列杂交。在具体的实施方案中，所述的探针可以同不与引物序列重叠的扩增子的序列杂交。可以理解所述的扩增子指利用正向和反向引物扩增的至少一个步骤的产物。
一方面，所述的探针包含核酸序列SEQ ID NO:15-19或25或其互补序列的至少22到35个连续的核苷酸。
一个具体方面中，所述探针具有选自SEQ ID NO:15-19或25或其互补序列的核酸序列。这些探针在检测HEV基因型中的表现示于表4中。在一个具体实施方案中，所述的探针具有选自SEQ ID NO:15-18的核酸序列。在另外的具体实施方案中，所述的探针具有选自SEQ ID NO:15和18的核酸序列。
在本申请所描述的方法,引物组,寡核苷酸组的具体实施方案中包含下述的引物核酸序列的组合:SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:8,10,11,13或是混合有SEQ ID NO:14的SEQ ID NO:13的组合；SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:8,9,10,11,13或是混合有SEQ ID NO：14的SEQ ID NO:13的组合；SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:7,8,9,10,11,12,13或是混合有SEQ ID NO:14的SEQ IDNO:13的组合；SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:7,8,9,10,11,12,13或是混合有SEQ ID NO:14的SEQ ID NO:13的组合；SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:10,11或13或是混合有SEQ ID NO:14的SEQ ID NO:13的组合；SEQ ID NO:6与SEQID NO:7,8,9,10,11,12,13或混合有SEQ ID NO：14的SEQ ID NO:13的组合。SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:3或4或6的组合；SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:2,3或4或6的组合；SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:2,3,4,5或6的组合；SEQ IDNO:10与SEQ ID NO:1,2,3,4,5或6的组合；SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:1,2,3,4,5或6的组合；SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:3或4的组合。正向和反向引物的核酸序列组合的另外的具体实施方案是SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7的组合,SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:13的组合,SEQ ID NO:6与SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14的组合,和SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:11的组合。在一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成。在一个具体实施方案中，其核酸序列由SEQ ID NO:6组成的正向引物与下述反向引物组合，其中所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO:7组成。在另一个具体实施方案中，其核酸序列由SEQ ID NO:6组成的正向引物与下述反向引物组合，其中所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO:13组成。在另一个具体实施方案中，其核酸序列由SEQ ID NO:6组成的正向引物与下述反向引物组合，其中所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO:11组成。在另一个具体实施方案中，其核酸序列由SEQ ID NO:6组成的正向引物与下述两种反向引物的混合物组合，其中所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO:13和SEQID NO:14组成。
这些引物组,使用这些引物组的方法以及包含这些引物组的试剂盒的有益效果是，在没有不相关的微生物的交叉反应的单一反应中，有效地扩增并检测HEV的四种基因型1,2,3和4。另外的有益之处在于，所述的试验是简化的，这是因为全部的寡核苷酸可由特异的、非-简并序列合成。这样显著地提高了寡核苷酸的质量，以及所述方法的灵敏度和特异性。而且，由于除了内部对照寡核苷酸之外，仅有三到四种HEV特异性的寡核苷酸(包括探针)用于同时检测四种HEV基因型，不同寡核苷酸之间的交叉反应风险被最小化。由于无需分别鉴定不同的HEV基因型，仅运行单一试验即可确定样品中是否存在四种HEV基因型中的任意基因型，本发明的引物组,寡核苷酸和试剂盒是有成本效益的。
上述引物组合的具体实施方案还可以与具有选自SEQ ID NO:15-19和21的核酸序列的探针相组合。在一个具体实施方案中，所述探针的核酸序列选自SEQ ID NO:15-18。在另一个具体实施方案中，所述探针的核酸序列选自SEQ ID NO:15或18。在一个具体实施方案中，所述探针的核酸序列由SEQID NO:15组成。在一个具体实施方案中，所述探针的核酸序列由SEQ ID NO:18组成。
表1A到C显示利用500cp/ml靶检测GT3或GT1,GT3和GT4时，与衣壳(ORF2)区域中的非-简并引物和探针相比，利用本发明的方法，引物，探针，用途和试剂盒在5’UTR中获得了更好的命中率。(GT表示基因型)
HEVGT15’UTR的代表性序列是SEQ ID NO:38，对于HEVGT25’UTR是SEQ ID NO:39，对于HEVGT35’UTR是SEQ ID NO:40，对于HEVGT45’UTR是SEQ ID NO:41。HEVGT1衣壳的代表性序列是SEQ ID NO:42，对于HEVGT2衣壳是SEQ ID NO:43，对于HEVGT3衣壳是SEQ ID NO:44，对于HEVGT4衣壳是SEQ ID NO:45。
在一个具体的方面，所述的探针包含与所述探针的5’端相偶联的荧光团，和猝灭剂，其中，所述荧光团和猝灭剂之间的间隔包含至少9个核苷酸。术语“间隔”指荧光团和猝灭剂之间的核苷酸数量。在另一具体方面中，所述的探针在所述荧光团和猝灭剂之间包含至少10个或至少11个或至少12个核苷酸。在一个具体实施方案中，所述的探针在所述荧光团和猝灭剂之间包含12个核苷酸。
利用荧光团和猝灭剂偶联的探针进行检测是本领域所公知的实时核酸扩增检测方法。探针未结合状态下的荧光团和猝灭剂之间的能量转移导致激发的荧光团发射的荧光消失。在杂交的状态下，所述荧光团和猝灭剂相分隔，能量转移被阻止，造成从激发的荧光团发光。荧光团是染料，其在激发后发射特定波长的荧光。这些染料用于检测。荧光团的示例包括FAM,HEX,JA270,Cy5,Cy5.5,CoμMarin等。荧光团可通过接头分子与5’核酸偶联。这种接头分子是本领域公知的。非限定性的示例是苏糖型-HEX,苏糖型-FAM,苏糖型-JA270等。猝灭剂可属于Dark猝灭剂组。此种猝灭剂的非限定性示例是Dabcyl,Eclipse,BHQ1,BHQ2,BBQ650,TAMRA。在一个具体实施方案中，所述荧光团是FAM或苏糖型-FAM并且所述的猝灭剂是BHQ2。
表4和6显示通过增大荧光团和猝灭剂之间的间隔，获得了利用非-简并探针序列对GT4检测的更好的命中率。因此，在一个具体方面，所述探针包含由选自Seq ID NO.15到Seq ID NO.18和SEQ ID NO:25的核酸序列组成的核酸序列。
在一个具体实施方案中，所述的探针包含在第86位的T。表4-6显示在所述探针这一位置上的C妨碍全部三种基因型的检测。因此，在一个具体方面中，所述探针包含由选自Seq ID NO.15到Seq ID NO.18和SEQ ID NO:25的核酸序列组成的核酸序列。
在一个特定的方面中，在第75位的核苷酸是A。表4,6和7显示在该位置上是A的探针比在该位置上是G的探针具有更好的命中率。因此，在一个具体实施方案中，所述探针包含由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:18的核酸序列组成的核酸序列。
上述的方法的一个方面中，所述方法还包括，平行地，在被怀疑含有第二靶核酸的样品中检测第二靶核酸，其中所述的第二核酸在容器中被扩增和检测，其中HEV不被扩增和检测，HEV在所述第二核酸不被扩增和检测的容器中被扩增和检测，其中扩增和检测HEV的容器以及扩增和检测第二靶核酸的容器处于相同的热阻(thermal block)中并且在相同的条件下循环。由于可以在相同的批次中同时运行不同的试验，使得核酸试验系统的通量得到优化。
一方面中，本发明涉及引物组，其包含正向和至少一种反向引物,或至少一种正向和一种反向引物,其中所述正向引物的核酸序列或至少一种正向引物选自SEQ ID NO:1-6，其中所述反向引物的核酸序列或至少一种反向引物选自SEQ ID NO:7-14。本申请中公开了所述引物的具体实施方案以及它们的有益效果。
本发明的一方面涉及寡核苷酸组,其中，所述的组由本申请所述的引物组和一种探针组成,其中，所述的探针包含核酸序列SEQ ID NO:15-19或其互补序列的至少连续的20个核苷酸。本申请中公开了所述引物和探针的具体实施方案以及它们的有益效果。
一方面，本发明涉及所述的引物组或寡核苷酸组在同时检测生物样品中HEV基因型1,2,3和/或4中的用途。本申请中公开了引物组或寡核苷酸组用途的具体实施方案。
一方面，本发明涉及包含依赖模板的DNA聚合酶，核苷酸和本申请所述的引物组或寡核苷酸组的试剂盒。本申请中描述了所述引物或寡核苷酸的具体实施方案。
还公开了确定样品中是否包含一种或以上HEV基因型1,2,3和/或4的方法，其包括根据本申请所描述的方法扩增HEV基因型1,2,3和/或4的步骤。还公开了确定样品中是否包含一种或以上HEV基因型1,2,3和/或4的方法，其包括同时检测HEV基因型1,2,3和/或4是否存在于样品中的步骤。
实施例
样品的制备
通过现有技术中已知的方法制备用于HEVGT1,GT2,GT3和GT4的被壳(Armored)RNA，用作模板。
预先制备50cp/ml或500cp/ml的HEV基因型并储存过夜(血浆稀释物于-60到-90℃):
每个样品(850μl)分别移至深孔板中，用于三次分析。向每个包含样品的孔添加50μl的内部对照核酸。加入作为定性对照的对照RNA(IC/QS)(300被壳颗粒/样品)。
对照核酸的序列在全部试验中都是一致的，其选自SEQ ID NOs 46-49。
各对照核酸储存于下述缓冲液中：
IC/QS-储存缓冲液 浓度或pH
Tris(mM) 10
EDTA(mM) 0.1
叠氮化钠(w/v,％) 0.05
Poly rA RNA(mg/l) 20
pH 8
样品的制备自动进行，根据图1中所描述的流程图利用下述试剂进行：
蛋白酶试剂 浓度或pH
Tris(mM) 10
EDTA(mM) 1
氯化钙(mM) 5
乙酸钙(mM) 5
Esperase(mg/ml) 80
甘油(w/v,％) 50
pH 5.5
MGP试剂 浓度或pH
MPG粉末(mg/ml) 60
Tris(mM) 30
对羟基苯甲酸甲酯(w/v,％) 0.1
叠氮化钠(w/v,％) 0.095
pH 8.5
裂解试剂 浓度或pH
硫氰酸胍(M) 4
柠檬酸钠(mM) 50
Polydocanol(w/v,％) 5
二硫苏糖醇(w/v,％) 2
pH 5.8
清洗缓冲液 浓度或pH
柠檬酸钠(mM) 7.5
对羟基苯甲酸甲酯(w/v,％) 0.1
pH 4.1
最终步骤之后，向每一孔中加入含扩增试剂的各主混合物(master mixes，MMxs)，含经分离的核酸的洗脱物与所述MMx混合，将每一所得混合物转移到微孔板相应的孔中，在其中进行扩增反应。
扩增和检测
下述浓度、总体积50μl的两种溶液R1和R2用于扩增：
R1:16.73mM MnOAc,pH 6.1,和0.09％叠氮化钠pH 7.0.
R2:0.09％叠氮化钠pH 7.0,18％DMSO,400mM KOAc pH 7.0,10％甘油,0.05％Tween 20,200mM Tricine pH 8.0,0.7μM适体,10U UNG,1.333mM dGTP,1.333mM dATP,1.333mM dCTP,2.667mM dUTP,45U Z05D聚合酶(每个反应),0.667μM HEV正向引物,0.417μM HEV有义探针,0.333μM HEV反向引物；0.417μM对照正向引物(SEQ ID NO:50),0.417μM对照反向引物(SEQ ID NO:51),0.333μM对照探针(SEQ ID NO:52)。
在使用两种反向引物时，每种以0.333μM浓度使用。
使用了下述的PCR方案(PCR profile)：
热循环方案
所述Pre-PCR程序包含使RNA模板反转录起始变性和在55℃,60℃和65℃下温育。在三个温度下进行温育形成优势的结合，即在较低温度下轻微错配的靶序列(如生物体的遗传变体)也被转录，同时在较高温度下RNA二级结构的形成受到抑制，由此导致更有效的转录。
PCR循环分成两次测定，其中两次测定应用一步式编排(one-step setup)(将退火和延伸结合起来)。55℃下头5个循环通过预扩增轻微错配的靶序列使包容度(inclusivity)提高，而第二次测定中的45个循环通过应用58℃的退火/延伸温度提高专一性。
应用不同的引物和探针组合试验了HEV基因型1,2,3和4的扩增，并确定了命中率，使用的是500cp/ml HEV或50cp/ml HEV。结果如下表所示。
在针对全部基因型的检测中，5’UTR引物和探针比衣壳引物和探针在500cp/ml HEV下提供了一致更佳的命中率，尤其是针对GT3和GT4的检测(表1A到1C)。
表1A
衣壳,500cp/ml,GT3
表1B
500cp/ml:衣壳，不同的GTs
表1C
500cp/ml:UTR，不同的GTs
表1D显示对于500cp/ml HEV，衣壳引物/探针给出90％的命中率，在将所述靶核酸降至50cp/ml时，命中率显著降低。利用来自5’UTR区的引物/探针组合，即使在所述的靶降至50cp/ml的情况下，仍保持高命中率。
表1D:50cp/ml vs 500cp/ml
衣壳
表2显示应用500cp/ml HEV不同的正向和反向引物组合对HEV的GT3检测的命中率。如表2中所示，几种正向和反向引物对给出100％的命中率，而其他的组合也给出良好的命中率。
表2:
正向引物 反向引物 引物 命中率 命中率％
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:15 1/11 9
SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:15 0/11 0
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:15 0/11 0
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:15 9/11 82
SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:15 0/11 0
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 0/11 0
SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 0/11 0
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 2/11 18
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 8/11 73
SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 0/11 0
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:15 9/11 82
SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:15 3/11 27
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:15 9/11 82
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:15 3/11 27
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:15 11/11 11
SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:15 4/11 36
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:15 10/11 91
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:15 7/11 64
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:15 0/11 0
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:15 11/11 100
SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:15 9/11 82
SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:15 11/11 100
表3显示利用来自5’UTR区的不同正向和反向引物组合的扩增结果，几种组合即使在使用仅50cp/ml HEV的情况下，对GT3检测获得77-100％的高命中率。
表3:
50cp/mL,GT3
表4显示使用不同的探针与特定的正向引物与两种反向引物混合物的组合的试验结果。一个探针没有工作。其他全部的探针均对GT1检测给出高命中率，并在应用仅50cp/ml的情况下给出对GT3的略低的命中率。50cp/mlHEV的情况下对GT4的检测呈现差异，几种探针序列对GT4的检测给出高于50％的合理命中率，两种探针给出高于70％的良好GT4检测命中率以及高于90％的GT3检测命中率和100％的GT1检测命中率。
表4:探针UTR
表5显示所述的引物和探针序列检测全部四种HEV基因型,GT1,GT2,GT3和GT4。
表5
表6显示不同探针序列的比对。如下所示，不同的探针序列几乎同一。不同之处一方面在于探针内猝灭剂Q的不同位置。其他的差异代表不同基因型中的非-保守核苷酸。所述的差异位置也示于表7中。如表4所示，序列差异对比以及所获得的命中率显示并非全部这些位置均与探针序列的表现相关。第86位的T有利于探针序列的表现。第75位的A也对检测GT4时探针的表现起到有利的作用。而且，荧光团和猝灭剂之间间隔9个或以上的核苷酸改善HEV5’UTR探针的表现。
表6
表7
表8A显示利用SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的混合物的引物组合，以及SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:11的引物组合检测全部四种基因型GT1,GT2,GT3和GT4。如表中所示，在500cp/ml HEV下，全部四种基因型均被所述引物组合有效地扩增，对每一种基因型的命中率是100％。在50cp/ml HEV的较低浓度下，仍维持高命中率(hitrates)，全部四种基因型以75％到100％的命中率被扩增出来。相比之下，利用来自HEV相同区域的其他引物组合，如表8B中所示，利用500cp/ml HEV的情况下，仅gt 2,GT3和GT4得到有效扩增。在50cp/ml HEV下，并非全部的基因型均能被扩增。每个试验中，相应的内部对照的命中率为100％。
表8A
表8B显示对不同基因型的检测模式(detection patterns)，利用引物组合SEQ ID NO:4和8,SEQ ID NO:3和9在针对基因型3的高HEV滴度下获得了信号。表中显示了用500cp/ml和50cp/ml HEV对HEV基因型1,2,3,4的检测。对基因型2的识别通常好于对基因型1和3的识别。每个试验中，相应的内部对照的命中率为100％。
表8B
表9显示引物和探针组合SEQ ID NO:6,13,14,15(表9A)和SEQ ID NO:6,11,15(表9B)的交叉反应性测试结果。
在以上描述的条件下进行交叉反应性测试。使用了下述的微生物浓度：
草绿色链球菌(Streptococcus viridians)(口腔(oralis)):1.00E+06cfu/ml；HAV:1.00E+06cp/ml；HBV:1.00E+06IU/ml；HCV:1.00E+06IU/ml；NSC:阴性刺突对照:无添加微生物；PSC:阳性刺突对照:添加150cp/ml HEV。
IC指内部对照。
表9A
SEQ ID NO:6,13,14,15
表9B
SEQ ID NO:6,11,15

Claims (14)

1.同时扩增可能存在于生物样品中的HEV基因型1,2,3和/或4的方法，该方法包括步骤：
(a)分离生物样品中的核酸；
(b)利用一种非-简并正向引物和至少一种非-简并反向引物扩增步骤(a)中分离的核酸，其中，所述的正向和反向引物能扩增HEV的基因型1,2,3和4，
其中，所述正向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:6，所述一种或以上反向引物的核酸序列包含选自SEQ ID NO:7-14的序列。
2.权利要求1的方法，其中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成，两种反向引物的混合物的核酸序列由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成。
3.权利要求1-2任一项的方法，其中，所述核酸通过结合于固相被分离。
4.权利要求1-3任一项的方法，其还包括使经扩增的核酸与探针在足以使得所述的探针结合于经扩增的核酸的条件下接触。
5.权利要求4的方法，其中，所述的探针包含核酸序列SEQ ID NO:15-19或25或其互补序列的至少22-35个连续的核苷酸。
6.权利要求4或5任一项的方法，其中，所述探针的核酸序列由选自SEQ ID NO:15-19或25或其互补序列的序列组成。
7.权利要求6的方法，其中，所述探针的核酸序列由选自SEQ ID NO:15-18或25的序列组成。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中，所述的探针包含与所述探针的5’端偶联的荧光团，和猝灭剂，其中，所述的荧光团和猝灭剂之间的间隔包含至少9个核苷酸。
9.包含正向引物和至少一种反向引物的引物组，其中，所述正向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:6，并且其中至少一种反向引物的核酸序列，或所述的反向引物选自SEQ ID NO:7-14。
10.权利要求9的引物组，其中，所述正向引物的核酸序列包含SEQ IDNO:6，两种反向引物的混合物的核酸序列包含SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14。
11.寡核苷酸组，其中，所述组由权利要求9或10的引物组和一种探针组成，其中，所述的探针包含SEQ ID NO:15-19或25或其互补序列的至少20个连续的核苷酸。
12.权利要求11的寡核苷酸组，其中，所述的探针包含与所述探针的5’端偶联的荧光团，和猝灭剂，其中，所述的荧光团和猝灭剂之间的间隔包含至少9个核苷酸。
13.权利要求9-12中任一项的引物组或寡核苷酸组在同时检测可能存在于生物样品中的基因型1,2,3和/或4中的用途。
14.试剂盒，其包含依赖模板的DNA聚合酶，核苷酸，权利要求9-12的引物组或寡核苷酸组。
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