CN117344044A - 检测肺部感染相关病原体的组合物、试剂盒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及肺部感染相关病原体的检测，更具体地，涉及马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌和结核分枝杆菌的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌的检测和区分，以便针对性的提供治疗策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及肺部感染相关病原体的检测，更具体地，涉及马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌和结核分枝杆菌的检测。
背景技术
马尔尼菲篮状菌病(Talaromycosis marneffei，TSM)由马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei，TM)感染引起，TM是蓝状菌属中唯一温度依赖型双相真菌，多见于免疫缺陷或免疫功能抑制者。马尔尼菲篮状菌感染分为局限型感染和播散型感染，局限型感染病灶常局限在肺部或皮肤、淋巴结，此为病原菌入侵部位，血培养则阴性；而播散型感染则致死率高。患者早期主要表现为反复发热(HIV阳性人群常表现为持续性发热，而HIV阴性人群常表现为间歇性发热)、咳嗽、咳痰、消瘦、贫血等不典型症状。近二十年来，随着激素、免疫抑制剂的广泛应用、器官移植、艾滋病等所导致的免疫缺陷宿主不断增多，马尔尼菲篮状菌病也日渐增多。由于TSM无特异性临床特征，组织培养及病理学检查诊断耗时长，误诊率高，易延误临床诊断及治疗，影响患者生存质量甚至威胁患者生命。
隐球菌病(Cryptococcosis)是人体吸入被新生或格特隐球菌(Cryptococcusneoformans，CN)污染的尘土所引起的肺部或播散性感染性疾病。临床上出现肺炎、脑膜炎的相应症状或由皮肤、骨骼或内脏受累及所出现的相关症状。
结核病是结核分枝杆菌(M.tubercutosis，MTB)感染所引起的重大传染性疾病，目前是全球单一传染源导致死亡的主要原因。2016年，WHO估计有1040万例感染病例，其中130万例人类免疫缺陷病毒(HIV)阴性患者死亡，另有374000例HIV阳性患者死亡。
上述马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌均可引起肺部感染并且症状相似，危及生命安全，因此早期诊断病原体并给予及时有效的抗感染治疗是改善预后的关键，能够大大降低发病率和病死率。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的病原体种类，而且目前病原体培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，且多重混合感染的培养极为困难，这给感染患者及临床医生带来很大困扰。
因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，以便针对性的提供治疗策略，并且灵敏度高，特异性好。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测肺部感染相关病原体的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测马尔尼菲篮状菌的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:4～6所示的检测结核分枝杆菌的上游引物、下游引物及探针。
进一步地，所述组合物还包括：
如SEQ ID NO:7～9所示的检测新型隐球菌的上游引物、下游引物及探针。
本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌的检测和区分，以便针对性的提供治疗策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是Rnase P。
在一个具体的实施方案中，组合物进一步包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在一些具体的实施方案中，马尔尼菲篮状菌探针的荧光报告基团为FAM；新型隐球菌探针的荧光报告基团为HEX；结核分枝杆菌探针的荧光报告基团为ROX。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测肺部感染相关病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌。
第三方面，本发明提供了一种检测肺部感染相关病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌的片段质粒或片段DNA中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸提取试剂，以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTP、dUTP、尿嘧啶糖基化酶(UDG)、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括Taq酶、Mg2+、dNTP(U)s、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于非诊断目的的检测肺部感染相关病原体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是血液、血浆等，但不限于此。还可以是肺泡灌洗液、痰液、穿刺组织、脓液、伤口分泌物等等。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
DNA预变性，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物用于制备检测肺部感染相关病原体的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
DNA预变性，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患血流感染的信息。例如，该方法可以在检测培养物中(例如血液)需求检测是否有上述病原体。
附图说明
图1为本发明组合物检测结果图(分别为马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌、内标)；
图2～5为本发明组合物灵敏度结果图(分别为马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌、内标)；
图6～9为本发明组合物精密度结果图(分别为马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌、内标)；
图10为本发明组合物特异性结果图；
图11～14为本发明对比例组合物检测结果图(分别为马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌、内标)。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示。
表1
其中，马尔尼菲篮状菌探针的荧光报告基团为FAM；新型隐球菌探针的荧光报告基团为HEX；结核分枝杆菌探针的荧光报告基团为ROX；内标探针为CY5。
实施例2、检测病原体的方法
荧光PCR扩增反应液：含有PCR缓冲液、Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、探针等。具体的反应体系如表2所示。
表2
| 组分 | 每一个反应中的体积/浓度 |
| PCR缓冲液 | 22.675μL |
| Taq酶 | 2μL(5U/μL) |
| Mg2+ | 0.3μL(1M) |
| dNTP | 0.3mM |
| 引物 | 400nM |
| 探针 | 200nM |
| 样本DNA | 10μL |
| ddH2O | 补至50μL |
其扩增反应程序如表3所示。
表3
结果分析与判断：
反应结束后自动保存结果，对检测靶标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录定性结果。
质量控制
阴性对照：FAM、HEX、ROX、CY5通道均无Ct值或Ct＞40；
阳性对照：FAM、HEX、ROX、CY5通道均Ct≤35；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
阳性判断值
通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为40，内标Ct的参考值为40。
根据上述的检测结果，判断结果如下表4所示：
表4
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌，在宏石荧光定量PCR仪器上进行PCR检测，检测结果如图1所示，从图中可以看出，本发明组合物均能对各种病原体进行良好的检测。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如图2～5所示，表明对低至500拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为500拷贝/mL。
实施例5、本发明组合物的精密度
本实验将阳性样本稀释至中浓度阳性浓度水平(为1.0×105copies/ml)进行批内精密度和批间精密度的测定，每个样本重复测定10次。结果显示中阳参考品的检出率均为100％，并批内、批间的检测Ct值变异系数(CV)小于5％，可以认为本发明组合物批内、批间均有着很好的检测精密度，结果如图6～9所示。
实施例6、本发明组合物的特异性
为了测试本发明实施例1中的组合物的特异性，以阴性对照为样本，按照上述操作步骤进行检测。结果如图10显示，各靶标通道均无非特异扩增，试剂盒的特异性好。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还针对每一个靶标设计了不同的引物分别进行了扩增效果的比较，结果如图11～14所示。从图中可以看出，引物和探针在单靶点的检测效果出现了较大的差别，出现了一系列检测效果很差的体系(图中红色所示)，表明并非所有通过常规手段设计的引物都能够用于检测，更不用说，并非能够用于四联检的检测中。
Claims (10)
1.一种检测肺部感染相关病原体的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测马尔尼菲篮状菌的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:4～6所示的检测结核分枝杆菌的上游引物、下游引物及探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQ ID NO:7～9所示的检测新型隐球菌的上游引物、下游引物及探针。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，马尔尼菲篮状菌探针的荧光报告基团为FAM；新型隐球菌探针的荧光报告基团为HEX；结核分枝杆菌探针的荧光报告基团为ROX。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测肺部感染相关病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌。
7.一种检测肺部感染相关病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸提取试剂、DNA聚合酶、dNTP、dUTP、UDG酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种组合物用于制备检测肺部感染相关病原体的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
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