CN117947191A - 检测立克次体并分型的组合物、试剂盒，及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及立克次体并分型的检测，更具体地，涉及恙虫病立克次体、伯纳特立克次体、五日热巴尔通体和普氏立克次氏体的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现恙虫病立克次体、伯纳特立克次体、五日热巴尔通体的检测和和普氏立克次氏体区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及不同类型立克次体并分型的检测，更具体地，涉及恙虫病立克次体、伯纳特立克次体、五日热巴尔通体和普氏立克次体的检测。
背景技术
恙虫病又名丛林斑疹伤寒，是由恙虫病立克次体(Orientia tsutsugamushi，Ot)引起的自然疫源性疾病。啮齿类为主要传染源，恙螨幼虫为传播媒介。临床特征为突然起病、发热、叮咬处有焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹。由于该病与其他热性病临床症状相似，且对常规青霉素类等抗生素不敏感，加上目前医院普遍未建立针对该病的特异性检测方法，临床上极易造成误诊，导致延误治疗甚至死亡。
Q热，亦称寇热，是由伯纳特立克次体(Coxiella burneti，Cb)引起的急性自然疫源性传染病。Q热是一种全世界广泛分布的重要人兽共患病。蜱、野生动物、禽类等均可为贝氏柯克斯体的宿主。临床上，急性Q热主要表现为发热、头痛、肌肉酸疼，常伴有肺炎、肝炎等；慢性Q热表现为长期持续或反复发热，常伴有心内膜炎、慢性肝炎、骨髓炎等，病死率高达60％。四环素族及氯霉素对本病有特效，但Q热仍会引起相应的并发症，应尽快治疗，以免延误最佳治疗期。
战壕热，又称五日热或华伦热，该病是由携带五日热巴尔通体(BartonellaQuintana，Bq)的体虱叮咬而传播的一种急性传染性疾病。临床主要表现为畏寒、发热、剧烈头痛、肌肉疼痛、眼球痛、脾脏肿大和部分患者出现充血性斑丘疹，对人体健康危害较大。
流行性斑疹伤寒又称虱传斑疹伤寒，是由普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)引起，通过人虱传播的急性传染病。其临床特点为持续高热、头痛、瘀点样皮疹(或斑丘疹)和中枢神经系统症状。氯霉素和四环素治疗有特效。未经治疗的斑疹伤寒病例的死亡率约为40％。
进入夏秋季，雨水较多，恙虫病比较流行，人群普遍易感，特别是在田间劳作的人，野外作业人员，野外训练人员和野外露营者受恙螨侵袭机会较多，容易发生感染，如果与携带贝氏柯克斯体的牛羊等牲畜有过密切接触，感染Q热的风险大大增加，现今进入深山老林与大漠戈壁巡逻执勤、勘探、旅游及各种从业活动仍有感染战壕热的风险。流行性斑疹伤寒多发生于寒冷地区的冬、春季节。由于气候寒冷，人们衣着较厚，且少换洗，这有利于虱的寄生和繁殖。战争、灾荒和群体个人卫生差的情况下，人虱繁殖的机会增加，容易导致流行。上述四种立克次体病原体致病后具有发热、头疼，重症患者表现为心肌炎、脑炎等相似的临床症状和流行特征，通过临床症状和血常规等实验室检测很难鉴别确定所感染的病原体种类，在临床上很难鉴别诊断，给及时预防和治疗带来很大的困难。
因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述不同的病原体，以便为临床医生提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短临床医生对患者病情诊断的时间，加快对患者实施治疗措施，并且灵敏度高，特异性好。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种立克次体检测并分型的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测恙虫病立克次体的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测伯纳特立克次体的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:7～9所示的检测五日热巴尔通体的上游引物、下游引物及探针。
进一步地，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测普氏立克次体的上游引物、下游引物及探针。
本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同靶点，对不同类型的病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实恙虫病立克次体、伯纳特立克次体、五日热巴尔通体、普氏立克次体的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性的策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是ICON。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括如SEQ ID NO:13～15所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
具体地，上游引物序列SEQ ID NO:13为CGCAATACCTCCGGATTCC，下游引物序列SEQID NO:14为TCCGCAGAGGCACTGAGTT，探针序列SEQ ID NO:15为AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA。
进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在一些具体的实施方案中，恙虫病立克次体探针的荧光报告基团为FAM；伯纳特立克次体探针的荧光报告基团为ROX；五日热巴尔通体探针的荧光报告基团为CY5；普氏立克次体的荧光报告基团为HEX。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
本发明的组合物可以任意组合成检测对应5个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
举例来说，上述5对引物和探针中的任意4对，上述5对引物和探针中的任意3对，可以包括上述5对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述5对引物和探针中的任意1对。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备立克次体检测并分型的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测立克次体并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水中的至少一种。阳性质控品是恙虫病立克次体、伯纳特立克次体、五日热巴尔通体、普氏立克次体的片段核酸、质粒等中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、dUTP、UNG酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种非诊断目的检测立克次体并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是血液、组织液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
UNG酶反应，温度为40～60℃，时间为1～5min，1次循环；Taq酶活化，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物用于制备立克次体检测并分型试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
UNG酶反应，温度为40～60℃，时间为1～5min，1次循环；Taq酶活化，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
附图说明
图1为本发明第一核酸组合物检测结果图(分别为恙虫病立克次体、伯纳特立克次体、五日热巴尔通体、内标)
图2为本发明第二核酸组合物检测结果图(分别为恙虫病立克次体、伯纳特立克次体、五日热巴尔通体、普氏立克次体)；
图3～6为本发明组合物灵敏度结果图(分别为恙虫病立克次体、伯纳特立克次体、五日热巴尔通体、普氏立克次体)；
图7为本发明对比例组合物的五日热巴尔通体的单检检测结果图；
图8为本发明对比例组合物的四联检检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示。
表1
其中，恙虫病立克次体探针的荧光报告基团为FAM；伯纳特立克次体探针的荧光报告基团为ROX；五日热巴尔通体探针的荧光报告基团为CY5；普氏立克次体探针的荧光报告基团为HEX。
实施例2、检测病原体的方法
荧光PCR扩增反应液：含有PCR缓冲液、Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、探针等。具体的反应体系如表2所示。酶混合液由UNG酶和H-Taq酶组成。将H-Taq酶(5U/μL)和UNG酶按照一定比例混合而成(每人份为1.9μL H-Taq酶与0.1μL UNG酶混合)。
表2
| 组份 | 每一个反应中的体积/浓度 |
| PCR缓冲液 | 36.16μL |
| dNTPs(U)(100mM) | 0.4μL |
| 1mol/L MgCl2 | 0.14μL |
| 引物SEQ ID NO:1(50pmol/μL) | 0.1μL |
| 引物SEQ ID NO:2(50pmol/μL) | 0.1μL |
| 引物SEQ ID NO:4(50pmol/μL) | 0.1μL |
| 引物SEQ ID NO:5(50pmol/μL) | 0.1μL |
| 引物SEQ ID NO:7(50pmol/μL) | 0.2μL |
| 引物SEQ ID NO:8(50pmol/μL) | 0.2μL |
| 引物SEQ ID NO:10(50pmol/μL) | 0.1μL |
| 引物SEQ ID NO:11(50pmol/μL) | 0.1μL |
| 探针SEQ ID NO:3(50pmol/μL) | 0.05μL |
| 探针SEQ ID NO:6(50pmol/μL) | 0.05μL |
| 探针SEQ ID NO:9(50pmol/μL) | 0.1μL |
| 探针SEQ ID NO:12(50pmol/μL) | 0.1μL |
试剂准备：
根据待测样本、阳性对照、阴性对照的数量，按比例(PCR反应液38μL/人份+酶混合液2μL/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，充分混匀成PCR混合液，2000rpm离心10s后备用。
样本处理与加样
取200μL待测样本、阴性对照、阳性对照到1.5mL离心管中，使用圣湘生物科技股份有限公司的核酸提取或纯化试剂按其说明书操作进行核酸提取；吸取上述处理好的样本、阴性对照及阳性对照各10μL分别加入对应的0.2mL PCR反应管中，每管加入40μL PCR混合液，盖上管盖。
在SLAN-96P全自动医用PCR分析系统上，按照一定的温度、时间设置程序进行PCR扩增其扩增反应程序如表3所示。
表3
结果分析与判断：
如果该样本FAM，HEX(VIC)，ROX，CY5通道有明显S型扩增曲线，且Ct值≤39，则判为阳性；如果该样本FAM，ROX，CY5，HEX(VIC)通道无扩增曲线(No Ct)或Ct值＞39，则判为阴性。具体如下表4所示。
表4
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针(第一核酸组合物SEQ ID NO:1～9，第二核酸组合物SEQ ID NO:1～12)，按照实施例2的方法对恙虫病立克次体、伯纳特立克次体、五日热巴尔通体、普氏立克次体混合样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行PCR检测，检测结果如图1～2所示，从图中可以看出，本发明组合物三重体系和四重体系均能对对应的各种病原体靶标进行良好的检测。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如表5和图2～5所示，表明对低至400拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为400拷贝/mL。
表5
实施例5、本发明组合物的特异性
为了测试本发明实施例1中的组合物的特异性，本发明的组合物分别对能引起相似症状或遗传相似的病原体(肺炎链球菌、流感嗜血杆、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯杆菌、福氏志贺氏菌、嗜肺军团菌、莫氏立克次体、康氏立克次体、日本立克次体、鼠疫耶尔森菌、鲍曼不动杆菌、钩端螺旋体)进行特异性实验，特异性实验结果如表6所示。结果表明，本发明方法对上述病原体无交叉反应。
表6
实施例6、本发明组合物的抗干扰性
对实施例2的试剂盒采用常规方法分析干扰物，实验结果表明，一定浓度的阿奇霉素(100μg/mL)、四环素(50μg/mL)、左氧氟沙星(50μg/mL)、氯霉素(50μg/mL)、诺氟沙星(50μg/mL)、盐酸环丙沙星(100μg/mL)、血红素(10μg/mL)、纯化粘蛋白(20μg/mL)、血液5％(v/v)、无水乙醇(20％V/V)等潜在的PCR抑制物/干扰物质对本试剂盒无明显影响。PCR反应液在感染物质存在下的扩增结果具体见下表7。
表7
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针组成了不同的检测体系(序列未示出)，同样用于检测上述病原体，具体检测结果如图7、图8所示，对比例组引物探针在单检五日热巴尔通体体系中能有效检出，但是在搭入对比例联检时存在漏检，进一步说明了本发明组合物的优越性。
Claims (10)
1.一种立克次体检测并分型的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测恙虫病立克次体的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测伯纳特立克次体的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:7～9所示的检测五日热巴尔通体的上游引物、下游引物及探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测普氏立克次氏体的上游引物、下游引物及探针。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述恙虫病立克次体探针的荧光报告基团为FAM；伯纳特立克次体探针的荧光报告基团为ROX；五日热巴尔通体探针的荧光报告基团为CY5；普氏立克次氏体的荧光报告基团为HEX。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测立克次体并分型的试剂盒中的用途。
7.一种检测立克次体并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、DNA聚合酶、dNTP、dUTP、UNG酶、PCR
缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种组合物用于制备立克次体检测并分型的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
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