CN111593142A

CN111593142A - 一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒

Info

Publication number: CN111593142A
Application number: CN202010469523.6A
Authority: CN
Inventors: 王海岩; 张通; 邓雪萍; 刘奕; 李艳艳; 陈旭; 赵书清; 张国宁
Original assignee: Shandong Acv Biotech Co ltd
Current assignee: Shandong Acv Biotech Co ltd
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2020-08-28

Abstract

本发明公开了一种同时检测包括SARS‑CoV‑2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明的试剂盒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型的引物组和荧光探针，以及反应液、酶混合液、阳性质控品、阴性质控品。本发明可实现包括新型冠状病毒SARS‑CoV‑2在内的九种常见呼吸道病毒的快速确认与筛查，同时本发明使用实时荧光定量PCR技术，试剂盒具备灵敏度高，特异性好。

Description

一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。TaqMan探针法实时荧光定量PCR原理是，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

流感是由流感病毒引起的一种急性病毒性呼吸道感染，传染性强，发病率高，其中甲型流感病毒的流行性比乙型流感病毒更强，症状更严重。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株。该病毒引起的症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。该病毒存在人传人现象，病毒潜伏期一般为1～14天，潜伏期具有传染性。

在成年人和儿童中，发热伴呼吸道症候群是最普遍的急性传染病，对于患者和公共卫生部门来说，准确快速诊断由哪种病毒引起的呼吸道感染十分重要。目前新型冠状病毒相关检测产品需求量较大，快速鉴别新型冠状病毒感染抑或是其他常见呼吸道病毒感染成为临床和公共卫生部门亟需解决的问题。

开发一种快速便捷检测多种呼吸道病毒的检测试剂盒是亟需解决的问题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒。本发明针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型，开发了呼吸道病毒多重检测体系。能够高效率、高特异性、低成本的对呼吸道病毒感染患者进行检测，有助于快速筛查新型冠状病毒SARS-CoV-2感染患者和其他呼吸道病毒感染患者。

本发明的技术方案为：

一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，包括检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型的引物组、探针组；

检测甲型流感病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的序列如SEQID No.2所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.3所示；

检测乙型流感病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，下游引物的序列如SEQID No.5所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.6所示；

检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，下游引物的序列如SEQ ID No.8所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.9所示；

检测鼻病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.10所示，下游引物的序列如SEQ IDNo.11所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.12所示；

检测副流感病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.13所示，下游引物的序列如SEQID No.14所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.15所示；

检测呼吸道合胞病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.16所示，下游引物的序列如SEQ ID No.17所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.18所示；

检测冠状病毒229E亚型的上游引物的序列如SEQ ID No.19所示，下游引物的序列如SEQ ID No.20所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.21所示；

检测冠状病毒OC43亚型的上游引物的序列如SEQ ID No.22所示，下游引物的序列如SEQ ID No.23所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.24所示；

检测冠状病毒HKU1亚型的上游引物的序列如SEQ ID No.25所示，下游引物的序列如SEQ ID No.26所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.27所示。

作为优选方案，所述引物组、探针组具体为引物探针混合液A、引物探针混合液B、引物探针混合液C；

所述引物探针混合液A包括检测甲型流感病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测乙型流感病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的上游引物、下游引物和荧光探针；

所述引物探针混合液B包括检测鼻病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测副流感病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测呼吸道合胞病毒的的上游引物、下游引物和荧光探针；

所述引物探针混合液C包括检测冠状病毒229E亚型的上游引物、下游引物和荧光探针，检测冠状病毒OC43亚型的上游引物、下游引物和荧光探针，检测冠状病毒HKU1亚型的上游引物、下游引物和荧光探针。

进一步地，还包括阳性质控品A、阳性质控品B、阳性质控品C和阴性质控品；

所述阳性质控品A为含甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2基因特异性片段的质粒；

所述阳性质控品B为含鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒特异性片段的质粒；

所述阳性质控品C为含冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型特异性片段的质粒；

所述阴性质控品包括DEPC处理水。

作为优选方案，检测甲型流感病毒、鼻病毒和冠状病毒229E亚型的荧光探针的荧光基团为FAM基团，淬灭基团为BHQ1。

作为优选方案，检测乙型流感病毒、副流感病毒和冠状病毒OC43亚型的荧光探针的荧光基团为CY5基团，淬灭基团为BHQ3。

作为优选方案，检测新型冠状病毒SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒、冠状病毒HKU1亚型的荧光探针的荧光基团为ROX基团，淬灭基团为BHQ2。

作为优选方案，还包括反应液、酶混合液；所述反应液包括Tris-HCl缓冲液、dNTPs、Mg²⁺、Tween-20和甜菜碱；所述酶混合液包括DNA聚合酶和反转录酶。

进一步地，反应液中Tris-HCl缓冲液浓度为10mM；dNTPs浓度为10mM；Mg²⁺浓度为6mM；Tween-20含量为0.5％；甜菜碱浓度为1.5M。

作为优选方案，酶混合液中DNA聚合酶浓度为50U/μl；反转录酶浓度为20U/μl。

多重检测上述九种呼吸道病毒核酸的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的核酸样本；

(2)配制RT-PCR反应体系并进行RT-PCR检测：

其中，所述RT-PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、引物探针混合液、反应液、酶混合液。

所述核酸样本可来自咽拭子样本、鼻拭子样本、肺泡灌洗液样本、痰液样本。

本发明的有益效果为：

本发明可实现包括新型冠状病毒SARS-CoV-2在内的九种常见呼吸道病毒的快速确认与筛查，同时本发明使用实时荧光定量PCR技术，试剂盒具备灵敏度高，特异性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为甲型流感病毒样本扩增曲线；

图2为乙型流感病毒样本扩增曲线；

图3为新型冠状病毒SARS-CoV-2样本扩增曲线；

图4为鼻病毒样本扩增曲线；

图5为副流感病毒样本扩增曲线；

图6为呼吸道合胞病毒样本扩增曲线；

图7为冠状病毒229E亚型样本扩增曲线；

图8为冠状病毒OC43亚型样本扩增曲线；

图9为冠状病毒HKU1亚型样本扩增曲线；

图10为甲型流感病毒灵敏度扩增曲线；

图11为乙型流感病毒灵敏度扩增曲线；

图12为新型冠状病毒SARS-CoV-2灵敏度扩增曲线；

图13为鼻病毒灵敏度扩增曲线；

图14为副流感病毒灵敏度扩增曲线；

图15为呼吸道合胞病毒灵敏度扩增曲线；

图16为冠状病毒229E亚型灵敏度扩增曲线；

图17为冠状病毒OC43亚型灵敏度扩增曲线；

图18为冠状病毒HKU1亚型灵敏度扩增曲线。

具体实施方式

下面以具体实施方式进一步说明本发明。

实施例1用于特异性检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物组和荧光探针

下载GISAID数据库中公布的新型冠状病毒SARS-CoV-2的序列，利用MAFFT分析软件比对序列，分析其基因组的保守区域。在这些保守区域中设计出数十组针对新型冠状病毒ORF1ab基因检测的特异性引物和探针序列。

引物、探针设计遵循以下原则：

先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段；这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过200bp，理想的最好能在80-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

保持GC含量在40％和60％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G(不能有4个连续的G)

将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

引物设计原则：

序列选取应在基因的保守区段。

避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构。

Tm值在55-65℃，GC含量在40％-60％。

引物之间的Tm值相差避免超过2℃。

引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。

为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

探针设计原则：

Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp。

引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。

探针长度应在20-30bp，以保证结合特异性

Tm值在65-70℃，通常比引物Tm值高8℃。

探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。

整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

此外，通过对NCBI Blast在线数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对上述设计的新型冠状病毒特异性引物和探针序列进行比对分析避免与其他病毒或人类基因发生非特异结核。通过多轮筛选和优化，最终确定了一套灵敏度和特异性最优的引物、探针序列。

用于检测新型冠状病毒的引物序列为：

SEQ ID NO.7：CACTTCAGAGAGCTAGGTGTTGTAC

SEQ ID NO.8：ATCTAGTAATAGATTACCAGAAGCAGCG

对应的检测探针的序列为：

SEQ ID NO.9：ROX-ACTTGTGTATGCTGCTGACCCTGCTATGC-BHQ2

其中，探针的5’端荧光基团为ROX，3’端淬灭基团为BHQ2。

实施例2同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒

一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，包括检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型的引物组、探针组；以及反应液、酶混合液、阳性质控品、阴性质控品。

具体地，

检测甲型流感病毒、鼻病毒和冠状病毒229E亚型的荧光探针的荧光基团为FAM基团，淬灭基团为BHQ1。

检测乙型流感病毒、副流感病毒和冠状病毒OC43亚型的荧光探针的荧光基团为CY5基团，淬灭基团为BHQ3。

检测新型冠状病毒SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒、冠状病毒HKU1亚型的荧光探针的荧光基团为ROX基团，淬灭基团为BHQ2。

引物组和探针序列如表1所示。

表1试剂盒中各PCR反应管中的引物探针序列

引物组、探针组具体为引物探针混合液A、引物探针混合液B、引物探针混合液C；

引物探针混合液A包括检测甲型流感病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测乙型流感病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的上游引物、下游引物和荧光探针；

引物探针混合液B包括检测鼻病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测副流感病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测呼吸道合胞病毒的的上游引物、下游引物和荧光探针；

引物探针混合液C包括检测冠状病毒229E亚型的上游引物、下游引物和荧光探针，检测冠状病毒OC43亚型的上游引物、下游引物和荧光探针，检测冠状病毒HKU1亚型的上游引物、下游引物和荧光探针。

阳性质控品包括阳性质控品A、阳性质控品B、阳性质控品C。

阳性质控品A为含甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2基因特异性片段的质粒；其中，甲型流感病毒的基因特异性片段如SEQ ID No.28所示；乙型流感病毒的基因特异性片段如SEQ ID No.29所示；新型冠状病毒SARS-CoV-2的基因特异性片段如SEQ ID No.30所示。

阳性质控品B为含鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒特异性片段的质粒；其中，鼻病毒的基因特异性片段如SEQ ID No.31所示；副流感病毒的基因特异性片段如SEQ IDNo.32所示；呼吸道合胞病毒的基因特异性片段如SEQ ID No.33所示。

阳性质控品C为含冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型特异性片段的质粒；其中，冠状病毒229E亚型的基因特异性片段如SEQ ID No.34所示；冠状病毒OC43亚型的基因特异性片段如SEQ ID No.35所示；冠状病毒HKU1亚型的基因特异性片段如SEQ ID No.36所示。

表2阳性质控品质粒中包含的各病毒的特异性片段序列

阴性质控品为DEPC处理水。

其中，阳性质控品中所述的特异性片段分别为：

反应液包括Tris-HCl缓冲液、dNTPs、Mg²⁺、Tween-20和甜菜碱；反应液中Tris-HCl缓冲液浓度为10mM；dNTPs浓度为10mM；Mg²⁺浓度为6mM；Tween-20含量为0.5％；甜菜碱浓度为1.5M。

酶混合液包括DNA聚合酶和反转录酶。酶混合液中DNA聚合酶浓度为50U/μl；反转录酶浓度为20U/μl。

实施例3采用实施例2的试剂盒同时检测九种呼吸道病毒的方法

1、提取待测样本核酸，采用山东艾克韦生物技术有限公司的核酸提取试剂盒(磁珠法)(鲁济械备20190256号)。

2、配制反应体系，将试剂盒内反应液、引物探针混合液、酶混合液参照试剂盒说明书进行配制。

检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒体系配制方法如表3所示。

表3检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2体系配制方法

反应体系组份	加量(μL)/每人份
		酶混合液	4
反应液	12
		引物探针混合液A	4
总体积	20

检测鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒体系配制方法如表4所示。

表4检测鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒体系配制方法

反应体系组份	加量(μL)/每人份
		酶混合液	4
反应液	12
		引物探针混合液B	4
总体积	20

检测冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型体系配制方法如表5所示。

表5检测冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型体系配制方法

反应体系组份	加量(μL)/每人份
		酶混合液	4
反应液	12
		引物探针混合液C	4
总体积	20

准备反应试剂人份数(n＝待检样本数+阴性质控品+阳性质控品)，计算上述各试剂的使用量，配制并充分混匀后，按20μL的量分装到n个PCR反应管中。

加样：在上述准备好的反应管中分别加入5μL处理好的样本，如表6所示.

表6反应管中加样

样本类型	加量
		临床样本	5μL
阳性质控品A/B/C	5μL
		阴性质控品	5μL

3、上机检测

将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。

参数设置如表7所示。

表7PCR检测参数

4、结果判定

(1)阳性：待测样本检测结果Ct值≤35且有典型S型扩增曲线，结果测定有效，可直接判断样本为阳性。

(2)阴性：待测样本检测结果在Ct﹥38或无典型S型扩增曲线，可直接判断样本为阴性。

(3)可疑：待测样本检测结果35﹤Ct≤38，此时应对样本进行重复检测，如重读实验结果Ct仍≤38，且曲线有明显扩增期，可判断样本为阳性，否则为阴性。

实施例4本发明检测试剂盒特异性检测

按照实施例3中所述检测方法，选择甲型流感病毒(样本编号001-010)、乙型流感病毒(样本编号011-020)、新型冠状病毒SARS-CoV-2(样本编号021-030)、鼻病毒(样本编号031-040)、副流感病毒(样本编号041-050)、呼吸道合胞病毒(样本编号051-060)、冠状病毒229E亚型(样本编号061-070)、冠状病毒OC43亚型(样本编号071-080)、冠状病毒HKU1亚型(样本编号081-090)核酸样本各10个，采用山东艾克韦生物技术有限公司的核酸提取试剂盒(磁珠法)(鲁济械备20190256号)提取核酸待测。检测扩增曲线结果如图1-图9所示。检测Ct值结果如表8所示。

表8个样本检测结果

CT值小于35表示该指标阳性，CT值大于38或Undetermined表示该指标阴性，CT值大于35小于38为检测灰度区间，需重新检测。

上述检测结果显示：样本001-010为甲型流感病毒阳性，样本011-020为乙型流感病毒阳性，样本021-030为新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性，样本031-040为鼻病毒阳性，样本041-050为副流感病毒阳性，样本051-060为呼吸道合胞病毒阳性，样本061-070为冠状病毒229E亚型阳性，样本071-080为冠状病毒OC43亚型阳性，样本081-090为冠状病毒HKU1亚型阳性，与样本实际情况相符；可见，本发明的试剂盒针对9种呼吸道病毒检测特异性极好。

实施例6本发明试剂盒灵敏度检测

预确定：选择甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型核酸样本各1个，利用数字PCR方法(按试剂盒说明书操作)对临床样本中病毒含量进行绝对定量，数字PCR采用Bio-rad公司生产的QX200数字PCR仪进行，试剂采用该仪器配套的一步法检测试剂盒(探针法)，定量结果如表7所示。后将样本进行倍比稀释，得到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍稀释的核酸样本，使用本发明试剂盒检测该样本及倍比稀释后核酸样本，重复检测3次，确定试剂盒灵敏度，结果如表9所示，检测结果如图10-18所示；各病毒检测灵敏度如表10所示。

表9数字PCR对待检测样本定量结果

病毒	数字PCR定量
		甲型流感病毒	1×10<sup>5</sup>copies/ml
乙型流感病毒	1×10<sup>5</sup>copies/ml
		新型冠状病毒	1×10<sup>5</sup>copies/ml
鼻病毒	2×10<sup>5</sup>copies/ml
		副流感病毒	1×10<sup>6</sup>copies/ml
呼吸道合胞病毒	7×10<sup>5</sup>copies/ml
		冠状病毒229E亚型	4×10<sup>5</sup>copies/ml
冠状病毒OC43亚型	3×10<sup>5</sup>copies/ml
		冠状病毒HKU1亚型	1×10<sup>6</sup>copies/ml

表10本发明试剂盒对各病毒检测灵敏度

病毒	灵敏度
		甲型流感病毒	1×10<sup>2</sup>copies/ml
乙型流感病毒	1×10<sup>2</sup>copies/ml
		新型冠状病毒	1×10<sup>2</sup>copies/ml
鼻病毒	2×10<sup>2</sup>copies/ml
		副流感病毒	1×10<sup>3</sup>copies/ml
呼吸道合胞病毒	7×10<sup>2</sup>copies/ml
		冠状病毒229E亚型	4×10<sup>2</sup>copies/ml
冠状病毒OC43亚型	3×10<sup>2</sup>copies/ml
		冠状病毒HKU1亚型	1×10<sup>3</sup>copies/ml

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东艾克韦生物技术有限公司

<120> 一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒

<130> 2020

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agatttggac ctgcgagcg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagcggctgt ctccacaagt 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcagtcctc gctcactggg cacg 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaccratcct gtcacctctg ac 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggcattytg gacaaakcgt ctacg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgcagcaaa gcctacagca actgt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cacttcagag agctaggtgt tgtac 25

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atctagtaat agattaccag aagcagcg 28

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acttgtgtat gctgctgacc ctgctatgc 29

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tagcaatgac acacactagt caat 24

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attacctgga taagggtcat tacact 26

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agacaatccc cgaccgaatg accc 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

accctcagtg tgatggcttc caaa 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

taagggaggc ataatccggc acat 24

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acgcagcaaa gcctacagca actgt 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caagctggaa tctgarggaa cttaca 26

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcatctgcaa gatccattgg acat 24

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cccagaacar gaaggcagca aaccccattg 30

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atggctacag tcaaatgggc 20

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cactatcaac aagcaaaggg catataa 27

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cacaacgtgg tcgtcagggt agaata 26

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggttactata ttgaaggctc aggaagg 27

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tggctctact acgcgatcct 20

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gctctgctgg atgtgcgcga agtaga 26

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

attcactgtg tctactcaac cac 23

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccgaaagcaa tgggaactcc 20

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

attattcctg gttctccggg atcactc 27

<210> 28

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gggcattttg aacaaatcgt ctacgctgaa gtcctcgctc actgggcacg gtgagcgtga 60

aaacaaaccc taaaatcccc ttagtcagag gtgacaggat tggtc 105

<210> 29

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tcctcaactc actcttcgag cgttttgatg aaggacattc aaagccaatt cgagcagctg 60

aaactgcggt gggagtctta tcccaatttg gtcaagagca ccg 103

<210> 30

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cacttcagag agctaggtgt tgtacataat caggatgtaa acttacatag ctctagactt 60

agttttaagg aattacttgt gtatgctgct gaccctgcta tgcacgctgc ttctggtaat 120

ctattactag at 132

<210> 31

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tagcaatgac acacactagt caatatatat gcagtcctgt tcttacagac aatccccgac 60

cgaatgaccc aaatataggt aagtgtaatg acccttatcc aggtaat 107

<210> 32

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

accctcagtg tgatggcttc caaaataaga aatgggacct ttttgttgaa cgcagcaaag 60

cctacagcaa ctgttaccct tatgatgtgc cggattatgc ctccctta 108

<210> 33

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

taagctggaa tctgagggaa cttacaaaat cctcaccatt tattcgactg tcgcctcatc 60

tcttgtgctt gcaatggggt ttgctgcctt cctgttctgg gccatgtcca atggatcttg 120

cagatgc 127

<210> 34

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

atggctacag tcaaatgggc tgatgcatct gaaccacaac gtggtcgtca gggtagaata 60

ccttattctc tttatagccc tttgcttgtt gatagtg 97

<210> 35

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ggttactata ttgaaggctc aggaaggtct gctcctaatt ccagatctac ttcgcgcaca 60

tccagcagag cctctagtgc aggatcgcgt agtagagcca 100

<210> 36

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

attcactgtg tctactcaac cacaaggaaa tactatccca cattattcct ggttctccgg 60

gatcactcaa tttcaaaaag gtagagactt taaattttca gatggtcaag gagttcccat 120

tgctttcgg 129

Claims

1.一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型的引物组、探针组；

检测甲型流感病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的序列如SEQ IDNo.2所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.3所示；

检测乙型流感病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，下游引物的序列如SEQ IDNo.5所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.6所示；

检测鼻病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.10所示，下游引物的序列如SEQ ID No.11所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.12所示；

检测副流感病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.13所示，下游引物的序列如SEQ IDNo.14所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.15所示；

检测呼吸道合胞病毒的上游引物的序列如SEQ ID No.16所示，下游引物的序列如SEQID No.17所示，荧光探针的序列如SEQ ID No.18所示；

2.如权利要求1所述同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述引物组、探针组具体为引物探针混合液A、引物探针混合液B、引物探针混合液C；

3.如权利要求2所述同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于：还包括阳性质控品A、阳性质控品B、阳性质控品C和阴性质控品；

所述阴性质控品为DEPC处理水。

4.如权利要求2所述同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于：检测甲型流感病毒、鼻病毒和冠状病毒229E亚型的荧光探针的荧光基团为FAM基团，淬灭基团为BHQ1。

5.如权利要求2或4所述同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于：检测乙型流感病毒、副流感病毒和冠状病毒OC43亚型的荧光探针的荧光基团为CY5基团，淬灭基团为BHQ3。

6.如权利要求2或4所述同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于：检测新型冠状病毒SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒、冠状病毒HKU1亚型的荧光探针的荧光基团为ROX基团，淬灭基团为BHQ2。

7.如权利要求1-3任一项所述同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于：还包括反应液、酶混合液；所述反应液包括Tris-HCl缓冲液、dNTPs、Mg²⁺、Tween-20和甜菜碱；所述酶混合液包括DNA聚合酶和反转录酶。

8.如权利要求7所述同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于：反应液中Tris-HCl缓冲液浓度为10mM；dNTPs浓度为10mM；Mg²⁺浓度为6mM；Tween-20含量为0.5%；甜菜碱浓度为1.5M。

9.如权利要求7所述同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于：酶混合液中DNA聚合酶浓度为50U/μl；反转录酶浓度为20U/μl。