CN109797247A - 同时检测a型鼻病毒、b型鼻病毒和c型鼻病毒的核酸组合物及试剂盒和鼻病毒分型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物及试剂盒和鼻病毒分型的方法。该核酸组合物包括序列如A型鼻病毒扩增引物对、B型鼻病毒扩增引物对、C型鼻病毒扩增引物对、A型鼻病毒检测探针、B型鼻病毒检测探针及C型鼻病毒检测探针；上述三种鼻病毒检测探针连接有不同的荧光报告基团。上述核酸组合物能够同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物及试剂盒和鼻病毒分型的方法。
背景技术
鼻病毒(Human rhinovirus，HRV)是小RNA病毒科、鼻病毒属的一种，是人患普通感冒的主要病原。鼻病毒被分为三个大类：A型鼻病毒(Human rhinovirus A)、B型鼻病毒(Human rhinovirus B)和C型鼻病毒(Human rhinovirus C)。为了较好地研究不同分型的鼻病毒，需要开发一种能够同时检测上述三种鼻病毒分型的产品。然而，传统的检测产品单次不能达到分型检测的目的，当一次性检测多种病毒亚型时，多条引物或探针之间存在相互干扰，导致引物二聚体、假阳性等问题，而不能有效地检测不同分型的鼻病毒。
发明内容
基于此，有必提供一种同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物。
此外，还有必要提供一种同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的试剂盒和鼻病毒分型的方法。
一种同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物，包括：
序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的A型鼻病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示的B型鼻病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的C型鼻病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.7所示的A型鼻病毒检测探针；
序列如SEQ ID No.8所示的B型鼻病毒检测探针；及
序列如SEQ ID No.9所示的C型鼻病毒检测探针；
其中，所述A型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光猝灭基团，所述B型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光猝灭基团，所述C型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光猝灭基团，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团及所述第三荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中，三对病毒扩增引物对及其对应的检测探针相互配合，能够避免各引物和探针之间的相互干扰，以能够实现一次性即同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒，以对待测样品中的鼻病毒进行分型。经试验验证，上述核酸组合物能够对一管标本同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒三个项目，节省检测时间，灵敏度达100copies/mL，准确度高、特异性好、重复性好。
其中一个实施例中，还包括：鼻病毒通用型扩增引物对及与所述鼻病毒通用型扩增引物对对应的鼻病毒通用型检测探针，所述鼻病毒通用型检测探针上的两端分别连接有第四荧光报告基团和第四荧光猝灭基团，所述第四荧光报告基团与所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团、所述第三荧光报告基团均不同。
其中一个实施例中，所述鼻病毒通用型扩增引物对的序列如SEQ ID No.10及SEQID No.11所示；及
所述鼻病毒通用型检测探针的序列如SEQ ID No.12所示。
其中一个实施例中，所述A型鼻病毒检测探针的5’端连接有第一荧光报告基团，3’端连接有第一荧光猝灭基团；
所述B型鼻病毒检测探针的5’端连接有第二荧光报告基团，3’端连接有第二荧光猝灭基团；
所述C型鼻病毒检测探针的5’端连接有第三荧光报告基团，3’端连接有第三荧光猝灭基团；
所述鼻病毒通用型检测探针的5’端连接有第四荧光报告基团，3’端连接有第四荧光猝灭基团。
其中一个实施例中，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团、所述第三荧光报告基团及所述第四荧光报告基团分别选自FAM、VIC、TEXAS RED和CY5中的一种；及
所述第一荧光猝灭基团、所述第二荧光猝灭基团、所述第三荧光猝灭基团和所述第四荧光猝灭基团分别选自BHQ1及BHQ2中的一种。
一种同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的试剂盒，包括上述同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物。
其中一个实施例中，还包括RNA提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液、阳性对照品以及阴性对照品中的至少一种。
一种鼻病毒分型的方法，包括如下步骤：
向待测样品中加入同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物进行多重荧光定量PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析；
其中，所述同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物包括序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的A型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.3及SEQ IDNo.4所示的B型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的C型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.7所示的A型鼻病毒检测探针；序列如SEQ ID No.8所示的B型鼻病毒检测探针；及序列如SEQ ID No.9所示的C型鼻病毒检测探针；所述A型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光猝灭基团，所述B型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光猝灭基团，所述C型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光猝灭基团，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团及所述第三荧光报告基团不同。
其中一个实施例中，所述多重荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括：5mM的dNTPs、5μL的PCR反应液、10μmol的A型鼻病毒扩增引物对、20μmol的B型鼻病毒扩增引物对、10μmol的C型鼻病毒扩增引物对、4μmol的A型鼻病毒检测探针、6μmol的B型鼻病毒检测探针、5μmol的C型鼻病毒检测探针、1μL的酶混合液及0.5μL～5μL的所述待测样本RNA。
其中一个实施例中，所述多重荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：42℃～50℃逆转录20min～30min；94℃～95℃预变性1min～5min；94℃～95℃变性5s～15s，55℃～60℃退火、延伸、信号采集30s～60s，循环35次～45次。
附图说明
图1为pUC57载体的结构示意图；
图2为实施例2中不同浓度的阳性待测品的扩增曲线图；
图3为实施例2中不同浓度阳性待测品的鼻病毒通用型的FAM通道的灵敏度标准曲线；
图4为实施例2中不同浓度阳性待测品的A型鼻病毒的VIC通道的灵敏度标准曲线；
图5为实施例2中不同浓度阳性待测品的B型鼻病毒的TEXAS RED通道的灵敏度标准曲线；
图6为实施例2中不同浓度阳性待测品的C型鼻病毒的CY5通道的灵敏度标准曲线；
图7为实施例3中实验组的扩增曲线图；
图8为实施例3中对照组1的扩增曲线图；
图9为实施例3中对照组2的扩增曲线图；
图10为实施例3中对照组3的扩增曲线图；
图11为实施例3中对照组4的扩增曲线图；
图12为实施例3中对照组5的扩增曲线图；
图13为实施例3中对照组6的扩增曲线图；
图14为实施例4中精密度待测品重复性检测的扩增曲线图；
图15为实施例4中精密度待测品的鼻病毒通用型重复性检测的FAM通道的扩增曲线图；
图16为实施例4中精密度待测品的A型鼻病毒重复性检测的VIC通道的扩增曲线图；
图17为实施例4中精密度待测品的B型鼻病毒重复性检测的TEXAS RED通道的扩增曲线图；
图18为实施例4中精密度待测品的C型鼻病毒重复性检测的CY5通道的扩增曲线图；
图19为实施例5中阳性待测品和阴性对照品的扩增曲线图；
图20为实施例5中试剂盒1测定待测样品时的扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究提供一实施方式的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物，该核酸组合物包括序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的A型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示的B型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的C型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.7所示的A型鼻病毒检测探针；序列如SEQ ID No.8所示的B型鼻病毒检测探针；及序列如SEQ ID No.9所示的C型鼻病毒检测探针；其中，A型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光猝灭基团，B型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光猝灭基团，C型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光猝灭基团，第一荧光报告基团、第二荧光报告基团及第三荧光报告基团不同。
具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：5'-GAAGAGCCCCGTGTGCTC-3'；如SEQ IDNo.2所示的序列为：5'-GCTGCAGGGTTAAGGTTAGCC-3'；
如SEQ ID No.3所示的序列为：5'-ACTAGTYTGGTCGATGAGGCT-3'，兼并碱基Y为C碱基或T碱基；如SEQ ID No.4所示的序列为：5'-GCCACGCAGGCTAGGA-3'；
如SEQ ID No.5所示的序列为：5'-GAAGAGCCGCGTGTGCTA-3'；如SEQ ID No.6所示的序列为：5'-GCAACRGCTACGGGGTT-3'，兼并碱基R为A碱基或G碱基；
如SEQ ID No.7所示的序列为：5'-AGTCCTCCGGCCCCTGAATGT-3'；
如SEQ ID No.8所示的序列为：5'-ATTCCCCACGGGYGACCGTG-3'，兼并碱基Y为C碱基或T碱基；
如SEQ ID No.9所示的序列为：5'-AGTCCTCCGGCCCCTGAATGC-3'。
上述核酸组合物能够同时检测待测样品中上述三种亚型的鼻病毒，节省检测时间，灵敏度高、准确度高、特异性好、重复性好。
在其中一个实施方式中，待测样品为实验用病毒检测品。通过检测实验用病毒检测品中所含鼻病毒的类型，能够更好地对不同的鼻病毒进行研究，例如：研究上述三种鼻病毒的生活习性和分布情况等。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括鼻病毒通用型扩增引物对及与鼻病毒通用型扩增引物对对应的鼻病毒通用型检测探针，鼻病毒通用型检测探针上的两端分别连接有第四荧光报告基团和第四荧光猝灭基团，第四荧光报告基团与第一荧光报告基团、第二荧光报告基团、第三荧光报告基团均不同。通过设置鼻病毒通用型扩增引物对及鼻病毒通用型检测探针，该引物对及其探针能够与其他引物对及其探针之间不存在相互干扰，能够进一步验证所检出的不同分型的病毒是否为鼻病毒，以对待测样品进行双重鉴定，提高检测结果的准确性和特异性。
在一个具体示例中，鼻病毒通用型扩增引物对的序列如SEQ ID No.10及SEQ IDNo.11所示；鼻病毒通用型检测探针的序列如SEQ ID No.12所示。
具体地，如SEQ ID No.10所示序列为：5'-TDGACADGGTGTGAAGA-3'，兼并碱基D为G碱基、A碱基或T碱基；
如SEQ ID No.11所示序列为：5'-GGGTTARGRTTAGCCRCA-3'，兼并碱基R为A碱基或G碱基；
如SEQ ID No.12所示序列为：5'-TGAGTCCTCCGGCCCCTGA-3'。
需要说明的是，上述鼻病毒通用型扩增引物对与鼻病毒通用型检测探针的序列不限于上述指出的序列，也可以为其他序列，只要能够检测待测样品中的鼻病毒即可。
在其中一个实施例中，A型鼻病毒检测探针的5’端连接有第一荧光报告基团，3’端连接有第一荧光猝灭基团；B型鼻病毒检测探针的5’端连接有第二荧光报告基团，3’端连接有第二荧光猝灭基团；C型鼻病毒检测探针的5’端连接有第三荧光报告基团，3’端连接有第三荧光猝灭基团；鼻病毒通用型检测探针的5’端连接有第四荧光报告基团，3’端连接有第四荧光猝灭基团。
进一步地，第一荧光报告基团、第二荧光报告基团、第三荧光报告基团及第四荧光报告基团分别选自FAM、VIC、TEXAS RED和CY5中的一种。需要说明的是，第一荧光报告基团、第二荧光报告基团、第三荧光报告基团及第四荧光报告基团均不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团，只要第一荧光报告基团、第二荧光报告基团、第三荧光报告基团及第四荧光报告基团不同即可。
更进一步地，第一荧光猝灭基团、第二荧光猝灭基团、第三荧光猝灭基团和第四荧光猝灭基团分别选自BHQ1及BHQ2中的一种。需要说明的是，第一荧光淬灭基团、第二荧光淬灭基团、第三荧光淬灭基团、第四荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团、第二荧光淬灭基团、第三荧光淬灭基团、第四荧光淬灭基团可以相同，也可以不同。
在一个具体示例中，A型鼻病毒扩增引物对的5’端连接有第一荧光报告基团，3’端连接有第一荧光猝灭基团，第一荧光报告基团为VIC，第一荧光淬灭基团为BHQ1。B型鼻病毒扩增引物对的5’端连接有第二荧光报告基团，3’端连接有第二荧光猝灭基团，第二荧光报告基团为TEXAS RED，第二荧光淬灭基团为BHQ2。C型鼻病毒扩增引物对的5’端连接有第三荧光报告基团，3’端连接有第三荧光猝灭基团，第三荧光报告基团为CY5，第三荧光淬灭基团为BHQ2。鼻病毒通用型扩增引物对的5’端连接有第四荧光报告基团，3’端连接有第四荧光猝灭基团，第四荧光报告基团为FAM，第四荧光淬灭基团为BHQ1。
上述的四组探针能够与四组引物协同作用，实现一次性即同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒，节省检测时间，检测的灵敏度高、特异性好、准确性高。
在其中一个实施例中，核酸组合物为混合均匀的混合物。A型鼻病毒扩增引物对与A型鼻病毒检测探针的摩尔比为5:2；B型鼻病毒扩增引物对与B型鼻病毒检测探针的摩尔比为10:3；C型鼻病毒扩增引物对与C型鼻病毒检测探针的摩尔比为2:1；鼻病毒通用型扩增引物对与鼻病毒通用型检测探针的摩尔比为2:1。该混合配比的核酸组合物的灵敏度较高，特异性较好，能够实现对A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的迅速扩增，实现同时检测同一个样本中的A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒。
上述核酸组合物中，三对病毒扩增引物对及其相应的检测探针相互配合，能够避免各引物和探针之间的相互干扰，以能够实现一次性即同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒，以对待测样品中的鼻病毒进行分型。经试验验证，上述核酸组合物能够对一管标本同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒三个项目，节省检测时间，灵敏度达100copies/mL，准确度高、特异性好、重复性好。
再者，上述核酸组合物还包括鼻病毒通用型扩增引物对及鼻病毒通用型检测探针，该引物对及其探针能够与其他引物对及其探针之间不存在相互干扰，能够进一步验证所检出的不同分型的病毒是否为鼻病毒，以对待测样品进行双重鉴定，提高检测结果的准确性和特异性。
进一步地，上述核酸组合物中的四对病毒扩增引物对和四条对应的检测探针的设计合理，能够对一管待检测样同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒三个项目，只需操作一次，减少了污染产生的机会，保证检测的准确度，有利于对鼻病毒分型的研究。
此外，本研究还提供一实施方式的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的试剂盒，包括上述实施方式的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物。
在其中一个实施例中，该试剂盒还包括RNA提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液、阳性对照品以及阴性对照品中的至少一种。
在其中一个实施例中，酶混合液包括热启动Taq酶和逆转录酶。进一步地，Taq酶和逆转录酶的体积比为4:1。具体地，Taq酶为热启动Taq酶。逆转录酶为MMLV逆转录酶。
进一步地，酶混合液还包括RNA酶抑制剂。RNA酶抑制剂与Taq酶的体积比为3:4。
在其中一个实施例中，阳性对照品包括含有A型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA(命名为A型鼻病毒阳性标准品)、含有B型病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA(命名为B型鼻病毒阳性标准品)、含有C型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA(命名为C型鼻病毒阳性标准品)。进一步地，阳性对照品还包括含有鼻病毒通用型靶序列的质粒逆转录形成的RNA(命名为鼻病毒通用型阳性标准品)。
具体地，阳性对照品的制备过程如下：分别提取A型鼻病毒、B型鼻病毒、C型鼻病毒的RNA作为逆转录PCR模板，分别用相应的扩增引物对将相应的靶序列进行扩增，同时采用鼻病毒通用型扩增引物对对提取的A型鼻病毒RNA、提取的B型鼻病毒RNA、提取的C型鼻病毒RNA中的任意一种进行扩增；将得到的扩增产物分别连入载体中，分别获得含有对应病毒靶序列的质粒；将上述质粒分别进行逆转录，得到相应的RNA。
在一个具体示例中，载体为pUC57-载体。pUC57载体的结构示意图如图1所示。图1a为pUC57载体的结构示意图，图1b为采用M13通用引物对上述载体进行测序得到该载体的多克隆位点的结构示意图。图1中的“pUC57-Amp Veactor Map”表示的pUC57-Amp载体图谱，M13F-(-21)和M13F-(-47)为M13通用引物对的两个上游引物、M13R为M13通用引物对的一个下游引物。M13F-(-21)的序列如SEQ ID No.27所示，M13F-(-47)的序列如SEQ ID No.28所示，M13R的序列如SEQ ID No.29所示。采用M13通用引物对上述载体进行测序得到该载体的多克隆位点的序列如SEQ ID No.30所示。
具体地，如SEQ ID No.27所示的序列为：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；
如SEQ ID No.28所示的序列为：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；
如SEQ ID No.29所示的序列为：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'；
如SEQ ID No.30所示的序列为：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGACGCGTATTGGGATATCCCAATGGCGCGCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTG-3'。
在一个具体示例中，阳性对照品的制备过程如下：分别以如SEQ ID No.13所示的A型合成片段、如SEQ ID No.14所示B型合成片段、如SEQ ID No.15所示的C型合成片段和如SEQ ID No.16所示的通用型合成片段为模板，分别用相应的引物将相应的扩增片段进行扩增；将扩增产物连入载体中，分别获得含有A型鼻病毒靶序列的质粒、含有B型鼻病毒靶序列的质粒、含有C型鼻病毒靶序列的质粒、含有通用型靶序列的质粒；将上述质粒分别进行逆转录，得到相应的RNA，即含有A型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA、含有B型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA、含有C型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA、含通用型靶序列的质粒逆转录形成的RNA。其中，通用型靶序列即A型鼻病毒基因、B型鼻病毒基因和C型鼻病毒基因共有的一段序列。
其中，A型鼻病毒扩增片段如SEQ ID No.17所示；B型鼻病毒扩增片段如SEQ IDNo.18所示；C型鼻病毒扩增片段如SEQ ID No.19所示；通用型扩增片段如SEQ ID No.20所示。
具体地，如SEQ ID No.13所示的序列为：5'-GCGAAGCCATATGTTTGACAAGGTGTGAAGAGCCCCGTGTGCTCACTTTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGCAGCTAGTGCATGCAATCCAGCATGTGGCTAGTCGTAATGAGCAATTGCGGGATGGGACCAACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCAC-3'；
如SEQ ID No.14所示的序列为：5'-ACTAGTTTGGTCGATGAGGCTAGGAATTCCCCACGGGTGACCGTGTCCTAGCCTGCGTGGCGGCCAACCCAGC-3'；
如SEQ ID No.15所示的序列为：5'-GAAGCCTAGGAACGGACAGGGTGTGAAGAGCCCCGTGTGCTACCAATGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCTTACCCCGCAGCTGTTGCACACAATCCAGTGTGTATGCAGTCGTAATGAGCAATTGTGGGATGGAACCG-3'；
如SEQ ID No.16所示的序列为：5'-GAAGCCATATATTGGACAAGGTGTGAAGAGCCCCGTGTGCTTGTTTTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGCAGCTGGTGTGTGCAATCCAGCACATGGCCAGTCGTAATGAGTAATTGCGGGATGGGACCAACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-3'；
如SEQ ID No.17所示的序列为：5'-GAAGAGCCCCGTGTGCTCACTTTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGCAGC-3'；
如SEQ ID No.18所示的序列为：5'-ACTAGTTTGGTCGATGAGGCTAGGAATTCCCCACGGGTGACCGTGTCCTAGCCTGCGTGGCGGC-3'；
如SEQ ID No.19所示的序列为：5'-GAAGAGCCCCGTGTGCTACCAATGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCTTACCCCGCAGCTGTTGC-3'；
如SEQ ID No.20所示的序列为：5'-TGGACAAGGTGTGAAGAGCCCCGTGTGCTTGTTTTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGTGGCTAACCTTAACCC-3'。
在其中一个实施例中，阴性对照为不含有A型鼻病毒、B型鼻病毒、C型鼻病毒的生理盐水溶液。需要说明的是，阴性对照也可以为不含有A型鼻病毒基因、B型鼻病毒基因、C型鼻病毒基因和鼻病毒通用型基因的1×TE缓冲溶液或灭菌双蒸水等。
上述同时检测四种肠道病毒的试剂盒能够对一管待检测样同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒、C型鼻病毒三个项目，以对鼻病毒进行分型，检测时间短，检测的灵敏度高、准确度高、特异性好、重复性好，对不同分型的鼻病毒的研究具有指导意义。
进一步地，本研究提供一实施方式的鼻病毒分型的方法，包括如下步骤：向待测样品中加入同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物进行多重荧光定量PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析；同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物包括序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的A型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQID No.3及SEQ ID No.4所示的B型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的C型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.7所示的A型鼻病毒检测探针；序列如SEQID No.8所示的B型鼻病毒检测探针；及序列如SEQ ID No.9所示的C型鼻病毒检测探针；A型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光猝灭基团，B型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光猝灭基团，C型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光猝灭基团，第一荧光报告基团、第二荧光报告基团及第三荧光报告基团不同。
具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：5'-GAAGAGCCCCGTGTGCTC-3'；如SEQ IDNo.2所示的序列为：5'-GCTGCAGGGTTAAGGTTAGCC-3'；
如SEQ ID No.3所示的序列为：5'-ACTAGTYTGGTCGATGAGGCT-3'，兼并碱基Y为C碱基或T碱基；如SEQ ID No.4所示的序列为：5'-GCCACGCAGGCTAGGA-3'；
如SEQ ID No.5所示的序列为：5'-GAAGAGCCGCGTGTGCTA-3'；如SEQ ID No.6所示的序列为：5'-GCAACRGCTACGGGGTT-3'，兼并碱基R为A碱基或G碱基；
如SEQ ID No.7所示的序列为：5'-AGTCCTCCGGCCCCTGAATGT-3'；
如SEQ ID No.8所示的序列为：5'-ATTCCCCACGGGYGACCGTG-3'，兼并碱基Y为C碱基或T碱基；
如SEQ ID No.9所示的序列为：5'-AGTCCTCCGGCCCCTGAATGC-3'。
上述核酸组合物能够同时检测待测样品中上述三种类型的鼻病毒，节省检测时间，灵敏度高、准确度高、特异性好、重复性好。
在其中一个实施方式中，待测样品为实验用病毒检测品。通过检测实验用病毒检测品中所含鼻病毒的类型，能够更好的对不同的鼻病毒进行研究。进一步地，在向待测样品中加入同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物进行多重荧光定量PCR扩增反应的步骤之前，还包括提取待测样品中核酸的步骤。更进一步地，核酸为DNA或RNA。需要说明的是，若待测样品直接为DNA或RNA时，则提取待测样品中核酸的步骤省略。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括鼻病毒通用型扩增引物对及与鼻病毒通用型扩增引物对对应的鼻病毒通用型检测探针，鼻病毒通用型检测探针上的两端分别连接有第四荧光报告基团和第四荧光猝灭基团，第四荧光报告基团与第一荧光报告基团、第二荧光报告基团、第三荧光报告基团均不同。通过设置鼻病毒通用型扩增引物对及鼻病毒通用型检测探针，该引物对及其探针能够与其他引物对及其探针之间不存在相互干扰，能够进一步验证所检出的不同分型的病毒是否为鼻病毒，以对待测样品进行双重鉴定，提高检测结果的准确性和特异性。
在一个具体示例中，鼻病毒通用型扩增引物对的序列如SEQ ID No.10及SEQ IDNo.11所示；鼻病毒通用型检测探针的序列如SEQ ID No.12所示。
具体地，如SEQ ID No.10所示序列为：5'-TDGACADGGTGTGAAGA-3'，兼并碱基D为G碱基、A碱基或T碱基；
如SEQ ID No.11所示序列为：5'-GGGTTARGRTTAGCCRCA-3'，兼并碱基R为A碱基或G碱基；
如SEQ ID No.12所示序列为：5'-TGAGTCCTCCGGCCCCTGA-3'。
当然，需要说明的是，上述鼻病毒通用型扩增引物对与鼻病毒通用型检测探针的序列不限于上述指出的序列，也可以为其他序列，只要能够检测待测样品中的鼻病毒即可。
在其中一个实施例中，A型鼻病毒检测探针的5’端连接有第一荧光报告基团，3’端连接有第一荧光猝灭基团；B型鼻病毒检测探针的5’端连接有第二荧光报告基团，3’端连接有第二荧光猝灭基团；C型鼻病毒检测探针的5’端连接有第三荧光报告基团，3’端连接有第三荧光猝灭基团；鼻病毒通用型检测探针的5’端连接有第四荧光报告基团，3’端连接有第四荧光猝灭基团。
进一步地，第一荧光报告基团、第二荧光报告基团、第三荧光报告基团及第四荧光报告基团分别选自FAM、VIC、TEXAS RED和CY5中的一种。需要说明的是，第一荧光报告基团、第二荧光报告基团、第三荧光报告基团及第四荧光报告基团均不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团，只要第一荧光报告基团、第二荧光报告基团、第三荧光报告基团及第四荧光报告基团不同即可。
更进一步地，第一荧光猝灭基团、第二荧光猝灭基团、第三荧光猝灭基团和第四荧光猝灭基团分别选自BHQ1及BHQ2中的一种。需要说明的是，第一荧光淬灭基团、第二荧光淬灭基团、第三荧光淬灭基团、第四荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团、第二荧光淬灭基团、第三荧光淬灭基团、第四荧光淬灭基团可以相同，也可以不同。
在一个具体示例中，A型鼻病毒扩增引物对的5’端连接有第一荧光报告基团，3’端连接有第一荧光猝灭基团，第一荧光报告基团为VIC，第一荧光淬灭基团为BHQ1。B型鼻病毒扩增引物对的5’端连接有第二荧光报告基团，3’端连接有第二荧光猝灭基团，第二荧光报告基团为TEXAS RED，第二荧光淬灭基团为BHQ2。C型鼻病毒扩增引物对的5’端连接有第三荧光报告基团，3’端连接有第三荧光猝灭基团，第三荧光报告基团为CY5，第三荧光淬灭基团为BHQ2。鼻病毒通用型扩增引物对的5’端连接有第四荧光报告基团，3’端连接有第四荧光猝灭基团，第四荧光报告基团为FAM，第四荧光淬灭基团为BHQ1。
上述的四组探针能够与四组引物协同作用，实现一次性即同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒，以对待测样品中的鼻病毒进行分型，节省检测时间，检测的灵敏度高、特异性好、准确性高。
在其中一个实施例中，核酸组合物为混合均匀的混合物。A型鼻病毒扩增引物对与A型鼻病毒检测探针的摩尔比为5:2；B型鼻病毒扩增引物对与B型鼻病毒检测探针的摩尔比为10:3；C型鼻病毒扩增引物对与C型鼻病毒检测探针的摩尔比为2:1；鼻病毒通用型扩增引物对与鼻病毒通用型检测探针的摩尔比为2:1。该混合配比的核酸组合物的灵敏度较高，特异性较好，能够实现对A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的迅速扩增，实现同时检测同一个样本中的A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒。
在其中一个实施例中，多重荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括：5mM的dNTPs、5μL的PCR反应液、10μmol的A型鼻病毒扩增引物对、20μmol的B型鼻病毒扩增引物对、10μmol的C型鼻病毒扩增引物对、4μmol的A型鼻病毒检测探针、6μmol的B型鼻病毒检测探针、5μmol的C型鼻病毒检测探针、1μL的酶混合液及0.5μL～5μL的待测样本RNA。进一步地，多重荧光定量PCR扩增反应的反应体系还包括：10μmol的鼻病毒通用型扩增引物对和5μmol的鼻病毒通用型检测探针。
在其中一个实施例中，多重荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：42℃～50℃逆转录20min～30min；94℃～95℃预变性1min～5min；94℃～95℃变性5s～15s，55℃～60℃退火、延伸、信号采集30s～60s，循环35次～45次。
在其中一个实施例中，多重荧光定量PCR扩增反应在多重荧光定量PCR仪中进行。进一步地，多重荧光定量PCR仪为ABI系列多重荧光定量PCR仪、Bio-Rad系列(ICycler/MJOpticon 2)多重荧光定量PCR仪、Stratagene MX系列多重荧光定量PCR仪、RocheLightcycler多重荧光定量PCR仪、Ccpheid smartcycler多重荧光定量PCR仪、CorbettRortor-Gene多重荧光定量PCR仪、杭州博日系列多重荧光定量PCR仪。需要说明的是，多重荧光定量PCR仪不限于上述指出的PCR仪，其他多重荧光定量PCR仪也能够用于本研究中。
具体地，同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的检测方法包括如下步骤S110～S130：
S110、提取待测样品中的核酸。
在一个具体示例中，提取待测样品中的RNA。
需要说明的是，待测样品为核酸时，则提取待测样品中核酸的步骤可以省略。
S120、向核酸中加入上述同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物进行多重荧光定量PCR扩增反应，得到待测样品的扩增曲线和Ct。
在一个具体示例中，S120包括：以待测样品中的RNA为模板，加入上述各病毒扩增引物对和上述各病毒检测探针，收集第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道及第四荧光通道的荧光信号，得到第一荧光通道对应的第一扩增曲线和Ct1、第二荧光通道对应的第二扩增曲线和Ct2、第三荧光通道对应的第三扩增曲线和Ct3、第四荧光通道对应的第四扩增曲线和Ct4，第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道及第四荧光通道分别对应于A型鼻病毒检测探针、B型鼻病毒检测探针、C型鼻病毒检测探针和鼻病毒通用型检测探针。
S130、对扩增曲线和Ct进行分析，若扩增曲线呈S形，且Ct值小于或等于38，则待测样品含有A型鼻病毒、B型鼻病毒、C型鼻病毒中的至少一种。
在其中一个实施例中，S130包括：对第一扩增曲线、第二扩增曲线、第三扩增曲线、第四扩增曲线、Ct1、Ct2、Ct3及Ct4进行分析。若第四扩增曲线呈S形，且Ct4值小于或等于38，则待测样品含有鼻病毒。进一步地，若第一扩增曲线呈S形，且Ct1值小于或等于38，则待测样品含有A型鼻病毒；若第二扩增曲线呈S形，且Ct2值小于或等于38，则待测样品含有B型鼻病毒；若第三扩增曲线呈S形，且Ct3值小于或等于38，则待测样品含有C型鼻病毒。
上述鼻病毒分型的方法能够同时检出一管待检测样中是否含有A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒三种类型的鼻病毒，以对待测样品中的鼻病毒进行分型，以利于对鼻病毒进行非疾病的治疗和诊断的相关研究，检测时间短，检测的灵敏度高、准确度高、特异性好、重复性好。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
提供一种同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的试剂盒。
试剂盒包括RT-PCR反应液、同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物、酶混合液、阳性对照和阴性对照。
其中，RT-PCR反应液为自行配置的包括：250mM的Tris-base、质量百分含量为0.25％的TritonX-100、25mmol/L的MgCl2。
核酸组合物包括：
序列如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示的鼻病毒通用型扩增引物对；
序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的A型鼻病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示的B型鼻病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的C型鼻病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.12所示的鼻病毒通用型检测探针，鼻病毒通用型检测探针的5’端连接有FAM，3’端连接有BHQ1；
序列如SEQ ID No.7所示的A型鼻病毒检测探针；A型鼻病毒检测探针的5’端连接有VIC，3’端连接有BHQ1；
序列如SEQ ID No.8所示的B型鼻病毒检测探针，B型鼻病毒检测探针的5’端连接有TEXAS RED，3’端连接有BHQ2；及
序列如SEQ ID No.9所示的C型鼻病毒检测探针；C型鼻病毒检测探针的5’端连接有CY5，3’端连接有BHQ2。
酶混合液包括热启动Taq酶、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂。
阳性对照品包括：含有A型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA(命名为A型鼻病毒阳性标准品)、含有B型病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA(命名为B型鼻病毒阳性标准品)、含有C型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA(命名为C型鼻病毒阳性标准品)、含有通用型靶序列的质粒逆转录形成的RNA(命名为通用型阳性标准品)。
具体地，阳性对照品的制备过程如下：分别以如SEQ ID No.13所示的A型合成片段、如SEQ ID No.14所示B型合成片段、如SEQ ID No.15所示的C型合成片段和如SEQ IDNo.16所示的通用型合成片段为模板，分别用相应的引物将相应的扩增片段进行扩增；将扩增产物连入载体中，分别获得含有A型鼻病毒靶序列的质粒、含有B型鼻病毒靶序列的质粒、含有C型鼻病毒靶序列的质粒、含有通用型靶序列的质粒；将上述质粒分别进行逆转录，得到相应的RNA，即含有A型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA、含有B型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA、含有C型鼻病毒靶序列的质粒逆转录形成的RNA、含通用型靶序列的质粒逆转录形成的RNA。其中，A型鼻病毒的扩增片段如SEQ ID No.17所示；B型鼻病毒的扩增片段如SEQ ID No.18所示；C型鼻病毒的扩增片段如SEQ ID No.19所示；通用型扩增片段如SEQ ID No.20所示。
阴性对照为不含有A型鼻病毒基因、B型鼻病毒基因、C型鼻病毒基因和鼻病毒通用型基因的生理盐水溶液。
实施例2
测定实施例1的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的试剂盒的灵敏度
(1)将实施例1的试剂盒中A型鼻病毒阳性标准品、B型鼻病毒阳性标准品、C型鼻病毒阳性标准品、鼻病毒通用型阳性标准品混合并配成混合液，得到阳性待测品。
(2)对阳性待测品进行10倍梯度稀释(即100copies/mL～106copies/mL)，采用实施例1的试剂盒对各梯度下的阳性待测品进行多重荧光定量PCR检测，多重荧光定量PCR反应的体系如表1所示。多重荧光定量PCR反应的反应条件为：45℃逆转录15min；95℃预变性3min；94℃变性10s，60℃退火、延伸、信号采集40s，循环40次。
表1多重荧光定量PCR反应的体系
其中，反应体系中热启动Taq酶、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂的体积比为4:1:3。ddH2O即为双蒸水。反应体系中的所有试剂放在同一反应管中进行多重荧光定量PCR检测。
(3)结果分析：通过荧光扩增曲线图和Ct值的大小来判断检测结果的阴阳性，确定样品中是否含有A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒。具体地，当扩增曲线图Ct值≤38，并扩增曲线呈现明显指数增长(即S型)时，结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值>38或无Ct值，结果表现为阴性。检测结果如图2～6所示。
其中，图2为实施例2中不同浓度的阳性待测品的扩增曲线图。图3为实施例2中不同浓度阳性待测品的鼻病毒通用型的FAM通道的灵敏度标准曲线。图4为实施例2中不同浓度阳性待测品的A型鼻病毒的VIC通道的灵敏度标准曲线。图5为实施例2中不同浓度阳性待测品的B型鼻病毒的TEXAS RED通道的灵敏度标准曲线。图6为实施例2中不同浓度阳性待测品的C型鼻病毒的CY5通道的灵敏度标准曲线。
从图2～6可以看出，实施例1的试剂盒能够同时一次性检测一份待测样品中的A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒，节省检测时间，并且A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒在100copies/mL～106copies/mL范围内的扩增曲线均呈良好的线性关系，三种鼻病毒的检测灵敏度均达到100copies/mL，灵敏度较高。再者，通过鼻病毒通用型扩增引物对及鼻病毒通用型检测探针进行检测，能够进一步验证待测样品中含有鼻病毒，特异性和准确性较高。
实施例3
(1)将实施例1的试剂盒中A型鼻病毒阳性标准品、B型鼻病毒阳性标准品、C型鼻病毒阳性标准品、鼻病毒通用型阳性标准品混合并配成混合液，得到阳性待测品；不含上述四种病毒阳性对照品的生理盐水为阴性待测品。
(2)实验分为实验组、对照组1～6，实验组的试剂盒为实施例1的试剂盒。
其中，对照组1的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同，不同之处在于，A型鼻病毒扩增引物对的序列如SEQ ID No.21及SEQ ID No.22所示。具体地，如SEQ ID No.21所示的序列为：5'-GAGAAGAGCCCCGTGTGCTC-3'；如SEQ ID No.22所示的序列为：5'-CTGCAGGGTTAAGGTTAGCC-3'。
对照组2的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同，不同之处在于，B型鼻病毒扩增引物对的序列如SEQ ID No.23及SEQ ID No.4所示，且与B型鼻病毒扩增引物对对应的B型鼻病毒检测探针的序列如SEQ ID No.24所示。具体地，如SEQ ID No.23所示的序列为：5'-ACTAGTTTGGTCGATGAGGCTAG-3'；如SEQ ID No.24所示的序列为：5'-ATTCCCCACGGGTGACCGTGTCC-3'。
对照组3的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同，不同之处在于，鼻病毒通用型扩增引物对的序列如SEQ ID No.10及SEQ ID No.25所示，且与鼻病毒通用型扩增引物对对应的鼻病毒通用型检测探针的序列如SEQ ID No.26所示。具体地，如SEQ ID No.25所示的序列为：5'-AGGGTTARGRTTAGCCRCA-3'，兼并碱基R为A碱基或G碱基；如SEQ ID No.26所示的序列为：5'-TGAGTCCTCCGGCCCCTGAATG-3'。
对照组4的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同，不同之处在于，对照组4的核酸组合物由A型鼻病毒扩增引物对和A型鼻病毒检测探针构成，且对照组4的A型鼻病毒扩增引物对和A型鼻病毒检测探针分别与对照组1的A型鼻病毒扩增引物对和A型鼻病毒检测探针相同。
对照组5的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同，不同之处在于，对照组5的核酸组合物由B型鼻病毒扩增引物对和B型鼻病毒检测探针构成，且对照组5的B型鼻病毒扩增引物对和B型鼻病毒检测探针分别与对照组2的B型鼻病毒扩增引物对和B型鼻病毒检测探针相同。
对照组6的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同，不同之处在于，对照组6的核酸组合物由鼻病毒通用型扩增引物对和鼻病毒通用型检测探针构成，且对照组6的鼻病毒通用型扩增引物对和鼻病毒通用型检测探针分别与对照组3的鼻病毒通用型扩增引物对和鼻病毒通用型检测探针相同。
(3)采用实验组的试剂盒、对照组1～6的试剂盒对阳性待测品和阴性待测品均进行多重荧光定量PCR检测，反应体系、反应条件和结果分析与实施例2相同。检测结果如图7～13所示。
其中，图7为实施例3中实验组的扩增曲线图，图7中箭头(7-1)所指曲线为C型鼻病毒的扩增曲线，图7中箭头(7-2)所指曲线为A型鼻病毒的扩增曲线，图7中箭头(7-3)所指曲线为B型鼻病毒的扩增曲线，图7中箭头(7-4)所指曲线为鼻病毒通用型的扩增曲线。图8为实施例3中对照组1的扩增曲线图，图8中箭头(8-1)所指曲线为C型鼻病毒的扩增曲线，图8中箭头(8-3)所指曲线为B型鼻病毒的扩增曲线，图8中箭头(8-4)所指曲线为鼻病毒通用型的扩增曲线。图9为实施例3中对照组2的扩增曲线图，图9中箭头(9-1)所指曲线为C型鼻病毒的扩增曲线，图9中箭头(9-2)所指曲线为A型鼻病毒的扩增曲线，图9中箭头(9-3)所指曲线为B型鼻病毒的扩增曲线，图9中箭头(9-4)所指曲线为鼻病毒通用型的扩增曲线。图10为实施例3中对照组3的扩增曲线图，图10中箭头(10-1)所指曲线为C型鼻病毒的扩增曲线，图10中箭头(10-2)所指曲线为A型鼻病毒的扩增曲线，图10中箭头(10-3)所指曲线为B型鼻病毒的扩增曲线，图10中箭头(10-4)所指曲线为鼻病毒通用型的扩增曲线。图11为实施例3中对照组4的扩增曲线图。图12为实施例3中对照组5的扩增曲线图。图13为实施例3中对照组6的扩增曲线图。
从图7可以看出，实验组得到四条S型扩增曲线，同时阴性待测品无扩增曲线，说明实验组的试剂盒能够同时检测出阳性待测样品中的A型鼻病毒、B型鼻病毒、C型鼻病毒，并验证阳性待测样品中所含的病毒为鼻病毒，各通道之间的信号值差异较小，不会出现非特异性扩增曲线。
从图11可以看出，单独采用对照组4的A型鼻病毒扩增引物对和A型鼻病毒检测探针进行扩增能够得到S型扩增曲线。而从图8可以看出，对照组1得到三条S型扩增曲线，未能够扩增A型鼻病毒阳性标准品，说明对照组1的四对引物对和四条探针之间存在相互干扰，导致未能同时检测上述三种鼻病毒。
从图12可以看出，单独采用对照组5的B型鼻病毒扩增引物对和B型鼻病毒检测探针进行扩增能够得到S型扩增曲线，且无假阳性扩增曲线。而从图9可以看出，对照组2得到四条S型扩增曲线，说明对照组2能够同时检测出待测样品中的A型鼻病毒、B型鼻病毒、C型鼻病毒，但是却存在假阳性扩增曲线，说明对照组2的四对引物对和四条探针进行鼻病毒检测时容易出现假阳性。
从图13可以看出，单独采用对照组6的鼻病毒通用型扩增引物对和鼻病毒通用型检测探针进行扩增能够得到S型扩增曲线，且信号值较高。而从图10可以看出，对照组3得到四条S型扩增曲线，说明对照组3能够同时检测出待测样品中的A型鼻病毒、B型鼻病毒、C型鼻病毒，但是各通道的信号值差异较大，容易出现假阴性的情况，导致检测灵敏度和准确性较差。
实施例4
将实施例1的试剂盒中A型鼻病毒阳性标准品、B型鼻病毒阳性标准品、C型鼻病毒阳性标准品、鼻病毒通用型阳性标准品混合并配成混合液，得到阳性待测品。将阳性待测品进行100倍稀释，得到精密度待测品，用实施例1所用的试剂盒进行多重荧光定量PCR扩增，扩增精密度待测品10个复孔，检测结果如图14～18所示。图14为实施例4中精密度待测品重复性检测的扩增曲线图。图15为实施例4中精密度待测品的鼻病毒通用型重复性检测的FAM通道的扩增曲线图。图16为实施例4中精密度待测品的A型鼻病毒重复性检测的VIC通道的扩增曲线图。图17为实施例4中精密度待测品的B型鼻病毒重复性检测的TEXAS RED通道的扩增曲线图。图18为实施例4中精密度待测品的C型鼻病毒重复性检测的CY5通道的扩增曲线图。
从图14～18可以看出，上述实施方式的试剂盒各通道的精密度都较好，导出CT值数据，计算获得精密度均≤3％，该试剂盒的扩增重复性非常好。
实施例5
(1)将实施例1的试剂盒中A型鼻病毒阳性标准品、B型鼻病毒阳性标准品、C型鼻病毒阳性标准品、鼻病毒通用型阳性标准品混合并配成混合液，得到阳性待测品，阳性待测品的浓度为105copies/mL。阴性对照品为不含上述四种病毒阳性对照品的生理盐水为。
(2)待提取样品共15例，分别为1例A型鼻病毒样本，2例B型鼻病毒样本，2例C型鼻病毒样本，1例呼吸道合胞病毒样本，2例人偏肺病毒样本和2例甲型流感病毒样本，所有样本均来自于深圳市龙华区疾控中心。采用病毒RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)分别提取各待提取样品中的RNA，得到相应的待测样品。
(3)采用实施例1的试剂盒(即试剂盒1)对阳性待测品、阴性对照待测品及步骤(2)的各待测样品进行进行多重荧光定量PCR检测，反应体系、反应条件和结果分析与实施例2相同。同时采用试剂盒2对步骤(2)的各待测样品进行进行多重荧光定量PCR检测，反应体系、反应条件和结果分析与实施例2相同，试剂盒2与试剂盒1大致相同，不同之处在于，试剂盒2不含有鼻病毒通用型扩增引物对及鼻病毒通用型检测探针。计算试剂盒1和试剂盒2对上述待测样品的检测准确性。测定结果如图19～20和表2所示。图19为实施例5中阳性待测品和阴性对照品的扩增曲线图，图19中箭头(19-1)所指曲线为C型鼻病毒的扩增曲线，图19中箭头(19-2)所指曲线为A型鼻病毒的扩增曲线，图19中箭头(19-3)所指曲线为B型鼻病毒的扩增曲线，图19中箭头(19-4)所指曲线为鼻病毒通用型的扩增曲线，图19中箭头(19-5)所指曲线为阴性对照品的扩增曲线。图20为实施例5中试剂盒1测定待测样品时的扩增曲线图。
表2试剂盒1和试剂盒2对待测样品的准确性测定结果
| A型鼻病毒(例) | B型鼻病毒(例) | C型鼻病毒(例) | 鼻病毒的总数(例) | 准确性(％) | |
| 试剂盒1 | 1 | 2 | 2 | 5 | 100 |
| 试剂盒2 | 1 | 2 | 1 | 4 | 80 |
从图19可以看出，实施例1的试剂盒能够检测出阳性待测品中的四种病毒，阴性对照品中未检测上述四种病毒，说明实施例1的试剂盒具有较高的特异性。
从图20和表1可以看出，试剂盒1和试剂盒2均能够同时检测A型、B型及C型三种鼻病毒。其中，采用试剂盒1对待测样品进行检测，能够检出有1例A型鼻病毒样本、2例B型鼻病毒样本、2例C型鼻病毒样本，1例呼吸道合胞病毒、2例偏肺病毒和2例甲型型流感病毒未检出，检测准确率达100％。
综上所述，上述实施方式的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的试剂盒能够对一管标本同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒三个项目，以能够对鼻病毒进行分型，检测时间短，检测的灵敏度高、准确度高、特异性好、重复性好，对临床应用具有较高的指导意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市艾伟迪生物科技有限公司
<120> 同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物及试剂盒和鼻病毒分型的方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaagagcccc gtgtgctc 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgcagggt taaggttagc c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actagtytgg tcgatgaggc t 21
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccacgcagg ctagga 16
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagagccgc gtgtgcta 18
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaacrgcta cggggtt 17
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtcctccgg cccctgaatg t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attccccacg ggygaccgtg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtcctccgg cccctgaatg c 21
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tdgacadggt gtgaaga 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggttargrt tagccrca 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgagtcctcc ggcccctga 19
<210> 13
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcgaagccat atgtttgaca aggtgtgaag agccccgtgt gctcactttg agtcctccgg 60
cccctgaatg tggctaacct taaccctgca gctagtgcat gcaatccagc atgtggctag 120
tcgtaatgag caattgcggg atgggaccaa ctactttggg tgtccgtgtt tcac 174
<210> 14
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
actagtttgg tcgatgaggc taggaattcc ccacgggtga ccgtgtccta gcctgcgtgg 60
cggccaaccc agc 73
<210> 15
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaagcctagg aacggacagg gtgtgaagag ccccgtgtgc taccaatgag tcctccggcc 60
cctgaatgcg gctaatctta ccccgcagct gttgcacaca atccagtgtg tatgcagtcg 120
taatgagcaa ttgtgggatg gaaccg 146
<210> 16
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaagccatat attggacaag gtgtgaagag ccccgtgtgc ttgttttgag tcctccggcc 60
cctgaatgtg gctaacctta accctgcagc tggtgtgtgc aatccagcac atggccagtc 120
gtaatgagta attgcgggat gggaccaact actttgggtg tccgtgtttc 170
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaagagcccc gtgtgctcac tttgagtcct ccggcccctg aatgtggcta accttaaccc 60
tgcagc 66
<210> 18
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
actagtttgg tcgatgaggc taggaattcc ccacgggtga ccgtgtccta gcctgcgtgg 60
cggc 64
<210> 19
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaagagcccc gtgtgctacc aatgagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcttacccc 60
gcagctgttg c 71
<210> 20
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tggacaaggt gtgaagagcc ccgtgtgctt gttttgagtc ctccggcccc tgaatgtggc 60
taaccttaac cc 72
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagaagagcc ccgtgtgctc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctgcagggtt aaggttagcc 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
actagtttgg tcgatgaggc tag 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
attccccacg ggtgaccgtg tcc 23
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agggttargr ttagccrca 19
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgagtcctcc ggcccctgaa tg 22
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caggaaacag ctatgac 17
<210> 30
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattg acgcgtattg 60
ggatatccca atggcgcgcc gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctg 115
Claims (10)
1.一种同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的A型鼻病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示的B型鼻病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的C型鼻病毒扩增引物对；
序列如SEQ ID No.7所示的A型鼻病毒检测探针；
序列如SEQ ID No.8所示的B型鼻病毒检测探针；及
序列如SEQ ID No.9所示的C型鼻病毒检测探针；
其中，所述A型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光猝灭基团，所述B型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光猝灭基团，所述C型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光猝灭基团，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团及所述第三荧光报告基团不同。
2.根据权利要求1所述的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物，其特征在于，还包括：鼻病毒通用型扩增引物对及与所述鼻病毒通用型扩增引物对对应的鼻病毒通用型检测探针，所述鼻病毒通用型检测探针上的两端分别连接有第四荧光报告基团和第四荧光猝灭基团，所述第四荧光报告基团与所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团、所述第三荧光报告基团均不同。
3.根据权利要求2所述的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物，其特征在于，所述鼻病毒通用型扩增引物对的序列如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示；及
所述鼻病毒通用型检测探针的序列如SEQ ID No.12所示。
4.根据权利要求2所述的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物，其特征在于，所述A型鼻病毒检测探针的5’端连接有第一荧光报告基团，3’端连接有第一荧光猝灭基团；
所述B型鼻病毒检测探针的5’端连接有第二荧光报告基团，3’端连接有第二荧光猝灭基团；
所述C型鼻病毒检测探针的5’端连接有第三荧光报告基团，3’端连接有第三荧光猝灭基团；
所述鼻病毒通用型检测探针的5’端连接有第四荧光报告基团，3’端连接有第四荧光猝灭基团。
5.根据权利要求2～4任一项所述的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物，其特征在于，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团、所述第三荧光报告基团及所述第四荧光报告基团分别选自FAM、VIC、TEXAS RED和CY5中的一种；及
所述第一荧光猝灭基团、所述第二荧光猝灭基团、所述第三荧光猝灭基团和所述第四荧光猝灭基团分别选自BHQ1及BHQ2中的一种。
6.一种同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物。
7.根据权利要求6所述的同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的试剂盒，其特征在于，还包括RNA提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液、阳性对照品以及阴性对照品中的至少一种。
8.一种鼻病毒分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
向待测样品中加入同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物进行多重荧光定量PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析；
其中，所述同时检测A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒的核酸组合物包括序列如SEQID No.1及SEQ ID No.2所示的A型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示的B型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的C型鼻病毒扩增引物对；序列如SEQ ID No.7所示的A型鼻病毒检测探针；序列如SEQ ID No.8所示的B型鼻病毒检测探针；及序列如SEQ ID No.9所示的C型鼻病毒检测探针；所述A型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光猝灭基团，所述B型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光猝灭基团，所述C型鼻病毒检测探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光猝灭基团，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团及所述第三荧光报告基团不同。
9.根据权利要求8所述的鼻病毒分型的方法，其特征在于，所述多重荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括：5mM的dNTPs、5μL的PCR反应液、10μmol的A型鼻病毒扩增引物对、20μmol的B型鼻病毒扩增引物对、10μmol的C型鼻病毒扩增引物对、4μmol的A型鼻病毒检测探针、6μmol的B型鼻病毒检测探针、5μmol的C型鼻病毒检测探针、1μL的酶混合液及0.5μL～5μL的所述待测样本RNA。
10.根据权利要求8所述的鼻病毒分型的方法，其特征在于，所述多重荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：42℃～50℃逆转录20min～30min；94℃～95℃预变性1min～5min；94℃～95℃变性5s～15s，55℃～60℃退火、延伸、信号采集30s～60s，循环35次～45次。
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