CN105936945B - 一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量pcr试剂盒 - Google Patents

一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR试剂盒，由核酸共提取液、四重RT‑qPCR反应液、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品、五个浓度的阳性定量标准品组成。本发明可简便快速地在一个反应管中同时、平行地检测四种常见儿童呼吸道病毒(RSV、INF、HMPV、ADV)的感染，实现了单管PCR同时检测四种不同类型核酸的病毒，且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性、重复性好，结果准确可靠，并可根据所检测的病毒核酸拷贝数的大小为呼吸道病毒感染患者提供早期明确诊断和防治，监测临床疗效，对阻断传染源、减少病毒感染或监测及鉴别诊断多种病毒混合感染均有极大的临床价值。

Description

一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术，涉及一种快速联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR(Reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)试剂盒，尤其涉及检测呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)，流感病毒(Influenza virus，INF)、人类偏肺病毒(Human metapneumovirus，HMPV)、腺病毒(Human adenovirus，ADV)的四重逆转录定量PCR试剂盒，具体地说，本发明涉及应用四重RT-qPCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时检测RNA病毒和DNA病毒(RSV、INF、HMPV、ADV)的试剂盒。
背景技术
近年来，各种流感病毒的流行让人们对呼吸道病毒性传染病越发关注。儿童由于免疫功能尚未发育完全，成为急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection,ARTI)的高发人群，据WHO最新统计，肺炎和腹泻仍为5岁以下儿童死亡的首位病，该年龄段死于上述两者疾病的比例高达29％。儿童肺炎常见病原包括细菌、病毒、非典型病原体等，其中，在婴幼儿中，约50％的肺炎由病毒引起。儿童急性呼吸道感染临床表现通常相似，依靠影像学技术和常规检验技术难以鉴别诊断，但是如果病原学诊断不明确，将导致临床医生对儿童急性呼吸道病毒感染盲目使用抗生素，不仅大大增加ARTI儿童的诊疗时间和费用，而且造成细菌耐药，给医患双方都带来麻烦。
大量流行病毒调查认为儿童呼吸道感染中RSV感染率最高，在世界范围内，约22％的急性下呼吸道感染与RSV有关，且至少10％会发展为重症感染需住院治疗。而ADV、INF、HMPV均被认为是重要的病原体，HMPV虽于2001年新近发现，但血清学研究提示HMPV在人群中至少存在了50年。许多调查研究表明HMPV与儿童ARTI密切相关，是儿童肺炎的第二位病因，仅次于RSV。
在分子诊断技术未发展之前，检测病毒手段主要包括病毒培养，血清学检测等，但病毒培养要求十分高，一般在实验室中应用，且检测时间过长，血清学方法技术成熟，有商品试剂盒供应，但是敏感性和特异性有待提高，同时，需要检测急性期和恢复期双份血清才有诊断意义且容易漏诊。PCR(Polymerase chain reaction)技术的出现改善了这种局面，其中多重定量PCR(Multiplex quantitative PCR)更适合于多种病毒混合感染的鉴别诊断，且取材方便，需用标本量少，减少劳动力，在需要同时检测大量样品的时候更具有优越性，有利于提高操作规程的标准化。目前多重PCR技术或许由于受核酸提取的限制，主要应用于检测同一种类型核酸的病毒，而常见呼吸道病毒往往包括多种病毒核酸，如腺病毒(Human adenovirus,ADV)为DNA病毒，而呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytialvirus,RSV)等为RNA病毒，其重要性相当，因此同时检测DNA病毒和RNA病毒具有重要意义。
单管PCR同时定量检测以上4种常见儿童呼吸道病毒，不仅快速准确、节约成本，还可根据病毒拷贝数为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治，为临床治疗方案的制定提供参考依据，从而提高临床决策水平，有效降低抗生素的过度使用，监测临床疗效，并最终改善患者预后。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR(RT-qPCR)试剂盒，由核酸共提取液、四重RT-qPCR反应液、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品、五个浓度的阳性定量标准品组成，其中四重RT-qPCR反应液为四组引物、探针以及RT-qPCR反应缓冲液、Hot Start Taq DNA聚合酶、PrimeScrip RT逆转录酶构成的混合液，阴性质控品为灭菌注射用水，强、弱阳性质控品为由RSV、INF、HMPV、ADV等量混合的阳性质粒样品(ADV为质粒，RSV、INF、HMPV为根据质粒转录而来的RNA片段)，其中强阳性质控品浓度106Copies/μl，弱阳性质控品浓度102Copies/μl，五个浓度阳性定量标准品是由RSV、INF、HMPV、ADV等量混合的质粒样品(ADV为质粒，RSV、INF、HMPV为根据质粒转录而来的RNA片段)，浓度分别为102Copies/μl、103Copies/μl、104Copies/μl、105Copies/μl、106Copies/μl。
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下：
RSV：
上游引物：GCACCGCCAAGACACTAGAA
下游引物：GTGGTTTGCCGAGGCTATGA
探针：JUP(VIC)-GGA CCT GGG ACA CTC TCA ATC ATC T-JUP
INF：
上游引物：ACACCATCTGTGTGGGCTAC
下游引物：CCGTTCAGACTGCAGAGCTT
探针：MAR(FAM)-CTC TAC AGA CAC TGT TGA CAC AGT ACT AG–MAR
HMPV
上游引物：GGGAGCAAAGCAGAA AGTTTGT
下游引物：TTGCACAGACACATGCCCTA
探针：NEP-GCT TAT GGA GCT GGT CAA ACA CTG C-NEP
ADV：
上游引物：TAAGACTCTCGTCCATTTGGTCA
下游引物：CTTAACATCGCCGCCAAGGAG
探针：SAT-CAC AATCTTCTTGTTGTCCAGCTTGG-SAT
SAT、MAR、JUP、NEP是AllGlo探针的四种不同荧光素。
RSV标准品序列：
GCACCGCC AAGACACTAG AAAGGACCTG GGACACTCTCAATCATCTAT
TATTCATATCATCGTGCTTATACAAGTTAA ATCTTAAATC TATAGCACAA
ATCACATTATCTATTTTGGCAATGATAATC TCAACCTCAC TTATAATTGC
AGCCATCATA TTCATAGCCT CGGCAAACCA C
INF标准品序列：
ACACCATCTGTGTGGGCTACCATGCA AACAACTCTA CAGACACTGTTGACACA
GTACTAGAAAAGAATGTGACCGTGACTCACTCAGTGAATTTGCTCGAAGACAGC
CATAATGGG AAGCTCTGCA GTCTGAACGG
HMPV标准品序列：
GGAG CAAAGCAGAA AGTTTGTTTGTAAATATATT TATGCAAGCT TATGGAGCTG
GTCAAACACT GCTAAGGTGG GGTGTCATTGCCAGATCATC CAACAACATA
ATGCTAGGGC ATGTGTCTGT GCAA
ADV标准品序列：
TAAGACTCTCGTCCATTTGGT CAGAAAACACAATCTTCTTGTTGTCCAGCTTGGTAG
CAAATGATCCATAGAGGGCATTGGATAGAAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTTTGG
TTCTTTTC CTTGTCCGCGCGCTCCTTGG CGGCGATGTT AAG。
所述的特异性四重RT-qPCR引物，是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与RSV、INF、HMPV、ADV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。
所述的特异性四重RT-qPCR荧光探针，是长度为25±4Nt的寡核苷酸链，与RSV、INF、HMPV、ADV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5′端和3′端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团。
本发明四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR试剂盒的快速检测方法包括如下步骤：
(1)引物和荧光探针设计：在GenBank中检索获得呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytial virus，RSV)，流感病毒(Influenza virus，INF)、人类偏肺病毒(Humanmetapneumovirus，HMPV)、腺病毒(Human adenovirus，ADV)特异性保守基因，通过序列比对，确定它们各自的高度保守序列区，作为四种病毒的待检靶基因特异性核酸序列分别设计特异引物和荧光探针；
(2)标准品和质控品：根据(1)中确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有RSV、INF、HMPV、ADV高度保守序列区的标准质粒分子；另将RSV、INF、HMPV三种RNA病毒的标准质粒分子(DNA)体外转录成RNA片段，构成标准品和质控品。
(3)四重逆转录定量PCR(Reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)反应液：使用步骤(1)中的引物和探针及RT-qPCR反应缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶等成分组成四重RT-qPCR反应液，利用正交设计筛选各个浓度的引物、探针、DNA聚合酶、逆转录酶、模板的组合，优化四重RT-qPCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；
(4)标准曲线：使用(3)中的四重RT-qPCR反应体系，将RSV、INF、HMPV重组质粒(已知拷贝数)体外转录而成的对应RNA片段或ADV根据重组质粒(已知拷贝数)连续10倍倍比稀释，加入到四重RT-qPCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析，制备标准曲线；
(5)临床验证：用含RSV、INF、HMPV、ADV的临床呼吸道标本DNA或RNA提取液作为模板，进一步用本试剂盒确立的方法和条件进行四重RT-qPCR扩增。
所述的特异性四重RT-qPCR荧光探针，指的是长度为25±4Nt的寡核苷酸链，与RSV、INF、HMPV、ADV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5′端和3′端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团。
所述的试剂盒包括如下成分：①核酸共提取液；②质控品(阴性、强阳性、弱阳性)及阳性定量标准品；③四重荧光PCR反应液。
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列同上。
所述的多重定量PCR指的是四重逆转录定量PCR(RT-qPCR)方法。
所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种病毒所特有的一段基因序列。
所述的标准品，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列，其中将RSV、INF、HMPV三种RNA病毒的标准质粒分子(DNA)体外转录成RNA片段，构成标准品和质控品，ADV的标准品认为人工重组质粒(DNA)。
所述的四重RT-qPCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及RT-qPCR反应缓冲液、四种核苷酸单体(dNTPs)、DNA聚合酶、逆转录酶等组成的混合液。
所述的四重RT-qPCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子(ADV)和根据标准质粒分子转录而来的RNA片段(RSV、INF、HMPV)作为模板用四重RT-qPCR反应液进行检测所得，标准曲线的R2均大于0.99，扩增效率在0.91-0.98之间，基本满足定量PCR标准曲线的要求。
所述的四种呼吸道病毒联检包括三种RNA病毒(呼吸道合胞病毒、流感病毒和人类偏肺病毒以及DNA病毒(腺病毒)，且采用一步法四重逆转录定量PCR(RT-qPCR)单管同时定量检测四种上述不同核酸类型的病毒。
本发明根据RSV、INF、HMPV、ADV特异性的保守基因，登录GenBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用Primer Premiers 5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，四种病毒各筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针，用自制的不同浓度的标准分子(ADV为靶基因质粒克隆载体，RSV、INF、HMPV为根据基因质粒克隆载转录而来的RNA片段)作为模板，在ABI 7500定量PCR仪中进行单、四重RT-qPCR实验，优化四重RT-qPCR反应体系，确定该方法的灵敏度、特异性、重复性等，制备标准曲线，最后用该方法检测临床阴、阳性标本各5份，并应用SYRB Green RT-qPCR法检测标本，测序验证，进行结果比较，分析四重RT-qPCR方法的可靠性。
本发明是一种主要针对引起小儿呼吸道感染的四种常见呼吸道病毒的早期、快速、简便而有效的四重RT-qPCR检测试剂盒，涉及的病原体包括RSV、INF、HMPV、ADV，采用AllGlo荧光素标记探针，建立了一种基于AllGlo探针技术的单管四重RT-qPCR同时检测四种病毒的方法，且检测灵敏度仍较高，对于单个样本检测时间约为1个小时，操作简便，并且可以进行大批量的样本分析检测，较现有的病毒培养方法在检测时间、鉴定程序、检出率等方面有了极大的提高，较血清学检测在检测灵敏度、特异性、定量等方面均有很大的提高或改进，对小儿呼吸道病毒的感染或混合感染的流行监控、快速鉴定、疗效判断等方面具有很大帮助。
本发明可以简便快速地在一个反应管中同时、平行地检测不同类型核酸四种病毒的感染，并可根据病毒拷贝数，为小儿呼吸道感染患者提供早期明确诊断和防治，为临床治疗方案的制定提供参考依据，从而提高临床决策水平，有效降低因误诊为细菌感染而导致的抗生素过度使用，对阻断传染源、减少RSV、INF、HMPV、ADV感染或混合感染、监测临床疗效均有很大的临床价值。采用本发明提供的试剂盒，解决了现有检测方法的诸多缺陷：包括检测速度慢、不能检测多重感染、不能定量、特异性较差或者成本高、操作繁琐等，实现了单管PCR同时定量检测DNA病毒和RNA病毒。本试剂盒操作简单快速，灵敏度高，特异性好，重复性好，结果准确可靠，其应用前景看好。
附图说明
图1是呼吸道合胞病毒在四重RT-qPCR中的标准曲线(斜率为-3.541，截距为40.693，R2为0.995)。
图2是甲型流感病毒在四重RT-qPCR中的标准曲线(斜率为-3.482，截距为41.023，R2为0.997)。
图3是人类偏肺病毒在四重RT-qPCR中的标准曲线(斜率为-3.351，截距为41.005，R2为0.993)。
图4是腺病毒在四重定量PCR(实际应用为RT-qPCR)中的标准曲线(斜率为-3.351，截距为41.005，R2为0.993)。
注：上述模板为RSV、INF、HMPV、ADV等量混合质粒(ADV为靶基因质粒克隆载体，RSV、INF、HMPV为根据基因质粒克隆载转录而来的RNA片段，下同)，浓度(Copies/test)为106、105、104、103，102平行3管。
图5是呼吸道合胞病毒(RSV)在四重RT-qPCR中的敏感性实验扩增图。
图6是甲型流感病毒(INF)在四重RT-qPCR中的敏感性实验扩增图。
图7是人类偏肺病毒(HMPV)在四重RT-qPCR中的敏感性实验扩增图。
图8是腺病毒(ADV)在四重定量PCR(实际应用为RT-qPCR)中的敏感性实验扩增图。
注：上述模板为RSV、INF、HMPV、ADV等量混合质粒，浓度(Copies/test)为107、106、105、104、103、102、101，平行3管。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
一种快速联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR试剂盒，由核酸共提取液、四重RT-qPCR反应液、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品、五个浓度的阳性定量标准品组成，其中四重荧光PCR反应液为四组引物、探针以及RT-qPCR反应缓冲液、Hot Start TaqDNA聚合酶、PrimeScrip逆转录酶构成的混合液，阴性质控品为灭菌注射用水，强、弱阳性质控品为由RSV、INF、HMPV、ADV等量混合的阳性质粒样品(ADV为靶基因质粒克隆载体，RSV、INF、HMPV为根据基因质粒克隆载转录而来的RNA片段，下同)，其中强阳性质控品浓度106Copies/μl，弱阳性质控品浓度102Copies/μl，五个浓度阳性定量标准品是由RSV、INF、HMPV、ADV等量混合的质粒样品，浓度分别为102Copies/μl、103Copies/μl、104Copies/μl、105Copies/μl、106Copies/μl。
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下：
RSV：
上游引物：GCACCGCCAAGACACTAGAA
下游引物：GTGGTTTGCCGAGGCTATGA
探针：JUP(VIC)-GGA CCT GGG ACA CTC TCA ATC ATC T-JUP
INF：
上游引物：ACACCATCTGTGTGGGCTAC
下游引物：CCGTTCAGACTGCAGAGCTT
探针：MAR(FAM)-CTC TAC AGA CAC TGT TGA CAC AGT ACT AG–MAR
HMPV
上游引物：GGGAGCAAAGCAGAA AGTTTGT
下游引物：TTGCACAGACACATGCCCTA
探针：NEP-GCT TAT GGA GCT GGT CAA ACA CTG C-NEP
ADV：
上游引物：TAAGACTCTCGTCCATTTGGTCA
下游引物：CTTAACATCGCCGCCAAGGAG
探针：SAT-CAC AATCTTCTTGTTGTCCAGCTTGG-SAT
SAT、MAR、JUP、NEP是AllGlo探针的四种不同荧光素。
RSV标准品序列：
GCACCGCC AAGACACTAG AAAGGACCTG GGACACTCTCAATCATCTAT
TATTCATATC ATCGTGCTTA TACAAGTTAA ATCTTAAATC TATAGCACAA
ATCACATTAT CTATTTTGGC AATGATAATC TCAACCTCAC TTATAATTGC
AGCCATCATA TTCATAGCCT CGGCAAACCA C
INF标准品序列：
ACACCATCTGTGTGGGCTACCATGCA AACAACTCTA CAGACACTGTTGACACA
GTACTAGAAAAGAATGTGACCGTGACTCACTCAGTGAATTTGCTCGAAGACAGC
CATAATGGG AAGCTCTGCA GTCTGAACGG
HMPV标准品序列：
GGAG CAAAGCAGAA AGTTTGTTTGTAAATATATT TATGCAAGCT TATGGAGCTG
GTCAAACACT GCTAAGGTGG GGTGTCATTGCCAGATCATC CAACAACATA
ATGCTAGGGC ATGTGTCTGT GCAA
ADV标准品序列：
TAAGACTCTCGTCCATTTGGT CAGAAAACACAATCTTCTTGTTGTCCAGCTTGGTAG
CAAATGATCCATAGAGGGCATTGGATAGAAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTTTGG
TTCTTTTC CTTGTCCGCGCGCTCCTTGG CGGCGATGTT AAG。
实施例2
四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR试剂盒的检测方法包括如下步骤：
(1)引物设计：在GenBank中检索获得呼吸道合胞病毒(RSV)，甲型流感病毒(INF)、人类偏肺病毒(HMPV)、腺病毒(ADV)特异性的保守基因，通过序列比对，确定它们各自的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列分别设计特异引物；
(2)荧光探针设计：根据步骤(1)中的四种病毒的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；
(3)标准品的构建：根据步骤(1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有RSV、INF、HMPV、ADV高度保守序列区的标准质粒分子，另将RSV、INF、HMPV三种RNA病毒的标准质粒分子(DNA)体外转录成RNA片段，构成标准品(下同)；
(4)四重RT-qPCR反应体系的优化与建立：使用步骤(1)中的引物和步骤(2)中的探针及RT-qPCR反应缓冲液、Hot Start Taq DNA聚合酶、PrimeScrip逆转录酶等成分组成四重RT-qPCR反应液，利用正交设计筛选80-320nM范围内各个浓度的引物、探针、DNA聚合酶、逆转录酶、模板的组合，优化四重定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的四重RT-qPCR反应体系；
(5)标准曲线制备：使用步骤(4)中的四重RT-qPCR反应体系，将已知拷贝数的含有RSV、INF、HMPV、ADV目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到四重RT-qPCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析，制备标准曲线；
(6)临床验证：提取RSV、INF、HMPV和/或ADV临床呼吸道标本中的DNA或RNA作为模板，进一步用步骤(4)和(5)的方法和条件进行四重RT-qPCRR扩增；
所述的特异性四重定量PCR荧光探针，指的是长度为25±4Nt的寡核苷酸链，与RSV、INF、HMPV、ADV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5′端和3′端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团；
所述的试剂盒包括如下成分：①核酸共提取液；②质控品(阴性、强阳性、弱阳性)及阳性定量标准品；③四重RT-qPCR反应液。
所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种病毒所特有的一段基因序列。
所述的标准品，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列，其中将RSV、INF、HMPV三种RNA病毒的标准质粒分子(DNA)体外转录成RNA片段，构成标准品，ADV的标准品为人工重组质粒(DNA)。
所述的四重RT-qPCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及RT-qPCR反应缓冲液、Hot Start Taq DNA聚合酶、PrimeScrip逆转录酶等组成的混合液
所述的四重RT-qPCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重RT-qPCR反应液进行检测所得，标准曲线的R2均大于0.99，扩增效率在0.91-0.98之间，基本满足定量PCR标准曲线的要求。
实施例3
1.四种病毒(RSV、INF、HMPV、ADV)目的基因质粒克隆载体的构建
采用T-A载体克隆方案，将四种目的基因PCR产物经过电泳确认扩增片段分子量后，扩增片段经2％琼脂糖凝胶回收纯化，克隆至pUC57质粒中，然后将连接产物转化至感受态大肠埃希菌中，在LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上筛选阳性菌落，经回收、抽提、纯化重组质粒，将经验证完全正确的目的质粒用紫外分光光度计定量后，用1×TE(pH8.0)缓冲液稀释到1010拷贝/μl作为储存液，–20℃保存备用。
2.三种RNA病毒(RSV、INF、HMPV)目的基因质粒克隆载体转录为RNA片段
使用用限制性内切酶Quickcut BamHⅠ将含有RSV、INF、HMPV目的基因质粒线性化，应用RNA生产系统T7试剂盒对RSV、HMPV、INF质粒进行转录试验，将经验证完全正确的目的片段用微量核酸蛋白分析仪检测定量后，用DEPC水稀释到108拷贝/μl作为储存液，–20℃保存备用。
3.核酸模板共提取
3.1痰液：痰液中加入4倍体积的生理盐水，混匀后取200μl痰液加入EP管中，离心5min，弃上清。加入300μl病毒裂解液(2mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，20μg/ml糖原，0.4mol/LDTT)，加入6μl RNA助沉剂振荡混匀，置于60℃保温10min冷却至室温后，加入20μl磁珠，加入1倍体积的无水乙醇，上下颠倒混勾充分,室温放置5min，每隔2-3min混勾一次。将离心管于离心机中高速短时离心，去除壁上的残液。磁铁吸附纳米磁珠，弃上清，用200μl 70％乙醇清洗2-5次。加入50微升RNase-free H2O，用移液器吸头吹打均匀，室温放置5min。磁铁吸附纳米磁珠，将含有核酸的上清液转移至一新的离心管中备用。
3.2分泌物拭子：加灭菌生理盐水1ml到无菌管，充分震荡混匀，挤干棉拭子，立即将液体全部转移至1.5ml离心管中，取200μl加入离心管中，离心5min，弃上清。加入300μl病毒裂解液(2mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，20μg/ml糖原，0.4mol/LDTT)，加入6μlRNA助沉剂振荡混匀，置于60℃保温10min冷却至室温后，加入20μl磁珠，加入1倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀充分,室温放置5min，每隔2-3min混匀一次。将离心管于离心机中高速短时离心，去除壁上的残液。磁铁吸附纳米磁珠，弃上清，用200μl 70％乙醇清洗2-5次。加入50μl RNase-free H2O，用移液器吸头吹打混匀，室温放置5min。磁铁吸附纳米磁珠，将含有核酸的上清液转移至一新的离心管中备用。
3.3质控品和阳性定量标准品处理：8000rpm离心数秒，备用。
4.AllGlo探针四重RT-qPCR
4.1引物及探针
查阅相关的专业文献，根据文献报道获取RSV、INF、HMPV、ADV特异性保守基因，登录GenBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用Primer Premiers 5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，每种细菌筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针(见表1)。
RSV、INF、HMPV、ADV单管四重RT-qPCR引物和相应的AllGlo探针分别由LifeTechnologies公司和上海奕跃生物科技有限公司合成。为了确保四重RT-qPCR的特异性和灵敏度，所有的引物和探针均与GenBank里的扩增靶序列进行BLAST，所有引物和探针的Tm值基本一致。采用ABI 7500定量PCR仪进行四重定量PCR实验。
表1 AllGlo探针四重RT-qPCR检测RSV、INF、HMPV、ADV引物和探针
SAT、MAR、JUP、NEP均为不同波长的AllGlo探针标记荧光素，分别对应于目前使用的CY3、FAM、VIC和CY5荧光。
4.2四重RT-qPCR条件优化
采用正交设计对四重RT-qPCR中的引物、探针、Hot Start Taq DNA聚合酶、PrimeScrip RT逆转录酶、模板加入量进行优化，25μl基础反应体系如表2，于ABI 7500定量PCR仪扩增，循环条件：Stage1反转录反应42℃5min 95℃10s(1cycle)，Stage2 95℃5s、60℃34s(40cycles)。
表2四重定量RT-qPCR反应体系
以上述反应体系为基础，阳性模板为ADV重组质粒105Copies/test和RSV、HMPV、INF质粒体外转录的RNA 105Copies/test等份混合物，阴性对照以双蒸水代替模板。
4.2.1四重RT-qPCR中引物浓度的优化
首先在加入RT-PCR反应缓冲液12.5μl、各病毒探针(10μmol/L)量0.4μl、HotStart Taq DNA聚合酶0.5μl、PrimeScrip逆转录酶0.5μl、核酸模板4μl的情况下对各病毒引物共四个因素利用正交试验设计进行优化选择，根据单重RT-qPCR的结果选择这四个因素的浓度范围设计4个水平(见表3)，正交试验见表4。
表3引物因素与水平(引物浓度为10μmol/L)
水平 A(ADV引物) B(RSV引物) C(INF引物) D(HMPV引物)
1 0.2μl 0.2μl 0.2μl 0.2μl
2 0.4μl 0.4μl 0.4μl 0.4μl
3 0.6μl 0.6μl 0.6μl 0.6μl
4 0.8μl 0.8μl 0.8μl 0.8μl
表4正交试验设计L16(45)
实验号 A B C D E(空列)
1 1 2 3 3 2
2 2 4 1 2 2
3 3 4 3 4 3
4 4 2 1 1 3
5 1 3 1 4 4
6 2 1 3 1 4
7 3 1 1 3 1
8 4 3 3 2 1
9 1 1 4 2 3
10 2 3 2 3 3
11 3 3 4 1 2
12 4 1 2 4 2
13 1 4 2 1 1
14 2 2 4 4 1
15 3 2 2 2 4
16 4 4 4 3 4
4.2.2四重RT-qPCR中探针的优化
本实验在加入各病毒引物(10μmol/L)量0.5μl、Hot Start Taq DNA聚合酶0.5μl、PrimeScrip逆转录酶0.5μl、核酸模板4μl的情况下对各病毒探针共四个因素利用正交试验设计进行优化选择，根据单重RT-qPCR的结果，选择这四个因素的浓度范围设计加入量分别为0.2μl、0.4μl、0.6μl、0.8μl四个水平，正交试验如表4，其中A为ADV探针，B为RSV探针，C为HMPV探针，D为INF探针。
4.2.3四重RT-qPCR中模板及酶的优化
根据上述实验结果得出的各病毒引物与探针的最优值对TaKaRa Ex Taq HS、PrimeScrip RT Enzyme Mix Ⅱ、模板浓度三个因素利用正交试验设计进行优化选择，根据单重RT-qPCR的结果选择这3个因素的浓度范围设计4个水平(见表5)，正交试验如表6。
表5四重RT-qPCR体系优化的因素与水平
表6正交试验表二L16(45)
实验号 A B C空白 D E空白
1 3 4 2 3 1
2 4 2 3 4 1
3 4 4 4 1 4
4 1 2 4 3 3
5 1 3 2 4 4
6 1 1 1 1 1
7 2 1 3 3 4
8 4 1 2 2 3
9 3 3 3 1 3
10 3 2 1 2 4
11 2 3 4 2 1
12 3 1 4 4 2
13 2 2 2 1 2
14 2 4 1 4 3
15 1 4 3 2 2
16 4 3 1 3 2
本实验运用综合加权评分法评价四重RT-qPCR的扩增结果，以一个综合指标(overall desirability,OD)将各个考察指标综合考察，即以ADV、RSV、INF、HMPV病毒的Ct值权重相加的综合评价作为指标，考虑到这些指标对观察四重RT-qPCR体系扩增效果的重要性相当，各自权重定为25％计算。OD值＝ADV(Ct值)×0.25+RSV(Ct值)×0.25+INF(Ct值)×0.25+HMPV(Ct值)×0.25，以OD值进行直观分析和方差分析，其中在分析酶与模板优化的正交试验时同时查看其对四种病毒扩增的影响。采用SPSS17.0软件对各个正交试验分别进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，采用正交设计的方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
4.3四重RT-qPCR的特异性、敏感性试验
将已知拷贝数的含ADV目的扩增片段的重组质粒及根据含RSV、INF、HMPV目的扩增片段的重组质粒转录而来的RNA，使用时连续10倍倍比稀释至浓度在101～107Copies/test之间作为单病毒四重RT-qPCR检测的标准品；同时，将以ADV、RSV、INF、HMPV 1:1:1:1混合后进行10倍倍比稀释成101～107Copies/test之间，作为多病毒四重RT-qPCR检测的标准品。取不同载量的标准品4μl作为四重RT-qPCR的模板，同时用灭菌注射用水做对照实验，对各稀释度模板按照(3.3)确立的反应体系和扩增条件同时进行RT-qPCR检测，所有检测标本至少检测三次，扩增完成后用仪器自带的软件自动分析结果，从而确定该方法的最低检出限，评估快速联检四种呼吸道病毒多重RT-qPCR试剂盒的检测灵敏度。
4.4四重RT-qPCR标准曲线制备
将浓度在(Copies/test)103、104、105、106、107的ADV质粒DNA和其他三种病毒体外转录RNA作为制备标准曲线的标准品，按照(4.2)确立的反应体系和扩增条件同时进行RT-qPCR检测，所有检测标本至少检测三次，扩增完成后用仪器自带软件分析结果，制备标准曲线。
4.5四重RT-qPCR的重复性试验
将已知拷贝数的ADV重组质粒及根据质粒转录而来的RNA片段(105Copies/test)分别平均分成10份，-20℃冷冻保存作为模板，按制备标准曲线的四重RT-qPCR的反应体系和扩增条件进行扩增，同时按照(4.4)制备标准曲线，每周检测一次，根据标准曲线仪器自动给出定量检测结果，连续5周，最后统计软件分析5次检测结果的重复性(CV％)。
4.6结果判定
分析条件设定：根据仪器所带分析软件自动分析结果，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增线和仪器噪音进行调整。
质控标准：阴性质控品无扩增曲线和Ct值；阳性定量标准品均为阳性，Ct值<35，且0.98≤R2≤1；阳性质控品全部阳性，Ct值应与标准曲线的相应标准品的Ct值相对应，并且出现典型的扩增曲线；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则实验视为无效，需重新进行。
A.阴性：无扩增曲线无Ct值。
B.阳性及定量判断：出现典型的扩增曲线且Ct值≤37判定为阳性，并根据标准曲线自动获取定量值，表示样品中存在ADV、RSV、INF、HMPV。
C.有效原则：Ct值>37的样品定量结果不可靠，需重做实验。无Ct值为阴性，有Ct值但仍>37需重新取标本复查。
4.7临床验证
取临床阴、阳性(ADV、RSV、INF、HMPV)标本各5份。将临床分离菌株菌液混入呼吸道标本中，按照(2)的方法提取标本中的核酸，使用本试剂盒的AllGlo探针四重RT-qPCR方法对标本进行检测，并与应用SYRB Green RT-qPCR法的检测结果相比较，进一步验证该方法的可靠性。
4.8实施例3检测结果
4.8.1四重RT-qPCR条件优化结果：反应体系配制优选方案见表7，仪器扩增条件：Stage1反转录反应42℃5min 95℃10s(1cycle)，Stage2 95℃5s、60℃34s(40cycles)。
表7反应体系配制优选方案
4.8.2四重RT-qPCR标准曲线制备结果：RSV、INF、HMPV、ADV分子的标准曲线在经过优化的四重定量PCR反应体系进行制备，它们的标准曲线的R2分别为0.995、0.997、0.993、0.998，扩增效率(Efficiency)分别为0.916、0.937、0.988、0.973(见附图1-4)。
4.8.3四重RT-qPCR的特异性、敏感性试验结果：RSV、INF、HMPV、ADV标准分子在四重RT-qPCR体系中进行扩增后，其特异性均为100％。RSV、INF、HMPV在四重定量PCR体系中检测灵敏度均为102Copies/test，ADV在四重定量PCR体系中检测灵敏度为10Copies/test(见附图5-8)。
4.8.4四重RT-qPCR的重复性试验结果：相同的RSV、INF、HMPV、ADV标准分子混合液(105Copies/test)在四重定量PCR体系检测5次，检测数据经对数转换后，RSV、INF、HMPV、ADV五次检测的CV均小于5％，详见表8。
表8 AllGlo探针四重RT-qPCR检测病毒核酸的重复性试验结果(105copies/test)
病毒 第一次 第二次 第三次 第四次 第五次 Mena SD CV
RSV 4.969 4.999 4.993 4.981 4.971 4.982 0.013 0.003
INF 4.951 5.001 5.058 4.951 4.997 4.992 0.044 0.009
HMPV 5.026 4.981 4.973 4.980 5.007 4.993 0.022 0.005
ADV 5.030 5.000 5.061 5.059 5.032 5.036 0.025 0.005
3.9.5临床验证结果：采用本试剂盒(AllGlo探针四重RT-qPCR)对临床标本进行检测的结果与SYBR鉴定结果一致。

Claims (4)

1.一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR试剂盒，由核酸共提取液、四重RT-qPCR反应液、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品、五个浓度的阳性定量标准品组成，其特征在于：其中四重RT-qPCR反应液为四组引物、探针以及RT-qPCR反应缓冲液、HotStart Taq DNA聚合酶、PrimeScrip RT逆转录酶构成的混合液，其中强阳性质控品浓度106Copies/μl ，弱阳性质控品浓度102Copies/μl ，五个浓度阳性定量标准品是由RSV、INF、HMPV、ADV等量混合的质粒样品，浓度分别为102Copies/μl 、103Copies/μl 、104Copies/μl、105Copies/μl 、106Copies/μl；强、弱阳性质控品为由RSV、INF、HMPV、ADV等量混合的阳性质粒样品；四种呼吸道病毒包括三种RNA病毒： RSV、INF、HMPV和一种DNA病毒：ADV；
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下：
RSV：
上游引物：GCACCGCCAAGACACTAGAA
下游引物：GTGGTTTGCCGAGGCTATGA
探针：JUP(VIC)- GGA CCT GGG ACA CTC TCA ATC ATC T -JUP
INF：
上游引物：ACACCATCTGTGTGGGCTAC
下游引物：CCGTTCAGACTGCAGAGCTT
探针：MAR(FAM)- CTC TAC AGA CAC TGT TGA CAC AGT ACT AG –MAR
HMPV
上游引物：GGGAGCAAAGCAGAAAGTTTGT
下游引物：TTGCACAGACACATGCCCTA
探针：NEP-GCT TAT GGA GCT GGT CAA ACA CTG C-NEP
ADV：
上游引物：TAAGACTCTCGTCCATTTGGTCA
下游引物：CTTAACATCGCCGCCAAGGAG
探针：SAT-CACAATCTTCTTGTTGTCCAGCTTGG-SAT
RSV标准品序列：
gcaccgcc aagacactag aaaggacctg ggacactctcaatcatctat tattcatatc atcgtgcttatacaagttaa atcttaaatc tatagcacaa atcacattat ctattttggc aatgataatc tcaacctcacttataattgc agccatcata ttcatagcct cggcaaacca c
INF标准品序列：
acaccatctgtgtgggctaccatgca aacaactcta cagacactgt tgacacagta ctagaaaagaatgtgaccgtgactcactcagtgaatttgctcgaagacagccataatggg aagctctgca gtctgaacgg
HMPV标准品序列：
ggag caaagcagaa agtttgtttgtaaatatatt tatgcaagct tatggagctg gtcaaacactgctaaggtgg ggtgtcattgccagatcatc caacaacata atgctagggc atgtgtctgt gcaa
ADV标准品序列：
t aagactctcgtccatttggt cagaaaacac aatcttcttg ttgtccagct tggtagcaaatgatccatagagggcattgg atagaagctt ggcgatggag cgcatggttt ggttcttttccttgtccgcgcgctccttgg cggcgatgtt aag。
2.根据权利要求1所述的一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR试剂盒，其特征在于：阴性质控品为灭菌注射用水。
3.根据权利要求1所述的一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的特异性四重RT-qPCR引物，是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与RSV、INF、HMPV、ADV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。
4.根据权利要求1所述的一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的特异性四重RT-qPCR荧光探针，是长度为25±4Nt的寡核苷酸链，与RSV、INF、HMPV、ADV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5´端和3´端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团。
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