CN117512222A - 检测出血热相关病原体的组合物、试剂盒及用途 - Google Patents

检测出血热相关病原体的组合物、试剂盒及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及出血热感染相关病原体的检测，更具体地，涉及马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒、阿尔库马出血热病毒的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒、阿尔库马出血热病毒的检测和区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。

Description

检测出血热相关病原体的组合物、试剂盒及用途
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及出血热相关病原体的检测，更具体地，涉及马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒，以及阿尔库马出血热病毒。
背景技术
马尔堡出血热(Marburg hemorrhagic fever，MHF)是由马尔堡病毒(Marburgvirus，MBGV)引起的严重的急性病毒性传染病，病死率可高达88％。MHF多发病突然，早期可表现为发热、寒战、头痛、吞咽痛、肌痛、呕吐和腹泻等，无明显特异性，通常病发后一周死亡。马尔堡病毒通过果蝠传播给人类，并通过体液，包括血液、排泄物、唾液及呕吐物，在人与人之间传播，会导致高传染性出血热。马尔堡病毒最容易感染儿童，在非洲，有75％的病例发生在5岁以下儿童，成人感染者大多为与受感染儿童接触密切的亲属和医护人员。对于这种具高度传染能力，而同时致命的疾病，目前尚无特效治疗药物，对其主要依靠早期发现、早期隔离、对症治疗以及积极的支持治疗。
裂谷热(Rift Valley fever)是由裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)引起、经蚊类媒介或接触传播的急性病毒性感染病。感染人体可引起出血热、肝炎和脑炎等症状，严重感染情况下可导致患者死亡。临床特点为突然发热(常为双相热)、头痛、疲劳、关节、肌肉关节疼痛等，严重者可能会导致出血、休克、脑炎或肝炎，甚至是死亡。
基孔肯雅热(Chikungunya fever)是由基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)引起，经伊蚊传播，肌肉疼痛、头痛、恶心、疲劳和皮疹以发热、皮疹及关节痛/关节炎为主要特征的急性传染病，极少数患者可出现脑膜脑炎、肝功能损伤、心肌炎及皮肤黏膜出血。基孔肯雅热主要分布于非洲、南亚和东南亚地区。2005－2007年本病在印度洋岛屿、印度和东南亚地区广泛流行，导致数百万人患病。由于感染后通常只有轻微症状，仅靠临床表现难以识别感染，在登革热流行地区也会被误诊。
阿尔库马出血热(Alkhurma Hemorrhag fever，AHFV)是由阿尔库马出血热病毒(Alkhurma Hemorrhag fever virus，AHFV)引起，经蜱叮咬或接触带病毒牲畜的血液而感染，初期症状表现为发烧、头痛、腹泻、呕吐、肌肉和关节疼痛、食欲不振和发冷。一些患者在致命前表现出神经出血和多器官功能衰竭。目前，尚无针对AHFV的特定治疗方法或疫苗，该病毒对区域公共卫生具有潜在影响。
马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒、阿尔库马出血热病毒均能引起病毒性出血热，在临床上较为相似，主要引起发烧、疲劳、头痛、肌肉酸痛等症状，这些症状可能会发展为血管渗漏，出血和多器官衰竭。对于感染患者而言，需要早诊断、早治疗，并及时控制传染源，阻断传播途径。建立一套快速诊断马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒以及阿尔库马出血热病毒的检测方法，对出血热相关病毒的鉴别诊断及疫情的防控具有重要意义。
因此，本领域需求一种能够简单、快速地检测上述病原体并且灵敏度高、特异性好的产品，为临床医生提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短临床医生对患者病情诊断的时间，加快对患者实施治疗措施。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测出血热感染病原体的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测马尔堡病毒的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测裂谷热病毒的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:7～9所示的检测基孔肯雅病毒的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:10～12所示的检测阿尔库马出血热病毒的上游引物、下游引物及探针。
本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒，和阿尔库马出血热病毒的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/mL，特异性好，检测更为准确，为临床医生提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短临床医生对患者病情诊断的时间，加快对患者实施治疗措施。
进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在一些具体的实施方案中，马尔堡病毒探针的荧光报告基团为FAM；裂谷热病毒探针的荧光报告基团为ROX；基孔肯雅病毒探针的荧光报告基团为CY5；阿尔库马出血热病毒探针的荧光报告基团为HEX(或VIC)。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。
在一些具体的实施方案中，所述组合物还包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测出血热感染病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒和/或阿尔库马出血热病毒。
第三方面，本发明提供了一种检测出血热感染病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水中的至少一种。阳性质控品是马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒、阿尔库马出血热病毒的假病毒或者片段基因中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，逆转录酶，以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶，DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。所述逆转录酶的浓度为0.1U/反应～3U/反应。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括Taq酶、RT酶、Mg2+、dNTP、引物、探针和PCR缓冲液。
PCR缓冲液组分包括Tris-HCl、KCl、Triton X-100，单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。
第四方面，提供了一种用于非诊断目的检测出血热感染病原体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是血浆或血清等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录反应，温度为50～60℃，时间为1～6min，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为1～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物用于制备检测出血热感染病原体的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录反应，温度为50～60℃，时间为1～6min，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为1～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患出血热的信息。例如，可以在检测培养物中(例如血浆或血清)需求检测是否有上述病原体。
附图说明
图1本发明组合物联合检测结果图(马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒、阿尔库马出血热病毒)；
图2～5为本发明组合物灵敏度结果图(分别为马尔堡病毒、阿尔库马出血热病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒)；
图6为本发明组合物特异性结果图；
图7为本发明组合物精密度结果图；
图8～11为本发明对比例组合物单检检测结果图(分别为马尔堡病毒、阿尔库马出血热病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒)；
图12为本发明对比例组合物四联检检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示：
表1
其中，马尔堡病毒探针的荧光报告基团为FAM；裂谷热病毒探针的荧光报告基团为ROX；基孔肯雅病毒探针的荧光报告基团为CY5；阿尔库马出血热病毒探针的荧光报告基团为HEX。
实施例2、检测病原体的方法
本发明检测样本为，试剂准备：
根据待测样本、阳性对照、阴性对照的数量，按比例(PCR反应液37.5μL/人份+酶混合液2.5μL/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，充分混匀成PCR混合液，2000rpm离心10s后备用。
样本处理与加样
使用圣湘生物科技股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(S10015)按其说明书操作进行核酸提取。
吸取上述处理好的样本、阴性对照及阳性对照各10μL分别加入对应的0.2mL PCR反应管中，每管加入40μL PCR混合液，盖上管盖。
实时荧光PCR反应体系按照如下表2进行配置：
表2
组份 每一个反应中的体积/浓度
PCR缓冲液 35.4μL
RT酶(5U/μL) 0.5μL
Taq酶(5U/μL) 2μL
Mg2+(1M) 0.1μL
dNTP(0.7mM) 1.2μL
引物(150nM) 0.6μL
探针(150nM) 0.2μL
样本DNA 10μL
PCR扩增程序如下表3进行设置：
表3
结果分析：
1)目的检测信号为FAM，HEX(或VIC)，ROX，CY5；
2)Baseline的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；
3)结果判读
表4
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒，阿尔库马出血热病毒，在宏石荧光定量PCR仪器上进行PCR检测，检测结果如图1所示，从图中可以看出，本发明组合物均能对各种病原体进行良好的检测。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，浓度分别为4000、1000、400、200拷贝/ml，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行20次多重PCR检测。其中，400拷贝/ml样本检测结果如图2～5所示，低至400拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，检出率100％，表明本发明组合物的灵敏度为400拷贝/mL。
实施例5、本发明组合物的特异性
本发明组合物与出血热常见病原体及感染症状相似的其他病原体(甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、风疹病毒、人类免疫缺陷病毒1型、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、人副流感病毒3型、巨细胞病毒、柯萨奇病毒A型、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌)均无交叉反应。结果如图6所示，表明本发明的组合物有很好的特异性。
实施例6、本发明组合物的精密度
将阳性样本稀释至中浓度阳性(R1)、临界浓度阳性(R2)2个浓度水平(分别为1.0×105copies/ml和1.0×103copies/ul)进行批内精密度和批间精密度的测定，每个样本重复测定10次。结果显示强阳、弱阳参考品的检出率均为100％，并批内、批间的检测Ct值变异系数(CV)小于5％，可以认为本试剂盒批内、批间均有着很好的检测精密度，以马尔堡病毒样本进行验证，结果如下图7所示。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针组成了不同的检测体系(序列未示出)，同样用于检测上述病原体。具体检测结果如图8～11所示，从图中可以看出检测4个靶标的引物和探针在单检体系中检测效果很好，然而在四联检的体系中检测却受到影响，存在明显的扩增曲线分层以及荧光增量显著降低的情况，如图12所示，进一步说明本发明的组合物的优越性。

Claims (10)

1.一种检测出血热感染病原体的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测马尔堡病毒的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测裂谷热病毒的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:7～9所示的检测基孔肯雅病毒的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:10～12所示的检测阿尔库马出血热病毒的上游引物、下游引物及探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，马尔堡病毒探针的荧光报告基团为FAM；裂谷热病毒探针的荧光报告基团为ROX；基孔肯雅病毒探针的荧光报告基团为CY5；阿尔库马出血热病毒探针的荧光报告基团为HEX。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测出血热感染病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为马尔堡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒和/或阿尔库马出血热病毒。
7.一种检测出血热感染病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、逆转录酶、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种组合物用于制备检测出血热感染病原体的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
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