CN111518960A - 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于区分新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS‑CoV)以及四种常见的人冠状病毒(包括人冠状病毒229E(HCoV‑229E)、人冠状病毒NL63(HCoV‑NL63)、人冠状病毒HKU1(HCoV‑HKU1)、人冠状病毒OC43(HCoV‑OC43))的多重反转录实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)试剂盒、专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管四色荧光多重RT‑qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分冠状病毒。本发明的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP‑UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法。
背景技术
人感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)后的常见体征包括呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难，在重症病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭甚至死亡，截止目前尚无特异性治疗方法，早发现早隔离是最为有效的遏制病毒传播的措施。由于针对不同冠状病毒感染患者的诊疗方式存在本质区别，对普通冠状病毒感染区分并进行分流治疗，有助于集中医疗资源对SARS-CoV-2阳性患者的针对性治疗，有助于提升治愈率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种用于区分SARS-CoV-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)以及四种常见的人冠状病毒(包括人冠状病毒229E (HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43))的多重反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒、其专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管多重RT-qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分冠状病毒。本发明的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
本发明所提供的一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒包含RT-qPCR反应液(包含引物探针组合物)、RT-qPCR酶液、阳性对照以及阴性对照。其中RT-qPCR反应液包括反应所需的 dNTPs、dUTP、Mg2+、缓冲液(表1)和引物探针组合物(表2和表 3)。
表1 RT-qPCR反应液试剂组成(50人份)
其中引物探针组合物包含用于检测SARS-CoV-2 S基因， SARS-CoV-2和SARS N基因，HCoV-229E、HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、HCoV-OC43 ORF1ab基因以及人类RNA内参B2M基因的引物和探针，引物和探针序列信息如表2所示，引物和探针组成如表3所示。由上述正反向引物和探针序列的衍生序列也属于本发明内容，所述衍生序列是指在SEQ ID NO：1～21的基础上，在序列的5’端或3’端添加或减少一个或多个碱基得到的序列。
表2 RT-qPCR反应液中所包含的引物和探针序列信息
其中，SARS-CoV-2 S基因扩增产物长度为128bp；SARS-CoV-2 N基因和SARS N基因扩增产物长度为102bp；HCoV-229E ORF1ab 基因扩增产物长度为105bp；HCoV-HKU1 ORF1ab基因扩增产物长度为92bp；HCoV-NL63 ORF1ab基因扩增产物长度为114bp； HCoV-OC43ORF1ab基因扩增产物长度为114bp；人类RNA内参 B2M基因扩增产物长度为147bp。
表3用于冠状病毒分型检测的引物和探针组成(50人份)
其中RT-qPCR酶液中包含逆转录酶、热启动DNA聚合酶和UNG 酶，其组分配比详见表4。
表4 RT-qPCR酶液各组分配比(50人份)
冠状病毒多重RT-qPCR分型检测试剂盒中阳性对照为包含 SARS-CoV-2S基因、SARS-CoV-2N基因、HCoV-229E ORF1ab基因、 HCoV-NL63 ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因和人类RNA内参B2M基因序列的重组质粒，阴性对照为RNase-free H2O。
进一步地，所述试剂盒的检测方法为通过对疑似患者呼吸道样本进行RNA提取，配制扩增反应体系后进行多重RT-qPCR扩增，并对得到的扩增曲线进行分析，最终做出阴阳性判断。具体使用方法包括以下步骤：
(1)采用核酸自动提取仪对样本总核酸进行提取；
(2)取提取得到的核酸，按照表5配制多重RT-qPCR反应体系；
表5多重RT-qPCR反应体系
| RT-qPCR反应体系 | 加样量(杜L) |
| RT-qPCR反应液 | 14 |
| RT-qPCR酶液 | 1 |
| 待检测的核酸样本/阴阳对照品 | 5 |
| 总体积 | 20 |
(3)根据表6设定反应程序进行多重RT-qPCR反应；
表6多重RT-qPCR反应程序
(4)根据多重RT-qPCR扩增曲线进行阴阳性判断，阴性结果判断条件：VIC通道的Ct值≤38，且其他荧光信号通道的Ct值≥38或显示为Undetermined/No Ct；阳性结果判定条件：若FAM通道/ROX 通道/VIC通道Ct值≤38，且扩增曲线呈典型S型，Cy5通道Ct值≥38 或显示为Undetermined/No Ct，则样本判断为SARS-CoV-2阳性；若 ROX通道/VIC通道Ct值≤38，且扩增曲线呈典型S型，Cy5通道/FAM 通道Ct值≥38或显示为Undetermined/No Ct，则样本判断为疑似 SARS-CoV-2或SARS阳性，需做进一步筛查；若Cy5通道/VIC通道 Ct值≤38，且扩增曲线呈典型S型，FAM通道/ROX通道Ct值≥38或显示为Undetermined/No Ct，则样本判断为HCoV-229E、HCoV-NL63、 HCoV-HUK1、HCoV-OC43中的一种冠状病毒阳性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明目的在于提供一种用于区分SARS-CoV-2、SARS-CoV以及四种常见的人冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、 HCoV-OC43)的多重RT-qPCR试剂盒、其专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管多重RT-qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分冠状病毒。本发明的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。
附图说明
图1为SARS-CoV-2S基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中1为 1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图2为SARS-CoV-2N基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中1为 1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图3为SARS-CoV N基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中1为1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图4为HCoV-229E ORF1ab基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中1 为1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为 1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图5为HCoV-NL63 ORF1ab基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中1 为1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为 1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图6为HCoV-HKU1 ORF1ab基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中 1为1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为 1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图7为HCoV-OC43 ORF1ab基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中1 为1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为 1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图8为人类RNA内参B2M基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中1 为1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为 1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5为1×102拷贝的阳性重组质粒。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1及效果实施例所述冠状病毒多重RT-qPCR分型检测试剂盒中的RT-qPCR反应液试剂组成如表1所示，RT-qPCR反应液中所包含的引物和探针序列信息如表2所示，用于冠状病毒分型检测的引物和探针组成如表3所示，RT-qPCR酶液各组分配比如表4所示，多重RT-qPCR反应体系如表5所示，多重RT-qPCR反应程序如表6所示。
实施例1
分别应用冠状病毒多重RT-qPCR分型检测试剂盒检测 SARS-CoV-2阳性确诊患者(样本编号S1)、HCoV-229E阳性确诊患者 (样本编号S2)、HCoV-NL63阳性确诊患者(样本编号S3)、 HCoV-HKU1阳性确诊患者(样本编号S4)、HCoV-OC43阳性确诊患者(样本编号S5)以及非疑似患者(样本编号S6)呼吸道样本中冠状病毒RNA的存在：
1.核酸提取：使用核酸提取试剂在全自动核酸提取仪上同时对样本S1～S6进行核酸自动提取，将完成提取的核酸样本置于-20℃保存；
2.根据表5配制反应体系，根据表6进行RT-qPCR，获得荧光扩增曲线；
3.根据判断标准判断样本中所含的冠状病毒种类。
S1～S6样本在各个荧光通道中的Ct值如表7所示。
检测结果表明本发明试剂盒能够准确的判定呼吸道样本中是否含有冠状病毒，且能够区分SARS-CoV-2和常见4种人冠状病毒。
表7 S1～S6样本在各个荧光通道中的Ct值
| 样本编号 | FAM | ROX | Cy5 | VIC |
| S1 | 26.33 | 24.56 | Undetermined | 29.01 |
| S2 | Undetermined | Undetermined | 30.41 | 33.13 |
| S3 | Undetermined | Undetermined | 29.34 | 30.43 |
| S4 | Undetermined | Undetermined | 28.84 | 25.67 |
| S5 | Undetermined | Undetermined | 26.86 | 28.45 |
| S6 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | 29.34 |
效果实施例
一、冠状病毒多重RT-qPCR分型检测试剂盒标准曲线建立和灵敏度试验
1.分别将测定浓度和纯度后的包含SARS-CoV-2S基因、 SARS-CoV-2N基因、SARS-CoV N基因、HCoV-229E ORF1ab基因、 HCoV-NL63 ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因以及人类RNA内参B2M基因的阳性重组质粒分别做10倍梯度稀释，等到从1×102～1×106 copies/μL共5个稀释度的阳性质粒作为标准模版。根据表5配制反应体系，根据表6进行RT-qPCR，获得荧光扩增曲线，绘制标准曲线并确定最低检出限。
2.对于SARS-CoV-2S基因、SARS-CoV-2N基因、SARS-CoV N 基因、HCoV-229EORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、 HCoV-HKU1ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因以及人类RNA 内参B2M基因，在浓度1×102～1×106 copies/μL范围内扩增曲线呈现典型的S型曲线，各曲线间距均匀，具有良好的相关性，其线性方程分别为SARS-CoV-2S基因：y＝-3.323logx+39.484(R2＝0.998)、 SARS-CoV-2N基因：y＝-3.334logx+37.837(R2＝0.999)、SARS-CoV N 基因：y＝-3.327logx+37.494(R2＝0.998)、HCoV-229E ORF1ab基因： y＝-3.319logx+41.064(R2＝0.999)、HCoV-NL63 ORF1ab基因： y＝-3.446logx+38.934(R2＝0.997)、HCoV-HKU1 ORF1ab基因： y＝-3.339logx+39.989(R2＝0.998)、HCoV-OC43 ORF1ab基因： y＝-3.299logx+40.656(R2＝0.999)、人类RNA内参B2M基因： y＝-3.411logx+39.823(R2＝0.997)，其最低检出限分别为SARS-CoV-2 S 基因：3.2×101copies/μL、SARS-CoV-2N基因：4.8×101copies/μL、 SARS-CoV N基因：4.8×101copies/μL、HCoV-229EORF1ab基因： 3.8×101copies/μL、HCoV-NL63 ORF1ab基因：6.5×101copies/μL、 HCoV-HKU1 ORF1ab基因：4.2×101copies/μL、HCoV-OC43 ORF1ab 基因：3.7×101copies/μL、人类RNA内参B2M基因：2.5×101copies/μL。通过对4个荧光通道的灵敏度比较来看，4个荧光通道的扩增效率相近，引物间相互干扰少，试剂盒性能稳定。
二、冠状病毒多重RT-qPCR分型检测试剂盒特异性试验
1.分别利用常见呼吸道疾病病原微生物(包括甲型流感病毒、副流感病毒、偏肺病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、博卡病毒、肺炎衣原体、沙眼衣原体、肺炎支原体以及腺病毒)的基因组作为模版，对试剂盒特异性进行试验。
2.试验结果如表8所示，结果表明，冠状病毒多重RT-qPCR分型检测试剂盒对常见呼吸道疾病病原微生物检测结果均为阴性，证明本发明试剂盒特异性好。
表8冠状病毒多重RT-qPCR分型检测试剂盒特异性验证结果
| 病原微生物 | FAM | ROX | Cy5 | VIC |
| 甲型流感病毒 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 副流感病毒 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 偏肺病毒 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 乙型流感病毒 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 呼吸道合胞病毒 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 鼻病毒 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 博卡病毒 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 肺炎衣原体 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 沙眼衣原体 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 肺炎支原体 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
| 腺病毒 | Undetermined | Undetermined | Undetermined | Undetermined |
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北省儿童医院、河北省人民医院、宁波海尔施基因科技有限公司
<120> 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
<130> 2020-06-16
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
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actttgtcag ttcgtatgct aaac 24
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cctttttctt tggcactgca agcac 25
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<213> 人工序列(Unknown)
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tctgctggat gacgtgagta aacctg 26
Claims (10)
1.一种用于冠状病毒分型检测的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括分别用于检测SARS-CoV-2 S基因、SARS-CoV-2 N基因、SARS N基因、HCoV-229E ORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因、HCoV-NL63ORF1ab基因以及人类RNA内参B2M基因的引物和相应探针；
所述用于检测SARS-CoV-2 S基因的正向引物序列为5’-GGCCATGGTACATTTGGCT-3’，如SEQ ID NO：1所示，其反向引物序列为5’-GCAGCAGGATCCACAAGAA-3’，如SEQ ID NO：2所示，其探针序列为5’-TTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTG-3’，如SEQ ID NO：3所示；
所述用于检测SARS-CoV-2 N基因和SARS N基因的正向引物列为5’-CTGAGGGAGCCTTGAATACA-3’，如SEQ ID NO：4所示，其反向引物序列为5’-TTGGCAATGTTGTTCCTTGA-3’，如SEQ ID NO：5所示，其探针序列为5’-AACAATGCTGCMAYCGTGCTAC-3’，如SEQ ID NO：6所示；
所述用于检测HCoV-229E ORF1ab基因的正向引物序列为5’-ACTTTGTCAGTTCGTATGCTAAAC-3’，如SEQ ID NO：7所示，其反向引物序列为5’-TTGTCAGAACATTGGCATTAACA-3’，如SEQ ID NO：8所示，其探针序列为5’-ATTATCAGCTTATGACTTGGCGTGT-3’，如SEQ ID NO：9所示；
所述用于检测HCoV-NL63 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-GTTCTCTTATAGGTGGCATGGT-3’，如SEQ ID NO：10所示，其反向引物序列为5’-GAAGCACATCAGTTTGTAAAGCA-3’，如SEQ ID NO：11所示，其探针序列为5’-CCTTTTTCTTTGGCACTGCAAGCAC-3’，如SEQ ID NO：12所示；
所述用于检测HCoV-HKU1 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-AGTTTATCTTTAGTTGATGTTTGGGA-3’，如SEQ ID NO：13所示，其反向引物序列为5’-GATTTAACTAGGCGTGACAATTCAT-3’，如SEQ ID NO：14所示，其探针序列为5’-TATTTGACAGGTTGTGATTATGTTGTTTGGG-3’，如SEQ ID NO：15所示；
所述用于检测HCoV-OC43 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-CTGGCCACTAGTTATTATTGCAAA-3’，如SEQ ID NO：16所示，其反向引物序列为5’-TCTGGACCACTATTAACAACCTG-3’，如SEQ ID NO：17所示，其探针序列为5’-TTGCAAAATAATGAATTAATGCCTGCTAAGTTGA-3’，如SEQ ID NO：18所示；
所述用于检测人类RNA内参B2M基因的正向引物序列为5’-TCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’，如SEQ ID NO：19所示，其反向引物序列为5’-CCACTTTTTCAATTCTCTCTCCATT-3’，如SEQ IDNO：20所示，其探针序列为5’-TCTGCTGGATGACGTGAGTAAACCTG-3’，如SEQ ID NO：21所示。
2.如权利要求1所述的一种用于冠状病毒分型检测的引物探针组合物，其特征在于，所述用于检测SARS-CoV-2 S基因的探针5’端添加荧光报告基团FAM，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；所述用于检测SARS-CoV-2 N基因和SARS N基因的探针5’端添加荧光报告基团ROX，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；所述用于检测HCoV-229E ORF1ab基因的探针5’端添加荧光报告基团Cy5，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；所述用于检测HCoV-NL63ORF1ab基因的探针5’端添加荧光报告基团Cy5，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；所述用于检测HCoV-HKU1 ORF1ab基因的探针5’端添加荧光报告基团Cy5，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；所述用于检测HCoV-OC43 ORF1ab基因的探针5’端添加荧光报告基团Cy5，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；所述用于检测人类RNA内参B2M基因的探针5’端添加荧光报告基团VIC，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2。
3.一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于，包括RT-qPCR反应液、RT-qPCR酶液、阳性对照和阴性对照；所述RT-qPCR反应液包括如权利要求1或2所述的引物探针组合物。
4.如权利要求3所述的一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述RT-qPCR反应液包括反应所需的dNTPs、dUTP、Mg2+和缓冲液。
5.如权利要求3所述的一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述RT-qPCR酶液包括UNG酶、逆转录酶和热启动DNA聚合酶。
6.如权利要求3所述的一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为包括SARS-CoV-2 S基因、SARS-CoV-2 N基因、SARS N基因、HCoV-229EORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因和人类RNA内参B2M基因序列的重组质粒；所述阴性对照为RNase-free H2O。
7.一种用于非疾病诊断目的的冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒的使用方法，其特征在于，通过对疑似患者呼吸道样本进行RNA提取、应用权利要求3～6任意一项所述的多重RT-qPCR试剂盒配制扩增反应体系后进行多重RT-qPCR扩增，并根据扩增曲线进行结果分析，最终做出阴阳性判断。
8.如权利要求7所述的一种用于非疾病诊断目的的冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒的使用方法，其特征在于，所述扩增反应体系包括14μL RT-qPCR反应液、1μL RT-qPCR酶液、5μL待检测的核酸样品或阴性/阳性对照。
9.如权利要求7所述的一种用于非疾病诊断目的的冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒的使用方法，其特征在于，扩增程序为：25℃2min；50℃30min；95℃2min；95℃15s，60℃60s，循环45次，并在60℃时收集荧光信号。
10.如权利要求7所述的一种用于非疾病诊断目的的冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒的使用方法，其特征在于，阴性结果判断条件：VIC通道的Ct值≤38，且其他荧光信号通道的Ct值≥38或显示为Undetermined/No Ct；阳性结果判定条件：若FAM通道/ROX通道/VIC通道Ct值≤38，且扩增曲线呈典型S型，Cy5通道Ct值≥38或显示为Undetermined/NoCt，则样本判断为SARS-CoV-2阳性；若ROX通道/VIC通道Ct值≤38，且扩增曲线呈典型S型，Cy5通道/FAM通道Ct值≥38或显示为Undetermined/No Ct，则样本判断为疑似SARS-CoV-2或SARS阳性，需做进一步筛查；若Cy5通道/VIC通道Ct值≤38，且扩增曲线呈典型S型，FAM通道/ROX通道Ct值≥38或显示为Undetermined/No Ct，则样本判断为HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HUK1、HCoV-OC43中的一种冠状病毒阳性。
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