CN111286530B - 一种基于核酸质谱法检测27种呼吸道病原体的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种基于核酸质谱法检测27种呼吸道病原体的引物组、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于核酸质谱技术可以同时检测27种呼吸道病原体的引物组、试剂盒和应用，属于病原体核酸检测领域。本发明试剂盒针对临床常见的27种呼吸道病原体设计了PCR扩增引物和单碱基延伸引物。病原菌对应引物和单碱基延伸引物序列见SEQ ID NO:1‑81。本发明的核酸质谱法整合了多重RT‑PCR技术和单碱基延伸技术，通过多重RT‑PCR对病原体目标基因进行扩增，提高检出的灵敏性；单碱基延伸反应通过对延伸引物进行一个碱基扩增，然后通过区分延伸产物分子质量进行病原体识别，特异性高。同时，核酸质谱的通量高，一个反应孔最高可实现40重基因的扩增，借助于芯片技术，单次最高可对384个样本进行分析；具有自动化程度高、检测通量高、灵敏度高、特异性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱法检测27种呼吸道病原体的引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
呼吸道感染是临床上较为常见的感染性疾病，尤其是在婴幼儿、老人及免疫缺陷病人中，常常导致严重的症状甚至死亡，根据WHO报道2016年约有300万人死于下呼吸道感染。常见的呼吸道感染病原体包括病毒、细菌、支原体、衣原体等微生物。病毒性病原体主要包含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、偏肺病毒、腺病毒等。细菌性病原体有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等。大多数呼吸道感染具有相似的临床症状，导致临床医生很难通过临床症状鉴别病原体，快速鉴定呼吸道感染的病原体对于临床精准诊断以及用药具有重要意义。过去几年，分子检测技术快速发展，在很大程度上弥补了传统培养和免疫检测等方法学对于27种呼吸道病原体检测的缺陷，使27种呼吸道病原体的速度更快、灵敏度和特异性都得到了很大的提高。尤其是多重PCR病原体检测体系的建立以及在临床上的应用，使得一次能够同时检测多种不同的病原体。多重PCR检测具有比较高的灵敏度和特异性，但受限于每个反应中荧光类型的数量，一般一个反应孔只能检测3-4种病原体，如果需要检测更多的病原体则需要更多的反应孔，从而使检测的便利性和检测通量大大的降低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于核酸质谱技术可以同时检测27种呼吸道病原体的引物组、试剂盒和应用，以简化呼吸道感染病原体的筛查过程，提高临床对于呼吸道感染的诊断能力。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一组针对27种呼吸道病原体检测的PCR扩增引物以及单碱基延伸引物，其序列特征如下：
用于检测卡他莫拉菌Moraxella Catarrhalis的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1～3所示；
用于检测人鼻病毒Human Rhinovirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4～6所示；
用于检测肺炎支原体Mycoplasma Pneumoniae的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:7～9所示；
用于检测冠状病毒Coronavirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:10～12所示；
用于检测甲型流感病毒Influenza A Virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:13～15所示；
用于检测肺炎衣原体Chlamydia Pneumoniae的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:16～18所示；
用于检测乙型流感病毒Influenza B Virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:19～21所示；
用于检测人偏肺病毒Human Metapneumovirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:22～24所示；
用于检测百日咳杆菌Bordetella pertussis的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:25～27所示；
用于检测流感嗜血杆菌Haemophilus influenza的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:28～30所示；
用于检测H-5型甲型流感病毒H-5influenza A virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:31～33所示；
用于检测化脓链球菌Streptococcus pyogenes的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:34～36所示；
用于检测肺炎链球菌Streptococcus pneumonia的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:37～39所示；
用于检测副流感病毒4型Type 4Parainfluenza virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:40～42所示；
用于检测H1N1型甲型流感病毒H1N1 Influenza A Virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:43～45所示。
用于检测B群链球菌Group B streptococcus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46～48所示；
用于检测副流感病毒3型Type 3Parainfluenza virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:49～51所示；
用于检测副流感病毒2型Type 2Parainfluenza virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:52～54所示；
用于检测腺病毒Adenovirus Virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:55～57所示；
用于检测呼吸道合胞病毒Respiratory syncytial virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:58～60所示；
用于检测H-3型甲型流感H-3influenza A virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:61～63所示；
用于检测嗜肺军团菌Legionella pneumophila的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:64～66所示；
用于检测副流感病毒1型Type 1Parainfluenza virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:67～69所示；
用于检测肠道病毒Enterovirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如
SEQ ID NO:70～72所示；
用于检测H-7型甲型流感H-7Influenza A Virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:73～75所示；
用于检测H3N2季节型甲型流感病毒H3N2 Seasonal Influenza A virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:76～78所示；
用于检测博卡病毒Bocavirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:79～81所示。
本发明还提供第二种技术方案：一种用于检测27种呼吸道病原体的PCR扩增引物和单碱基延伸引物在制备检测27种呼吸道病原体试剂中的应用。
本发明还提供第三种技术方案：一种基于核酸质谱法检测27种呼吸道病原体的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
(1)一步法RT-PCR反应液：该RT-PCR反应液中含有DNA聚合酶、逆转录酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dNTP，-20℃保存；
(2)PCR扩增引物混合液：将27种呼吸道PCR扩增引物分成两组，具体分组见表1；扩增引物用蒸馏水溶解，每条引物稀释到终浓度浓度为500nM；
表1：扩增引物分组表
(3)PCR产物纯化试剂：包括虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶缓冲液；
(4)单碱基延伸引物混合液：将27条单碱基延伸引物分成两组，具体分组情况见表2；
(5)单碱基延伸试剂：包含所述单碱基延伸引物、耐高温的单碱基延伸酶、ddNTP、延伸反应缓冲液；
(6)试剂组成还包括阳性质控品、阴性质控品、纯化用树脂、点样及质谱检测用芯片。
本发明的第四种即使方案为：一种基于核酸质谱法检测27种呼吸道病原体试剂盒的使用方法，其检测程序包含以下步骤：
(1)多重RT-PCR反应：在40ul反应体系中，以待测样本核酸为模板，分别用第1组和第2组扩增引物对27种病原基因进行扩增，得到相应特定扩增片段的PCR产物；
(2)利用虾碱性磷酸酶消化步骤(1)产物中剩余的dNTP；
(3)利用单碱基延伸酶对步骤(2)产物进行单碱基延伸反应，获得单碱基延伸产物；
(4)单碱基延伸产物进行树脂纯化去除盐离子，然后通过MassARRAY平台进行芯片点样、质谱检测，检测结束后使用Typer4.0软件分析和输出相应结果。
作为又一优选，所述步骤(1)多重RT-PCR反应条件为：50℃，25分钟；95℃，5分钟；94℃，15秒；55℃，30秒；68℃，20秒；进行45个循环扩增；72℃，3分钟。
进一步地，所述步骤(2)虾碱性磷酸酶消化反应条件为：45℃，25分钟，80℃，2分钟。
进一步地，所述步骤(3)单碱基延伸反应条件为：94℃，30秒，30个循环，94℃，5秒，52℃，5秒，80℃，5秒，5个循环，72℃，3分钟。
有益效果：
本发明的核酸质谱法整合了多重RT-PCR技术和单碱基延伸技术，通过多重RT-PCR对病原体目标基因进行扩增，提高检出的灵敏性；单碱基延伸反应通过对延伸引物进行一个碱基扩增，然后通过区分延伸产物分子质量进行病原体识别，特异性高。同时，核酸质谱的通量高，一个反应孔最高可实现40重基因的扩增，借助于芯片技术，单次最高可对384个样本进行分析；同时，需要指出的是，核酸质谱总的流程大约在6小时，手工操作时间小于45分钟，是一种自动化程度高、检测通量高、灵敏度高、特异性好的检测方法。该试剂盒覆盖了呼吸道常见的27种病原体，病原种类覆盖全面，为临床诊疗带来极大的便利。
附图说明
图1：第一组阴性对照核酸质谱谱图。
图2第二组阴性对照核酸质谱谱图。
图3：阳性对照核酸质谱谱图。
图4为肺炎支原体阴性和阳性结果谱图对比。图中左侧箭头所指位置为延伸引物峰位置，右侧箭头所指为延伸产物峰位置，阴性结果：没有延伸产物峰，而阳性结果则为出现延伸产物峰，延伸引物峰被消耗。
具体实施方式
结合下述实施例可以更好地对本发明进行理解。
实施例1：检测27种呼吸道病原体的引物和单碱基延伸引物，由上海百力格生物有限公司合成，在实际应用中分为两组，第一组为SEQ ID NO:1～69，第二组为SEQ ID NO:70～81。第一组中扩增引物应配合第一组中单碱基延伸引物使用，第二组扩增引物则配合第二组中的单碱基延伸引物使用。
实施例2：基于核酸质谱法检测27种呼吸道病原体的试剂盒的制备方法。
(1)RT-PCR反应液：10*PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、Mg2+及dNTPs，-20℃保存；
(2)引物和单碱基延伸引物混合液：将SEQ ID NO：1～81所示的核苷酸序列交由上海百力格生物公司合成。然后将扩增引物分为两组，并配置成混合液备用(每种扩增引物浓度为0.5uM)。延伸引物相应分为两组，第一组延伸引物混合配制见表3，第二组延伸引物混合液配制见表4。
表3：第一组延伸引物混合液各序列配比
| 延伸引物 | 工作液浓度 | 加入体积(ul) |
| SEQ ID：72 | 500uM | 6.56 |
| SEQ ID：75 | 500uM | 7.10 |
| SEQ ID：78 | 500uM | 7.46 |
| SEQ ID：81 | 500uM | 9.51 |
| ddH2O | 469.37 |
表4：第一组延伸引物混合液各序列配比
(3)PCR产物纯化试剂：包括虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶缓冲液，-20℃保存；
(4)单碱基延伸试剂：包含单碱基延伸引物混合液、耐高温的单碱基延伸酶、ddNTP、延伸反应缓冲液；
(5)试剂组成还包括阳性质控品、阴性质控品：阳性质控品为包含27种病原体基因核酸(10ng/ul)，阴性质控为大肠杆菌基因组DNA(100ng/ul)，-20℃保存；
(6)纯化用树脂、点样及质谱检测用芯片，室温保存。
实施例3：检测方法
仪器：Agena点样仪、Agena核酸质谱仪、Eppendorf proS定性PCR仪、涡旋混匀仪、Centrifuge 5810R离心机、18Centrifuge离心机。
(1)呼吸道病原体核酸模板的制备：呼吸道样本类型主要为鼻咽拭子和肺泡灌洗液，采用相应的商品化基因组DNA/RNA抽提试剂盒，按照试剂盒说明书制备病原基因组DNA/RNA，作为RT-PCR反应模板备用。
(2)以步骤(1)得到的病原体基因组DNA/RNA为模板，利用27对特异性引物进行病原基因扩增检测，具体包括如下步骤；
(3)RT-PCR反应：按照表5配置RT-PCR反应液，取38ulRT-PCR反应液加入8连管或96孔板中，加入2ul样本核酸。同时需要设置阳性对照、阴性对照、空白对照检测孔，分别加入2ul阳性对照、2ul阴性对照和2ul双蒸水。样本加入完毕后，盖上管盖，振荡混匀后离心。然后放置到Eppendorf proS定性PCR仪上进行扩增，反应条件为：50℃，25分钟；95℃,5分钟；94℃，15秒，55℃30秒，68℃20秒，进行45个循环扩增；72℃，3分钟；4℃永久保温；
表5：RT-PCR反应液配方
(4)PCR产物纯化：利用虾碱性磷酸酶对PCR反应产物进行纯化，去除多余的dNTP，虾碱性磷酸酶反应液配方如表6，取5ulRT-PCR产物加入虾碱性磷酸酶反应液2ul，然后置于Eppendorf proS定性PCR仪上，反应条件为：45℃，25分钟，80℃，2分钟；
表6：虾碱性磷酸酶反应液配方
(5)单碱基延伸反应：配置单碱基延伸反应液，配方如表7。在步骤4产物中加入2ul延伸反应液，然后置于Eppendorf proS定性PCR仪上，反应条件为94℃30秒，30个循环[94℃5秒，(52℃5秒，80℃5秒)5个循环]，72℃3分钟；
表7：单碱基延伸反应混合液配方
(6)步骤5延伸产物进行树脂脱盐和芯片点样：延伸产物管中加入41ul水，然后加入15mg树脂，然后颠倒混匀15分钟进行脱盐，结束后采用Agena点样仪将反应产物点到芯片上；
(7)核酸质谱检测：用Agena核酸质谱仪对点样后的芯片进行核酸质谱检测得到相应结果，通过Typer4.0软件解读核酸质谱检测结果。
实施例4：呼吸道病原体检测试剂盒的灵敏度分析
利用27种病原体的标准质粒对反应体系灵敏度进行研究。将质粒稀释成10000、1000、100、10copies/ul四个梯度，然后进行核酸质谱检测。各病原体检测灵敏度见表8。
| 病原检测 | 检出限(copies/ul) | 病原检测 | 检出限(copies/ul) |
| 卡他莫拉菌 | 100 | H1N1型甲型流感 | 100 |
| 人鼻病毒 | 100 | B群链球菌 | 10 |
| 肺炎支原体 | 100 | 副流感病毒3型 | 100 |
| 冠状病毒 | 100 | 副流感病毒2型 | 100 |
| 甲型流感病毒 | 100 | 腺病毒 | 100 |
| 肺炎衣原体 | 10 | 呼吸道合胞病毒 | 1000 |
| 乙型流感病毒 | 1000 | H-3型甲型流感病毒 | 100 |
| 人偏肺病毒 | 100 | 嗜肺军团菌 | 100 |
| 百日咳杆菌 | 100 | 副流感病毒1型 | 10 |
| 流感嗜血杆菌 | 100 | 肠道病毒 | 10 |
| H-5型甲型流感病毒 | 10 | H-7型甲型流感病毒 | 10 |
| 化脓链球菌 | 100 | H3N2季节型流感病毒 | 100 |
| 肺炎链球菌 | 100 | 博卡病毒 | 10 |
| 副流感病毒4型 | 10 |
表8：各呼吸道病原体检测灵敏度
实施例5：核酸质谱上机结果解读：
阴性对照和空白对照结果：所有的延伸产物峰均没有出现，只有延伸引物峰，结果如附图1、2所示；
阳性对照：必须保证延伸产物出峰，延伸引物峰消耗干净或减少，结果如图附图3所示；
样本结果解读：不同病原体延伸引物峰及延伸产物分子质量表见表9，各病原结果的判定必须相应延伸产物是否出峰来进行判定。若仅出现一个延伸产物峰为单一感染，若出现多个延伸产物峰则为多重感染。图4为肺炎支原体阴性和阳性结果谱图对比，图中左侧箭头所指位置为延伸引物峰位置，右侧箭头所指为延伸产物峰位置，阴性结果：没有延伸产物峰，而阳性结果则为出现延伸产物峰，延伸引物峰被消耗。
/>
表9：呼吸道病原体延伸产物分子质量表
序列表
<110> 浙江迪谱诊断技术有限公司
<120> 一种基于核酸质谱法检测27种呼吸道病原体的引物组、试剂盒及其应用
<160> 81
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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acgttggatg agcttcagtc agttcaacag 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgttggatg cctgcagatg ttggcatgta 30
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acgcggcagt tttcagaca 19
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg tgggagttct ggtaggtgtg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttcccgccc acagaccaa 19
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<211> 30
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gatgcacttc cacattatat 20
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<212> DNA
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acgttggatg gaccagctat catgattgcc 30
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gataaacagt ggcgagttcc 20
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<211> 30
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acgttggatg agcaacaagt agtacagcag 30
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acgttggatg ttagctacta gtgtagctg 29
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ccccctccag gagcaacttg a 21
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acgttggatg tcgtgcgttt taattccagc 30
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acgttggatg acgcaatcta gcagatgaag 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtatcagatg aagcaggttt g 21
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg cctgcaagga aagcagagat 30
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ggtagtaatg ccccttgctt aa 22
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<212> DNA
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acgttggatg gttaacatca gcaacaccaa c 31
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acgttggatg agagagagga attgcccgc 29
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ctgtacagtc agtggtttcc gt 22
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acgttggatg gaaacattga ttgcccagc 29
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<211> 30
<212> DNA
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acgttggatg aggaagattt atcgcacctg 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaggccccc cacgatactc atg 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg actctatcca ctctcagacc 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg atgggatctc tgaggatac 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatctctgag gatacagatg aat 23
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acgttggatg gatcgagcat ctggaataac 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccctgttatt tctactctat ctat 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gacgcctcgg agtacctga 29
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cccccaagta cgtgtcggtg gcac 24
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acgttggatg cacagaagat gctaatcat 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
acgttggatg ggtgtcttct cttcctaatc 30
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ctattctctt cctaatctag acata 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gcattcagaa ttgcatttg 29
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cgctaaataa tgagatcaga tgcac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg tggtgactgc agctgttatg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg tccggattaa catctatgcc 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtatttttaa aattcttccc caaatc 26
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<212> DNA
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acgttggatg attacctgga ccaagtctac 30
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acgttggatg cacatccttg agtgattaag 30
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gggacgaata cgcatatatt gcatca 26
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acgttggatg ctgaatgcgg ctaatcccaa 30
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acgttggatg gattgtcacc ataagcagcc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaggaaaca cggaca 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg cagcatacaa ttgatctggc 30
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<212> DNA
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atggacaaac tgtacga 17
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acgttggatg accacccggg tacggacaa 29
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acgttggatg ggcttctttt ggtagatact g 31
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<212> DNA
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<400> 78
aatcttcctg tatgctca 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg aaatctcttc tggctacacg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg cctctgcgat ctctatattg 30
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
ctctatattg aaggatctgc at 22
Claims (3)
1.一组针对27种呼吸道病原体检测的PCR扩增引物以及单碱基延伸引物，其序列特征如下：
用于检测卡他莫拉菌Moraxella Catarrhalis的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1～3所示；
用于检测人鼻病毒Human Rhinovirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4～6所示；
用于检测肺炎支原体Mycoplasma Pneumoniae的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:7～9所示；
用于检测冠状病毒Coronavirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:10～12所示；
用于检测甲型流感病毒Influenza AVirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:13～15所示；
用于检测肺炎衣原体Chlamydia Pneumoniae的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:16～18所示；
用于检测乙型流感病毒Influenza B Virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:19～21所示；
用于检测人偏肺病毒Human Metapneumovirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:22～24所示；
用于检测百日咳杆菌Bordetella pertussis的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:25～27所示；
用于检测流感嗜血杆菌Haemophilus influenza的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:28～30所示；
用于检测H-5型甲型流感病毒H-5influenza A virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:31～33所示；
用于检测化脓链球菌Streptococcus pyogenes的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:34～36所示；
用于检测肺炎链球菌Streptococcus pneumonia的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:37～39所示；
用于检测副流感病毒4型Type 4Parainfluenza virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:40～42所示；
用于检测H1N1型甲型流感病毒H1N1 Influenza A Virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:43～45所示；
用于检测B群链球菌Group B streptococcus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46～48所示；
用于检测副流感病毒3型Type 3Parainfluenza virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:49～51所示；
用于检测副流感病毒2型Type 2Parainfluenza virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:52～54所示；
用于检测腺病毒Adenovirus Virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:55～57所示；
用于检测呼吸道合胞病毒Respiratory syncytial virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:58～60所示；
用于检测H-3型甲型流感H-3influenza A virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:61～63所示；
用于检测嗜肺军团菌Legionella pneumophila的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:64～66所示；
用于检测副流感病毒1型Type 1Parainfluenza virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:67～69所示；
用于检测肠道病毒Enterovirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:70～72所示；
用于检测H-7型甲型流感H-7Influenza A Virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:73～75所示；
用于检测H3N2季节型甲型流感病毒H3N2 Seasonal Influenza A virus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:76～78所示；
用于检测博卡病毒Bocavirus的特异性扩增引物对和单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID NO:79～81所示。
2.一种权利要求1所述的用于检测27种呼吸道病原体的PCR扩增引物和单碱基延伸引物在制备检测27种呼吸道病原体试剂中的应用。
3.一种基于核酸质谱法检测27种呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如下试剂：
(1)一步法RT-PCR反应液：该RT-PCR反应液中含有DNA聚合酶、逆转录酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dNTP，-20℃保存；
(2)PCR扩增引物混合液：将27种呼吸道PCR扩增引物分成两组，其中第一组为权利要求1中序列SEQ ID：1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31、32、34、35、37、38、40、41、43、44、46、47、49、50、52、53、55、56、58、59、61、62、64、65、67、68；第二组为权利要求1中序列SEQ ID：70、71、73、74、76、77、79、80；扩增引物用蒸馏水溶解，每条引物稀释到终浓度浓度为500nM；
(3)PCR产物纯化试剂：包括虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶缓冲液；
(4)单碱基延伸引物混合液：将27条单碱基延伸引物分成两组，其中第一组为权利要求1中序列SEQ ID：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69；第二组为权利要求1中序列SEQ ID：72、75、78、81；
(5)单碱基延伸试剂：包含权利要求1所述单碱基延伸引物、耐高温的单碱基延伸酶、ddNTP、延伸反应缓冲液；
(6)试剂组成还包括阳性质控品、阴性质控品、纯化用树脂、点样及质谱检测用芯片。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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