KR102526656B1

KR102526656B1 - 핵산 검출 방법

Info

Publication number: KR102526656B1
Application number: KR1020210028198A
Authority: KR
Inventors: 서영준; 최문혁
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2021-03-03
Publication date: 2023-04-27
Also published as: KR20220124494A

Abstract

본 발명은 RPA 방법으로 표적 유전자를 증폭하고 이를 새로운 형광 뉴클레오티드 dUrkTP를 이용한 형광 DNA 탐지체-GO 시스템에 적용한 유전자 진단 기술에 관한 것으로, 본 발명의 rkDNA-GO 시스템은 짧은 시간 내에 정확한 서열의 합성 형광 DNA를 제작할 수 있고, 소광된 rkDNA-GO에 rkDNA와 상보적인 서열의 표적 핵산이 결합되면 형광이 회복되어 빠른 시간 내에 (30분 이내) 경제적이고 쉽게 유전서열에 대한 진단이 가능하며, 이를 유전자의 등온증폭방법과 함께 사용함으로써 이중-선택 과정 (RPA 반응 단계 및 rkDNA-GO 단계)에 의한 높은 민감도 및 선택성을 나타내므로, 이를 간단하고 신속한 진단 시스템으로 이용할 수 있다.

Description

핵산 검출 방법{METHOD FOR DETECTING NUCLEIC ACID}

본 발명은 RPA 방법으로 표적 유전자를 증폭하고 이를 새로운 형광 뉴클레오티드 dUrkTP를 이용한 형광 DNA 탐지체-GO 시스템에 적용한 유전자 진단 기술에 관한 것이다.

특정한 핵산 (DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 검출하는 방법은 과학연구 분야에서 기본적으로 중요한 기술이다. 특정한 핵산 또는 단백질을 검출하고 동정할 수 있게 됨으로써, 연구자들은 어떤 유전적, 생물학적 표지가 사람의 건강상태를 나타내는 지표가 되는지를 판정할 수 있게 되었다. 이러한 핵산과 단백질을 검출하는 방법을 이용하면 시료에 존재하는 병원체 유전자의 변형, 또는 특정 유전자의 발현 등을 발견할 수 있다. 이와 같은 분자 진단은 DNA 또는 RNA 등 질병의 근본을 진단하는 것으로 감염질환, 암진단, 유전질환 및 맞춤 진단 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 대표적인 분자진단 기술로는 단시간 내에 DNA를 증폭시키는 PCR 기술이 있다 (Saiki, R., et. al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-91. 1998). 그러나, 일반적인 PCR 기술은 증폭된 DNA를 확 인하기 위해서 전기 영동 방법을 사용하여야 한다. 이러한 전기 영동을 수행하기 위해서는 아가로즈 젤(Agarose gel)을 만들고 DNA를 EtBr 등으로 염색하여 확인해야 하는 번거로움이 있어왔다. 또한, 최근에 사용되고 있는 real-time PCR 방법은 형광을 사용하기 때문에 전기 영동이 불필요하나, 고가의 사용 기기와 고가의 형광시약을 사용해야 한다 (Higuchi, R., et. al., Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions. Nature Biotechnology 11, 1026 - 1030, 1993)는 문제점이 있다. 최근에 현장 진단 개념의 PCR 제품인 Cepheid사의 GeneXprt system과 시약이 개발되어 판매되고 있으나, 장비와 시약이 매우 고가이므로 일반적인 검사에서 사용하는 데는 어려움이 있다 (Helb, D., et. al., Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, Near-Patient Technology. J. Clin. Microbiol. 48, 229-237, 2010).

한편, 그래핀은 탄소원자가 2 차원 격자 내로 채워진 평면 단일층 구조를 가지며, 이것은 모든 다른 차원구조를 가지는 흑연의 기본 구조이다. 즉, 상기 그래핀은 0차원 구조인 풀러렌, 1 차원 구조인 탄소나노튜브, 또는 3 차원 구조로 적층된 흑연의 기본 구조가 될 수 있다. 최근 많은 연구에서 그래핀이 가지는 육각형의 결정구조, 두 개의 상호침투하는 삼각 형태의 하위 격자 구조, 및 하나의 원자 크기에 해당하는 두께 등에 의하여 그래핀이 특이한 물리적 특성, 예를 들면, 제로 밴드갭을 보이는 점을 주목하고 있다. 또한 그래핀은 특이한 전자 전달 특성을 갖는데, 이로 인하여 그래핀은 종래에는 관찰되지 않았던 독특한 현상을 보여준다. 예를 들면, 반정수 양자 홀 효과 및 바이폴라 초전류 트랜지스터 효과 등이 그 예이며, 이 또한 상기 그래핀의 특유한 구조에 기인하는 것으로 여겨진다. 이러한 그래핀의 산화된 형태인 산화그래핀(graphene oxide, GO)은 형광 공명 에너지전달(FRET, Fluorescence resonance energy transfer)현상을 통해 유기형광염료의 형광 신호를 소광시킬 수 있다.

코로나바이러스는 단일가닥 양성 RNA를 게놈으로 가지고 있는 외피가 있는 바이러스로 1937년 처음 발견된 이후 사람을 포함하여 다양한 동물에게서 분리되었다. 코로나바이러스는 4개의 그룹으로 나눌 수 있다. 이중 알파-코로나바이러스(Alpha-coronavirus)와 베타-코로나바이러스(Beta-coronavirus)는 주로 포유류에 감염되고, 감마코로나바이러스(Gamma-coronavirus)와 델타-코로나바이러스(Delta-coronavirus)는 조류에 감염되지만 최근 돼지에서 델타-코로나바이러스(Delta-coronavirus)의 감염이 확인된 사례가 있다. 코로나바이러스는 이종 간 감염이 이루어질 수 있다. 대표적인 사례로서 2003년에 전세계적으로 유행한 중증급성호흡기증후군을 일으키는 사스(SARS) 코로나바이러스와 2015년에 국내에 전파되어 확산된 메르스(MERS) 코로나바이러스를 들 수 있으며, 이들 바이러스 모두 박쥐에서 유래된 것으로 알려져 있다. 박쥐는 포유동물 중 비행능력이 있어 광범위한 지역에 서식할 수 있으며, 동굴 등 협소한 공간에서 다수의 개체가 집단으로 생활하는 특성으로 인하여 한 개체가 바이러스에 감염될 경우 집단으로 감염이 전달되고 비행을 통한 광범위한 지역으로의 이동을 통하여 다른 동물에 감염을 확산시킬 수 있다. 또한 박쥐는 다른 포유류와 달리 체온이 높아 바이러스에 대한 저항력이 있어 코로나바이러스 숙주인 박쥐는 영향을 받지 않고 지속적인 감염을 전파할 수 있다. 2019년 12월 중국 우한지역에서 발생했다고 보고되는 새로운 코로나바이러스인 코로나-19 바이러스 감염증(신종 코로나바이러스 감염증, COVID-19)은 감염 시 약 2~14일의 잠복기를 거친 뒤 발열 및 기침이나 호흡곤란 등 호흡기 증상, 폐렴이 주 증상으로 나타나지만 무증상 감염 사례도 드물게 나오고 있다. 세계보건기구(WHO)는 코로나-19에 대해 최고 경보단계인 '팬데믹(pandemic)'을 선언했다.

이에, 본 발명의 발명자들은 COVID-19의 빠른 전파를 막기 위해, 진료 시점에서 COVID-19를 빠르고 간단하면서도 매우 민감하고 선택적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하였다.

본 발명의 목적은 새로운 형광 유전자를 효소로 저렴하게 합성하고, 이의 형광을 소광시킨 상태에서, 원하는 서열의 유전자를 빠른 시간 이내에 정확히 진단하는 용도로 이용하는 것에 있다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 핵산 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 코로나-19 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 코로나-19 바이러스 검출 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 핵산 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 코로나-19 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 코로나-19 바이러스 감염증 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 rkDNA-GO 시스템은 짧은 시간 내에 정확한 서열의 합성 형광 DNA를 제작할 수 있고, 소광된 rkDNA-GO에 rkDNA와 상보적인 서열의 표적 핵산이 결합되면 형광이 회복되어 빠른 시간 내에 (30분 이내) 경제적이고 쉽게 유전서열에 대한 진단이 가능하며, 이를 유전자의 등온증폭방법과 함께 사용함으로써 이중-선택 과정 (RPA 반응 단계 및 rkDNA-GO 단계)에 의한 높은 민감도 및 선택성을 나타내므로, 이를 간단하고 신속한 진단 시스템으로 이용할 수 있다.

도 1은 RPA로 가공된 표적 서열과 rkDNA-GO의 반응에 의한 표적 핵산 검출 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 rkDNA 제작 과정 및 rkDNA-GO와 표적 핵산과의 반응으로 인한 형광 방출 기작을 나타낸 모식도이다.
도 3은 dUrkTP의 프라이머 연장을 PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다:
왼쪽 도: EtBr 염색 전;
오른쪽 도: EtBr 염색 후;
레인 1: 프라이머;
레인 2: 주형;
레인 3: 프라이머+주형;
레인 4: 프라이머+주형+DNA 폴리머레이즈 (dATP, dGTP, dCTP 및 dUrkTP 포함); 및
레인 5: 람다 뉴클리에이즈 처리한, 프라이머+주형+DNA 폴리머레이즈 (dATP, dGTP, dCTP 및 dUrkTP 포함).
도 4는 rkDNA를 소광하기 위한 GO의 최적 양을 확인한 도이다.
도 5는 RPA 방법으로 증폭한 N-SARS-CoV-2을 변성(denaturing) PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: RPA 역방향(Rev) 및 정방향(Fow) 프라이머로 N-SARS-CoV-2 및 N-SARS-CoV를 RPA한 결과:
레인 1: 1 nM의 N-SARS-CoV-2 + RPA-Rev 프라이머 + RPA-Fow 프라이머;
레인 2: 1 nM의 N-SARS-CoV-2 + RPA-Rev 프라이머 + RPA-Fow 프라이머 + RPA 효소 키트;
레인 3: 1 nM의 N-SARS-CoV + RPA-Rev 프라이머 + RPA-Fow 프라이머; 및
레인 4: N-SARS-CoV + RPA-Rev Primer + RPA-Fow Primer + RPA enzyme kit; 및
b: RPA 반응 생성물의 이중 가닥 (레인 1) 및 단일 가닥 (레인 2).
도 6은 1 nM의 표적 N-SARS-CoV-2 존재하의 RPA/rkDNA-GO 시스템의 형광 스펙트럼을 확인한 도이다.
도 7은 N-SARS-CoV-2의 검출 민감도 (a) 및 검출 한계(LOD) (b)를 나타낸 도이다.
도 8은 RPA/rkDNA-GO 시스템의 N-SARS-CoV-2에 대한 선택성을 확인한 도이다 (0.1 μM (1 mL)의 rkDNA 및 0.18 mg의 GO, pH 7.2):
a: N-SARS-CoV-2 또는 N-SARS-CoV에 대한 RPA/rkDNA-GO 시스템의 형광 스펙트럼 (여기 파장: 410 nm); 및
b: N-SARS-CoV-2 또는 N-SARS-CoV에 대한 RPA/rkDNA-GO 시스템의 선택성.
도 9는 표적 핵산의 농도(1 nM 및 1 fM)로 다양한 반응 시간 (20분 내지 120분) 동안 수행된 RPA 반응 산물의 형광 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 10은 RPA 반응을 1시간 동안 수행했을 때, 조합된 RPA/rkDNA-GO 프로빙 시스템의 N-SARS-CoV-2 검출에 대한 민감도를 나타낸 도이다:
a: N-SARS-CoV-2 (1 fM-1 aM) 존재하의 RPA/rkDNA-GO 프로빙 시스템의 형광 스펙트럼; 및
b: 형광 반응 (λ= 545 nm) 및 표적 N-SARS-CoV-2 (1 fM-1 aM) 농도의 로그 사이의 선형 관계 그래프.
도 11은 RPA 반응 시간이 1시간일 때, 1 fM N-SARS-CoV-2 및 1 fM N-SARS-CoV에 대한 조합된 RPA/rkDNA-GO 프로빙 시스템의 선택성을 나타내는 형광 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 12는 RPA 반응 시간이 1시간일 때, λem = 545 nm에서 형광 반응에 의해 결정된 1 fM N-SARS-CoV-2 및 1 fM N-SARS-CoV에 대한 조합된 RPA/rkDNA-GO 프로빙 시스템의 선택성을 나타낸 도이다 (여기 파장: 410 nm).

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.

본 발명에서 용어, "프로브"란 핵산과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

본 발명에서 용어, "시료(샘플)"는 대상 또는 환자로부터 얻은 조직, 세포, 혈액, 혈청, 소변, 타액, 혈장 또는 체액을 포함하며, 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

본 발명에서 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.

일 측면에서, 본 발명은 표적 핵산의 적어도 일부에 상보적인 프라이머, 형광 몰폴린 나프탈이미드 데옥시우리딘 뉴클레오타이드(fluorescent morpholine naphthalimide deoxyuridine nucleotide, dUrkTP), dATP, dCTP, dGTP, 중합효소, 엑소뉴클리에이즈(exonuclease) 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO)를 포함하는, 핵산 검출용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 중합효소는 엑소뉴클리에이즈 기능이 없고 DNA 치환 기능을 가지는 DNA 중합효소일 수 있으며, Vent (exo-) DNA 중합효소, Bst 중합효소, Klenow 절편(fragment) 및 Bsu DNA 중합효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, Vent (exo-) DNA 중합효소인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 RPA 수행을 위해, 표적 핵산의 적어도 일부에 상보적인 RPA(recombinase polymerase amplification) 프라이머 세트, dNTP 및 SSB(single-strand DNA binding protein) 및 재조합효소(Recombinase)를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 뉴클리에이즈를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 뉴클리에이즈는 3'-모노포스페이트(monophosphate)를 포함한 DNA에 특이적인 엑소뉴클리에이즈일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 질병 관련 핵산에 특이적인 rkDNA(표적 핵산, 즉, 특정 질병에 관련된 핵산의 적어도 일부에 상보적인 프로브 DNA) 및 그래핀 옥사이드를 포함하는, 질병 관련 핵산 검출용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, rkDNA 서열은 특정 질병 관련 DNA 또는 RNA를 표적으로 하여 설계될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA(표적 핵산, 즉, 코로나-19 바이러스의 적어도 일부에 상보적인 프로브 DNA) 및 그래핀 옥사이드를 포함하는, 코로나-19 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 RPA 수행을 위해, 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)의 적어도 일부에 상보적인 RPA 프라이머 세트, dNTP, SSB 및 재조합효소를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 코로나-19 바이러스의 적어도 일부에 상보적인 RPA 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함할 수 있고, 상기 역방향 프라이머는 5' 말단에 인산화될 수 있다.

일 구현예에서, 코로나-19 바이러스는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 코로나-19 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 코로나-19 바이러스 검출 키트에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 a) 표적 핵산을 등온 증폭하는 단계; b) 엑소뉴클리에이즈를 처리하여 단일가닥 핵산으로 만드는 단계; c) 표적 핵산에 특이적인 rkDNA-GO를 제작하는 단계; 및 d) 단계 b)의 단일가닥 핵산을 rkDNA-GO에 처리하는 단계를 포함하는, 핵산 검출 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 등온 증폭은 RPA(recombinase polymerase amplification) 방법으로 수행될 수 있으며, 표적 핵산의 적어도 일부에 상보적인 RPA 프라이머 세트, dNTP, SSB, 재조합효소 및 중합효소를 이용하여 등온 증폭될 수 있다.

일 구현예에서, 등온 증폭을 20분 내지 60분 수행할 수 있다.

일 구현예에서, rkDNA-GO는: ⅰ) 표적 핵산의 적어도 일부에 상보적인 프라이머와 표적 핵산을 결합시키는 단계; ⅱ) dUrkTP, dATP, dCTP, dGTP 및 중합효소를 이용하여 반응시키는 단계; ⅲ) 엑소뉴클리에이즈를 처리하는 단계; ⅳ) rkDNA를 정제하는 단계; 및 ⅴ) rkDNA에 그래핀 옥사이드를 혼합하는 단계를 포함하는 방법으로 제작될 수 있다.

일 구현예에서, rkDNA가 그래핀 옥사이드에 부착되어 rkDNA의 형광이 그래핀 옥사이드와의 상호작용에 의해 소광될 수 있다.

일 구현예에서, 단계 ⅴ)에서 rkDNA 1 μM 당 0.18 mg의 그래핀 옥사이드를 혼합하면 rkDNA의 형광을 그래핀 옥사이드로 소광시킬 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 a) 코로나-19 바이러스를 등온 증폭하는 단계; b) 엑소뉴클리에이즈를 처리하여 단일가닥 핵산으로 만드는 단계; c) 코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA-GO를 제작하는 단계; 및 d) 단계 b)의 단일가닥 핵산을 rkDNA-GO에 처리하는 단계를 포함하는, 코로나-19 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA-GO는 ⅰ) 코로나-19 바이러스의 적어도 일부에 상보적인 프라이머와 표적 핵산을 결합시키는 단계; ⅱ) dUrkTP, dATP, dCTP, dGTP 및 중합효소를 이용하여 반응시키는 단계; ⅲ) 엑소뉴클리에이즈를 처리하는 단계; ⅳ) rkDNA를 정제하는 단계; 및 ⅴ) rkDNA에 그래핀 옥사이드를 혼합하는 단계를 포함하는 방법으로 제작될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 코로나-19 바이러스를 검출하는 방법은 검출 시간이 총 1시간 미만으로 소요되며, 민감성은 LOD=6.0 aM이고 선택성은 차별 계수=114.5로 나타났다.

일 측면에서, 본 발명은 a) 검체로부터 분리된 시료를 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 이용하여 RPA 방법으로 등온 증폭하는 단계; b) 엑소뉴클리에이즈를 처리하여 단일가닥 핵산으로 만드는 단계; 및 c) 단계 b)의 단일가닥 핵산을 코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA-GO에 처리하여 형광을 확인하는 단계를 포함하는, 코로나-19 바이러스 감염증 진단에 관한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. rkDNA-GO 제작

1-1. rkDNA 제작

SARS-CoV-2 RNA의 뉴클레오캡시드 포스포단백질과 관련된 N-gene을 표적으로 하는 rkDNA 프로브 서열을 디자인한 뒤, Vent (exo-) DNA 폴리머레이즈 및 형광 몰폴린 나프탈이미드 데옥시우리딘 뉴클레오타이드(fluorescent morpholine naphthalimide deoxyuridine nucleotide, dUrkTP)를 이용하여 프라이머 연장(extension)을 수행하고, 람다 엑소뉴클리에이즈(Lambda exonuclease)로 절단하여 단일 가닥의 형광 DNA로서 rkDNA를 제작하였다. 구체적으로, 하기 표 1의 서열로 표시된 주형 가닥 (Pho: 5'-인산화된(phosphorylated) 말단) 및 이에 대한 프라이머를 95℃에서 가열하고 천천히 상온으로 냉각시킴으로써 어닐링하여 이중 가닥을 형성한 뒤, 형성된 이중 DNA(0.05mM) 6.5uL, 각각 2mM의 dUrkTP, dATP, dCTP 및 dGTP의 혼합물 5μL, Mg²⁺ 이온을 포함한 Vent (exo-) DNA 폴리머레이즈 완충 용액, 및 0.5μL의 Vent (exo-) DNA 폴리머레이즈 (2U/μL)를 혼합하여 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 그 후, 1.8μL의 10 x 람다 엑소뉴클리에이즈 완충액 및 1μL의 람다 엑소뉴클리에이즈 (5U/μL)를 첨가하여 37℃에서 20분 동안 반응시킴으로써 5'-인산염(5´-phosphate) 말단을 포함하는 주형을 분해하였다. 이 후, 이를 QIAquick 뉴클레오다이드 제거 키트로 정제하여 SARS-CoV-2 RNA에 특이적인 rkDNA를 제작하였다. 제작된 rkDNA를 확인하기 위해, PAGE를 수행한 결과, rkDNA가 젤 상에서 염색없이 형광 밴드로 주형 서열과 동일한 위치에 나타나, rkDNA가 성공적으로 합성된 것을 확인하였다 (도 3).

명칭	서열 (5'-> 3')	서열번호
프라이머	GCA TCA CCG CCA TTG	5
주형	Pho-G AAT GGC TGG CAA TGG CGG TGA TGC	6
rkDNA	GCA TCA CCG CCA TTG CCA GCC ANN C (N: Urk)	2
N-SARS-CoV-2	uuccuc aucacguagu cgcaacaguu caagaaauuc aacuccaggc agcaguaggg gaacuucucc ugcuagaaug gcuggcaaug gcggugaugc ugcucuugcu uugcugcugc uugacagauu gaac	1
N-SARS-CoV	cuccuc aucacguagu cgcgguaauu caagaaauuc aacuccuggc agcaguaggg gaaauucucc ugcucgaaug gcuagcggag guggugaaac ugcccucgcg cuauugcugc augacagauu gaac	7

1-2. rkDNA-GO 제작

FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 효과에 의해 rkDNA의 형광이 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO)에 의해 완전히 흡수되어 소광되게 하기 위한 GO의 최적 양을 PET으로 도출하여 rkDNA-GO를 제작하였다. 구체적으로, 100μL의 rkDNA를 빈 1.5mL 튜브에 넣은 뒤, 1mg/1mL GO 용액을 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10, 0.12, 0.14, 0.16 및 0.18mg 각각 첨가하고 물을 첨가하여 총 500uL가 되도록한 뒤, 2 x Trizma 완충액 (50mM Tris, 100mM NaCl, 20mM MgCl₂) 500uL를 첨가하여 1mL의 1 x Trizma 용액 조건이 되도록하였다. 상기 혼합물들을 각각 3분 동안 볼텍싱한 뒤, rkDNA의 형광이 GO에 흡수되도록 하기 위해 20분 동안 13000rpm으로 원심분리하였다. 그 후, 상등액만 취하여 형광 방출 스펙트럼(fluorescence emission spectra)을 측정하였다. 그 결과, 1 μM의 rkDNA는 0.18 mg의 GO에 의해 완전히 소광(quench)되는 것으로 확인되어 (도 4), 상기 조건을 이용하여 SARS-CoV-2 RNA에 대한 rkDNA-GO를 제작하였다.

실시예 2. RPA 방법을 이용한 표적 시료 가공

RPA(recombinase polymerase amplification)의 N-SARS-CoV-2 표적에 대한 반응성 및 선택성을 확인하기 위해, N-SARS-CoV에 대해서는 미스매치(mismatch)되는 염기를 가지면서, N-SARS-CoV-2만을 표적화하는 RPA 정방향 및 역방향 프라이머를 디자인하였다 (표 2). 구체적으로, Twist DX RPA 키트의 일반적인 절차에 따라, 재수화 완충액 29.5 μL을 1.5-mL 튜브에 넣고 dNTP (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 각각 8 mM)와 표 2 서열의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 각각 0.96 μM씩 첨가하였다. 그 후, 표적 시료로서, 표 1 서열의 N-SARS-CoV-2 및 N-SARS-CoV를 각각 튜브에 첨가하고 총 47.5 μL가 되도록 물을 첨가하였다. 이 후, 상기 용액을 TwistAmp Basic 반응 키트로 옮기고 파이펫으로 동결건조된 효소와 혼합하였다. 혼합한 혼합물을 1.5-mL 튜브로 옮기고 280 mM Mg(OAc)₂ (2.5 μL)를 첨가하여 4분 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 그 후 볼텍싱한 뒤 인큐베이터에서 16분 동안 인큐베이션하고, 5'-포스페이트 말단을 가지는 서열을 절단하기 위해 10x람다 뉴클리에이즈 완충액 5.7 μL 및 람다 뉴클리에이즈 (5U/μL) 1 μL를 첨가하여 37 ℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. N-SARS-CoV-2의 증폭을 변성 PAGE로 확인한 결과, N-SARS-CoV-2 표적과의 RPA 반응은 잘 일어났으나, N-SARS-CoV의 증폭은 일어나지 않은 것으로 나타났다 (도 5a). 이렇게 확인된 증폭된 표적 서열을 rkDNA-GO 시스템에 적용하기 위해서는 단일가닥으로 제작해야하기 때문에, 5'-포스페이트 말단을 가지는 서열을 인식하고 분해할 수 있는 람다 엑소뉴클리에이즈를 RPA 반응으로 제작된 상기 증폭된 이중 가닥에 처리하여 단일 가닥 DNA만 남겼다 (도 5b).

명칭	서열 (5'-> 3')	서열번호
RPA 정방향 프라이머	TTC CTC ATC ACG TAG TCG CAA CAG TTC AAG AAA TT	3
RPA 역방향 프라이머	Pho-GTT CAA TCT GTC AAG CAG CAG CAA AGC AAG AGC AG	4

실시예 3. 표적 검출 검증 및 검출 조건 최적화

N-SARS-CoV-2를 검출하기 위해 단일 가닥 RPA 증폭 산물을 rkDNA-GO 시스템에 첨가하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 RPA 키트로 증폭한 단일 가닥 표적 시료를 rkDNA 및 GO가 들어있는 튜브에 옮기고 물을 500 μL 첨가하고 2x Trizma 완충액 (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 20 mM MgCl₂; 500 μL)을 첨가하여 1 mL의 1x Trizma 용액이 되도록 하였다. 이를 3분 동안 볼텍싱한 뒤 17분 동안 원심분리하여 투명한 용액을 튜브에 옮겨 형광 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과, 1 nM의 N-SARS-CoV-2 존재하에 rkDNA-GO [0.1 μM의 rkDNA (1 mL)]의 형광 반응을 측정한 경우에는 형광이 현저히 증가가 관찰되지 않아, 표적 서열의 농도가 GO 표면의 rkDNA를 대체하기에 충분하지 않은 것으로 유추되었다. 이에, 더 많은 양의 표적을 얻도록, RPA 반응 동안 정방향 및 역방향 프라이머를 0.24 내지 1.2 μM로, dNTP의 양을 2 내지 10 mM로 증가시키고 형광 강도를 확인한 결과, 프라이머 및 뉴클레오타이드의 농도가 증가함에 따라 형광 강도가 현저하게 증가하였다 (도 6). rkDNA-GO 시스템이 rkDNA 자체 형광의 80% 이상 회복할 수 없으므로, 1 nM N-SARS-CoV-2의 검출을 위한 RPA 최적 조건을 0.96 μM의 프라이머 및 8 mM의 dNTP로 수립하였다.

실시예 4. 검출 한계 확인

최적 조건에서 표적 N-SARS-CoV-2의 농도 (1 nM 내지 1 fM)에 따른 검출 민감μ민감성(sensitivity)를 확인하고 3σ 방법으로 검출 한계 (limit of detection, LOD)를 결정한 결과, 검출 한계는 2.2 fM로 나타났다 (도 7). 상기 LOD는 rkDNA-GO 시스템 단독 (즉, RPA와 조합하지 않은 시스템)의 LOD에 비해 현저히 우수한 것으로 나타나, 조합된 RPA/rkDNA-GO 시스템이 검출 프로브로서 rkDNA-GO 시스템에 비해 현저히 효율적임을 확인할 수 있었다. 이와 같은 표적 핵산 (N-SARS-CoV-2)을 검출하는데 필요한 시간은 총 1시간 미만이었다.

실시예 5. 표적 선택성 확인

본 발명의 RPA/rkDNA-GO 시스템의 표적 선택성을 확인하기 위해, 표적인 N-SARS-CoV-2 (1 nM)과 미스매치 표적으로서 N-SARS-CoV (1 nM)에 대한 검출 선택성을 확인하였다. 그 결과, N-SARS-CoV-2 및 N-SARS-CoV를 이용하여 얻은 형광 강도 차이의 비율로 계산된 식별 계수(discrimination factor)가 6.75로 나타났다 (도 8).

즉, 상기와 같은 높은 선택성은 하기의 이중 선택 단계로 인해 나타냈다:

(i) 프라이머의 표적 서열과의 상호작용에 의한 RPA 시스템의 선택성 (도 5a); 및

(ii) RPA 시스템의 비특이적 증폭 산물에 대한 rkDNA-GO 시스템의 식별.

실시예 6. 포화점 확인

포화 RPA에 대한 반응 시간을 결정하기 위해, RPA 프라이머 및 뉴클레오타이드의 양을 고정하고 표적 N-SARS-CoV-2의 양 및 반응시간을 변경하여 RPA 반응의 포화점(saturation point)을 확인하였다. 구체적으로, N-SARS-CoV-2의 농도를 1 fM로 고정하고, 다양한 시간 (20분 내지 120분) 동안 RPA 반응을 수행하여 얻은 산물의 형광 스펙트럼들을 측정하고, 포화된 형광을 나타낸 (도 7) 1 nM의 표적 N-SARS-CoV-2을 이용하여 RPA 반응을 20분 수행하여 얻은 값과 비교하였다. 1 fM N-SARS-CoV-2 존재하에 RPA 반응을 수행한 결과, 60분 후에 포화 형광 신호가 나타났고 (도 9), 이는 1 nM의 표적 용액의 20분 RPA 반응 결과와 유사한 것으로 나타났다. 따라서, N-SARS-CoV-2의 농도가 1fM인 경우에도 충분한 양의 RPA 프라이머와 뉴클레오타이드를 이용하고 1시간의 RPA 반응 시간을 적용하면 충분히 강한 신호를 검출할 수 있었다.

실시예 7. 최적화 조건에서의 민감도 및 선택성 확인

상기 실시예로 수립한 최적화 조건에서 조합된 RPA/rkDNA-GO 프로빙 시스템의 민감도 및 선택성을 다시 확인하였다. 구체적으로, N-SARS-CoV-2 (1 fM-1 aM)의 존재하에 RPA 반응을 1시간 동안 수행하고 0.1 μM (1 mL)의 rkDNA 및 0.18 mg의 GO (pH 7.2)를 이용한 RPA/rkDNA-GO 시스템에서 민감도 및 선택성을 확인한 결과, 민감도가 다시 증가한 것으로 나타났으며 (도 10a), 1 fM의 N-SARS-CoV-2도 6.0 aM의 LOD로 명확하게 검출할 수 있었다 (도 10b). 또한, 미스매치 표적 N-SARS-CoV를 이용하여 선택성을 확인한 결과, 조합된 RPA/rkDNA-GO 프로빙 시스템이 더 긴 RPA 반응 시간 후에 현저히 더 높은 선택성 (차별 계수 114.5)을 나타냈다 (도 11 및 도 12).

이와 같은 현저히 더 높은 선택성은 이중-선택 과정 (RPA 반응 단계 및 rkDNA-GO 단계)에 의해 발생하므로, RPA와 rkDNA-GO 시스템의 조합에 의해 간단한 방법으로 매우 높은 선택성 및 민감도로 N-SARS-CoV2의 검출이 가능하다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION JEONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> METHOD FOR DETECTING NUCLEIC ACID <130> P-2021-003 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 130 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-SARS-CoV-2 <400> 1 uuccucauca cguagucgca acaguucaag aaauucaacu ccaggcagca guaggggaac 60 uucuccugcu agaauggcug gcaauggcgg ugaugcugcu cuugcuuugc ugcugcuuga 120 cagauugaac 130 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rkDNA-N-SARS-CoV-2 <400> 2 gcatcaccgc cattgccagc cannc 25 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-SARS-CoV-2-RPA forward primer <400> 3 ttcctcatca cgtagtcgca acagttcaag aaatt 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-SARS-CoV-2-RPA reverse primer <400> 4 gttcaatctg tcaagcagca gcaaagcaag agcag 35 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-SARS-CoV-2-rkDNA primer <400> 5 gcatcaccgc cattg 15 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-SARS-CoV-2-rkDNA template <400> 6 gaatggctgg caatggcggt gatgc 25 <210> 7 <211> 130 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-SARS-CoV <400> 7 cuccucauca cguagucgcg guaauucaag aaauucaacu ccuggcagca guaggggaaa 60 uucuccugcu cgaauggcua gcggaggugg ugaaacugcc cucgcgcuau ugcugcauga 120 cagauugaac 130

Claims

표적 핵산의 적어도 일부에 상보적인 프라이머, 형광 몰폴린 나프탈이미드 데옥시우리딘 뉴클레오타이드(fluorescent morpholine naphthalimide deoxyuridine nucleotide, dUrkTP), dATP, dCTP, dGTP, 중합효소(polymerase), 엑소뉴클리에이즈(exonuclease) 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO)를 포함하는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 표적 핵산의 적어도 일부에 상보적인 RPA(recombinase polymerase amplification) 프라이머 세트, dNTP 및 SSB(single-strand DNA binding protein) 및 재조합효소(Recombinase)를 추가로 포함하는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 중합효소는 엑소뉴클리에이즈 기능이 없고 DNA 치환 기능을 가지는 DNA 중합효소인, 핵산 검출용 조성물.
제 3항에 있어서, 중합효소는 Vent (exo-) DNA 중합효소, Bst 중합효소, Klenow 절편(fragment) 및 Bsu DNA 중합효소로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 핵산 검출용 조성물.
코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA 및 그래핀 옥사이드를 포함하는, 코로나-19 바이러스 검출용 조성물로서,
상기 코로나-19 바이러스는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인 조성물.
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제 5항에 있어서, 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)의 적어도 일부에 상보적인 RPA 프라이머 세트, dNTP, SSB 및 재조합효소를 추가로 포함하는, 코로나-19 바이러스 검출용 조성물.
제 8항에 있어서, 코로나-19 바이러스의 적어도 일부에 상보적인 RPA 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는, 코로나-19 바이러스 검출용 조성물.
제 5항의 코로나-19 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 코로나-19 바이러스 검출 키트.
a) 표적 핵산을 등온 증폭하는 단계;
b) 엑소뉴클리에이즈를 처리하여 단일가닥 핵산으로 만드는 단계;
c) 표적 핵산에 특이적인 rkDNA-GO를 제작하는 단계; 및
d) 단계 b)의 단일가닥 핵산을 rkDNA-GO에 처리하는 단계를 포함하는, 핵산 검출 방법.
제 11항에 있어서, 등온 증폭은 RPA 방법으로 수행되는, 핵산 검출 방법.
제 11항에 있어서, 등온 증폭을 20분 내지 60분 수행하는, 핵산 검출 방법.
제 11항에 있어서, rkDNA-GO는 하기의 단계를 포함하는 방법으로 제작하는, 핵산 검출 방법:
ⅰ) 표적 핵산의 적어도 일부에 상보적인 프라이머와 표적 핵산을 결합시키는 단계;
ⅱ) dUrkTP, dATP, dCTP, dGTP 및 중합효소를 이용하여 반응시키는 단계;
ⅲ) 엑소뉴클리에이즈를 처리하는 단계;
ⅳ) rkDNA를 정제하는 단계; 및
ⅴ) rkDNA에 그래핀 옥사이드를 혼합하는 단계.
제 14항에 있어서, 중합효소는 엑소뉴클리에이즈 기능이 없고 DNA 치환 기능을 가지는 DNA 중합효소인, 핵산 검출 방법.
제 14항에 있어서, 단계 ⅴ)에서 rkDNA 1 μM 당 0.18 mg의 그래핀 옥사이드를 혼합하는, 핵산 검출 방법.
a) 코로나-19 바이러스를 등온 증폭하는 단계;
b) 엑소뉴클리에이즈를 처리하여 단일가닥 핵산으로 만드는 단계;
c) 코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA-GO를 제작하는 단계; 및
d) 단계 b)의 단일가닥 핵산을 rkDNA-GO에 처리하는 단계를 포함하는, 코로나-19 바이러스를 검출하는 방법.
제 17항에 있어서, 코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA-GO는 하기의 단계를 포함하는 방법으로 제작하는, 코로나-19 바이러스를 검출하는 방법:
ⅰ) 코로나-19 바이러스의 적어도 일부에 상보적인 프라이머와 표적 핵산을 결합시키는 단계;
ⅱ) dUrkTP, dATP, dCTP, dGTP 및 중합효소를 이용하여 반응시키는 단계;
ⅲ) 엑소뉴클리에이즈를 처리하는 단계;
ⅳ) rkDNA를 정제하는 단계; 및
ⅴ) rkDNA에 그래핀 옥사이드를 혼합하는 단계.
제 18항에 있어서, rkDNA는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 코로나-19 바이러스를 검출하는 방법.
a) 검체로부터 분리된 시료를 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 이용하여 RPA 방법으로 등온 증폭하는 단계;
b) 엑소뉴클리에이즈를 처리하여 단일가닥 핵산으로 만드는 단계; 및
c) 단계 b)의 단일가닥 핵산을 코로나-19 바이러스에 특이적인 rkDNA-GO에 처리하여 형광을 확인하는 단계를 포함하는, 코로나-19 바이러스 감염증 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.