CN115807129B

CN115807129B - 新型冠状病毒和猴痘病毒联检并分型的组合物

Info

Publication number: CN115807129B
Application number: CN202211335228.7A
Authority: CN
Inventors: 王剑; 孙青芝; 谭德勇; 乔同; 郭鑫武; 刘佳; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2022-10-28
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2042-10-28
Also published as: CN115807129A

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及新型冠状病毒α毒株、β毒株和猴痘病毒的联检并分型的组合物、方法和用途。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现新型冠状病毒α毒株、β毒株和猴痘病毒的检测并分型。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到200拷贝/mL，检测更为准确。

Description

新型冠状病毒和猴痘病毒联检并分型的组合物

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及新型冠状病毒2019-nCoV和猴痘病毒的联检并分型组合物、方法和用途。

背景技术

基于流行病学调查，新型冠状病毒的潜伏期为1～14天，症状主要是发热、乏力、干咳，重症患者表现为呼吸困难、脓毒症休克、出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭、难以纠正的代谢性酸中毒等。作为一种RNA病毒，新冠病毒最大的特点之一就是容易变异，从变异株阿尔法(Alpha B.1.1.7)到贝塔(Beta B.1.351)，再到伽玛(Gamma P.1)和德尔塔(DeltaB.1.617.2)，每次变异，新冠病毒都携带着更强的传播力。

猴痘病毒是一种双链DNA病毒，属于人畜共患病，1958年，在丹麦哥本哈根的实验猕猴上首次发现，1970年首次报道扎伊尔地区出现人类感染猴痘病毒。猴痘病毒与天花病毒同属痘病毒科，感染的症状与天花相似，如发热、咳嗽、淋巴结肿大和全身疼痛，可通过直接接触患者或者被感染的动物，或通过患者的体液、呼吸道飞沫传播，毒力强的病毒株有可能致死。从2022年5月第一例病例被发现以来，不到一个月已确诊了超过100多例，WHO扩大了对非流行国家的监测，现有信息表明，与有症状的病例发生密切身体接触的人群中正在发生人际传播，现在越来越多的人不再对猴痘病毒具有免疫力。

一种临床表现可由多个病原体引起，为临床早期诊断带来了困难，不同的病毒其临床治疗方式可能不一样。同时一个个体可能同时存在多个感染，日前就发现一例患者同时感染新冠和猴痘。对于易感染病毒而言，需要尽早发现，尽早治疗，且及时控制传染源，阻断传播途径。区分这些病毒感染，对后续的防控、治疗以及采取针对性的措施提供指导，因此本领域需求一种能够同时检测并区分新型冠状病毒和猴痘病毒的相关产品，特别地，能区分新型冠状病毒α毒株、β毒株和猴痘病毒。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种新型冠状病毒和猴痘病毒联检的组合物，包括：

以下三对引物和探针中至少一对的第一核酸组合物：

如SEQ ID NO:1～3所示的检测A570D的上下游引物和探针；

如SEQ ID NO:4～6所示的检测S982A的上下游引物和探针；或

如SEQ ID NO:7～9所示的检测D1118H的上下游引物和探针；

以下两对引物和探针中至少一对的第二核酸组合物：

如SEQ ID NO:10～12所示的检测D80A的上下游引物和探针；或

如SEQ ID NO:13～15所示的检测Δ241/243的上下游引物和探针；以及

以下两对引物和探针中至少一对的第三核酸组合物：

如SEQ ID NO:16～18所示的检测F3L基因的上下游引物和探针；或

如SEQ ID NO:19～21所示的检测B6R基因的上下游引物和探针。

本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现新型冠状病毒α毒株、β毒株和猴痘病毒的检测和分型。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到200拷贝/mL，检测更为准确。

在一些具体的实施方案中，第一核酸组合物包括以下三对引物和探针中至少两对：

如SEQ ID NO:1～3所示的检测A570D的上下游引物和探针；

如SEQ ID NO:4～6所示的检测S982A的上下游引物和探针；或

如SEQ ID NO:7～9所示的检测D1118H的上下游引物和探针。

在一些具体的实施方案中，第一核酸组合物包括以下三对引物和探针：

如SEQ ID NO:1～3所示的检测A570D的上下游引物和探针；

如SEQ ID NO:4～6所示的检测S982A的上下游引物和探针；或

如SEQ ID NO:7～9所示的检测D1118H的上下游引物和探针。

使用上述组合物，能够更准确的检测新冠病毒α毒株，防止某一位点突变所带来的漏检，进一步提高了检测准确率。降低了假阴性的概率。

在一些具体的实施方案中，所述第二核酸组合物包括：

如SEQ ID NO:10～12所示的检测D80A的上下游引物和探针；和

如SEQ ID NO:13～15所示的检测Δ241/243的上下游引物和探针。

使用上述组合物，能够更准确的检测新冠病毒β毒株，防止某一位点突变所带来的漏检，进一步提高了检测准确率。降低了假阴性的概率。

一些具体的实施方案中，所述第三核酸组合物包括：

如SEQ ID NO:16～18所示的检测F3L基因的上下游引物和探针；和

如SEQ ID NO:19～21所示的检测B6R基因的上下游引物和探针。

使用上述组合物，能够更准确的检测猴痘病毒，防止某一位点突变所带来的漏检，进一步提高了检测准确率。降低了假阴性的概率。

进一步地，所述组合物包括第四核酸组合物。

所述第四核酸组合物为：检测内标的上下游引物及探针。

在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。

在一些具体的实施方案中，用于检测内标的上下游引物及探针为如SEQ IDNO:22所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:23所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:24所示的内标探针。

进一步地，本发明第一、第二、第三和第四核酸组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。

本发明的组合物可以任意组合成检测对应7个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。

举例来说，可以包括上述7对引物和探针中的任意6对，可以包括上述7对引物和探针中的任意5对，可以包括上述7对引物和探针中的任意4对，可以包括上述7对引物和探针中的任意3对，可以包括上述7对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述7对引物和探针中的任意1对。

举例来说，还可以只包括第一核酸组合物；只包括第二核酸组合物；只包括第三核酸组合物。

举例来说，还可以包括不同核酸组合物中不同对，举例来说可以包括第一核酸组合物中1对或2或3对引物和探针，和/或第二核酸组合物中1对或2对引物和探针，和/或第三组合物中1对或2对引物和探针。

在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。

在一个具体的实施方案中，第一核酸组合物的探针的荧光报告基团为FAM；第二核酸组合物的探针的荧光报告基团为HEX或VIC；第三核酸组合物的探针的荧光报告基团为ROX；第四核酸组合物的探针的荧光报告基团为CY5。

进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。

进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。

在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。

进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μM；所述组合物中探针的用量为0.1～0.2μM。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测新型冠状病毒和猴痘病毒联检并分型的试剂盒中的用途。

第三方面，本发明提供了一种新型冠状病毒和猴痘病毒联检并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H₂O、生理盐水、内标基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是新型冠状病毒和猴痘病毒靶基因的片段质粒、片段RNA、假病毒中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。

更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTPs、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是Neoscript RT逆转录酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、Mg²⁺、Mn²⁺、Rnasin、dNTPs、引物、探针和PCR缓冲液。

常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl₂、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。

第四方面，提供了一种用于新型冠状病毒和猴痘病毒联检并分型的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、口咽拭子、血液等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的的新型冠状病毒和猴痘病毒联检并分型的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染新型冠状病毒和猴痘病毒并罹患肺炎和猴痘等的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有上述病原体。

附图说明

图1～3为本发明组合物检测结果图(分别为新型冠状病毒α毒株、β毒株和猴痘病毒)；

图4～6为本发明组合物灵敏度(分别为新型冠状病毒α毒株、β毒株和猴痘病毒)；

图7为本发明组合物特异性；

图8为本发明对比例组合物检测结果图；

图9～10为本发明组合物检测和漏检的结果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

表1

其中，A570D、S982A和D1118H的荧光报告基团为FAM；D80A和Δ241/243探针的荧光报告基团为HEX；F3L和B6R探针的荧光报告基团为ROX；内标探针的荧光报告基团为CY5。

实施例2、检测新型冠状病毒和猴痘病毒的方法

本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。磁珠法提取病毒核酸，在样本处理室进行如下操作：

2.1根据待测样本数量取1.5mL离心管若干，每管加入300μL样品；

2.2加入500μL提取溶液1和50μL蛋白酶K-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀30s，60℃加热10min。

2.3室温静置1min，低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，5min后缓慢吸弃废液(*注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠)；

2.4加入200μL洗涤液1和600μL洗涤液2，震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃。

2.6将离心管至于离心机中低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将管底液体完全吸尽。

2.7加入30～100μL洗脱液S(推荐使用80μL洗脱)，震荡混匀30s，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置3min；低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到干净的1.5mL离心管中。

2.8吸取上述处理好的样本、阳性对照及阴性对照各20μL分别加入对应的0.2mLPCR反应管中，每管加入30μL PCR混合液，盖上管盖。

实时荧光PCR反应体系按照如下表2进行配置：

表2

组份	每一个反应中的体积/浓度
		Mg²⁺	5mM
dNTPs(100mM)	3mM
		MMLV(5U/μl)	10U
Taq酶(5U/μl)	10U
		引物	300nM
探针	150nM
		PCR缓冲液(1x)	补至50μl

PCR扩增程序如下表3进行设置：

表3

结果分析：

1)目的检测信号为FAM，HEX(或VIC)，ROX，人基因内标检测信号为CY5；

2)Baseline的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；

结果判读A.对于FAM通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为2019-nCoV Alpha突变株病毒阳性；对于FAM通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，且CY5通道有扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为2019-nCoV Alpha突变株病毒阴性。B.对于HEX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为2019-nCoV Beta突变株病毒阳性；对于HEX通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，且CY5通道有扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为2019-nCoV Beta突变株病毒阴性。C.对于ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为猴痘病毒阳性；对于ROX通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，且CY5通道有扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为猴痘病毒阴性。

实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果

将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对新型冠状病毒α毒株、β毒株和猴痘病毒的假病毒样本进行验证，结果表明能够对新型冠状病毒α毒株、β毒株和猴痘病毒的检测和分型，检测结果如图1～3所示。

实施例4、本发明组合物的灵敏度

使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如图4～6所示，表明对低至200拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为200拷贝/ml。

实施例5、本发明组合物的特异性

为了测试本发明实施例1中的组合物的特异性，以冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、光滑念珠菌，肺炎链球菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、丁酸酸菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、肉毒杆菌、藤黄微球菌、马红球菌、格式李斯特菌、琼氏不动杆菌、副流感嗜血杆菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、脑膜炎奈瑟菌为样本，按照上述操作步骤进行检测。结果如图7显示，各靶标通道均无非特异扩增，试剂盒的特异性好。

对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针

由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。

因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系，同样用于检测新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒。具体检测结果如图8所示，从图中可以看出检测只出现部分扩增曲线，且扩增曲线增幅低重复性差，而其他靶标甚至无扩增曲线，因此，整体检测效果差。

对比例2

由于2019-nCoV Alpha突变株有三个特有的靶点，2019-nCoV Beta突变株存在两个特有的靶点，所以使用其中一套可能存在漏检其他靶点的现象。

因此，发明人把所有的突变位点检测引物和探针共同混合成一个体系，用于检测新型冠状病毒新型冠状病毒α毒株、β毒株和猴痘病毒。具体检测结果如图9和图10所示，从图中可以看出使用单套引物无扩增曲线，但是使用全套扩增引物能够出现扩增曲线。

Claims

1.一种新型冠状病毒和猴痘病毒联检的组合物，包括：

第一核酸组合物：

核苷酸序列如SEQ ID NO:1~3所示的检测A570D的上下游引物和探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:4~6所示的检测S982A的上下游引物和探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:7~9所示的检测D1118H的上下游引物和探针；

第二核酸组合物：

核苷酸序列如SEQ ID NO:10~12所示的检测D80A的上下游引物和探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:13~15所示的检测Δ241/243的上下游引物和探针；以及

第三核酸组合物：

核苷酸序列如SEQ ID NO:16~18所示的检测F3L基因的上下游引物和探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:19~21所示的检测B6R基因的上下游引物和探针。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括第四核酸组合物，所述第四核酸组合物包括用于检测内标的上下游引物及探针，所述上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22~23所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。

3.根据权利要求1~2中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。

4.权利要求1~3中任一项所述的组合物在制备新型冠状病毒和猴痘病毒联检的试剂盒中的用途。

5.一种新型冠状病毒和猴痘病毒联检的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1~3中任一项所述的组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTPs、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

7.一种用于以非诊断目的的新型冠状病毒和猴痘病毒联检的方法，所述方法包括以下步骤：

1）提取或释放待测样本的核酸；

2）使用如权利要求1~3中任一项所述的组合物或如权利要求5~6中任一项所述的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR分析；

3）获得并分析结果。