CN115838836B

CN115838836B - 不同类型病毒联检的组合物、试剂盒、方法及其用途

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Publication number: CN115838836B
Application number: CN202211424671.1A
Authority: CN
Inventors: 程星; 张杰洪; 谭德勇; 郭鑫武; 陈明; 刘佳; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2022-11-14
Filing date: 2022-11-14
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2042-11-14
Also published as: CN115838836A

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒、艾滋病病毒以及人鼻病毒的检测，更具体地，呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒Theta和Mu型、艾滋病病毒以及人鼻病毒的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒Theta毒株和/或Mu毒株、艾滋病病毒以及人鼻病毒的检测。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，检测更为准确。

Description

不同类型病毒联检的组合物、试剂盒、方法及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒、艾滋病病毒以及人鼻病毒的检测，更具体地，呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒Theta和Mu型、艾滋病病毒以及人鼻病毒的检测。

背景技术

呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus，RSV)，属于副黏病毒科的肺病毒属(Pneumovirus)的RNA病毒，只有一种血清型，是免疫缺陷人群(如婴幼儿和老年人等)严重呼吸道疾病的主要致病因子之一，在世界范围内发病率和死亡率都很高。RSV病毒主要引起6个月以下婴儿患细支气管炎和肺炎等下呼吸道感染，以及较大儿童和成人的鼻炎、感冒等上呼吸道感染。由RSV引发的急性下呼吸道感染在很大程度上加重了全球儿童的死亡负担。据估计，5岁以下的儿童，每50例死亡中就有1例死于RSV，6个月及以下的儿童，每28例死亡中就有1例死于RSV。

新型冠状病毒现今被称为SARS-CoV-2(以前称为2019-nCoV)，是β冠状病毒家族的一种RNA病毒。SARS-CoV-2已证明其传染性强、聚集发病，Theta和Mu型别是新冠的两种变异毒株，且这两种毒株的刺突蛋白突变位点相似度高，目前针对这两种型别的核酸检测试剂产品较少。

艾滋病病毒，即人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)， HIV病毒是一种逆转录病毒，是诱发人获得性免疫缺陷综合征(Acquired ImmunodeficiencySyndrome,AIDS)的主要病原体，在分类学上属于逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(Lentivirus)。HIV可引起人类细胞免疫功能损害、缺陷，导致一系列致病菌感染和罕见肿瘤的发生，传染快，病死率高。传播途径包括血液传播、性传播、母婴传播。以目前的医疗水平，艾滋病只能被控制，不能被治愈。这使得个人尽早被诊断并尽快开始治疗变得至关重要。HIV常可引起潜伏感染，但仍具有传染性。

人鼻病毒(Human Rhinovirus，HRV)是小RNA病毒科、鼻病毒属的一种，是人患普通感冒的主要病原。大约有10％～20％的成年人感冒是由HRV感染引起，而婴幼儿感冒有15％～30％是由HRV致病。HRV是感染具有自限性，但是有时会引起诸如哮喘、充血性心衰、支气管扩张，包囊纤维化等严重并发症，并且HRV多与其它呼吸道病毒合并感染，例如呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒以及肠道病毒等。

上述呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒、鼻病毒引起的呼吸道感染性疾病严重的可能导致重症肺炎、呼吸衰竭，甚至死亡。而艾滋病人，尤其是通过母婴传播途径感染艾滋病的新生儿，由于免疫缺陷，更容易感染呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒、人鼻病毒等，且容易出现重症甚至死亡。因此早诊断、早治疗、早隔离是防治的根本。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的病毒种类，而且病毒的培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，甚至有些病毒在目前条件下尚不能培养，这给感染患者及临床医生带来很大困扰。

本领域需求一种试剂产品，能够同时检测呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒、艾滋病病毒以及人鼻病毒，其灵敏度高，特异性好。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种不同类型病毒联检的组合物，包括：

第一核酸组合物：

如SEQ ID NO:1～3所示的检测呼吸道合胞病毒的上下游引物和探针；

第二核酸组合物

如SEQ ID NO:4～6所示的检测新冠Theta毒株的上下游引物和探针；或如SEQ IDNO:7～9所示的检测新冠Mu毒株的上下游引物和探针中至少一个；

第三核酸组合物：

如SEQ ID NO:10～12所示的检测艾滋病毒的上下游引物和探针；

以及

第四核酸组合物：

如SEQ ID NO:13～15所示的检测鼻病毒的上下游引物和探针。

本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒Theta毒株和/或Mu毒株、艾滋病病毒以及人鼻病毒的检测。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，检测更为准确。

进一步地，本发明组合物的第二核酸组合物包括：

如SEQ ID NO:4～6所示的检测新冠Theta毒株的上下游引物和探针；和

如SEQ ID NO:7～9所示的检测新冠Mu毒株的上下游引物和探针。

进一步地，本发明各核酸组合物的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。

本发明的组合物可以任意组合成检测对应5个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。

举例来说，可以包括上述5对引物和探针中的任意3对，上述5对引物和探针中的任意3对，可以包括上述5对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述5对引物和探针中的任意1对。

在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。

在一个具体的实施方案中，RSV探针的荧光报告基团为FAM；新冠Theta、 Mu突变型探针的荧光报告基团为HEX/VIC；HIV探针的荧光报告基团为ROX； HRV探针的荧光报告基团为CY5。

进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。

进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。

在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。

进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.5μM；所述组合物中探针的用量为0.1～0.2μM。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

进一步地，所述组合物还包括检测内标的上下游引物及探针。

在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。

在一些具体的实施方案中，用于检测内标的上下游引物及探针为如SEQ ID NO:16所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:17所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:18所示的内标探针。

第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测不同类型病毒的试剂盒中的用途，其中，所述病毒为呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒Theta毒株或Mu毒株、艾滋病病毒以及人鼻病毒。

第三方面，本发明提供了一种不同类型病毒联检的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物，其中，所述病毒为呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒Theta毒株或Mu毒株、艾滋病病毒以及人鼻病毒。

进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H₂O、生理盐水、内标基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒Theta 毒株和Mu毒株、艾滋病病毒以及人鼻病毒靶基因的片段质粒、片段RNA、假病毒中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。

更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTPs、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是Neoscript RT逆转录酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、Mg²⁺、 Mn²⁺、Rnasin、dNTPs、引物、探针和PCR缓冲液。

常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl₂、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。

第四方面，提供了一种用于不同类型病毒联检的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、口咽拭子、血液等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～40秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的的不同类型病毒联检的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～40秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染不同病毒并罹患肺炎和艾滋病等的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有上述病原体。

附图说明

图1为本发明组合物检测结果图；

图2～6为本发明组合物灵敏度(分别为呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒 Theta毒株、Mu毒株、艾滋病病毒以及人鼻病毒)；

图7为本发明组合物特异性；

图8～10为本发明对比例组合物1～3检测结果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

表1

其中，RSV探针的荧光报告基团为FAM；新冠Theta、Mu突变型探针的荧光报告基团为HEX/VIC；HIV探针的荧光报告基团为ROX；HRV探针的荧光报告基团为CY5；内标单独一管，探针报告基团为FAM。

实施例2、检测人副流感病毒的方法

逆转录荧光PCR扩增反应液：含有5×HCV buffer、逆转录酶、Taq酶、 Mg2+、Rnasin、dNTP、引物、探针等。具体的反应体系如表2所示。

表2

其扩增反应程序如表3所示。

表3

结果分析与判断：

反应结束后自动保存结果，对检测靶标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录定性结果。

质量控制

阴性对照：FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道均无Ct值或Ct＞40；

阳性对照：FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道均Ct≤35；

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

阳性判断值

通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为40。

检验结果的解释

表4

根据上述的检测结果，判断结果如下：

表5

实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果

将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对合胞病毒、新冠病毒Theta和Mu型、艾滋病病毒以及人鼻病毒的假病毒样本进行验证，结果表明能够对合胞病毒、新冠病毒Theta和Mu型、艾滋病病毒和人鼻病毒进行联检并区分，检测结果如图1所示。

实施例4、本发明组合物的灵敏度

使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如图 2～6所示，表明对低至500拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为500拷贝/mL。

实施例5、本发明组合物的特异性

为了测试本发明实施例1中的组合物的空白特异性，以阴性对照为样本，按照上述操作步骤进行检测。结果如图7显示，各靶标通道均无非特异扩增，试剂盒的空白特异性好。

对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针

由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。

因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系1、2和3(对比例组合物1～3)，同样用于检测合胞病毒、新冠病毒 Theta和Mu型、艾滋病病毒以及人鼻病毒。具体检测结果如图8～10所示，从图中可以看出检测只出现部分扩增曲线，且扩增曲线增幅低，而其他靶标甚至无扩增曲线，因此，整体检测效果差。

Claims

1.一种不同类型病毒联检的组合物，包括：

第一核酸组合物：

第二核酸组合物

如SEQ ID NO:4～6所示的检测新冠Theta毒株的上下游引物和探针；或如SEQ ID NO:7～9所示的检测新冠Mu毒株的上下游引物和探针中至少一个；

第三核酸组合物：

如SEQ ID NO:10～12所示的检测艾滋病毒的上下游引物和探针；

以及

第四核酸组合物：

如SEQ ID NO:13～15所示的检测鼻病毒的上下游引物和探针。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二核酸组合物包括：

如SEQ ID NO:7～9所示的检测新冠Mu毒株的上下游引物和探针。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，RSV探针的荧光报告基团为FAM；新冠Theta、Mu突变型探针的荧光报告基团为HEX/VIC；HIV探针的荧光报告基团为ROX；HRV探针的荧光报告基团为CY5。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物还包括检测内标的上下游引物及探针。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中，检测内标的上下游引物及探针为如SEQ ID NO:16所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:17所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:18所示的内标探针。

7.权利要求1～6中任一项所述的组合物在制备检测不同类型病毒的试剂盒中的用途，其中，所述病毒为呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒Theta毒株或Mu毒株、艾滋病病毒以及人鼻病毒。

8.一种不同类型病毒联检的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，所述病毒为呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒Theta毒株或Mu毒株、艾滋病病毒以及人鼻病毒。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

10.一种用于以非诊断目的的不同类型病毒联检的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如权利要求1～6中任一项所述的组合物或如权利要求8～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；

3)获得并分析结果。