CN117106970A - 检测新型冠状病毒的组合物、试剂盒、方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及SARS‑CoV‑2的检测；更具体地，涉及检测SARS‑CoV‑2奥密克戎变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途。本发明提供了包含所述组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测SARS‑CoV‑2奥密克戎变异株并分型的方法。通过检测SARS‑CoV‑2奥密克戎变异株的4个不同的特征变异位点，对奥密克戎变异株BF.7、BQ.1、BQ.1.1、XBB、BN.1进行分型，从而在单管反应体系中同时实现奥密克戎5种变异株分型的检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及SARS-CoV-2的检测；更具体地，涉及SARS-CoV-2奥密克戎(Omicron)变异株的检测以及BA.4、BA.5的分型。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)，在2020年2月11日国际病毒分类委员会将该病毒命名为SARS-CoV-2。冠状病毒是一个大型病毒家族，在此之前已知有6种可以感染到人类，如可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等，而SARS-CoV-2是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，该病毒在分类学上属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征基因组为线性单股正链的RNA((+)ssRNA)病毒。
据世界卫生组织官网显示，目前全世界已经发现数百种新冠病毒的变种，迄今为止，出现的奥密克戎变异株BF.7、BQ.1、BQ.1.1、XBB、BN.1同时具有包括细胞受体亲和力、病毒复制能力和免疫逃逸能力增强的位点。突变的叠加可能降低部分抗体药物对奥密克戎变异株的保护效力。奥密克戎毒力明显较其余毒株减弱。
因此，本领域需求一种能够准确检测奥密克戎变异株以及区分BF.7、BQ.1、BQ.1.1、XBB、BN.1的试剂，以便针对性采取防疫和治疗措施，使得应对更为效率。同时，检测所需时间短，灵敏度高。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供了一种能够检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的组合物，所述组合物同时包括：
如SEQ ID NO:1所示的突变F490S上游引物、如SEQ ID NO:2所示的突变F490S下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的突变F490S探针；
如SEQ ID NO:4所示的突变K356T上游引物、如SEQ ID NO:5所示的突变K356T下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的突变K356T探针；
如SEQ ID NO:7所示的突变R346T上游引物、如SEQ ID NO:8所示的突变R346T下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的突变R346T探针；以及
如SEQ ID NO:10所示的突变K444T上游引物、如SEQ ID NO:11所示的突变K444T下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的突变K444T探针。
本发明提供的检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的试剂盒，主要利用多重荧光PCR方法，通过检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株上的4不同的特征功能变异位点，对奥密克戎变异株BF.7、BQ.1、BQ.1.1、XBB、BN.1进行分型，从而在单管反应体系中同时实现SARS-CoV-2病毒奥密克戎5种变异株分型的检测。使得不同毒株能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更效率。本发明的组合物，成本低，通量高。并且操作简便。检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个突变的互相匹配的上游、下游引物和探针。
进一步地，组合物中各探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:3荧光报告基团为FAM；SEQ IDNO:6的荧光报告基团为HEX；SEQ ID NO:9的荧光报告基团为ROX；SEQ IDNO:12的荧光报告基团为CY5。
进一步地，所述组合物包括通用引物。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:13所示的通用上游引物，和如SEQ ID NO:14所示的通用下游引物。
“包括通用引物”指通用引物连接在每个引物片段的5’端，例如，SEQ IDNO:13连接通用引物序列变为：
TCGGCATCAATCGGTCCCT。
SEQ ID NO:14连接通用引物序列变为：
CCGCTCCAGCTCTGCTCTC。
通过引入通用引物序列片段，可使不同靶标均使用相同的通用引物对进行扩增并大量富集靶标序列，可降低引物二聚体的发生，并平衡多重特异扩增引物对之间的竞争关系，从而显著提高多重PCR扩增效率。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
在本发明中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
进一步地，所述组合物中引物的用量为0.1～0.3μM；所述组合物中探针的用量为0.1～0.3μM。
进一步地，所述组合物中通用上游引物的用量为0.5～0.8μM，通用下游引物的用量为4～8μM。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各核酸组合物分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各核酸组合物存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的每一核酸组合物中的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内参基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是含新型冠状病毒各突变位点目的片段质粒、片段RNA、假病毒中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、尿嘧啶糖基化酶、Mg2+、Mn2+、Rnasin、dNTP、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20-100μL。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光，温度为95℃，时间0～1分钟。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光，温度为95℃，时间0～1分钟。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染SARS-CoV-2奥密克戎变异株并罹患肺炎的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型。
附图说明
图1为本发明组合物检测奥密克戎变异株XBB的检测结果；
图2为本发明组合物检测奥密克戎变异株BN.1的检测结果；
图3为本发明组合物检测奥密克戎变异株BF.7的检测结果；
图4为本发明组合物检测奥密克戎变异株BQ.1的检测结果；
图5为本发明组合物检测奥密克戎变异株BQ.1.1的检测结果；
图6为本发明组合物检测奥密克戎变异株BN.1的灵敏度检测结果(200拷贝/mL)；
图7为本发明组合物检测奥密克戎变异株XBB的灵敏度检测结果(200拷贝/mL)；
图8～12为本发明组合物特异性检测(分别为地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒)；
图13～15为本发明组合物新冠变异株特异性检测；
图16为本发明对比例组合物检测结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
表1
其中，SEQ ID NO:3荧光报告基团为FAM；SEQ ID NO:6的荧光报告基团为HEX；SEQID NO:9的荧光报告基团为ROX；SEQ ID NO:12的荧光报告基团为CY5，探针的3’末端还具有BHQ1淬灭基团。
实施例2、检测SARS-CoV-2的方法
标本类型：口咽拭子、鼻咽拭子。
核酸提取：
采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到80μLRNA溶液，直接进行检测。
或保存于-80℃。阴性质控品、阳性质控品均需进行提取。
体系配置：
根据检测所需总反应数N，每管PCR加入15μl RT-PCR扩增液(MgCl26mM、dNTP0.8mM，以及上游引物/下游引物浓度均为0.2μM，探针浓度为0.25μM，通用上游引物6μM，通用下游引物6μM)及1.5μl的酶混合液(热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG))。计算所需的总量，混匀后再分装到特制的PCR反应管中。
加样：
向已分装有试剂的PCR反应管中分别加入阴性质控品，样本RNA溶液，阳性质控品，加样量均为10μL，盖紧管盖，混匀，离心收集溶液置管底。
上机扩增检测：
RT-PCR扩增程序及熔解曲线分析程序的设定如下表2所示：
表2
结果分析：
在满足扩增有效的前提下，判定依据如表3和4所示：
表3
表4
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对奥密克戎的假病毒进行检测，实验结果如图1-图5所示。结果表明，各通道均能正常进行检测，该多重PCR体系能够检测对应靶标的情况，并对新冠奥密克戎变异株进行分型，以鉴定奥密克戎变异株。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
将XBB、BN.1、BF.7、BQ.1、BQ.1.1新冠变异株假病毒分别用阴性样本稀释浓度至200拷贝/mL，以验证本试剂及检测方法的灵敏度。部分典型检测结果如图6～7所示，Omicron新冠变异株的4个特征变异位点在200拷贝/mL的假病毒模拟样本均能准确检出，且分型正确，表明该检测方法具较高的灵敏度。
实施例5、本发明组合物的特异性
将地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的假病毒稀释至1×106拷贝/mL作为特异性检测样本用本发明实施例1所述组合物进行检测，实验结果发现均未出现特异性扩增，部分检测结果如图8～12所示。
检测结果表明，地方性人类冠状病毒(HKU1、OC43、NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒，共8种病原体，检测结果均为阴性，表明本发明组合物的特异性好。
实施例6、本发明组合物的新冠变异株特异性
为验证XBB、BN.1、BF.7、BQ.1、BQ.1.1分型检测试剂盒与新冠病毒其他变异株的鉴别诊断的准确性和有效性，将阴性样本及新冠其他变异株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron BA.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5的假病毒样本进行验证，结果显示XBB、BN.1、BF.7、BQ.1、BQ.1.1分型正确，且与其他变异株无交叉反应，说明试剂盒能准确的将XBB、BN.1、BF.7、BQ.1、BQ.1.1变异株与其他变异株进行鉴别诊断，典型检测见下图13～15所示。结果显示XBB、BN.1、BF.7、BQ.1、BQ.1.1分型正确，且与其他变异株无交叉反应，说明试剂盒能准确的将XBB、BN.1、BF.7、BQ.1、BQ.1.1变异株与其他变异株进行鉴别诊断。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系，同样用于检测奥密克戎变异株。具体检测结果如图16所示，从图中可以看出检测只出现部分靶标的扩增曲线，且扩增效果差，而其他靶标甚至无典型扩增曲线，因此，整体检测效果差。
Claims (10)
1.一种能够检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的组合物，所述组合物同时包括：
如SEQ ID NO:1所示的突变F490S上游引物、如SEQ ID NO:2所示的突变F490S下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的突变F490S探针；
如SEQ ID NO:4所示的突变K356T上游引物、如SEQ ID NO:5所示的突变K356T下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的突变K356T探针；
如SEQ ID NO:7所示的突变R346T上游引物、如SEQ ID NO:8所示的突变R346T下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的突变R346T探针；以及
如SEQ ID NO:10所示的突变K444T上游引物、如SEQ ID NO:11所示的突变K444T下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的突变K444T探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中各探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，SEQ ID NO:3荧光报告基团为FAM；SEQ ID NO:6的荧光报告基团为HEX；SEQ ID NO:9的荧光报告基团为ROX；SEQ ID NO:12的荧光报告基团为CY5。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括通用引物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物还包括：如SEQ IDNO:13所示的通用上游引物，和如SEQ ID NO:14所示的通用下游引物。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的各成分存在于同一个包装中。
7.权利要求1～6中任一项所述的组合物在制备检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的试剂盒中的用途。
8.一种检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1～6中任一项所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种用于以非诊断目的检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～6中任一项所述的组合物或如权利要求8～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
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