CN107090519B - 呼吸道常见病原体多重rt-pcr联合基因芯片检测试剂盒 - Google Patents

呼吸道常见病原体多重rt-pcr联合基因芯片检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种呼吸道常见病原体多重RT‑PCR联合基因芯片检测试剂盒，该试剂盒使用多重特异性保守简并引物组合和探针组合检测22种呼吸道常见病原体中的一种或多种，同时设有内源对照以及阳性对照和阴性对照。本发明所涉及的检测试剂盒提高了对高突变病原体目标序列的覆盖率，避免了多重引物和探针之间非特异性交叉反应的问题，可实现单个反应体系同时检测多达20种以上的呼吸道常见病原体，为呼吸道常见病原体检测提供一种简单灵敏，快速通量大，可多指标并行检测的检测工具。

Description

呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体为一种呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒。
背景技术
急性呼吸道感染是我国临床多发性常见病，可引起严重的并发症甚至死亡。常见感染病原体包括病毒、细菌、支原体、衣原体等，所引起疾病和疫情的病原学复杂，因此快速准确多指标的病原体检测将为疾病的诊治提供充足的依据，并为疫情的控制提供基础。
目前，常用的呼吸道病原检测技术包括病原体抗原检测和核酸检测两个方面。酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫试纸条等方法是目前主要的基于蛋白的检测方法，该类方法使用方便、快速，但缺点是检测灵敏度相对较低，并且随着抗原蛋白的变异，容易出现假阴性；同时抗原检测易受到多种因素的影响，造成假阳性。而基于核酸的检测方法是目前最普遍、最准确的病原体检测技术，检测方法主要包括PCR(聚合酶链式反应)技术和基于分子杂交的基因芯片技术。目前仍以PCR技术应用最为广泛，其常用的技术方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等方法。普通定性PCR方法检测效率低，尤其检测多基因对象时更加费时费力；巢式PCR虽然提高了检测的灵敏度，但同样存在检测效率的问题；荧光定量PCR方法灵敏度高，但其成本高，并且需要特殊检测仪器，同时单管的检测指标数也很有限。多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，可以实现多重扩增与检测，其技术难点是要避免PCR过程中多条引物间的交联反应，并且各扩增子的最佳反应条件要一致，目前常规设计的多重PCR检测能力大概是10个指标左右，更优的多重引物设计方案会显著提高方法的多指标检测能力。基因芯片是目前非常实用的病原体检测技术，它可以和多重PCR技术配合使用，从而实现对目标病原体的多重扩增和多指标检测，该技术对多重引物和探针的灵敏度和特异性要求很高，合理的引物和探针设置是关键。
目前呼吸道病原体检测需要解决如下几方面的问题：一是病原体种类多样，已发现的常见病原体有二十几种，其中半数以上是RNA病毒，同时还包括多种DNA病毒、支原体、衣原体和细菌。复杂的病原学要求检测技术可以实现多达20个指标以上的平行检测，并且具有同时检测核酸RNA和核酸DNA的能力。二是绝大多数呼吸道病原体具有快速进化的特点，同一类病原体对应的是一大组不同的变异基因，并且有能力在短时间内突变出新的变异基因。这种特点给临床检测带来了非常大的挑战，要求检测技术对一大组变异基因具有很好的覆盖度，并且具有容忍基因变异的能力。三是呼吸道疾病是临床多发性常见病，发病快，并且有集中爆发的特点，这要求检测技术在短时间内可以同时处理多个临床样本，具备快速检测和高通量检测的能力。
发明内容
本发明的目的是通过使用多重特异性保守简并引物组合和探针组合解决常规引物和探针对高突变病原体检测覆盖率低的问题，解决多达20种以上呼吸道病原体单反应体系平行检测的问题，同时解决多重引物和探针之间非特异性交叉反应的问题，克服现有技术单反应体系检测指标较少，费时费力的缺陷，提供一种操作简单，快速灵敏，检测通量大的呼吸道病原体基因检测试剂盒。
本发明呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，该试剂盒用于检测以下病原体中的一种或多种：流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人类偏肺病毒、鼻病毒A型、鼻病毒B型、鼻病毒C型、博卡病毒、腺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU-1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团杆菌和肺炎链球菌；
试剂盒内设有呼吸道病原体的引物组合和探针组合，同时设有人GAPDH基因內源对照以及阳性对照和阴性对照；
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒由引物组合、探针组合、基因芯片、辅料和配液构成。
本发明特征在于引物组合为一组或多组多重特异性保守区简并引物(MultiplexSpecific Conserved Degenerate Primer，其中简并位点的核苷酸表示为R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T)，各对引物的碱基序列5’-3’如下，其中反向引物5’端带Cy5荧光基团标志：
流感病毒A型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCTTTYACNGADGARGGAGCAA，
反向引物：Cy5-5’-AYSYCAAYTGCATTTTTGACATCCT；
流感病毒B型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCCAATTCGAGCAGCTGAAACTG，
反向引物：Cy5-5’-TCCGTRACYAGTCTAATTGTCTCYCTC；
副流感病毒1型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：TCAAACTTAATCACTCAAGGATGTGYAGAT，
反向引物：Cy5-5’-AGAAAYTRCCGGKTTTARATCAGGATACAT；
副流感病毒2型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：ACAATGTAATRCTTGGAGATTGYCTYGAT，
反向引物：Cy5-5’-GCTTTTSCGATTGATTCCATCACTTAGG；
副流感病毒3型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：TGGCATAATGTGYTATCAAGACCAGG，
反向引物：Cy5-5’-TCYARTATRACAGATGAYACAATGCTYCCT；
副流感病毒4型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：WGCTCTTAGRATCATTGAAGTTGATGCA，
反向引物：Cy5-5’-GCWARGCTRATAGGCAAATCYCTGG；
人类偏肺病毒，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：YGARGTMAATGCRACTGTRGCA，
反向引物：Cy5-5’-GCYGARCTYACAAAYTTTGAYACCA；
鼻病毒A型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCCGGAGGABTCAARGYGAG，
反向引物：Cy5-5’-TAGACCTGGCAGATGAGGCT；
鼻病毒B型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：CYCCACTAGTYTGGTCGATGAGGCT，
反向引物：Cy5-5’-NTCACAAYCAAGCACATGCRRGTCTT；
鼻病毒C型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：CACYGGYGACRGTGRYGTAGC，
反向引物：Cy5-5’-CCATCCCRYAATTRCTCRTTACGAC；
博卡病毒，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：ACTGCTACTGAGATTGCAGCTC，
反向引物：Cy5-5’-GCAGTATCCGTTTTCGTGAAGTGTA；
腺病毒，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：AGACACCTACTTCAGTMTKGGGAA，
反向引物：Cy5-5’-GGCACRAAGCGCAGCRTCAG；
冠状病毒229E，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：AACGTTTCAGAACTAGAAAGGGCA，
反向引物：Cy5-5’-TGTAGGYTCAGTTTTAGCACCATCAA；
冠状病毒HKU-1，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：CCTGGTACGATTYTGCCTCAAGG，
反向引物：Cy5-5’-ACGAKTATTGGGTCCACGTGAT；
冠状病毒NL63，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCCAAAGGTTTTCCACAGYTTGC，
反向引物：Cy5-5’-CTGCTCAATGAACTTAGGAAGGTTCTT；
冠状病毒OC43，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：CATTGTCGATCGGGACCCAA，
反向引物：Cy5-5’-TRCTGGATGTGCGCGAAGTA；
呼吸道合胞病毒A型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCAAATAYACCATCCAACGGAGC，
反向引物：Cy5-5’-YCCAGTGAATTTRTGATTRGCATCTTCTG；
呼吸道合胞病毒B型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GGGCAAATACAAARATGGCTCTTAGC，
反向引物：Cy5-5’-TGYTTTTGYACATCATAATTGGGAGTGTC；
肺炎支原体，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GGCCCATACTCCTACGGGAG，
反向引物：Cy5-5’-GCGACTGCTGGCACATAGTT；
肺炎衣原体，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：TGTAAAGCACTTTCGCCTGGGAA，
反向引物：Cy5-5’-CACCCTCCGTATTACCGCAGCT；
嗜肺军团杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGA，
反向引物：Cy5-5’-CTTTCATTTGYTGYTCGGTTAAAGCCA；
肺炎链球菌，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCTGGAAGAAAATCGCTGABAAGTG，
反向引物：Cy5-5’-GGTTTGAGGTAGTACCARCCTGTT；
內源对照GAPDH基因，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：ATCTTCCAGGAGCGAGATCC，
反向引物：Cy5-5’-AGGGGGCAGAGATGATGAC；
并且，探针组合为顺序固定于基因芯片表面的一条或多条核酸探针，包括呼吸道病原体特异性保守简并探针、GAPDH內源对照探针，阳性杂交点探针和阴性杂交点探针，其中简并位点的核苷酸表示为R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T)，各探针的5’端做氨基标志(NH2)，各条探针的碱基序列5’-3’如下：
流感病毒A型探针：
NH2-5’-GADGARGGAGCAATHGTDGGMGAAATYTCACCATTRCCTTCTYTTCCAGGACATACTDD；
流感病毒B型探针：
NH2-5’-CTGAAACTGCGRTGGGAGTCYTATCCCAATTTGGTCAAGAGCACCGATTATCACCAGAA；
副流感病毒1型探针：
NH2-5’-YAGATATAGGGAAGTCRTAYCAGGTTTTACAATTAGGTTAYATATCYTTAAATTCAGAT；
副流感病毒2型探针：
NH2-5’-CRRCATCTRAYCAGTATTTAKCAATGGGGATAATACAACAATCTGCTGCRGVRTTTCCA；
副流感病毒3型探针：
NH2-5’-CAAYGAATGTCCATGGGGACAYTCATGYCCRGATGGRTGYATAACRGGAGTRTATACHG；
副流感病毒4型探针：
NH2-5’-CCRCMRGATTATACATTAACYATTAAYCCAAGRTCTGGCTGGGATGAYATCAAGATCAG；
人类偏肺病毒探针：
NH2-5’-TYGAYGARTAYAGYAAAYTDGAHTTTGAYAARYTNACRGTYTGYGADGTWAAAACAGTT；
鼻病毒A型探针：
NH2-5’-DRRRGTGYGCAGGCAGCCACGCAGGCTRGAACACTGTYRCCAGTGGGGDDYTTCYAGCC；
鼻病毒B型探针：
NH2-5’-YYAGCCTGCGTGGCGGCCARCCCAGCDYHTGCTGGGACGCCHWTTYAHDGACATGGTGY；
鼻病毒C型探针：
NH2-5’-AAGRCHBKMRTGYGCTAVNHRTGABTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCYTAAMCC；
博卡病毒探针：
NH2-5’-ACRACTGTACTCTGACAGGATTTAAACAAAAATGGAATTTAGATAAAATTCCAAACYCA；
腺病毒探针：
NH2-5’-AARTTTAGRAACCCCACRGTGGCGCCYACCCACGATGTGACCACCGAYCGYAGCCAGCG；
冠状病毒229E探针：
NH2-5’-GRGTGGATTTGYCACCCAAGYTRYATTTTTATTATCTTGGCACAGGACCYCATAAAGMT；
冠状病毒HKU-1探针：
NH2-5’-CTATTATGTTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGCTTCTAATAGYCGRCCAGGTTCACGTTCTC；
冠状病毒NL63探针：
NH2-5’-ARTTGATTCCYAATCAGGCTGCDTTATTCTTTGATAGTGAGGTTAGCACTGAWGAAGTG；
冠状病毒OC43探针：
NH2-5’-TAGYGATGAGGCTATTYCGACTAGGTTTCCGCCTGGYACGGTACTCCCTCAGGGTTACT；
呼吸道合胞病毒A型探针：
NH2-5’-AYACTCCTAAYTAYGATGTRCAGAAACACATYAAYAAKYTATGTGGCATGTTATTAATC；
呼吸道合胞病毒B型探针：
NH2-5’-AGGATCAGCTGCTGTCATYCAGCAAATAYRCYATTCAACGTAGYACAGGAGATAATATT；
肺炎支原体探针：
NH2-5’-GCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAATGCCGCGTGAAC；
肺炎衣原体探针：
NH2-5’-TAATATCCAATYGATTTGAGCGTACCRGGTAAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGC；
嗜肺军团杆菌探针：
NH2-5’-TTGGGRAAGAAYTTTAARAATCAAGGCATWGATGTTARYCCGGAAGCAWTGGCTAAAGG；
肺炎链球菌探针：
NH2-5’-TACTATTTYRAYGWAGAAGGTGCCATGAAGACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACHTG；
內源对照GAPDH基因探针：
NH2-5’-TCCAAAATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTCTT；
阳性杂交点探针：
NH2-5’-CCCTCGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCGAGTTATGTTGCTGCGGAGATGG；
阴性杂交点探针：
NH2-5’-GATCGTCGTTGGGCTTTAGATTTCTCTTATAGGCTCGGTCGGCGCCTCTCGCCCCGAGC；
本发明中所述基因芯片为表面固定有探针阵列的固相支持介质，所述固相支持介质为玻璃片、硅片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。
本发明中所述呼吸道病原体检测试剂盒由引物组合、探针组合、基因芯片、辅料和配液组成，辅料为一步法逆转录扩增试剂(One Step RT-PCR Reagent)、超纯水(UltrapureWater)和5’端带Cy5标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带Cy5标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为Cy5-5′-CCATCTCCGCAGCAACATAACTCGCAACGTGTGGTGACAATCGCGCATTAACCCGAGGG-3’。
本发明中所述呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒由引物组合、探针组合、基因芯片、辅料和配液组成，配液为芯片点样液、芯片清洗液、杂交液、清洗液I和清洗液II。
上述方案中，所述芯片点样液为50％DMSO；芯片清洗液为5xSSC(20xSSC：3M NaCl，0.3M Na3Citrate·2H2O，pH 7.0)，0.2％SDS；杂交液为5xSSC，0.1％SDS；清洗液I为0.5xSSC，0.1％SDS；清洗液II为0.05xSSC。
本发明设计采用经特殊设计的多重特异性保守简并引物(Multiplex SpecificConserved Degenerate Primer)进行目标序列扩增。呼吸道病原体种类多样，已发现的常见病原体有二十几种，并且大多数是高度易突变的病原体，如流感病毒、鼻病毒和冠状病毒等，序列变异大，进化迅速，即使同一类病原体内部也存在多种不同变异株。针对呼吸道病原体种类多，变异快的特征，本发明在多重引物设计中解决两方面技术问题：一是设计特异性保守简并引物，保证引物在不同类病原体间的特异性，尤其是在不同亚型病原体间的特异性，同时设计保证引物在同一类病原体不同变异株间的保守性和检测覆盖度，引物采用特异性保守简并引物，即可以涵盖同一类病原体的多种变异类型，对目标基因的位点突变具有很强适应性，同时又可以有效地避免非特异性扩增，尤其适合检测高突变多亚型的病原体。二是设计解决多达20种以上病原体单反应体系多重扩增的问题，通过引物间的相互匹配设计，避免引物间的相互交联。
本发明采用基于多重特异性保守简并引物的一步法逆转录多重RT-PCR(One-stepReverse Transcription Polymerase Chain Reaction)扩增技术检测呼吸道病原体。多重RT-PCR方法是将多对引物放到同一个反应管中，并在同一体系中依次进行逆转录反应和PCR扩增反应，达到单管反应体系同时检测多种目标RNA/DNA序列的目的。
本发明采用一组特异性保守简并探针检测多重RT-PCR产物中的目标序列。简并探针采用长探针设计，长度为59个核苷酸，相对于短探针，长探针与目标基因的结合更牢固，检测灵敏度更高。特异性保守简并探针5’端带氨基(NH2)修饰，方便探针与基因芯片的结合。
本发明采用基因芯片方面进行呼吸道病原体的分子杂交检测，基因芯片技术基于核酸分子杂交原理。其工作过程是首先将针对各个呼吸道病原体的单链探针按顺序排列固定于固相支持介质表面的特定区域，形成低密度探针阵列，再将待测的多重RT-PCR产物与其杂交，这样产物中的目标基因序列就会和支持介质上的探针杂交，目标序列产物DNA上带有荧光基团标志，结合了待测DNA的探针点就偶联上了标志物，在经过相应洗涤和荧光扫描等步骤就能读取对应的杂交信号，这样一张芯片上就可以同时检测多个呼吸道病原体目标序列。
本发明的有益效果是：
1)提供呼吸道病原体多重PCR引物和检测探针组合，解决多达20种以上病原体单反应体系多重扩增和检测的问题；2)检测探针和引物采用特异性保守简并寡核苷酸设计，提高了对目标序列的检测覆盖度，尤其适合具有高突变特点的呼吸道病原体检测；3)设计避免了多重体系中不同引物之间的非特异性交叉反应；4)设计避免了引物与样本中潜在的非目标序列间的非特异性扩增；5)设计避免探针与非目标序列产物DNA的非特异性杂交；6)操作简单，经过一次样本前处理，单管RT-PCR扩增，单芯片杂交就可以同步检测样本中多种呼吸道病原体，具有平行分析和多重判断的特点；7)检验对象完备，包含了22种常见的呼吸道病原体，并且可以很方便的加入新的检测序列；8)试剂盒采用了基因芯片的检测方式，提高了系统的多指标平行检测能力；9)试剂盒操作简单，便捷，适用于呼吸道病原体的大规模检测。
附图说明
图1-3为本发明用于检测呼吸道病原体样本基因芯片杂交结果，其中：
图1为芯片探针分布模式图；
图2为22份呼吸道样本检测结果图；
图3为23份阳性对照(22种病原体标准核酸分子和1种GAPDH內源对照标准核酸分子)和1份阴性对照(H2O)检测结果图。
具体实施方式
呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，该试剂盒用于检测以下病原体中的一种或多种：流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人类偏肺病毒、鼻病毒A型、鼻病毒B型、鼻病毒C型、博卡病毒、腺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU-1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团杆菌和肺炎链球菌共22种呼吸道病原体的引物组合和探针组合；同时设有人GAPDH基因內源对照以及阳性对照和阴性对照。除引物和探针组合外，试剂盒中还包含基因芯片、辅料和配液。
实施例一：呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒。
1)多重特异性保守简并引物和探针的设计与制备：
从核酸数据库下载各病原体的核酸序列，进行多序列比对(NCBI database，ClustalW)，根据比对结果生成一条简并序列(Python程序)；剔除序列中的高变异区(Python程序)，并经引物设计过程生成多对候选引物(Primer3，Python程序)，序列比对分析候选引物特异性，以避免与样品中其他核酸发生交叉反应(BLAST+)；之后评估不同目标基因引物间兼容性，评估内容包括Tm值相似性、引物二聚体倾向和3’末端杂交倾向(Python程序)，最终生成多重简并引物组合；再根据引物扩增区域，使用相应程序设计特异性保守简并探针(Python程序)，再通过序列比对分析探针的特异性以避免与样品中其他核酸发生交叉反应(BLAST+)。內源对照GAPDH采用相同的设计方法。阳性对照探针和阴性对照探针为随机生成的59个核苷酸的寡核苷酸，并且通过序列比对避免与待检病原体序列发生非特异性交联。根据阳性对照探针生成阳性寡核苷酸单链DNA，其序列为阳性对照探针的反向互补序列。采用固相亚磷酰胺三酯法合成得到上述引物和探针组合以及相应的对照序列。最后通过实验方法验证探针和引物的性能。
2)制备基因芯片：
采用微定量喷点式基因芯片点样仪，将各个核苷酸探针(探针用芯片点样液溶解，浓度10μmol/L)分布在光学级氨基芯片上的特定位置区域。芯片置于80℃烘2小时以固定探针，固定后芯片在清洗液中清洗5分钟，后无水乙醇洗涤，离心甩干，处理好的芯片室温保存。芯片表面包被的探针阵列布局如图1。
3)制备阳性标准核酸分子：
使用基因合成的方法制备各病原体和内对照的阳性标准核酸分子，合成区包括PCR扩增区及上下游各150个核苷酸的区域。合成序列插入到pET-30a质粒载体，之后经过质粒提取、纯化和定量，并稀释成105copies/μl，用来作为多重PCR扩增和基因芯片检测的阳性标准核酸分子。
4)准备PCR反应预混液：使用SuperRT One Step RT-PCR Kit(CWBIO)，体系中含有逆转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等成分。每管反应需准备15μl反应预混液，预混液包含：2×RT-PCR反应缓冲液(12.5μl)、酶混合液(0.5μl)、引物混合液(2μl)，其中引物混合液中含有各病原体的扩增引物，其中每条Cy5标志的引物浓度为3.75μmol/L，每条非标志引物的浓度为2.5μmol/L。
5)提取样本核酸：采集待检临床样本，样本类型可以为鼻咽拭子样本、痰液、肺灌洗液等呼吸道样本。之后采用适当的核酸提取技术(如病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒Viral DNA/RNA Kit，CWBIO)从样本中抽提核酸。
6)多重PCR扩增反应：采用25μl扩增体系，组成为：PCR反应预混液(15μl)，样本提取核酸(5μl)，超纯水(5μl)。同时设置阳性对照(阳性标准核酸分子)和阴性对照(无菌水)，并以相同的体系对阳性对照和阴性对照进行混合操作。随后将各反应管按照如下程序进行多重PCR扩增：45℃保持30分钟(逆转录)；95℃保持2分钟(热启动)；之后进入35个热循环过程，94℃保持30秒，55℃保持30秒，72℃保持30秒；最后72℃保持5分钟。
7)基因芯片杂交检测：将芯片微阵列面朝上放入杂交设备中，在点阵位置加上配制好的杂交液(使用前配制，500～1000μl杂交液(5xSSC，0.1％SDS)中加入20μl多重PCR扩增产物，同时加入1μl浓度为2μmol/L阳性寡核苷酸单链DNA)，小心盖上杂交盒上盖，50℃杂交1小时；取出芯片，将芯片放入42℃清洗液I(0.5xSSC，0.1％SDS)中清洗2分钟，之后将芯片再放入42℃清洗液II(0.05xSSC)中清洗2分钟，离心甩干；用合适的荧光扫描仪扫描芯片(如博奥LuxScan 10k扫描仪)，之后根据杂交点荧光信号进行结果判读。
实施例二：呼吸道病原体阳性样本检测。
使用带有如下病原体的呼吸道阳性样本，样本类型为咽拭子采样或肺灌洗液：流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人类偏肺病毒、鼻病毒A型、鼻病毒B型、鼻病毒C型、博卡病毒、腺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU-1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团杆菌和肺炎链球菌，共22份阳性样本。同时设置阳性对照(22种病原体标准核酸分子和1种GAPDH內源对照标准核酸分子)和阴性对照(无菌水)，并以相同的过程实施检测。引物和探针组合、辅料、配液以及对照标准质粒分子的获取见实施例一。
利用核酸提取试剂盒(病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒Viral DNA/RNA Kit，CWBIO)从样本中抽提核酸，核酸最后溶于50μl核酸洗脱液。吸取5ul核酸样本，用于多重PCR扩增。采用25μl扩增体系，组成为：PCR反应预混液(15μl)，样本提取核酸(5μl)，超纯水(5μl)。同时设置阳性对照(阳性标准核酸分子)和阴性对照(无菌水)，并以相同的体系对阳性对照和阴性对照进行混合操作。随后将各反应管按照如下程序进行多重PCR扩增：45℃保持30分钟(逆转录)；95℃保持2分钟(热启动)；之后进入35个热循环过程，94℃保持30秒，55℃保持30秒，72℃保持30秒；最后72℃保持5分钟。
使用基因芯片方法检测多重PCR产物，具体过程同实施例一，之后根据杂交点的显色情况进行结果判读。结果22份样本中可分别检测到22中呼吸道病原体的存在，同时23份阳性对照(22种病原体标准核酸分子和1种GAPDH內源对照标准核酸分子)和1份阴性对照(无菌水)杂交点显色正确。检测结果如图2和图3。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州协云基因科技有限公司
<120> 呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒
<160> 71
<210> 1
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<212> DNA
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gctttyacng adgarggagc aa 22
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wgctcttagr atcattgaag ttgatgca 28
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tagacctggc agatgaggct 20
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cyccactagt ytggtcgatg aggct 25
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trctggatgt gcgcgaagta 20
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gcaaatayac catccaacgg agc 23
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<213> 人工序列
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yccagtgaat ttrtgattrg catcttctg 29
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tgyttttgya catcataatt gggagtgtc 29
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ggcccatact cctacgggag 20
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gcgactgctg gcacatagtt 20
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tgtaaagcac tttcgcctgg gaa 23
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caccctccgt attaccgcag ct 22
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gataagttgt cttatagcat tggtgccga 29
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<212> DNA
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ctttcatttg ytgytcggtt aaagcca 27
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gctggaagaa aatcgctgab aagtg 25
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ggtttgaggt agtaccarcc tgtt 24
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atcttccagg agcgagatcc 20
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agggggcaga gatgatgac 19
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gadgarggag caathgtdgg mgaaatytca ccattrcctt ctyttccagg acatactdd 59
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<212> DNA
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ctgaaactgc grtgggagtc ytatcccaat ttggtcaaga gcaccgatta tcaccagaa 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
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yagatatagg gaagtcrtay caggttttac aattaggtta yatatcytta aattcagat 59
<210> 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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crrcatctra ycagtattta kcaatgggga taatacaaca atctgctgcr gvrtttcca 59
<210> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
caaygaatgt ccatggggac aytcatgycc rgatggrtgy ataacrggag trtatachg 59
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ccrcmrgatt atacattaac yattaaycca agrtctggct gggatgayat caagatcag 59
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<213> 人工序列
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<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
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tygaygarta yagyaaaytd gahtttgaya arytnacrgt ytgygadgtw aaaacagtt 59
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<212> DNA
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drrrgtgygc aggcagccac gcaggctrga acactgtyrc cagtggggdd yttcyagcc 59
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yyagcctgcg tggcggccar cccagcdyht gctgggacgc chwttyahdg acatggtgy 59
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<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 56
aagrchbkmr tgygctavnh rtgabtcctc cggcccctga atgcggctaa tcytaamcc 59
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acractgtac tctgacagga tttaaacaaa aatggaattt agataaaatt ccaaacyca 59
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<400> 58
aartttagra accccacrgt ggcgccyacc cacgatgtga ccaccgaycg yagccagcg 59
<210> 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
grgtggattt gycacccaag ytryattttt attatcttgg cacaggaccy cataaagmt 59
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ctattatgtt gaaggctcag gaaggtctgc ttctaatagy cgrccaggtt cacgttctc 59
<210> 61
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<400> 61
arttgattcc yaatcaggct gcdttattct ttgatagtga ggttagcact gawgaagtg 59
<210> 62
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<213> 人工序列
<400> 62
tagygatgag gctattycga ctaggtttcc gcctggyacg gtactccctc agggttact 59
<210> 63
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<212> DNA
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ayactcctaa ytaygatgtr cagaaacaca tyaayaakyt atgtggcatg ttattaatc 59
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
aggatcagct gctgtcatyc agcaaatayr cyattcaacg tagyacagga gataatatt 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcagcagtag ggaatttttc acaatgagcg aaagcttgat ggagcaatgc cgcgtgaac 59
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taatatccaa tygatttgag cgtaccrggt aaagaagcac cggctaactc cgtgccagc 59
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<213> 人工序列
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tactatttyr aygwagaagg tgccatgaag acaggctggg tcaagtacaa ggacachtg 59
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gatcgtcgtt gggctttaga tttctcttat aggctcggtc ggcgcctctc gccccgagc 59

Claims (6)

1.一种呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，该试剂盒用于同时检测以下病原体：流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人类偏肺病毒、鼻病毒A型、鼻病毒B型、鼻病毒C型、博卡病毒、腺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU-1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团杆菌和肺炎链球菌；
试剂盒内设有呼吸道病原体的引物组合和探针组合，同时设有人GAPDH基因內源对照以及阳性对照和阴性对照；
其特征在于引物组合为由如下多重特异性保守简并引物组成，其中简并位点的核苷酸表示为R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
流感病毒A型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCTTTYACNGADGARGGAGCAA，
反向引物：Cy5-5’-AYSYCAAYTGCATTTTTGACATCCT；
流感病毒B型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCCAATTCGAGCAGCTGAAACTG，
反向引物：Cy5-5’-TCCGTRACYAGTCTAATTGTCTCYCTC；
副流感病毒1型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：TCAAACTTAATCACTCAAGGATGTGYAGAT，
反向引物：Cy5-5’-AGAAAYTRCCGGKTTTARATCAGGATACAT；
副流感病毒2型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：ACAATGTAATRCTTGGAGATTGYCTYGAT，
反向引物：Cy5-5’-GCTTTTSCGATTGATTCCATCACTTAGG；
副流感病毒3型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：TGGCATAATGTGYTATCAAGACCAGG，
反向引物：Cy5-5’-TCYARTATRACAGATGAYACAATGCTYCCT；
副流感病毒4型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：WGCTCTTAGRATCATTGAAGTTGATGCA，
反向引物：Cy5-5’-GCWARGCTRATAGGCAAATCYCTGG；
人类偏肺病毒，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：YGARGTMAATGCRACTGTRGCA，
反向引物：Cy5-5’-GCYGARCTYACAAAYTTTGAYACCA；
鼻病毒A型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCCGGAGGABTCAARGYGAG，
反向引物：Cy5-5’-TAGACCTGGCAGATGAGGCT；
鼻病毒B型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：CYCCACTAGTYTGGTCGATGAGGCT，
反向引物：Cy5-5’-NTCACAAYCAAGCACATGCRRGTCTT；
鼻病毒C型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：CACYGGYGACRGTGRYGTAGC，
反向引物：Cy5-5’-CCATCCCRYAATTRCTCRTTACGAC；
博卡病毒，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：ACTGCTACTGAGATTGCAGCTC，
反向引物：Cy5-5’-GCAGTATCCGTTTTCGTGAAGTGTA；
腺病毒，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：AGACACCTACTTCAGTMTKGGGAA，
反向引物：Cy5-5’-GGCACRAAGCGCAGCRTCAG；
冠状病毒229E，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：AACGTTTCAGAACTAGAAAGGGCA，
反向引物：Cy5-5’-TGTAGGYTCAGTTTTAGCACCATCAA；
冠状病毒HKU-1，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：CCTGGTACGATTYTGCCTCAAGG，
反向引物：Cy5-5’-ACGAKTATTGGGTCCACGTGAT；
冠状病毒NL63，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCCAAAGGTTTTCCACAGYTTGC，
反向引物：Cy5-5’-CTGCTCAATGAACTTAGGAAGGTTCTT；
冠状病毒OC43，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：CATTGTCGATCGGGACCCAA，
反向引物：Cy5-5’-TRCTGGATGTGCGCGAAGTA；
呼吸道合胞病毒A型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCAAATAYACCATCCAACGGAGC，
反向引物：Cy5-5’-YCCAGTGAATTTRTGATTRGCATCTTCTG；
呼吸道合胞病毒B型，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GGGCAAATACAAARATGGCTCTTAGC，
反向引物：Cy5-5’-TGYTTTTGYACATCATAATTGGGAGTGTC；
肺炎支原体，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GGCCCATACTCCTACGGGAG，
反向引物：Cy5-5’-GCGACTGCTGGCACATAGTT；
肺炎衣原体，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：TGTAAAGCACTTTCGCCTGGGAA，
反向引物：Cy5-5’-CACCCTCCGTATTACCGCAGCT；
嗜肺军团杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGA，
反向引物：Cy5-5’-CTTTCATTTGYTGYTCGGTTAAAGCCA；
肺炎链球菌，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：GCTGGAAGAAAATCGCTGABAAGTG，
反向引物：Cy5-5’-GGTTTGAGGTAGTACCARCCTGTT；
內源对照GAPDH基因，反向引物5’端带Cy5标志：
正向引物：ATCTTCCAGGAGCGAGATCC，
反向引物：Cy5-5’-AGGGGGCAGAGATGATGAC；
并且，所述探针组合为顺序固定于基因芯片表面的如下所示核酸探针，包括呼吸道病原体特异性保守简并探针、GAPDH內源对照探针，阳性杂交点探针和阴性杂交点探针，其中简并位点的核苷酸表示为R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T，各探针的5’端做氨基标志，各条探针的碱基序列5’-3’如下：
流感病毒A型探针：
NH2-5’-GADGARGGAGCAATHGTDGGMGAAATYTCACCATTRCCTTCTYTTCCAGGACATACTDD；
流感病毒B型探针：
NH2-5’-CTGAAACTGCGRTGGGAGTCYTATCCCAATTTGGTCAAGAGCACCGATTATCACCAGAA；
副流感病毒1型探针：
NH2-5’-YAGATATAGGGAAGTCRTAYCAGGTTTTACAATTAGGTTAYATATCYTTAAATTCAGAT；
副流感病毒2型探针：
NH2-5’-CRRCATCTRAYCAGTATTTAKCAATGGGGATAATACAACAATCTGCTGCRGVRTTTCCA；
副流感病毒3型探针：
NH2-5’-CAAYGAATGTCCATGGGGACAYTCATGYCCRGATGGRTGYATAACRGGAGTRTATACHG；
副流感病毒4型探针：
NH2-5’-CCRCMRGATTATACATTAACYATTAAYCCAAGRTCTGGCTGGGATGAYATCAAGATCAG；
人类偏肺病毒探针：
NH2-5’-TYGAYGARTAYAGYAAAYTDGAHTTTGAYAARYTNACRGTYTGYGADGTWAAAACAGTT；
鼻病毒A型探针：
NH2-5’-DRRRGTGYGCAGGCAGCCACGCAGGCTRGAACACTGTYRCCAGTGGGGDDYTTCYAGCC；
鼻病毒B型探针：
NH2-5’-YYAGCCTGCGTGGCGGCCARCCCAGCDYHTGCTGGGACGCCHWTTYAHDGACATGGTGY；
鼻病毒C型探针：
NH2-5’-AAGRCHBKMRTGYGCTAVNHRTGABTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCYTAAMCC；
博卡病毒探针：
NH2-5’-ACRACTGTACTCTGACAGGATTTAAACAAAAATGGAATTTAGATAAAATTCCAAACYCA；
腺病毒探针：
NH2-5’-AARTTTAGRAACCCCACRGTGGCGCCYACCCACGATGTGACCACCGAYCGYAGCCAGCG；
冠状病毒229E探针：
NH2-5’-GRGTGGATTTGYCACCCAAGYTRYATTTTTATTATCTTGGCACAGGACCYCATAAAGMT；
冠状病毒HKU-1探针：
NH2-5’-CTATTATGTTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGCTTCTAATAGYCGRCCAGGTTCACGTTCTC；
冠状病毒NL63探针：
NH2-5’-ARTTGATTCCYAATCAGGCTGCDTTATTCTTTGATAGTGAGGTTAGCACTGAWGAAGTG；
冠状病毒OC43探针：
NH2-5’-TAGYGATGAGGCTATTYCGACTAGGTTTCCGCCTGGYACGGTACTCCCTCAGGGTTACT；
呼吸道合胞病毒A型探针：
NH2-5’-AYACTCCTAAYTAYGATGTRCAGAAACACATYAAYAAKYTATGTGGCATGTTATTAATC；
呼吸道合胞病毒B型探针：
NH2-5’-AGGATCAGCTGCTGTCATYCAGCAAATAYRCYATTCAACGTAGYACAGGAGATAATATT；
肺炎支原体探针：
NH2-5’-GCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAATGCCGCGTGAAC；
肺炎衣原体探针：
NH2-5’-TAATATCCAATYGATTTGAGCGTACCRGGTAAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGC；
嗜肺军团杆菌探针：
NH2-5’-TTGGGRAAGAAYTTTAARAATCAAGGCATWGATGTTARYCCGGAAGCAWTGGCTAAAGG；
肺炎链球菌探针：
NH2-5’-TACTATTTYRAYGWAGAAGGTGCCATGAAGACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACHTG；
內源对照GAPDH基因探针：
NH2-5’-TCCAAAATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTCTT；
阳性杂交点探针：
NH2-5’-CCCTCGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCGAGTTATGTTGCTGCGGAGATGG；
阴性杂交点探针：
NH2-5’-GATCGTCGTTGGGCTTTAGATTTCTCTTATAGGCTCGGTCGGCGCCTCTCGCCCCGAGC。
2.根据权利要求1所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含引物组合、探针组合和基因芯片，基因芯片为表面固定有探针阵列的固相支持介质，探针阵列为权利要求1所述的呼吸道病原体特异性保守简并探针、GAPDH內源对照探针，阳性杂交点探针和阴性杂交点探针。
3.根据权利要求2所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，其特征在于所述固相支持介质为玻璃片、硅片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。
4.根据权利要求1或2所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含引物组合、探针组合、基因芯片、辅料，其中，所述辅料为一步法逆转录扩增试剂、超纯水和5’端带Cy5标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带Cy5标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基序列为Cy5-5'-CCATCTCCGCAGCAACATAACTCGCAACGTGTGGTGACAATCGCGCATTAACCCGAGGG-3’。
5.根据权利要求4所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含引物组合、基因芯片、辅料和配液，其中，所述配液为芯片点样液、芯片清洗液、杂交液、清洗液I和清洗液II。
6.根据权利要求5所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，其特征在于所述芯片点样液为50％DMSO；芯片清洗液为5xSSC，0.2％SDS；杂交液为5xSSC,0.1％SDS；清洗液I为0.5xSSC，0.1％SDS；清洗液II为0.05xSSC。
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