CN109234456B

CN109234456B - 一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109234456B
Application number: CN201811246029.2A
Authority: CN
Inventors: 朱艳宁; 廖生赟; 陈建东
Original assignee: Shenzhen Yilifang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Yilifang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109234456A

Abstract

本发明公开了一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用，具体地，提供一种可同时检测6种呼吸道病原体的引物组和探针组、包含上述引物组和探针组的试剂盒以及它们的用途。本发明采用特异性引物对和分子信标荧光探针组成的试剂盒对样本进行恒温扩增，并结合熔解曲线分析技术，检测结果不易出错，检测特异性高，可实现对NASBA扩增产物的区分和鉴别，提高检测通量。

Description

一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及病原体核酸检测技术领域，具体涉及一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用。

背景技术

急性呼吸道感染是世界范围内导致儿童患病和死亡的重要原因。引起急性呼吸道感染的病原微生物十分复杂，包括：细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，其中病毒最为常见。而呼吸道病毒感染所引起的症状没有特异性，无法依靠临床症状来确诊。目前，临床上较为常见的检测方法包括培养方法、生化方法和免疫方法等。其中，培养法操作复杂，检测周期长、费用高，不适合作为临床样品的常规检测。生化检测方法操作简单、快速，费用低，但该方法灵敏度和特异性不高，影响因素多，不能区分病毒的具体种类。免疫检测方法快速简便，但一个检测只能针对其中一种病毒。

核酸序列依赖扩增(NASBA)技术，于1990年由Guatelli等首先报道，主要用于特异性地等温扩增RNA。相比较而言，传统的PCR技术每次循环只产生双倍的复制子，而NASBA每次扩增可产生10-100倍的RNA分子，且可在30分钟产生多达10¹²个复制子，扩增效率明显高于普通PCR。目前NASBA技术已经被广泛应用于检测细菌和病毒的感染，其中包括弯曲杆菌，李斯特菌，沙门菌，HIV，HCV，禽流感病毒等。目前国际上对NASBA扩增产物的检测绝大多数采用开放式的核酸杂交探针检测体系，如采用酶联显色或化学发光进行结果评价，这就存在操作较为复杂及扩增产物污染易产生假阳性及假阴性的缺点与不足。

发明内容

本发明目的是为了解决现有技术中核酸检测操作复杂及靶标的扩增产物易污染造成检测结果不准确的问题，提出一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用。

本发明提出的一种可同时检测6种呼吸道病原体的引物组，所述引物组包括以下引物对：由序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条序列组成的针对腺病毒的引物对；由序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两条序列组成的针对人博卡病毒的引物对；由序列表SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条序列组成的针对百日咳杆菌的引物对；由序列表SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两条序列组成的针对肺炎衣原体的引物对；由序列表SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的两条序列组成的针对肺炎支原体的引物对；由序列表SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的两条序列组成的针对嗜肺军团菌的引物对。

本发明还提供一种可同时检测6种呼吸道病原体的探针组，所述探针组包括以下分子信标荧光探针：由序列表中SEQ ID NO.14所示的序列组成的针对腺病毒的分子信标荧光探针；由序列表中SEQ ID NO.15所示的序列组成的针对人博卡病毒的分子信标荧光探针；由序列表中SEQ ID NO.16所示的序列组成的针对百日咳杆菌的分子信标荧光探针；由序列表中SEQ ID NO.17所示的序列组成的针对肺炎衣原体的分子信标荧光探针；由序列表中SEQ ID NO.18所示的序列组成的针对肺炎支原体的分子信标荧光探针；由序列表中SEQID NO.19所示的序列组成的针对嗜肺军团菌的分子信标荧光探针。

优选地，所述引物对中的反向引物在其5’端添加能够被T7RNA聚合酶识别的启动子序列，所述启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGG。

优选地，每一条所述分子信标荧光探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团。

优选地，所述荧光基团选自ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL、Fluor Gold540、JOE、HEX、CAL FlourOrange560、TAMRA、Cal Fluor Red590、ROX、CAL Fluor、Red610、TEXASRED、CAL Flour Red635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar705中的至少一种；所述淬灭基团选自DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA中的一种。

优选地，所述试剂盒包括2×NASBA反应液及5×NASBA反应酶混合液，所述2×NASBA反应液包括所述引物组和所述探针组。

优选地，所述2×NASBA反应液还包括：Tris-HCl、KCl、MgCl₂、dNTP、rNTP、DTT、甜菜碱和DMSO；所述5×NASBA反应酶混合液包括：AMV反转录酶、T7RNA聚合酶、RNase H、RNA酶抑制剂和BSA。

优选地，所述2×NASBA反应液中组份如下：150mM pH8.3的Tris-HCl，200mM KCl，30mM MgCl₂，1mM dNTP，4mM rNTP，20mM DTT，0.5mM甜菜碱，体积分数为20％的DMSO，分子信标荧光探针各0.3μM和1μM引物组；

所述5×NASBA反应酶混合液中组份如下：1.6U/μL AMV反转录酶，10U/μL T7RNA聚合酶，RNase H 0.05U/μL，3U/μL RNA酶抑制剂，30mg/mL BSA。

本发明还提供一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒的应用，以鼻咽拭子样本的RNA为模板，利用所述试剂盒对其进行恒温扩增，对扩增产物进行熔解曲线分析，根据所述试剂盒中的探针的荧光类型及其特定Tm值对不同病原体分型。

本发明的有益效果包括：1、利用引物组及分子信标荧光探针，通过探针的Tm值的不同来判定扩增产物的存在与否，结果不易出错，检测特异性高，结果容易判读；2、利用设计的试剂盒结合熔解曲线分析方法，可以实现对NASBA扩增产物的区分和鉴别，提高检测通量。

附图说明

图1是本发明实施例2中的腺病毒的检测结果图。

图2是本发明实施例2中的人博卡病毒的检测结果图。

图3是本发明实施例2中的百日咳杆菌的检测结果图。

图4为本发明实施例2中的肺炎衣原体的检测结果图。

图5为本发明实施例2中的肺炎支原体的检测结果图。

图6为本发明实施例2中的嗜肺军团菌检测结果图。

图7为本发明实施例2中的阴性样本检测结果图。

图8为本发明实施例2中的腺病毒的灵敏度检测结果图。

图9为本发明实施例3中的人博卡病毒的灵敏度检测结果图。

图10为本发明实施例3中的百日咳杆菌的灵敏度检测结果图。

图11为本发明实施例3中的肺炎衣原体的灵敏度检测结果图。

图12为本发明实施例3中的肺炎支原体的灵敏度检测结果图。

图13为本发明实施例3中的嗜肺军团菌灵敏度检测结果图。

图14为本发明实施例4中的临床样本中腺病毒和肺炎支原体的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式并对照附图对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

本发明可用于同时检测腺病毒、人博卡病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体、肺炎支原体和嗜肺军团菌。

在一些实施例中，可通过扩增病原体的RNA检测，其中引物对的序列如表1所示：

表1

优选地，上述引物对中的反向引物在其5’端添加能够被T7RNA聚合酶识别的启动子序列，启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGG。

在一些实施例中，探针组包括以下六条分子信标荧光探针，探针序列如表2所示：

表2

优选地，上述每一条分子信标荧光探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中，除上表2中所带的荧光基团FAM、CY5、ROX外，在其他实施方式中，所述荧光基团还可以是选自ALEX-350、VIC、TET、CAL、Fluor Gold540、JOE、HEX、CAL FlourOrange560、TAMRA、CalFluor Red590、CAL Fluor、Red610、TEXASRED、CAL Flour Red635、Quasar670、CY3、CY5.5或Quasar705；除上表2中所带的淬灭基团Dabcy1外，在其他实施方式中，所述淬灭基团还可以是选自BHQ、ECLIPSE或TAMRA。

本发明还提供一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒，试剂盒包括2×NASBA反应液及5×NASBA反应酶混合液，其中：

2×NASBA反应液中组份如下：150mM pH8.3的Tris-HCl，200mM KCl，30mM MgCl₂，1mM dNTP，4mM rNTP，20mM DTT，0.5mM甜菜碱，体积分数为20％的DMSO，分子信标荧光探针各0.3μM和1μM引物组；

5×NASBA反应酶混合液中组份如下：1.6U/μL AMV反转录酶，10U/μL T7RNA聚合酶，RNase H 0.05U/μL，3U/μL RNA酶抑制剂，30mg/mL BSA。

本发明还提供了一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒的应用，下面结合实施例对其进一步说明。本发明利用NASBA技术大量扩增靶标，然后利用分子信标荧光探针特异地与对应靶标结合，通过熔解曲线分析，对不同病原体进行区分。本发明实施例中选用的荧光仪为ABI 7500荧光PCR仪。

实施例1制备试剂盒

(1)引物组和探针组的制备

从GenBank获取腺病毒、人博卡病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体、肺炎支原体和嗜肺军团菌的核酸序列，采用Clustalx1.8.msw Alignment软件进行同源性比对分析，确定各型靶标的保守序列区域，然后在保守区域内选择合适的序列，采用Primer Primier 5.0软件设计出特异的引物和探针，其中反向引物的5’端添加有能够被T7RNA聚合酶识别的启动子序列，所述启动子序列为如SEQ ID NO.13所示，即TAATACGACTCACTATAGGG。

(2)2×NASBA反应液及5×NASBA反应酶混合液制备

根据多重NASBA优化试验，2×NASBA反应液中最优组份如下：150mM pH8.3的Tris-HCl，200mM KCl，30mM MgCl₂，1mM dNTP，4mM rNTP，20mM DTT，0.5mM甜菜碱，体积分数为20％的DMSO，分子信标荧光探针各0.3μM和1μM引物组；

5×NASBA反应酶混合液中最优组份如下：1.6U/μL AMV反转录酶，10U/μL T7RNA聚合酶，RNase H 0.05U/μL，3U/μL RNA酶抑制剂，30mg/mL BSA。

实施例2试剂盒检测特异性评价

(1)样本总RNA的提取：采集患者的鼻咽拭子、痰液的分离培养物，然后使用市售总RNA提取试剂提取样本中的RNA，具体操作按照说明书进行。

(2)NASBA扩增：取5μL待检样本RNA提取液为模板，加入12.5μL本试剂盒中的2×NASBA反应液混匀，以及补充2.5μLDEPC处理水至总体积20μL后，在PCR仪上65℃加热5min，使RNA形成单链结构；然后在41°的恒温条件下冷却5min使引物与靶序列的RNA结合开始扩增反应；随后立即加入5μL5×NASBA反应酶混合液，41℃反应90min。

(3)NASBA扩增产物检测：将扩增产物在荧光PCR仪上进行熔解曲线分析，具体分析程序为：95℃2min→40℃2min→40℃～85℃，其中，40℃～85℃以0.1℃/s的升温速率进行熔解曲线分析，此时，探针与靶标逐渐解离，重新形成茎环结构，探针上的荧光基团与淬灭基团靠近，在40℃～85℃阶段采集荧光信号。

各型样本检测结果如图1-图7所示，由检测结果可以看出，采用本发明的试剂盒能够特异的检出对应的阳性样本，即对应的荧光通道内只有一条特定Tm值的熔解曲线峰，各型靶标病毒对应的荧光通道类型和熔解峰Tm值如表3所示，检测阴性样本均为阴性，表明本试剂盒具有较高的特异性。

表3

病原体	荧光类型	熔解峰Tm值
			腺病毒	FAM	58.5℃±0.5℃
人博卡病毒	FAM	52.5℃±0.5℃
			百日咳杆菌	CY5	59℃±0.5℃
肺炎衣原体	CY5	51℃±0.5℃
			肺炎支原体	ROX	56℃±0.5℃
嗜肺军团菌	ROX	62.5℃±0.5℃

实施例3试剂盒检测灵敏性评价

(1)RNA参考品制备：以各型呼吸道病原体RNA为模板，使用能够被T7RNA聚合酶识别的启动子序列的上游引物和对应的反向引物，进行一步法RT-PCR，以扩增产物cDNA为模板，按照Large Scale RNA Production System-T7试剂盒(Promega)说明书的步骤进行体外转录，转录产物经酚氯仿抽提后，异丙醇沉淀，用无RNase酶的水溶解后定量待用，分装并于-70℃保存，作为体外转录RNA参考品。为评价试剂盒的检测灵敏度，RNA参考品采用TE缓冲液或DEPC处理水以10倍梯度稀释，从10⁷copies/μL梯度稀释至10copies/μL制备成灵敏度参考品。

(2)NASBA扩增及NASBA扩增产物检测同实施例2。

灵敏度检测结果见附图8至附图13，图中曲线峰从高到低依次代表参考品浓度为10⁷copies/μL至10copies/μL检测出的熔解峰。由检测结果可知，本试剂盒检测腺病毒、人博卡病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体、肺炎支原体和嗜肺军团菌的最低检测限均小于100copies/μL，各型检测限见下表4，表明本试剂盒具有较高的灵敏度。

表4

病原体	最低检测限
		腺病毒	100copies/μL
人博卡病毒	100copies/μL
		百日咳杆菌	10copies/μL
肺炎衣原体	1copies/μL
		肺炎支原体	10copies/μL
嗜肺军团菌	10copies/μL

实施例4试剂盒对临床样本的检测效果

(1)提取病原体RNA：收集疑似呼吸道病原体感染者的鼻咽拭子样品，用市售总RNA提取试剂提取样品中的RNA，具体操作按照说明书进行。

(2)NASBA扩增及NASBA扩增产物检测同实施例2。

图14所示为部分临床样本检测结果，图中熔解曲线峰1为为ROX通道检测出的肺炎支原体，熔解曲线峰2为FAM通道检测出的腺病毒，3为CY5通道未检出熔解曲线峰，表明此荧光通道未检出病原体。

尽管已经描述和叙述了被看作本发明的示范实施例，本领域技术人员将会明白，可以对其做出各种改变和替换，而不会脱离本发明的精神。另外，可以做出许多修改以将特定情况适配到本发明的教义，而不会脱离在此描述的本发明中心概念。所以，本发明不受限于在此披露的特定实施例，但本发明可能还包括属于本发明范围的所有实施例及其等同物。

序列表

<110> 深圳市亿立方生物技术有限公司

<120> 一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用

<130> 18A103160JYC

<160> 19

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacagaggac agcaagaaac gcag 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagtgcaaag gagggtccat ga 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccataaccac tcccaggaaa tgacg 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcaccacaag cgtggagct 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgttctggc tgcgcgag 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccggttcgg atgaaccatg c 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tctatgggag ccaaacctac tgga 24

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggcaatgaa gcctgcatta gtgaac 26

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtatggtggc gggggtca 18

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccaagtggac ttggacaagg cag 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgatgcccgc tggatcaact tg 22

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agcctttaca aagagagcat ccctctc 27

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

taatacgact cactataggg 20

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cggcaatacc gcagctggta ccttgccg 28

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccgaagctgc tgcacttcgg 20

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctaggcgccg actacatggc ctag 24

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggcagcactg caaactatac tactgctgcc 30

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctggcttcgt gtagttcaag attgccag 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctggcggacc tattggccca aatgccag 28

Claims

1.一种可同时检测6种呼吸道病原体的引物组和探针组在制备NASBA检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物组为以下引物对：

由SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的两条序列组成的针对腺病毒的引物对；

由SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示的两条序列组成的针对人博卡病毒的引物对；

由SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6所示的两条序列组成的针对百日咳杆菌的引物对；

由SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示的两条序列组成的针对肺炎衣原体的引物对；

由SEQ ID NO .9和SEQ ID NO .10所示的两条序列组成的针对肺炎支原体的引物对；

由SEQ ID NO .11和SEQ ID NO .12所示的两条序列组成的针对嗜肺军团菌的引物对；

所述引物对中的反向引物在其5’端添加能够被T7 RNA聚合酶识别的启动子序列，所述启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGG；

所述探针组为以下分子信标荧光探针：

由SEQ ID NO .14所示的序列组成的针对腺病毒的分子信标荧光探针，其5’端带有FAM荧光基团，3’端带有Dabcy1淬灭基团；

由SEQ ID NO .15所示的序列组成的针对人博卡病毒的分子信标荧光探针，其5’端带有FAM荧光基团，3’端带有Dabcy1淬灭基团；

由SEQ ID NO .16所示的序列组成的针对百日咳杆菌的分子信标荧光探针，其5’端带有CY5荧光基团，3’端带有Dabcy1淬灭基团；

由SEQ ID NO .17所示的序列组成的针对肺炎衣原体的分子信标荧光探针，其5’端带有CY5荧光基团，3’端带有Dabcy1淬灭基团；

由SEQ ID NO .18所示的序列组成的针对肺炎支原体的分子信标荧光探针，其5’端带有ROX荧光基团，3’端带有Dabcy1淬灭基团；

由SEQ ID NO .19所示的序列组成的针对嗜肺军团菌的分子信标荧光探针，其5’端带有ROX荧光基团，3’端带有Dabcy1淬灭基团；

利用分子信标荧光探针特异地与对应靶标结合，通过熔解曲线分析，对不同病原体进行区分，各型靶标病原体对应的荧光通道类型和熔解峰Tm值如下所示：

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括2×NASBA反应液，所述2×NASBA反应液包括权利要求1所述引物组和所述探针组，还包括Tris-HCl、KCl、MgCl₂、dNTP、rNTP、DTT、甜菜碱、DMSO、AMV反转录酶、T7 RNA聚合酶、RNase H、RNA酶抑制剂和BSA。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述2×NASBA反应液中组份如下：150mMpH8.3的Tris-HCl，200mM KCl，30mM MgCl₂，1mM dNTP，4mM rNTP，20mM DTT，0.5mM甜菜碱，体积分数为20％的DMSO，分子信标荧光探针各0.3μM和1μM引物组，1.6U/μL AMV反转录酶，10 U/μL T7RNA聚合酶，RNase H 0.05 U/μL，3 U/μL RNA酶抑制剂，30 mg/mL BSA。