KR20210122632A - RT-LAMP를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법 - Google Patents
RT-LAMP를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 RT-LAMP를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 RT-LAMP를 이용한 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 종래 코로나바이러스감염증-19 진단에 사용되는 PCR과 RT-PCR 방법에 비해 편리하고 신속하게 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자와 N 유전자를 증폭 및 판별할 수 있어, SARS-CoV-2 감염 여부를 빠르게 진단할 수 있다.
Description
본 발명은 RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 RT-LAMP를 이용한 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법에 관한 것이다.
코로나바이러스는 외피가 있는 단일가닥의 양성 RNA 바이러스이며 게놈 크기는 25-32kb로 지금까지 알려진 RNA 바이러스 중에서는 비교적 큰 바이러스에 속한다. 외피에 곤봉모양의 돌기인 스파이크(spike) 단백질이 박혀 있어 화염 또는 왕관 모양의 특이적 구조를 가지고 있으며, 라틴어로 왕관이라는 뜻인 Corona로부터 바이러스 이름이 유래되었다. 1937년 닭에서 처음으로 발견된 후 박쥐, 새, 고양이, 개, 소, 돼지, 쥐 등 다양한 조류와 동물에서 발견된 코로나바이러스는 4개의 그룹(Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta- corona virus)으로 나누어진다. 알파와 베타코로나바이러스 그룹은 포유류에 주로 감염되고 감마와 델타코로나바이러스 그룹은 조류에서 찾을 수 있다. 코로나바이러스는 동물들에서 위장병 및 호흡기질환과 같은 다양한 질환을 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 사람에게 감염되는 사람 코로나바이러스는 1960대 발견된 HCoV-229E와 HCoV-OC43, 사스 대유행 이후 발견된 HCoV-NL63(2004년)과 HCoV-HKU1(2005년)로 이들은 일반적으로 상기도 감염증과 관계가 있다고 알려져 있으나 면역결핍환자들에게는 심각한 폐질환을 유도하기도 한다. 주로 겨울이나 이른 봄에 코로나바이러스에 대한 감염률이 증가된다고 보고되고 있고, 성인 감기환자 중 코로나바이러스가 원인 병원체인 비율이 상당히 높다고 알려져 있다. 2003년 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)을 일으키는 사스 코로나바이러스(SARS-CoV)가 처음 발견되었으며 세계보건기구(WHO) 보고에 따르면 2002년에서 2003년 동안 전 세계적으로 8,273명의 환자와 775명의 사망자(치사율 약 10%)가 발생하였고, 2004년까지 추가적인 환자 발생과 사망자가 보고되었다(Saif LJ., Rev. Sci. Tech., 23:643, 2004).
2012년 9월 사스와 유사한 고열, 기침, 호흡곤란 등의 호흡기 증상을 나타내는 중중 호흡기질환 환자가 발생하였고, 이 원인 병원체는 기존의 알려진 바이러스와는 다른 신종 코로나바이러스(HCoV-EMC)로 밝혀졌다. 이 바이러스는 중동호흡기 증후군 코로나바이러스 또는 메르스 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus; MERS-CoV)로 불리며, 사람에게 감염되었을 때에 중증의 호흡기 질환을 유발하여 사망에 이르게 하며(Zaki AM et al., N Engl J Med, 367:1814, 2012), 2015년 5월 우리나라에서 발생하여 38명의 사망자를 낸 바 있다.
코로나바이러스감염증-19는 2019년 12월 중국 우한시에서 발생한 바이러스성 호흡기 질환이다. '우한 폐렴', '신종코로나바이러스감염증', '코로나19'라고도 한다. 신종 코로나바이러스에 의한 유행성 질환으로 호흡기를 통해 감염되며, 증상이 거의 없는 감염 초기에 전염성이 강한 특징을 보인다. 감염 후에는 인후통, 고열, 기침, 호흡곤란 등의 증상을 거쳐 폐렴으로 발전한다. 2020년 3월 전세계로 확산되자, 세계보건기구는 이 질환에 대해 팬데믹을 선언했다.
코로나바이러스감염증-19(Covid-19)는 주로 호흡기로 전염된다. 감염되었을 경우 바이러스는 폐를 침범하며, 고열과 기침, 호흡곤란 등의 증상이 발생하고 폐렴과 유사한 증상을 보인 끝에 심한 경우 폐포가 손상되어 호흡 부전으로 사망에 이르기도 한다. 잠복기는 3~7일이지만 최장 14일까지 이어지기도 한다. 2020년 1월 30일 중국에서는 잠복기가 23일까지 늘어난 사례가 있다고 발표했다. 코로나바이러스감염증-19는 증상이 나타나지 않는 잠복기 중에도 전염되는 사례가 있다고 보고되었다.
코로나바이러스감염증-19의 잠복기 무증상 시에도 전염되는 특성과 강한 전염성으로 인해 인접한 지역으로 신속하게 확산되기 때문에 조기 검출에 의한 환자의 격리 및 관리가 매우 중요하다.
현재 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2는 기본적으로 '판코로나바이러스 검사법(Conventional PCR)'과 염기서열 분석으로 진단한다. 판코로나바이러스 검사법은 신종코로나바이러스를 포함한 모든 코로나바이러스의 존재 유무를 우선 검사하는 것으로, 음성으로 판정되면 코로나바이러스 감염이 아님을 의미한다. 만일 양성인 경우에는 감기를 일으키는 다른 코로나바이러스인지, 신종코로나바이러스인지 유무를 유전자염기서열 분석을 통해 판단한다. 이에 따라 진단에 1~2일 정도 소요된다.
한국의 질병관리본부는 2020년 1월 31일부터는 검사속도와 편의성이 향상된 '실시간 유전자 증폭검사(Real Time RT-PCR)'를 통해 진단하고 있는데 이 검사방법으로는 6시간 이내에 결과 확인이 가능하다.
하지만 검사속도와 편의성, 민감도 및 특이도가 보다 향상된 효과적인 검출이 가능한 검출 가능한 방법이 필요하다.
한편, LAMP법(Loop-Mediated Isothermal Amplification의 줄임말)은 에이켄화학이 개발한 유전자 증폭법이다(Notomi T et al.,Nucleic Acids Res》 28 (12): E63, US6410278). 표적유전자에서 6개의 영역을 선택하여 조합한 4개의 프라이머를 사용하여 표적 유전자를 사슬치환반응을 이용해 증폭시키는 방법이다. 사용되는 프라이머를 처음의 증폭산물의 프라이머 결합부위에 루프 구조를 생기게 디자인한다. 루프부분은 한가닥이므로, 다음의 프라이머가 결합(Annealing)가능하다. 사슬치환활성이 높은 특수한 DNA 합성효소를 사용하여, 진행방향에 있는 두 가닥 DNA를 해리시키면서, 스스로의 신장반응을 진행해간다. 최종적으로 원래의 표적서열의 약 정수배의 길이의 증폭산물이 65℃ 1시간정도의 반응에서 축적된다. 따라서 반응산물을 전기영동하면 사다리 모양의 결과를 얻을 수 있다. LAMP법은 기존의 PCR법과 비교하여, 검체 핵산을 한 가닥에서 두 가닥으로 변성시킬 필요가 없어, 60~65℃의 온도에서 반응이 진행하는 특징이 있고, 서멀사이클러와 같은 기기가 필요 없다. 또한, 증폭속도가 빠르고, 특이성도 높아(표적 핵산 이외의 것이 증폭되기 어려움), 반응액의 백탁(뽀얗게 흐려짐)을 확인하는 것만으로도 템플릿(표적)이 증폭되었는지 확인할 수 있다.
또한, PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브는 DNA보다 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어나 DNA 프로브보다 빠르고 강하게 타겟 DNA와 결합할 수 있는 특징을 사용하여 민감도와 특이도를 개선하였다.
이에, 본 발명자들은 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 기존의 RT-PCR보다 높은 민감도와 특이도를 가지면서도 등온에서 진단하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, PNA 프로브를 사용하여, RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)법으로 SARS-CoV-2의 표적 핵산을 검출하는 경우, 기존의 PCR 방법이나 RT-PCR 방법보다 편리하고, 신속하게 표적 핵산을 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 편리하고, 신속하게 진단하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 편리하고, 신속하게 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다:
(a) 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍 또는; 및
(b) 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(c) 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(d) 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 19로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 ORF1ab 유전자 증폭산물을 검출하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 21로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법을 제공한다;
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 실험방법의 검증 및 SARS-CoV-2 감염으로 판정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다;
(a') 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및
(b') 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(c') 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(d') 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 20으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 N 유전자 증폭산물을 검출하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 21로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법을 제공한다;
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 실험방법의 검증 및 SARS-CoV-2 감염으로 판정하는 단계.
본 발명에 따르면, 종래 코로나바이러스감염증-19 진단에 사용되는 PCR과 RT-PCR 방법에 비해 편리하고 신속하게 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자와 N 유전자를 증폭 및 판별할 수 있어, SARS-CoV-2 감염 여부를 빠르게 진단할 수 있으며, 동시에 내부 대조물질인 Human RNaseP 유전자를 통하여 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 전과정에 대한 검증도 할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 SARS-CoV-2의 표준핵산 제작방법을 나타낸 것이다.
도 2는 PNA 프로브를 사용하여 SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자와 N 유전자를 신속하게 분석하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 3은 SARS-CoV-2 감염여부를 확인하기 위한 LAMP 반응조건을 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따른 SARS-CoV-2의 검출 결과를 나타낸 것으로, A는 SARS-CoV-2 검출 결과를 나타낸 것이고, B는 SARS-CoV-2 미검출 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 방법의 SARS-CoV-2의 최소검출한계를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 방법의 교차반응확인을 통한 SARS-CoV-2 진단 키트의 특이도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7. SARS-CoV-2 양성이 확인된 임상샘플을 사용하여 본 발명에 따른 PNA 기반 SARS-CoV-2 진단 키트의 활용성을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 PNA 프로브를 사용하여 SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자와 N 유전자를 신속하게 분석하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 3은 SARS-CoV-2 감염여부를 확인하기 위한 LAMP 반응조건을 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따른 SARS-CoV-2의 검출 결과를 나타낸 것으로, A는 SARS-CoV-2 검출 결과를 나타낸 것이고, B는 SARS-CoV-2 미검출 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 방법의 SARS-CoV-2의 최소검출한계를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 방법의 교차반응확인을 통한 SARS-CoV-2 진단 키트의 특이도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7. SARS-CoV-2 양성이 확인된 임상샘플을 사용하여 본 발명에 따른 PNA 기반 SARS-CoV-2 진단 키트의 활용성을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 기존의 RT-PCR 보다 높은 민감도와 특이도를 가지면서도 등온에서 진단하는 방법으로, RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)법을 사용하였으며, 코로나바이러스감염증-19를 일으키는 SARS-CoV-2 바이러스의 ORF1ab 유전자(ORF1ab gene)과 N 유전자(N gene)을 등온에서 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 및 내부 대조물질인 Human RNaseP 유전자를 등온에서 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머도 디자인하였다. 아울러 상기 프라이머에 의해 증폭된 ORF1ab 유전자와, N유전자, RNaseP 유전자는 DNA보다 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어난 PNA를 사용한 PNA(Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하여 혼성화하여 증폭산물을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트에 관한 것이다:
(a) 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 및
(b) 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(c) 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(b) 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 및 서열번호 18의 RNaseP 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 N 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(e) 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍;
(f) 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍; 및
(g) 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍; 으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트들은 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법을 이용한 분석용 프라이머이며, 바람직하게는 RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 19, 서열번호 20 또는 서열번호 21로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 소광자(quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 상기 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브와 내부대조 물질을 확인하기 위한 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법에 관한 것이다.
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화 시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 실험방법의 검증 및 SARS-CoV-2 감염으로 판정하는 단계.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트에 관한 것이다:
(a') 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및
(b') 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 11 및 서열번호 12의 N 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(c') 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(b') 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 및 서열번호 18의 RNaseP 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 ORF1ab 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다:
(e') 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍;
(f') 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 및
(g') 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트들은 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법을 이용한 분석용 프라이머이며, 바람직하게는 RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 상기 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브와 내부대조 물질을 확인하기 위한 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법에 관한 것이다.
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자(내부대조 유전자)를 증폭하는 단계;
(c) 상기 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자 증폭산물에 대한 PNA 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화 시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 실험방법의 검증 및 SARS-CoV-2 감염으로 판정하는 단계.
본 발명에 있어서, "펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)"은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다.
펩티드핵산은 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
PNA는 상보적인 염기서열의 천연핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다.
또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection)할 수 있게 된다.
본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 사람 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 기관의 대표적인 예로는, 기관지, 폐, 비강, 눈, 뇌, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭,위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 타액, 가래, 콧물, 비말, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 유무를 검출할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 표적 핵산 준비
SARS-CoV-2의 진단을 위하여 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자 300bp(서열번호 22)와 N 유전자 300bp(서열번호 23)를 합성하고, 내부대조물질인 RNaseP의 증폭확인을 위하여 Human의 RNaseP 유전자 400bp(서열번호 24)을 합성하여 각각 pUC57 벡터에 클로닝 후 표준물질로 사용하여 확인하였다(도 1).
실시예 2: SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자, N 유전자 및 Human RNaseP 유전자 증폭을 위한 프라이머 제작
SARS-CoV-2의 표적물질에 대한 LAMP 반응 (Loop-mediated isothermal amplification)을 위해 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, ORF1ab 유전자를 증폭하는 서열번호 1~6의 프라이머와, N 유전자를 증폭하는 서열번호 7~ 12의 프라이머를 제작하였으며, 내부대조 물질에 대한 LAMP반응을 위해 Human RNaseP 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 13~18의 프라이머를 제작하였다. (표 1).
| 서열번호 | 서열 (5'-3') | 상세내용 |
| 서열번호 1 | GCTTGTCACACCGTTTCT | SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자 바깥 정방향 프라이머 |
| 서열번호 2 | GGCAATTTTGTTACCATCAGT | SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자 바깥 역방향 프라이머 |
| 서열번호 3 | GGTTTAACATATAGTGAACCGCCACGCTAATGAGTGTGCTCAAG | SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자 안쪽 정방향 프라이머 |
| 서열번호 4 | CAGGAGATGCCACAACTGCTTATAGATAAAAGTGCATTAACATTGG | SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자 안쪽 역방향 프라이머 |
| 서열번호 5 | CATGACCATTTCACTCA | SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자 고리 정방향 프라이머 |
| 서열번호 6 | GCTAATAGTGTTTTTAACATTTG | SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자 고리 역방향 프라이머 |
| 서열번호 7 | CAAGAAATTCAACTCCAGGC | SARS-CoV-2 N 유전자 바깥 정방향 프라이머 |
| 서열번호 8 | AGTACGTTTTTGCCGAGG | SARS-CoV-2 N 유전자 바깥 역방향 프라이머 |
| 서열번호 9 | GCAAAGCAAGAGCAGCATCAAGTAGGGGAACTTCTCCTG | SARS-CoV-2 N 유전자 안쪽 정방향 프라이머 |
| 서열번호 10 | ACAGATTGAACCAGCTTGAGAGGCAGCAGATTTCTTAGTGAC | SARS-CoV-2 N 유전자 안쪽 역방향 프라이머 |
| 서열번호 11 | CATTGCCAGCCATTCTAG | SARS-CoV-2 N 유전자 고리 정방향 프라이머 |
| 서열번호 12 | CCAACAACAACAAGGCCA | SARS-CoV-2 N 유전자 고리 역방향 프라이머 |
| 서열번호 13 | CTACATTCACGGCTTGGGC | Human RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 |
| 서열번호 14 | GGGGATAAGTGGAGGAGTGT | Human RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 |
| 서열번호 15 | TTGGCAGCCACCTGCAAGGAATCAACCGCGCCATCAAC | Human RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 |
| 서열번호 16 | CGACACACGGGAGCCACTGATGACCCTGAAGACTCGGATG | Human RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 |
| 서열번호 17 | CAGCTGCAGCGCGATG | Human RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 |
| 서열번호 18 | GACTCGGATCCGCAACA | Human RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 |
실시예 3: 형광 PNA 프로브 제작
SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자와 N 유전자의 특이적 증폭분석과 Human RNaseP 유전자의 특이적 증폭분석을 위하여 PNA 프로브를 제작하였으며, 융해온도 분석을 위해 프로브 서열 양 끝에 각각 형광과 소광자를 결합시켰다(표 2).
| 서열번호 | 서열 (5'-3') | 형광 | |
| SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자 PNA 프로브 | 서열번호 19 | Dabcyl-TCAAGCTGTCACG-O-K | FAM |
| SARS-CoV-2 N 유전자 PNA 프로브 | 서열번호 20 | Dabcyl-CAAAATGTCTGGTA-O-K | FAM |
| Human RNaseP 유전자 PNA 프로브 | 서열번호 21 | Dabcyl-ACTCAGCCATCCAC-O-K | HEX |
| * 표 2에서 O-는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다 | |||
실시예 4: 표준물질을 이용한 SARS-CoV-2 검출 키트의 검증
실시예 1에서 합성된 SARS-CoV-2의 표적핵산과 RNaseP의 표적핵산을 실시예 2와 실시예 3에서 합성된 프라이머 및 PNA 프로브와 혼합한 후 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)를 이용하여 LAMP 반응을 수행하여 형광을 측정하였다.
ORF1ab 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 1 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 19의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다.
N 유전자 검출을 위한, LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM N 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM N 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 2 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 20의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다. 실험 과정은 도 2에 나타내었으며, 도 3의 조건으로 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 SARS-CoV-2 표준물질이 있을 경우에만 FAM 형광이 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: SARS-CoV-2 의 최소검출한계 확인
SARS-CoV-2 진단 키트의 검출한계를 확인하기 위하여 SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자와 N 유전자를 각각 포함한 표준물질 1 및 표준물질 2를 대상으로 실시예 2 및 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
각 표준물질은 1X105 copies 농도부터 1X100 copies 농도로 희석하여 사용하였으며, LAMP 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 ORF1ab 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 1 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 19의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였고, N 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM N 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM N 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 2 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 20의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP 반응을 실시하는 중간에 형광검출 분석을 수행하였다. 실험은 각각 3회 반복 확인하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 검출방법을 사용할 경우, 표준물질의 10 copies까지 검출이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 6: 교차반응확인을 통한 SARS-CoV-2 진단 키트의 특이도 확인
SARS-CoV-2 진단 키트의 특이도 확인을 위하여 표 3에서 제시된 바와 같이 반응물질인 SARS-CoV-2 표준물질 1 및 표준물질 2 와 14개의 비특이물질을, 내부대조물질 반응물질인 Human RNaseP 표준물질3 과 14개의 비특이물질을 대상으로 실시예 2와 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
ORF1ab 유전자 검출을 위한 LAMP 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 10㎕ 표준물질 1 DNA, 서열번호 19의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였고, N 유전자 검출을 위한 LAMP 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM N 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM N 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 10㎕ 표준물질 2 DNA, 서열번호 20의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였고, RNaseP 검출을 위한 LAMP 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 10㎕ 표준물질 3 DNA, 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였으며, 실험은 각각 3회 반복 실행하였다.
그 결과 도 6와 같이 SARS-CoV-2는 검출이 확인된 반면, 14개의 비반응물질에서는 표적핵산의 증폭이 일어나지 않는 것을 확인하였으며, 내부대조물질 Human RNaseP도 마찬가지로 검출이 확인된 반면, 14개의 비반응물질에서는 표적 핵산의 증폭이 일어나지 않는 것을 확인하였다.
| 특이물질 | 비 특이물질 |
| SARS-CoV-2 ORF1ab (표준물질 1), SARS-CoV-2 N (표준물질 2) |
Enterobacter cloacae Mycobacterium asiaticum Mycobacterium chelonae subsp. chelonae Mycobacterium gordonae Gordonia polyisoprenivorans Mycobacterium massiliense Mycobacterium neoaurum Enterococcus faecalis Mycobacterium paraseoulense Escherichia coli Veillonella dispar Streptococcus mitis Staphylococcus aureus HeLa |
| Human RNaseP (표준물질 3) |
Enterobacter cloacae
Mycobacterium asiaticum Mycobacterium chelonae subsp. chelonae Mycobacterium gordonae Gordonia polyisoprenivorans Mycobacterium massiliense Mycobacterium neoaurum Enterococcus faecalis Mycobacterium paraseoulense Escherichia coli Veillonella dispar Streptococcus mitis Staphylococcus aureus SARS-CoV-2 virus |
실시예 7: 임상샘플을 사용한 PNA 기반 SARS-CoV-2 진단 키트의 검증
SARS-CoV-2 감염이 의심되는 임상조직에서 DNA를 추출한 후 기존 real-time PCR 방식으로 확인된 임상샘플 1-3의 RNA를 대상으로 실시예 2 및 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
ORF1ab 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM ORF1ab 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM ORF1ab 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM ORF1ab 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 1 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 19의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였고, N 유전자 검출을 위한 LAMP 반응액은 2X reaction 버퍼, 9.6mM MgSO4, 1.8mM dNTPs, 60U RTase, 10U Bst polymerase, 0.2μM N 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.2μM N 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 2μM N 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.8μM N 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 정방향 프라이머 (Outer forward primer, 표 1), 0.02μM RNaseP 유전자 바깥 역방향 프라이머 (Outer reverse primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 정방향 프라이머 (Inner forward primer, 표 1), 0.16μM RNaseP 유전자 안쪽 역방향 프라이머 (Inner reverse primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 정방향 프라이머 (Loop forward primer, 표 1), 0.08μM RNaseP 유전자 고리 역방향 프라이머 (Loop reverse primer, 표 1)에 5㎕ 표준물질 2 DNA, 5㎕ 표준물질 3 DNA, 1㎕ 서열번호 20의 형광 PNA 프로브, 1㎕ 서열번호 21의 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가한 다음 LAMP를 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다. 실험 과정의 도식은 도 2에 나타내었으며, 도 3의 조건으로 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 기존 방법으로 SARS-CoV-2 양성으로 확인된 샘플에서, 본 발명의 RT-LAMP 방법을 사용하여서도 SARS-CoV-2 ORF1ab 유전자와 N 유전자의 형광이 검출되는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
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Using RT-LAMP and Method for Detecting SARS-CoV-2 Infection Using
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<160> 21
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 ORF1ab primer
<400> 1
gcttgtcaca ccgtttct 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 ORF1ab primer
<400> 2
ggcaattttg ttaccatcag t 21
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 ORF1ab primer
<400> 3
ggtttaacat atagtgaacc gccacgctaa tgagtgtgct caag 44
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 ORF1ab primer
<400> 4
caggagatgc cacaactgct tatagataaa agtgcattaa cattgg 46
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 ORF1ab primer
<400> 5
catgaccatt tcactca 17
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 ORF1ab primer
<400> 6
gctaatagtg tttttaacat ttg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene primer
<400> 7
caagaaattc aactccaggc 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene primer
<400> 8
agtacgtttt tgccgagg 18
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene primer
<400> 9
gcaaagcaag agcagcatca agtaggggaa cttctcctg 39
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene primer
<400> 10
acagattgaa ccagcttgag aggcagcaga tttcttagtg ac 42
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene primer
<400> 11
cattgccagc cattctag 18
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<212> DNA
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<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene primer
<400> 12
ccaacaacaa caaggcca 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human RNaseP gene primer
<400> 13
ctacattcac ggcttgggc 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Human RNaseP gene primer
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ggggataagt ggaggagtgt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Human RNaseP gene primer
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ttggcagcca cctgcaagga atcaaccgcg ccatcaac 38
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human RNaseP gene primer
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cgacacacgg gagccactga tgaccctgaa gactcggatg 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human RNaseP gene primer
<400> 17
cagctgcagc gcgatg 16
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human RNaseP gene primer
<400> 18
gactcggatc cgcaaca 17
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<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 ORF1ab probe
<400> 19
tcaagctgtc acg 13
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<211> 14
<212> DNA
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<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene probe
<400> 20
caaaatgtct ggta 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human RNaseP gene probe
<400> 21
actcagccat ccac 14
Claims (33)
- 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
(a) 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 및
(b) 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
(c) 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(b) 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 5 및 서열번호 6의 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 하기 N 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
(e) 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍;
(f) 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍; 및
(g) 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍; 으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
- 제2항에 있어서, 서열번호 17 및 서열번호 18의 RNaseP 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
- 제6항에 있어서, RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
- 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 19로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 ORF1ab 유전자 증폭산물을 검출하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
- 제8항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
- 제8항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
- 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 21로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브.
- 제11항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
- 제11항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
- 제14항에 있어서, 제8항의 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
- 제14항에 있어서, 제11항의 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
- 제14항에 있어서, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 20으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 N 유전자 증폭산물 검출용 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법;
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 증폭하는 단계;
(c) 제8항의 프로브, 제12항의 프로브 또는 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 20으로 표시되는 서열을 가지는 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 실험방법의 검증 및 SARS-CoV-2 감염으로 판정하는 단계.
- 다음을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
(a') 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및
(b') 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍으로 이루어진 N 유전자 검출용 프라이머 세트.
- 제19항에 있어서, 하기 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
(c') 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 및
(b') 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍으로 이루어진 내부대조물질 RNaseP 유전자 검출을 위한 프라이머 세트.
- 제19항에 있어서, 서열번호 11 및 서열번호 12의 N 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트.
- 제19항에 있어서, 하기 ORF1ab 유전자 검출을 위한 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트:
(e') 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍;
(f') 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 및
(g') 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 으로 이루어진 ORF1ab 유전자 검출용 프라이머 세트.
- 제20항에 있어서, 서열번호 17 및 서열번호 18의 RNaseP 유전자 검출용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 프라이머 세트.
- 제19항에 있어서, LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
- 제24항에 있어서, RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)방법을 이용한 분석용인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
- 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 20으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
- 제26항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
- 제26항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
- 제29항에 있어서, 제26항의 코로나바이러스감염증-19 진단을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
- 제29항에 있어서, 제11항의 내부대조물질 RNaseP 검출을 위한 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
- 제29항에 있어서, 제8항의 ORF1ab 유전자 증폭산물을 검출하는 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 진단용 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 원인 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하는 방법;
(a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하는 단계;
(b) 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응을 수행하여 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 증폭하는 단계;
(c) 제26항의 프로브, 제8항의 프로브 또는 제12항의 프로브와 증폭된 표적핵산의 ORF1ab 유전자, N 유전자 또는 RNaseP 유전자를 혼성화 시키는 단계; 및
(d) 형광검출 측정을 통해 실험방법의 검증 및 SARS-CoV-2 감염으로 판정하는 단계.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2021/004009 WO2021201601A1 (ko) | 2020-04-01 | 2021-03-31 | Rt-lamp를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 sars-cov-2의 검출용 pna 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| KR1020200101758A KR102338861B1 (ko) | 2020-04-01 | 2020-08-13 | RT-LAMP를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법 |
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| KR102413053B1 (ko) * | 2021-12-10 | 2022-06-24 | 주식회사 낙스 | 도파민이 결합된 흑린 나노 시트 및 금 나노 막대를 포함하는 나노물질 복합체 및 이의 용도 |
| DE202022103701U1 (de) | 2021-07-05 | 2022-09-27 | Hyundai Mobis Co., Ltd. | Rotorplatte und Rotoranordnung mit dieser Rotorplatte |
| WO2023106868A1 (ko) * | 2021-12-09 | 2023-06-15 | 포항공과대학교 산학협력단 | 단일가닥 생성 방법 및 이를 이용한 변이 검출 방법 |
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2020
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| CN116555497A (zh) * | 2022-01-27 | 2023-08-08 | 深圳联合医学科技有限公司 | 用于检测新型冠状病毒的试剂盒和方法 |
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