CN116240312A - 新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒联检的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及新型冠状病毒2019‑nCoV、艾滋病毒和猴痘病毒的联检组合物、方法和用途。本发明提供的联检组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒的检测。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，检测更为准确。

Description

新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒联检的组合物
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及新型冠状病毒2019-nCoV、艾滋病毒和猴痘病毒的联检组合物、方法和用途。
背景技术
基于流行病学调查，新型冠状病毒的潜伏期为1～14天，症状主要是发热、乏力、干咳，重症患者表现为呼吸困难、脓毒症休克、出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭、难以纠正的代谢性酸中毒等。
猴痘病毒是一种双链DNA病毒，属于人畜共患病，1958年，在丹麦哥本哈根的实验猕猴上首次发现，1970年首次报道扎伊尔地区出现人类感染猴痘病毒。猴痘病毒与天花病毒同属痘病毒科，感染的症状与天花相似，如发热、咳嗽、淋巴结肿大和全身疼痛，可通过直接接触患者或者被感染的动物，或通过患者的体液、呼吸道飞沫传播，毒力强的病毒株有可能致死。从2022年5月第一例病例被发现以来，不到一个月已确诊了超过100多例，WHO扩大了对非流行国家的监测，现有信息表明，与有症状的病例发生密切身体接触的人群中正在发生人际传播，现在越来越多的人不再对猴痘病毒具有免疫力。
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)为获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体，属于反转录病毒科慢病毒属，HIV为直径100～120nm的球形颗粒，由核心和包膜两部分组成。核心由衣壳蛋白(CA，p24)组成，衣壳内包括两条完全相同的病毒单股正链 RNA、核衣壳蛋白(NC)和病毒复制所必需的酶类，包括反转录酶(RT，p51/p66)、整合酶(IN，p32)和蛋白酶(PR，p10)等。
一种临床表现可由多个病原体引起，为临床早期诊断带来了困难，不同的病毒其临床治疗方式可能不一样。同时一个个体可能同时存在多个感染，日前就发现一例患者同时感染新冠、艾滋和猴痘。对于易感染病毒而言，需要尽早发现，尽早治疗，且及时控制传染源，阻断传播途径。区分这些病毒感染，对后续的防控、治疗以及采取针对性的措施提供指导，因此本领域需求一种能够同时检测并区分新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒的相关产品。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种新型冠状病毒、艾滋病毒，和猴痘病毒联检的组合物，同时包括：
第一核酸组合物：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测2019-nCoV ORF1ab基因的上下游引物和探针；和
如SEQ ID NO:4～6所示的检测2019-nCoV N基因的上下游引物和探针；
第二核酸组合物：
如SEQ ID NO:7～9所示的检测猴痘病毒的上下游引物和探针；
第三核酸组合物：
如SEQ ID NO:13～15所示的检测艾滋病毒的上下游引物和探针。
本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒的检测。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，检测更为准确。
在一些具体的实施方案中，所述第二核酸组合物还包括：
如SEQ ID NO:10～12所示的检测猴痘病毒的上下游引物和探针。
一些具体的实施方案中，所述第三核酸组合物还包括：
如SEQ ID NO:16～18所示的检测艾滋病毒的上下游引物和探针。
使用额外的猴痘和艾滋病毒的引物和探针可以进一步预防漏检。避免在第一靶基因突变导致检测失效时，仍然能够检测到猴痘和艾滋病毒，进一步提高了检测准确率。降低了假阴性的概率。
进一步地，所述组合物包括第四核酸组合物。
所述第四核酸组合物为：检测内标的上下游引物及探针。
在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。
在一些具体的实施方案中，用于检测内标的上下游引物及探针为如SEQ ID NO:19所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:20所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:21所示的内标探针。
进一步地，本发明第一、第二、第三和第四核酸组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
本发明的组合物可以任意组合成检测对应6个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
举例来说，可以包括上述6对引物和探针中的任意5对，可以包括上述6 对引物和探针中的任意4对，可以包括上述6对引物和探针中的任意3对，可以包括上述6对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述6对引物和探针中的任意1对。
举例来说，还可以只包括第一核酸组合物；只包括第二核酸组合物；只包括第三核酸组合物。
举例来说，还可以包括不同核酸组合物中不同对，举例来说可以包括第一核酸组合物中1对或2对引物和探针，和/或第二核酸组合物中1对或2对引物和探针，和/或第三组合物中1对或2对引物和探针。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
在一个具体的实施方案中，第一核酸组合物的探针的荧光报告基团为 FAM；第二核酸组合物的探针的荧光报告基团为HEX；第三核酸组合物的探针的荧光报告基团为ROX；第四核酸组合物的探针的荧光报告基团为CY5。
进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2μM～0.5μM；所述组合物中探针的用量为0.2μM～0.5μM。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒联检的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒联检的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒靶基因的片段质粒、片段RNA、假病毒中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTPs、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是Neoscript RT逆转录酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、Mg2+、 Mn2+、Rnasin、dNTPs、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒联检的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、口咽拭子、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的的新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒联检的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒并罹患肺炎和猴痘等的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有上述病原体。
附图说明
图1～3为本发明组合物检测结果图(分别为新冠病毒、猴痘病毒和艾滋病毒)；
图4～6为本发明组合物灵敏度结果图(分别为新冠病毒、猴痘病毒和艾滋病毒)；
图7为本发明组合物特异性结果图；
图8为本发明对比例组合物检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
表1
Figure BDA0003874543400000061
Figure BDA0003874543400000071
其中，2019-nCoV ORF1ab基因探针和2019-nCoV N基因探针的荧光报告基团为FAM；猴痘病毒探针的荧光报告基团为HEX；艾滋病毒探针的荧光报告基团为ROX；内标探针的荧光报告基团为CY5。
实施例2、检测新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒的方法
逆转录荧光PCR扩增反应液：含有PCR缓冲液、逆转录酶、Taq酶、Mg2+、 Rnasin、dNTP、引物、探针等。具体的反应体系如表2所示。
表2
Figure BDA0003874543400000072
Figure BDA0003874543400000081
其扩增反应程序如表3所示。
表3
Figure BDA0003874543400000082
结果分析与判断：
反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录定性结果。
质量控制
阴性对照：FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道均无Ct值或Ct＞40；
阳性对照：FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道均Ct≤35；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
阳性判断值
通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为40，内标Ct 的参考值为40。
检验结果的解释
先分析内标是否有扩增曲线，且Ct≤35，若有，表示本次检测有效，可继续进行后续分析:
表4
Figure BDA0003874543400000091
若在内标通道没有检测到Ct或Ct＞40，表示本次检测样本细胞含量太低或者有干扰物质抑制反应，该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本重新采样，进行重复试验。
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒的假病毒样本进行验证，结果表明能够对新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒进行联检并区分，检测结果如图1～3所示。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如图4～6所示，表明对低至500拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为500拷贝/ml。
实施例5、本发明组合物的特异性
为了测试本发明实施例1中的组合物的特异性，以光滑念珠菌，肺炎链球菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、、甲型流感病毒、乙型流感病毒、脑膜炎奈瑟菌、水痘、带状疱疹、单纯疱疹、麻疹、登革热，甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、风疹病毒为样本，按照上述操作步骤进行检测。结果如图7显示，各靶标通道均无非特异扩增，试剂盒的特异性好。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系，同样用于检测新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒。具体检测结果如图8所示，从图中可以看出检测只出现部分扩增曲线，且扩增曲线增幅低重复性差，而其他靶标甚至无扩增曲线，因此，整体检测效果差。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒、艾滋病毒，和猴痘病毒联检的组合物，同时包括：
第一核酸组合物：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测2019-nCoV ORF1ab基因的上下游引物和探针；和
如SEQ ID NO:4～6所示的检测2019-nCoV N基因的上下游引物和探针；
第二核酸组合物：
如SEQ ID NO:7～9所示的检测猴痘病毒的上下游引物和探针；
第三核酸组合物：
如SEQ ID NO:13～15所示的检测艾滋病毒的上下游引物和探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二核酸组合物还包括：
如SEQ ID NO:10～12所示的检测猴痘病毒的上下游引物和探针。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第三核酸组合物还包括：
如SEQ ID NO:16～18所示的检测艾滋病毒的上下游引物和探针。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括第四核酸组合物，所述第四核酸组合物包括用于检测内标的上下游引物及探针为如SEQ ID NO:19所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:20所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:21所示的内标探针。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述第一核酸组合物的探针的荧光报告基团为FAM；所述第二核酸组合物的探针的荧光报告基团为HEX；所述第三核酸组合物的探针的荧光报告基团为ROX；所述第四核酸组合物的探针的荧光报告基团为CY5。
6.根据权利要求1～3和5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
7.权利要求1～6中任一项所述的组合物在制备新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒联检的试剂盒中的用途。
8.一种新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒联检的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～6中任一项所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种用于以非诊断目的的新型冠状病毒、艾滋病毒和猴痘病毒联检的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～6中任一项所述的组合物或如权利要求8～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2024076994A1 (en) * 2022-10-04 2024-04-11 Hackensack Meridian Health, Inc. Mpx-f3l assay for real-time detection of monkeypox

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