CN111100954A - 同时检测包括2019-nCoV在内的四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时检测包括2019‑nCoV在内的四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒具体，属于检测技术领域。其应用于RT‑PCR/qRT‑PCR检测；所述检测试剂盒具体包括：四对特异性引物对和四条探针，阳性质控品。所述四种人冠状病毒分别对应的一对特异性引物和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列。以无菌水或超纯水作为阴性质控品。本发明可快速同时甄别2019‑nCoV/MERS‑CoV/HCoV‑OC43/HCoV‑HKUI四种人冠状病毒，具有检测灵敏度高、特异性强、可实现多重快速检测、操作简单、应用方便等突出的优点。

Description

同时检测包括2019-nCoV在内的四种人冠状病毒的四重荧光 定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种同时检测包括2019-nCoV在内的四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒具体涉及用于检测2019-nCoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒的试剂盒，属于检测技术领域。
背景技术
人冠状病毒(Human Coronaviruses，hCoVs)感染是引起人类呼吸道疾病的重要病原之一，在常见呼吸道病原体中冠状病毒检出率约为3％-10％，是感染婴幼儿、老人及免疫功能低下的成人，从而引发咳嗽、发热、喉炎、支气管炎以及肺炎等临床症状的重要病原。目前，已知的人冠状病毒共有七种，分别是19世纪六十年代发现的人冠状病毒229E(Humancoronavirus 229E,HCoV-229E)和HCoV-OC43，2003年出现的严重急性呼吸综合征(Severeacute respiratory syndrome,SARS)冠状病毒SARS-CoV，2004年在荷兰分离鉴定的新型人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，2005年在香港分离鉴定的新型人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)，2012年6月在中东地区出现的中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)冠状病毒MERS-CoV，以及2019年出现并爆发流行的新型冠状病毒2019-nCoV。
流行病学研究表明，HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI这四种人冠状病毒在世界各地均有流行，呈全球性分布，临床症状主要表现为发热、咳嗽、鼻炎、喉炎以及支气管炎、肺炎等，给人类生命健康造成一定的负担。SARS-CoV和MERS-CoV以及2019-nCoV这三种冠状病毒感染人后却能造成急性呼吸道症状，严重者引发呼吸系统和肾功能系统衰竭并造成死亡。SARS-CoV自2003年出现后共造成全球约9000人感染，约800死亡，死亡率近10％。得益于全球有效的疾病防控措施，目前SARS-CoV已经消失未见流行报道。MERS-CoV作为新近出现第六种人冠状病毒，目前全球已有26个国家及地区报道了确诊病例2428例，死亡839例，死亡率高达34.6％。MERS-CoV目前主要在中东沙特阿拉伯地区流行，韩国在2015年出现过一次集中爆发流行，我国也有一例从韩国输入性病例。MERS-CoV不仅是国内疾控重点监测的传染病，同时也是目前国境口岸严防传入的重要传染病之一。
早期防控是防止传染病输入播散、保障公共卫生安全、维护人类生命健康的前提条件，而开发快速、灵敏、特异的分子检测技术方法是早期防控的关键，同时也为指导临床、合理选择抗病毒药物提供重要依据。目前，针对人冠状病毒的检测技术方法主要包括病毒分离培养、血清学检测法、普通PCR法、等温扩增法以及荧光定量RT-PCR法。病毒分离培养、血清学检测法以及普通PCR法是比较常规的检测方法，这些方法在实验过程中面临检测灵敏度较低、检测时间过长、对实验室硬件要求高、对操作人员技术要求较高等诸多缺点，无法保证检测的时效性和结果的准确性。等温扩增法和荧光定量RT-PCR法是目前大多数实验室经常用到的分子检测技术方法。等温扩增法存在检测设备、检测试剂昂贵，极易发生交叉污染导致检测结果不确定性等突出问题，而且仅能实现单一病原体检测，无法实现单管多重检测等问题。荧光定量RT-PCR法目前同样面临仅能实现单管单重(最多两重)病原体检测的问题，不仅增加了病原体筛查的次数，使得检测结果的时间大大延长，而且增加了操作过程，极大增大了检测成本，不利于疾病的快速诊断和早期防控。hCoVs快速、准确的检测不仅对监测和防控hCoVs的流行具有重要意义，也为临床早期诊断，合理选择抗病毒药物治疗等提供可靠实验室依据。
发明内容
本发明为解决hCoVs检测过程中耗时较长、检测效率较低、检测成本较高、检测时效性不强等缺陷，提供一种同时检测包括2019-nCoV在内的四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其检测快速，特异性好。
本发明的技术方案，用于检测2019-nCoV人冠状病毒荧光定量RT-PCR/qRT-PCR的特异性引物，包括特异性引物1，具体如SEQ ID No.1：GGGGAACTTC TCCTGCTAGAAT；特异性引物2，SEQ ID No.2：CAGACATTTT GCTCTCAAGC TG。
本发明的另一种技术方案，用于检测2019-nCoV人冠状病毒荧光定量RT-PCR/qRT-PCR的探针，2019-nCoV探针，具体如SEQ ID No.9：5'VIC-TTGCTGCTGC TTGACAGATT-3'MGB。
优选的，所述2019-nCoV探针5'端标记VIC荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团。
本发明的另一种技术方案，同时检测2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/HCoV-HKUI四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，应用于RT-PCR/qRT-PCR检测；所述检测试剂盒具体包括：四对特异性引物对和四条探针，阳性质控品。
具体根据2019-nCoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒基因组序列，分别寻找各个冠状病毒的保守序列，作为优选，分别设计了适用于qRT-PCR的特异性引物组和靶探针，引物信息。
优选的，所述四种人冠状病毒分别对应的一对特异性引物和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列。
优选的，针对人冠状病毒2019-nCoV，特异性引物对包括特异性引物1和特异性引物2，特异性引物1的序列如SEQ ID No.1，特异性引物2的序列如SEQ ID No.2；2019-nCoV探针序列如SEQ ID No.9；
针对人冠状病毒MERS-CoV，特异性引物对包括特异性引物3和特异性引物4，特异性引物3的序列如SEQ ID No.3，特异性引物4的序列如SEQ ID No.4；MERS-CoV探针序列如SEQ ID No.10；
针对人冠状病毒HCoV-OC43，特异性引物对包括特异性引物5和特异性引物6，特异性引物5的序列如SEQ ID No.5，特异性引物6的序列如SEQ ID No.6；HCoV-OC43探针序列如SEQ ID No.11；
针对人冠状病毒HCoV-HKU1，特异性引物对包括特异性引物7和特异性引物8，特异性引物7的序列如SEQ ID No.7，特异性引物8的序列如SEQ ID No.8；HCoV-HKU1探针序列如SEQ ID No.12。
优选的，所述2019-nCoV探针5'端标记VIC荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；MERS-CoV探针5'端标记FAM荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；HCoV-OC43探针5'端标记ROX荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；HCoV-HKU1探针5'端标记Cy5荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团。
优选的，所述阳性质控品靶序列涵盖了四对特异性引物对和四条探针的片段。
优选的，所述阳性质控品靶序列具体如SEQ ID No.13。
优选的，以无菌水或超纯水作为阴性质控品。
上述序列具体如表1所示。
表1
Figure BDA0002381019500000041
同时检测2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/HCoV-HKUI四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒在2019-nCoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒qRT-PCR检测中的应用。
本发明实施例中，本发明提供的同时检测2019-nCoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒qRT-PCR试剂盒含有扩增体系，检测方法如下步骤：
(1)样本制备：样本核酸可从鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液等样本中用核酸提取试剂盒直接提取，或可手动提取，也可用全自动核酸提取仪提取，提取的核酸直接用于下一步扩增反应。
(2)qRT-PCR检测：
选用One-step qRT-PCR Kit(TOYOBO)以25μL反应体系为例使用量终浓度具体如下：2Х反应液12.5μL，DNA聚合酶1μL，RT逆转录酶1μL，四对特异性引物对每条均为0.5μL，终浓度均为0.5μM，四条探针序列每条均为0.375μL，终浓度均为0.2μM，配置三管上述反应体系，各在其中加入5μL步骤(1)提取的样本RNA、阳性质控品和阴性质控品，随后采用超纯水定容至25μL；
该体系中，探针分别标记荧光色不同的荧光基团，作为优选，所述荧光基团包括FAM、VIC、ROX、Cy5，荧光淬灭基团标记MGB。
本发明的试剂盒中含有阳性质控品靶序列，其核苷酸序列如阳性质控靶序列所示，该阳性质控品由人工合成，所述试剂盒在工作时，在扩增体系中分别加入样品RNA和阳性质控品及阴性质控品，以去离子水或无菌水作为阴性质控品，混合均匀后进行qRT-PCR扩增检测。
本发明试剂盒可应用于的仪器设备包括但不限于ABI7000/7300/7500/7500Fast/7900HT/StepOnedTM等等，Roche公司的仪器，Bio-Rad公司的仪器，QIAGEN公司的仪器等。
(3)结果分析与判定：
a、调整阈值：阈值设定原则为以刚好超过正常阴性对照的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整。
b、质量控制：阴性对照或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，实验成立；否则实验结果无效。
c、结果判定：
c1、若检测样品有S型扩增且Ct(或Cq)值≤38，根据检测目标所对应的荧光通道进行判读；
c2、若有S型扩增，且38<Ct(或Cq)值<40,判定为不确定样品，需重新提取核酸后进行检测；若复检样品与前者一致，则可判定样品为弱阳性；
c3、若无明显S型扩增曲线，但报告有Ct(或Cq)值，为非特异性扩增，判定为阴性。
本发明的有益效果：本发明可快速同时甄别2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/HCoV-HKUI四种人冠状病毒，具有检测灵敏度高、特异性强、可实现多重快速检测、操作简单、应用方便等突出的优点。
附图说明
图1是本发明试剂盒对MERS-CoV病毒的检出扩增曲线。
图2是本发明试剂盒对2019-nCoV病毒的检出扩增曲线。
图3是本发明试剂盒对HCoV-OC43病毒的检出扩增曲线。
图4是本发明试剂盒对HCoV-HKU1病毒的检出扩增曲线。
图5是本发明试剂盒与A公司试剂盒对HCoV-HKU1检测对比图。
具体实施方式
本发明实施例中，提供的同时检测2019-nCoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒qRT-PCR试剂盒含有扩增体系，检测方法步骤如下：
(1)样本制备：样本核酸可从鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液等样本中用核酸提取试剂盒直接提取，或可手动提取，也可用全自动核酸提取仪提取，提取的核酸直接用于下一步扩增反应。
(2)qRT-PCR检测：
选用One-step qRT-PCR Kit(TOYOBO)以25μL反应体系为例使用量终浓度具体如下：2Х反应液12.5μL，DNA聚合酶1μL，RT逆转录酶1μL，四对特异性引物对每条均为0.5μL，终浓度均为0.5μM，四条探针序列每条均为0.375μL，终浓度均为0.2μM，配置三管上述反应体系，各在其中加入5μL步骤(1)提取的样本RNA、阳性质控品和阴性质控品，随后采用超纯水定容至25μL；
以Bio-Rad CFX96仪器为实施例，扩增程序设置如表2所示。
表2
Figure BDA0002381019500000061
检测设置：以Bio-Rad CFX96仪器设置为例，点击“plate”窗口，进入“create New”样本信息编辑界面，在“select Folurophore”中分别选则FAM、VIC、ROX和Cy5荧光通道，分别对应MERS-CoV、2019-nCoV、HCoV-OC43、HCoV-HKUI的检测。
(3)结果分析与判定：
a、调整阈值：阈值设定原则为以刚好超过正常阴性对照的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整。
b、质量控制：阴性对照或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，实验成立；否则实验结果无效。
c、结果判定：
c1、若检测样品有S型扩增且Ct(或Cq)值≤38，根据检测目标所对应的荧光通道按照下表(表3)进行判读；
c2、若有S型扩增，且38<Ct(或Cq)值<40,判定为不确定样品，需重新提取核酸后进行检测；若复检样品与前者一致，则可判定样品为弱阳性；
c3、若无明显S型扩增曲线，但报告有Ct(或Cq)值，为非特异性扩增，判定为阴性。
表3
荧光通道 FAM VIC ROX Cy5
MERS-CoV 阳性(+) 阴性(-) 阴性(-) 阴性(-)
2019-nCoV 阴性(-) 阳性(+) 阴性(-) 阴性(-)
HCoV-OC43 阴性(-) 阴性(-) 阳性(+) 阴性(-)
HCoV-HKU1 阴性(-) 阴性(-) 阴性(-) 阳性(+)
实施例1
待测样品为：鼻咽拭子。
对应表3进行结果判读，具体扩增曲线如图1所示。
如图1，阴性质控品或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在FAM荧光通道出现S型扩增曲线，且Ct(或Cq)值≤38，判读该待检样本MERS-CoV阳性。
实施例2
待测样品为：鼻咽拭子。
对应表3进行结果判读，具体扩增曲线如图2所示。
如图2，阴性质控品或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在VIC荧光通道出现S型扩增曲线，且Ct(或Cq)值≤38，判读该待检样本2019-nCoV阳性。
实施例3
待测样品为：鼻咽拭子。
对应表3进行结果判读，具体扩增曲线如图3所示。
如图3，阴性质控品或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在ROX荧光通道出现S型扩增曲线，且Ct(或Cq)值≤38，判读该待检样本HCoV-OC43阳性。
实施例4
待测样品为：鼻咽拭子。
对应表3进行结果判读，具体扩增曲线如图4所示。
如图4，阴性质控品或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在Cy5荧光通道出现S型扩增曲线，且Ct(或Cq)值≤38，判读该待检样本HCoV-HKU1阳性。
实施例5特异性实验
选择与人冠状病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他病原体，如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒为待检样本，用本发明试剂盒进行检测，操作严格按照试剂盒说明书进行，在CFX96实时荧光定量PCR仪器上进行检测，检测结果均为阴性，表明本发明试剂盒具备较好检测特异性。
对比实施例1
选用本发明试剂盒与A公司单重检测试剂盒对HCoV-HKU1进行检测，结果如图5所示，采用本发明提供的四重qRT-PCR试剂盒与A公司单重检测试剂盒检测HCoV-HKU1病毒，本发明试剂盒阳性质控品Ct值远低于A公司，且能检出HCoV-HKU1阳性。
A公司未能检出HCoV-HKU1，检测灵敏度低于本专利试剂盒。
对比实施例2
分别使用3个批次的本发明试剂盒对阳性质控品、阴性质控品、中、低三个浓度的标准品进行10次重复检测，批内不精密度Ct值的CV范围为：MERS-CoV为0.68～1.42％，2019-nCoV为0.73～1.55％，HCoV-OC43为0.77～1.47％，HCoV-HKU1为0.89～1.65％；批间不精密度Ct值的CV范围为：MERS-CoV为1.12～1.19％，2019-nCoV为1.03～1.40％，HCoV-OC43为1.03～1.52％，HCoV-HKU1为0.95～1.40％；检测结果如表4所示。
表4
Figure BDA0002381019500000081
由表4可知，其批内和批间精密度Ct值的CV值均小于5％，阴性对照均为阴性，表明本发明试剂盒精密度良好。
本发明试剂盒具备市场上独一无二的创新性，即可单管实现同时检测2019-nCoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒，不仅检测特异性强、检测灵敏度高，而且检测时间快，避免了逐个检测所带来的耗时长、检测成本高、容易交叉污染等缺点。目前市场上未见有类似相关产品报道，本发明试剂盒在疾病检测、传染病防控、指导临床治疗等方面具有广阔应用前景。
以上显示和描述了发明的基本原理、主要特征和发明的优点。本行业的技术人员应该了解，发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是发明的原理，在不脱离发明精神和范围的前提下发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的发明的范围内。发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 中华人民共和国无锡海关
新疆国际旅行卫生保健中心（乌鲁木齐海关口岸门诊部）
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> 同时检测包括2019-nCoV在内的四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 特异性引物1(人工序列)
<400> 1
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 特异性引物2(人工序列)
<400> 2
cagacatttt gctctcaagc tg 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 2019-nCoV探针(人工序列)
<400> 3
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 特异性引物3(人工序列)
<400> 4
caacacggga aagtccctct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 特异性引物4 (人工序列)
<400> 5
gtcctgtctc cgccaatacc 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> MERS-CoV探针(人工序列)
<400> 6
gggtgtacct cttaatgcca attcc 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 特异性引物5(人工序列)
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aggaccgcat gctaaagacc 20
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<213> 特异性引物6 (人工序列)
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cctcatcgct acttgggtcc 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> HCoV-OC43探针 (人工序列)
<400> 9
caaccaggct gatgtcaata ccccg 25
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 特异性引物7(人工序列)
<400> 10
gcccatatgc caatgcatcc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 特异性引物8(人工序列)
<400> 11
aggcggaaac ctagtaggga 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> HCoV-HKU1探针 (人工序列)
<400> 12
aggggtcttc tgggttgcta atcac 25
<210> 13
<211> 846
<212> DNA
<213> 阳性质控品(人工序列)
<400> 13
aactagaaag ggcaaacggg tggatttgtc acccaagctg catttttatt atcttggcac 60
aggaccccat aaagatgcaa aatttagaga gcgtgttgaa ggtgtcgtct gggttgaccc 120
aacacgggaa agtccctctt acctttccac ctgggcaggg tgtacctctt aatgccaatt 180
ccacccctgc gcaaaatgct gggtattggc ggagacagga cagacattcc caggaatctt 240
gtccctattg gtaagggtaa taaagatgag cagattggtt attggaatgt tcaagagcgt 300
tggcgtatgc gcagggggca acgtgttgat ttgcctccta acaggaccgc atgctaaaga 360
ccagtacggc accgatattg acggagtcta ctgggtcgct agcaaccagg ctgatgtcaa 420
taccccggct gacattgtcg atcgggaccc aagtagcgat gaggctaccg gcccatatgc 480
caatgcatcc tatggtgaat ccctcgaagg ggtcttctgg gttgctaatc accaagctga 540
cacttctact ccctccgatg tttcgtcaag ggatcctact actcaagaag ctatccctac 600
taggtttccg cctggtcacc cctgtgggtt ttacacttaa aaacacagtc tgtaccgtct 660
gcggtatgtg gaaaggttat ggctgtagtt gtgatcaact ccgcgaaccc atgcttcagt 720
cagctgatgc acaatcgttt gaccggggaa cttctcctgc tagaatggct ggcaatggcg 780
gtgatgctgc tcttgctttg ctgctgcttg acagattgaa ccagcttgag agcaaaatgt 840
ctgcta 846

Claims (10)

1.用于检测2019-nCoV人冠状病毒荧光定量RT-PCR/qRT-PCR的特异性引物，其特征是：包括特异性引物1，具体如SEQ ID No.1：GGGGAACTTC TCCTGCTAGA AT；特异性引物2，SEQ IDNo.2：CAGACATTTT GCTCTCAAGC TG。
2.用于检测2019-nCoV人冠状病毒荧光定量RT-PCR/qRT-PCR的探针，其特征是：2019-nCoV探针，具体如SEQ ID No.9：5'VIC-TTGCTGCTGC TTGACAGATT-3'MGB。
3.如权利要求2所述用于检测2019-nCoV人冠状病毒荧光定量RT-PCR/qRT-PCR的探针，其特征是：所述2019-nCoV探针5'端标记VIC荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团。
4.同时检测2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/HCoV-HKUI四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：应用于RT-PCR/qRT-PCR检测；所述检测试剂盒具体包括：四对特异性引物对和四条探针，阳性质控品。
所述四种人冠状病毒分别对应的一对特异性引物和一条探针；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列。
5.如权利要求4所述同时检测2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/ HCoV-HKUI四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：
针对人冠状病毒2019-nCoV，特异性引物对包括特异性引物1和特异性引物2，特异性引物1的序列如SEQ ID No.1，特异性引物2的序列如SEQ ID No.2；2019-nCoV探针序列如SEQID No.9；
针对人冠状病毒MERS-CoV，特异性引物对包括特异性引物3和特异性引物4，特异性引物3的序列如SEQ ID No.3，特异性引物4的序列如SEQ ID No.4；MERS-CoV探针序列如SEQID No.10；
针对人冠状病毒HCoV-OC43，特异性引物对包括特异性引物5和特异性引物6，特异性引物5的序列如SEQ ID No.5，特异性引物6的序列如SEQ ID No.6；HCoV-OC43探针序列如SEQID No.11；
针对人冠状病毒HCoV-HKU1，特异性引物对包括特异性引物7和特异性引物8，特异性引物7的序列如SEQ ID No.7，特异性引物8的序列如SEQ ID No.8；HCoV-HKU1探针序列如SEQID No.12。
6.如权利要求5所述同时检测2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/ HCoV-HKUI四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述2019-nCoV探针5'端标记VIC荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团； MERS-CoV探针5'端标记FAM荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团； HCoV-OC43探针5'端标记ROX荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；HCoV-HKU1探针5'端标记Cy5荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团。
7.如权利要求4所述同时检测2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/ HCoV-HKUI四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述阳性质控品靶序列涵盖了四对特异性引物对和四条探针的片段。
8.如权利要求7所述同时检测2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/ HCoV-HKUI四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是所述阳性质控品靶序列具体如SEQ IDNo.13。
9.如权利要求4所述同时检测2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/ HCoV-HKUI四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：以无菌水或超纯水作为阴性质控品。
10.如权利要求4-9之一所述同时检测2019-nCoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/ HCoV-HKUI四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒在2019-nCoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒qRT-PCR检测中的应用。
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