KR102511155B1

KR102511155B1 - SPF(specific pathogen free) 넙치 판정을 위한 감염성 기생충 검출 및 판별 방법

Info

Publication number: KR102511155B1
Application number: KR1020210042020A
Authority: KR
Inventors: 민은영; 조미영; 최혜승; 김명석; 김아란
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2023-03-17
Also published as: KR20220135829A

Abstract

넙치(Paralichthys olivaceus) 감염성 병원체 12종에 대한 검출용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 넙치에서 감염병을 일으키는 4종의 세균, 4종의 기생충 및 4종의 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 PNA 프로브를 함유하는 리얼타임 PCR용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 넙치의 주요 질병 병원체인 세균 4종, 바이러스 4종, 기생충 4종을 리얼타임 PCR 장비를 이용하여 3시간 이내에 검출할 수 있어, 넙치 병원체에 대해 조기 진단이 가능하고, 감염 및 확산을 빠르게 차단할 수 있는 효과가 있다.

Description

SPF(specific pathogen free) 넙치 판정을 위한 감염성 기생충 검출 및 판별 방법{Methods for Identification and Discrimination of Infectious Parasitic Pathogens in SPF Flounder(Paralichthys olivaceus)}

넙치(Paralichthys olivaceus) 감염성 병원체 12종에 대한 검출용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 넙치에서 감염병을 일으키는 4종의 세균, 4종의 기생충 및 4종의 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 PNA 프로브를 함유하는 리얼타임 PCR용 조성물에 관한 것이다.

한국의 1인당 연간 수산물 소비량(2013~2015년 기준)은 25.4kg으로 세계 주요국 중 1위일 정도로 높아 현재뿐만 아니라 미래 식량 자원의 확보 측면에 있어서도 양식업은 중요한 사업이다. 2018년 국내 양식 어류의 생산량은 80,485톤(928,676,818천원)으로 이 중 넙치가 37,267톤(전체 생산량의 46.3%)으로 가장 많은 생산량을 차지하고 있다 (어업생산통계, 통계청, 2018). 반면 양식 어류의 병원체 검출률은 매년 지속해서 증가하는 추세이며, 양식어류의 질병에 의한 폐사는 연간 피해액이 700억 원대에 이를 정도로 가장 큰 문제로 자리 잡고 있다.

특히, 국내 양식 넙치의 경우, 연중 생산량의 약 30%(1.2만여 톤 이상)이 질병으로 인한 피해가 발생할 것으로 추정하고 있으며, 넙치에서 많이 발생하는 질병은 세균성, 기생충성 및 바이러스성 질병으로 분류할 수 있다. 원인별로는 기생충성 질병인 스쿠티카병(44.5%), 여윔증(12%), 바이러스성 질병인 바이러스성출혈성패혈증(16.6%), 세균성 질병으로 연쇄구균병(9.8%) 순으로 확인되고 있다(양식생물 폐사 동향 조사 및 활어수송용 소독장치 효과 검증 연구, 국립수산과학원 용역, 2018). 이 외에 바이러스성 질병인 바이러스성출혈성패혈증(VHS), 마린버나바이러스병(MABVD), 바이러스성뇌망막증(VER), 넙치랍도바이러스병(HIRRV), 세균성 질병인 활주세균병, 에드워드병, 비브리오병, 기생충성 질병인 쿠도아 등에 의한 점액포자충성 질병에 의한 피해도 상당하다. 특히 연쇄구균병 (Streptococcosis)은 어류의 패혈증을 유발하는 질병으로, 원인균은 Streptococcus parauberis, Streptococcus iniae, Lactococcus garviae 종으로 전 세계 지역의 제한 없이 어류에 발병하여 심각한 피해를 주고 있다.

질병에 감염된 수산생물 또는 유입수(해수)에 존재하는 병원체가 양식장 내로 유입되어 양식생물에 질병을 전파하거나 이와 반대로 질병에 걸린 양식생물 및 병원체가 포함된 배출수가 자연수계로 유입됨에 따라 자연수계 수산생물에 질병을 전파할 가능성이 있다. 따라서 수산생물 질병의 확산 방지 및 양식업 보호를 위해서라도 질병 병원체의 정확한 진단 및 질병 모니터링은 꼭 필요한 작업이다. 이러한 상황에서 질병의 전파 및 확산을 막기 위해서는 병원체의 빠른 검출 및 특이도가 높은 진단 제품이 필요하다.

현재 국내에서 수산생물 질병을 진단하기 위해서는 기본적으로 임상 증상을 관찰한 이후 기생충성 질병은 생검 표본을 통한 광학현미경 검사, 세균성 질병은 TSA 또는 BHIA 배지 등을 이용하여 1~3일 배양한 후 API kit 또는 PCR을 이용한 종 동정 결과를 바탕으로 진단하고, 바이러스성 질병의 경우는 질병 발생 어류의 표적 장기를 적출하여 PCR 또는 RT-PCR 방법으로 진단하고 있다. PCR 분석으로 병원체 확인이 명확하지 않았을 때는 증폭된 PCR 산물에 대해 유전자 염기서열 분석법(Sanger sequencing)을 진행하여 확인하는 검증단계를 거쳐야 한다. 이러한 검증은 추가 분석으로 많은 시간과 인력을 추가로 투입해야 하는 단점이 있다. 특히 수산생물 병원체의 경우에는 데이터베이스가 많지 않아 정확도가 떨어지는 단점이 있다. 이러한 검출 시간 소요 및 낮은 민감도와 같은 단점을 보완하기 위해서 최근 새로운 분자진단 방법으로 real-time PCR(실시간 유전자증폭)법이 도입되어 많은 분야에서 적용되고 있다. 실시간 유전자증폭에서 주로 사용되고 있는 TaqMan 프로브는 구조적으로 hydrolysis method 방법으로 형광 값을 띄는 특징을 가지고 있어, 프로브 내 유전자 염기서열의 변이와 양성 대조군의 혼합 시, 그 사실 여부를 판단할 수 없는 단점이 있다. 따라서 검사의 신속성과 비용의 절감과 더불어 유전자 오염으로 인한 오진 가능성을 최소화하는 등, 검사의 정확성을 높일 수 있는 기술이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 넙치에 발병하는 대표적인 질병 12종(세균성 질병 4종, 바이러스성 질병 4종, 기생충성 질병 4종)을 신속하고 정확히 동시에 검출하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 세균, 바이러스, 기생충 각각 4종의 특이적 프라이머, PNA 프로브를 이용함으로써, 병원체 개별 또는 혼합 시료 내 다른 종의 간섭을 방지할 수 있으며, 신속·정확하게 판별·검출할 수 있는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 넙치에서 발생하는 감염병의 병원체를 동시에 검출 및 진단할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 넙치에서 발생하는 감염병의 병원체를 동시에 검출 및 진단할 수 있는 조성물 유효성분으로 포함하는 넙치 감염병 병원체의 동시 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 넙치에서 발생하는 감염병의 병원체를 동시에 검출 및 진단할 수 있는 조성물을 이용한 넙치 감염병 병원체의 동시 진단 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 35 및 서열번호 38로 표시되는 PNA 프로브를 포함하는 넙치 감염병 병원체 기생충 쿠도아 셉템펑타타(Kudoa septempunctata), 파비캡슐라 아니소카우다타(Parvicapsula anisocaudata), 엔테로믹슘 레이(Enteromyxum leei) 및 엔테로믹슘 스코프탈미(Enteromyxum scophthalmi)에 대한 동시검출 또는 동시 진단을 위한 리얼타임 PCR용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 리얼타임 PCR용 조성물을 포함하는 넙치 감염병 병원체의 동시 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 리얼타임 PCR용 조성물을 이용한 넙치 감염병 병원체의 동시 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 넙치의 주요 질병 병원체인 세균 4종, 바이러스 4종, 기생충 4종을 리얼타임 PCR 장비를 이용하여 3시간 이내에 검출할 수 있어, 넙치 병원체에 대해 조기 진단이 가능하고, 감염 및 확산을 빠르게 차단할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 쌍을 이용한 비대칭 PCR 단계, PNA 프로브와의 혼성화 단계 및 혼성화 산물이 융해되는 단계를 나타낸 개념도이다.
도 2는 본 발명에 따른 실험을 진행하는 경우 유전자 염기서열에 따라서 융해온도 차이가 나타나는 이유를 설명하기 위한 개념도이다.
도 3은 서열번호 9 내지 14의 염기서열로 표시되는 FAM과 HEX 파장의 PNA 프로브가 각각 이에 상보적으로 결합하는 서열과 혼성화된 후 융해되는 과정에서 융해 곡선의 피크 및 융해온도를 확인하여 세균 종 검출에 적합한 프로브를 선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 서열번호 15 내지 20의 염기서열로 표시되는 TxR과 Cy5 파장의 PNA 프로브가 각각 이에 상보적으로 결합하는 서열과 혼성화된 후 융해되는 과정에서 융해 곡선의 피크 및 융해온도를 확인하여 세균 종 검출에 적합한 프로브를 선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 서열번호 29 내지 34의 염기서열로 표시되는 FAM과 HEX 파장의 PNA 프로브가 각각 이에 상보적으로 결합하는 서열과 혼성화된 후 융해되는 과정에서 융해 곡선의 피크 및 융해온도를 확인하여 기생충 종 검출에 적합한 프로브를 선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 서열번호 35 내지 40의 염기서열로 표시되는 TxR과 Cy5 파장의 PNA 프로브가 각각 이에 상보적으로 결합하는 서열과 혼성화된 후 융해되는 과정에서 융해 곡선의 피크 및 융해온도를 확인하여 기생충 종 검출에 적합한 프로브를 선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 서열번호 49 내지 54의 염기서열로 표시되는 FAM과 HEX 파장의 PNA 프로브가 각각 이에 상보적으로 결합하는 서열과 혼성화된 후 융해되는 과정에서 융해 곡선의 피크 및 융해온도를 확인하여 바이러스 종 검출에 적합한 프로브를 선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 서열번호 55 내지 60의 염기서열로 표시되는 TxR과 Cy5 파장의 PNA 프로브가 각각 이에 상보적으로 결합하는 서열과 혼성화된 후 융해되는 과정에서 융해 곡선의 피크 및 융해온도를 확인하여 바이러스 종 검출에 적합한 프로브를 선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 선별 과정을 통해서 최종적으로 선별된 PNA 프로브를 보여준 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 세균, 바이러스, 기생충 진단 키트들이 서로 오진의 가능성이 없는지 확인하기 위해 교차 반응을 통해서 확인한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 넙치에 발생하는 주요 질병의 감염성 병원체인 세균 4종(Edwardsiella tarda, Lactococcus garviae, Streptococcus parauberis, Flexibacter maritimus), 기생충 4종(점액포자충; Kudoa septempunctata, Parvicapsula anisocaudata, Enteromyxum leei, Enteromyxum scophthalmi) 및 바이러스 4종(바이러스성출혈성패혈증(VHSV, Viral Hemorrhagic Septicemia Virus), 마린버나바이러스(MBV, Marine Birnavirus), 바이러스성신경괴사증 바이러스(VNNV, Viral Nervous Necrosis Virus), 넙치랍도바이러스(HIRRV, Hirame Rhabdovirus)을 신속하게 개별 또는 혼합 시료 내 다른 종의 간섭을 방지하면서 동시에 진단하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 12종의 병원체에 대한 검출용 프라이머 쌍과 PNA 프로브를 이용한 real-time PCR법을 개발하고, 병원체 종마다 서로 다른 형광의 증폭 및 융해 곡선을 나타내게 함으로써 신속·정확하게 판별·검출할 수 있는 효과가 있음을 확인하고자 하였다.

넙치의 주요 감염성 병원체 12 종

분류	종명
세균	Edwardsiella tarda
	Lactococcus garveiae
	Streptococcus parauberis
	Flexibacter maritimus
바이러스	MBV
	VNNV
	HRV
	VHSV
기생충	Kudoa septempunctata
	Parvicapsula anisocaudata
	Enteromyxum leei
	Enteromyxum scophthalmi

Real-time PCR법은 PCR법에 의한 유전자 증폭 이후 gel-loading으로 인한 소요 시간을 절약하고, 종래 유전자 마커에 따른 PCR 산물의 특이 또는 비특이적 증폭 여부를 gel-loading과 시퀀싱 단계 없이 또는 시퀀싱 단계 전에 검출하기 위한 대안으로, 새로운 유전자 마커 및 이에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 개발하게 되었다.

더욱 상세하게 설명하면 real-time PCR은 검출용 프라이머 쌍들과 유전자 검출용 PNA 프로브들을 포함하는 올리고머 혼합물 및 상기 프라이머를 이용하여 생성된 증폭 산물을 주형으로 단일 가닥 DNA를 생성하고 상기 단일 가닥에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키기 위한 버퍼(buffer)를 포함하는 검출할 수 있는 조성물 또는 키트를 개발하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15 및 서열번호 18로 표시되는 PNA 프로브를 포함하는 넙치 감염병 병원체 세균 플렉시박터 마리티머스(Flexibacter maritimus), 락토코커스 가비애(Lactococcus garviae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 및 에드워드시엘라 탈다(Edwardsiella tarda)에 대한 동시검출 또는 동시 진단을 위한 리얼타임 PCR용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광물질이 결합할 수 있으며, 상기 PNA 프로브에 결합하는 리포터는 서로 각기 다른 리포터인 것이 바람직하며, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는, 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는, 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 리얼타임 PCR용 조성물은 각 병원체의 타겟 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1 ~ 8로 표기되는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 35 및 서열번호 38로 표시되는 PNA 프로브를 포함하는 넙치 감염병 병원체 기생충 쿠도아 셉템펑타타(Kudoa septempunctata), 파비캡슐라 아니소카우다타(Parvicapsula anisocaudata), 엔테로믹슘 레이(Enteromyxum leei) 및 엔테로믹슘 스코프탈미(Enteromyxum scophthalmi)에 대한 동시검출 또는 동시 진단을 위한 리얼타임 PCR용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광물질이 결합할 수 있ㅇ으며, 상기 PNA 프로브에 결합하는 리포터는 서로 각기 다른 리포터인 것이 바람직하며, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는, 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는, 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 리얼타임 PCR용 조성물은 각 병원체의 타겟 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 21 ~ 28로 표기되는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 49, 서열번호 52, 서열번호 55 및 서열번호 58로 표시되는 PNA 프로브를 포함하는 넙치 감염병 병원체 바이러스인 바이러스성출혈성패혈증(VHSV, Viral Hemorrhagic Septicemia Virus), 마린버나바이러스(MBV, Marine Birnavirus), 바이러스성신경괴사증 바이러스(VNNV, Viral Nervous Necrosis Virus) 및 넙치랍도바이러스(HIRRV, Hirame Rhabdovirus)에 대한 동시검출 또는 동시 진단을 위한 리얼타임 PCR용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 리얼타임 PCR용 조성물은 각 병원체의 타겟 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 41 ~ 48로 표기되는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 49, 서열번호 52, 서열번호 55 및 서열번호 58로 표시되는 PNA 프로브를 포함하는 넙치에 발생하는 12종의 병원체인 세균성 병원체인 플렉시박터 마리티머스(Flexibacter maritimus), 락토코커스 가비애(Lactococcus garviae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 및 에드워드시엘라 탈다(Edwardsiella tarda)와 기생충성 병원체인 쿠도아 셉템펑타타(Kudoa septempunctata), 파비캡슐라 아니소카우다타(Parvicapsula anisocaudata), 엔테로믹슘 레이(Enteromyxum leei) 및 엔테로믹슘 스코프탈미(Enteromyxum scophthalmi)와 바이러스성 병원체인 바이러스성출혈성패혈증(VHSV, Viral Hemorrhagic Septicemia Virus), 마린버나바이러스(MBV, Marine Birnavirus), 바이러스성신경괴사증 바이러스(VNNV, Viral Nervous Necrosis Virus) 및 넙치랍도바이러스(HIRRV, Hirame Rhabdovirus)에 대한 동시검출 및 진단을 목적으로 하는 Real-time multiplex PCR 검출 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.

상기 리얼타임 PCR용 조성물은 각 병원체의 타겟 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함할 수 있으며, 세균 검출을 위한 서열번호 1 ~ 8로 표기되는 프라이머, 기생충 검출을 위한 서열번호 21 ~ 28로 표기되는 프라이머 및 바이러스 검출을 위한 서열번호 41 ~ 48로 표기되는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 리얼타임 PCR용 조성물을 포함하는 넙치 감염병 병원체의 동시 진단용 키트에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 리얼타임 PCR용 조성물을 이용한 넙치 감염병 병원체의 동시 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는, 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는, 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.

펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)이란 핵산 염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로, 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었으며, 자연계에서는 발견되지 않아 화학적인 방법으로 인공 합성될 수 있다.

본 발명에서 "검체" 또는 "시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물 시료(biosample)를 분석한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 기재된 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 세균에 감염된 개체(예컨대, 넙치 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 세균(박테리아) 및 바이러스 기원의 생물 시료가 분석될 수 있다. 동물 시료일 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물 시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물 시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 ‘표적 핵산', ‘합성 DNA' 또는 ‘인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리·생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 ‘표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

본 발명의 ‘혼성화'는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융해 곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해 곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(염기변이 또는 SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.

본 발명의 ‘염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해 곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.

본 발명의 융해 곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 따라 행해지기 때문에, 융해 곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 시행하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.

본 발명의 형광 융해 곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해 곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해 곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터킬레이팅 형광물질일 수 있다.

본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해 곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열(염기변이, SNP 포함)의 유무로 세균 검출 및 변이 판별이 가능하다.

본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합 효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 시행하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합 효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 게시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 해당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 유전자 분석을 통한 주요 병원체 12종에 대한 검출용 유전자 마커 및 특이적인 프라이머 및 프로브 제작

넙치의 주요 병원체 12종을 검출하기 위한 특이적 유전자 마커를 도출하기 위하여, 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열을 가지고 분석을 공통서열(consensus)로 제작하여 유전자 분석을 진행하였다. 종별로 분석한 타겟 유전자(target gene)는 표 3에 표기하였다.

넙치 주요 병원체 12종 및 타겟 유전자

분류	종명	타겟 유전자
세균	Edwardsiella tarda	etfD
	Lactococcus garveiae	16S rDNA
	Streptococcus parauberis	23S rDNA
	Flexibacter maritimus	16S rDNA
바이러스	MBV	VP2N
	VNNV	RdRp
	HRV	N gene
	VHSV	N gene
기생충	Kudoa septempunctata	28S rDNA
	Parvicapsula anisocaudata	18S rDNA
	Enteromyxum leei	18S rDNA
	Enteromyxum scophthalmi	18S rDNA

표 2에 나타낸 각각의 병원체의 타겟 유전자를 증폭하기 위한 프라이머와 상기 프라이머를 사용하여 증폭된 타겟 유전자 단편을 검출할 수 있는 PNA 프로브를 각 타겟 유전자에 대하여 3 종류 씩 제작하였다.

상기 PNA 프로브의 말단에는 리포터와 소광자가 결합되어 있으며, PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법으로 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다. 표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.

본 실시예에서 제작한 프로브와 프라이머는 표 3~5에 나타내었다.

종	구분	서열번호	서열(5' -> 3')	타겟
세균	프라이머	서열번호1	TGTAGCTTGCTACAGATGA	F. maritimus
		서열번호2	ACGCATAGTCATCTTCTACCG	F. maritimus
		서열번호3	GGCAACCCTGACCGAGCAA	L. garvieae
		서열번호4	GTTAGATACCGTCACTTAAGT	L. garvieae
		서열번호5	TTTCGTCTGAGGCAATGTTG	S. parauberis
		서열번호6	GCTTCATATATCGCTATACT	S. parauberis
		서열번호7	GGTAACCTGATTTGGCGTTC	E. tarda
		서열번호8	GGATCACCTGGATCTTATCC	E. tarda
	PNA프로브	서열번호9	Dabcyl-AAGATTAATACCTCATAA-O-K (FAM)	F. maritimus
		서열번호10	Dabcyl-GCGCACGGGTGCG-O-K (FAM)	F. maritimus
		서열번호11	Dabcyl-CGCGTATAGAATC-O-K (FAM)	F. maritimus
		서열번호12	Dabcyl-ACGTTAAGTAGAGT-O-K (HEX)	L. garvieae
		서열번호13	Dabcyl-GAGTGAAGAAGG-O-K (HEX)	L. garvieae
		서열번호14	Dabcyl-TTCGGATCGTAA-O-K (HEX)	L. garvieae
		서열번호15	Dabcyl-AAATCAATCGTAGAGT-O-K (TxR)	S. parauberis
		서열번호16	Dabcyl-GGGCTTAGTGATCC-O-K (TxR)	S. parauberis
		서열번호17	Dabcyl-TACCCTGGGGAT-O-K (TxR)	S. parauberis
		서열번호18	Dabcyl-TGGGGTTTCGATCA-O-K (Cy5)	E. tarda
		서열번호19	Dabcyl-GAGAGCACGCCT-O-K (Cy5)	E. tarda
		서열번호20	Dabcyl-CGCCGCCGGCGG-O-K (Cy5)	E. tarda

종	구분	서열번호	서열(5' -> 3')	타겟
기생충	프라이머	서열번호21	GTGTGTGATCAGACTTGATATG	K. septempunctata
		서열번호22	AAGCCAAAACTGCTGGCCATTT
		서열번호23	CGATAGCAGAACGCCGG	P. anisocaudata
		서열번호24	GAGCAGGCCTGCTCTAACATGTA
		서열번호25	GTAGCTTGGTACGAATATCGG	E. leei
		서열번호26	TTCCCGGAGAAGCCAACGTAT
		서열번호27	GATGTGTCAGTATCTTACGCAAGT	E. scophthalmi
		서열번호28	GTCCCTTTTAATCGAGACCAAG
	PNA 프로브	서열번호29	Dabcyl-CGGCTCAAACTCATTT-O-K (FAM)	K. septempunctata
		서열번호30	Dabcyl-GAGTGGAATGTGAGTTT-O-K (FAM)	K. septempunctata
		서열번호31	Dabcyl-CATTTCAAATGAGA-O-K (FAM)	K. septempunctata
		서열번호32	Dabcyl-CAAGTCCCGGCTGT-O-K (HEX)	P. anisocaudata
		서열번호33	Dabcyl-CCGGCTGTGGGCT-O-K (HEX)	P. anisocaudata
		서열번호34	Dabcyl-GTGGCCGGTCGCTT-O-K (HEX)	P. anisocaudata
		서열번호35	Dabcyl-TTTTGGATTGGTGTCTA-O-K (TxR)	E. leei
		서열번호36	Dabcyl-CGAATATCGGTGACGCC-O-K (TxR)	E. leei
		서열번호37	Dabcyl-AACGAAGGTTGG-O-K (TxR)	E. leei
		서열번호38	Dabcyl-TGTAGATGGTCACTTG-O-K (Cy5)	E. scophthalmi
		서열번호39	Dabcyl-AAATTAAGTTTTT-O-K (Cy5)	E. scophthalmi
		서열번호40	Dabcyl-GACCAGTTCTTTTTAT-O-K (Cy5)	E. scophthalmi

종	구분	서열번호	서열(5'-> 3')	타겟
바이러스	프라이머	서열번호41	CCCGGATGAGGTGCACAG	MBV
		서열번호42	AGTCGAGCTGGAAGTCGTAC	MBV
		서열번호43	GTCGTATTGCTGGTCCGCA	VNNV
		서열번호44	GCCCGCTGTAACGGCTTG	VNNV
		서열번호45	CTCGGATTGGGGCAGCG	HRV
		서열번호46	CTCATGGCACAAAGGGCCTT	HRV
		서열번호47	GCAGGATGTGTGCGTCC	VHSV
		서열번호48	CCCAGGTTGTTGGCGGC	VHSV
	PNA 프로브	서열번호49	Dabcyl-GACATCAGCTTCAGAC-O-K (FAM)	MBV
		서열번호50	Dabcyl-GCACCACGAAGGTA-O-K (FAM)	MBV
		서열번호51	Dabcyl-CGACTGGGACCCTC-O-K (FAM)	MBV
		서열번호52	Dabcyl-CCCCTCACGTATGTCG-O-K (HEX)	VNNV
		서열번호53	Dabcyl-AAACTGCTGTATTT-O-K (HEX)	VNNV
		서열번호54	Dabcyl-CGCTCCTGGACCG-O-K (HEX)	VNNV
		서열번호55	Dabcyl-ATCCCGCCACTGCT-O-K (TxR)	HRV
		서열번호56	Dabcyl-GGATCATTCTTATCAACC-O-K (TxR)	HRV
		서열번호57	Dabcyl-GGTAAGACCGGG-O-K (TxR)	HRV
		서열번호58	Dabcyl-GGAATGACCATGAT-O-K (Cy5)	VHSV
		서열번호59	Dabcyl-CCCTTGACTGGG-O-K (Cy5)	VHSV
		서열번호60	Dabcyl-GGTCAGGATGAA-O-K (Cy5)	VHSV

실시예 2: 각 병원체에 대한 검출성능 확인

실시예 1에서 디자인된 프라이머와 PNA 프로브와 각 병원체, 병원체를 포함하는 시료, 병원체 염기서열을 포함하는 양성체를 이용하여 실험을 진행하였다.

본 실험에 사용된 12종 병원체의 입수처는 표 6에 나타내었으며, 각 병원체의 시료 처리방법은 다음과 같다.

분류	종명	입수처	비고 (균주번호 등)
세균	Edwardsiella tarda	국립수산과학원 한국수산미생물자원은행	FP 5060
	Lactococcus garveiae		FP 5245
	Streptococcus parauberis		FP 3287
	Flexibacter maritimus		FBSSt 200001
기생충	Kudoa septempunctata	국립수산과학원 병리연구과	제주도 양식 넙치 조직시료
	Parvicapsula anisocaudata	국립수산과학원 병리연구과	제주도 양식 넙치 조직시료
	Enteromyxum leei	합성 양성체	-
	Enteromyxum scophthalmi	합성 양성체	-
바이러스	MBV	합성 양성체	-
	VNNV	국립수산과학원 병리연구과	FVST 200009
	HRV		FVST 200007
	VHSV		FVST 200008

4종의 세균 중 Lactococcus garvieae, Streptococcus parauberis 및 Edwardsiella tarda) 균주는 국립수산과학원 한국수산미생물자원은행에 보유 중인 자원을 사용하였다. 각 세균을 1.5%(v/v) NaCl이 첨가된 BHIB (Brain heart infusion agar) 배지에 접종한 후, 27℃에서 24시간 배양하였다. 그 다음, 배양된 평판배지의 집락을 무균적으로 1.5% NaCl이 첨가된 BHIB에 접종 후 교반 배양기(JS Research Inc.)에서 150rpm, 27℃로 48시간 동안 배양하였다. 배양된 균액은 12,000 RCF로 원심분리한 다음, 멸균 생리 식염수로 3회 세척한 후 균체를 수거하고 최종적으로 습균체를 실험구에 따라 농도에 맞게 현탁하여 실험에 사용하였다. Flexibacter maritimus는 염기서열 정보를 수집한 후 유전자를 합성하여 프라이머와 프로브의 염기서열을 포함하는 양성체를 주문제작한 후 사용하였다.

4종의 기생충 중 Kudoa septempunctata, Parvicapsula anisocaudata의 경우, 넙치 병어로부터 감염부위의 조직(신장, 방광, 장, 근육)의 일부에서 DNA를 추출한 후 실험에 사용하였으며, Enteromyxum leei, Enteromyxum scophthalmi는 염기서열 정보를 수집한 후 유전자를 합성하여 프라이머와 프로브의 염기서열을 포함하는 양성체를 주문제작한 후 사용하였다.

4종의 바이러스 중 바이러스성출혈성패혈증(VHSV, Viral Hemorrhagic Septicemia Virus), 바이러스성뇌망막증 바이러스(VNNV, Viral Nervous Necrosis Virus), 넙치랍도바이러스(HIRRV, Hirame RhabdoVirus)의 경우, 넙치 병어로부터 감염부위의 조직(신장, 방광, 장, 근육)의 일부에서 DNA를 추출한 후 실험에 사용하였으며, 마린버나바이러스(MBV, Marine Birnavirus)는 염기서열 정보를 수집한 후 유전자를 합성하여 프라이머와 프로브의 염기서열을 포함하는 양성체를 주문제작한 후 사용하였다.

PCR 반응은 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며 장비의 형광을 고려하여 세균, 기생충, 바이러스 별로 각각의 튜브에서 진행하였다.

4종의 세균(Flexibacter maritimus, Lactococcus garvieae, Sterptococcus parauberis 및 Edwardsiella tarda)의 경우는 서열번호 1 ~ 8의 프라이머를 이용하여 multiplex로 진행했으며, 서열번호 9 ~ 20까지의 PNA 프로브를 사용하여, 검출 성능을 확인하였다.

4종의 기생충(점액포자충; Kudoa septempunctata, Parvicapsula anisocaudata, Enteromyxum leei, Enteromyxum scophthalmi)의 경우는 서열번호 21 ~ 28의 프라이머를 이용하여 multiplex로 진행했으며, 서열번호 29 ~ 40까지의 PNA 프로브를 사용하여, 검출 성능을 확인하였다.

4종의 바이러스(바이러스성출혈성패혈증(VHSV, Viral Hemorrhagic Septicemia Virus), 마린버나바이러스(MBV, Marine Birnavirus), 바이러스성신경괴사증 바이러스(VNNV, Viral Nervous Necrosis Virus), 넙치랍도바이러스(HIRRV, Hirame Rhabdovirus)의 경우는 서열번호 31 ~ 38의 프라이머를 이용하여 multiplex로 진행하였으며, 서열번호 39 ~ 60의 PNA 프로브를 사용하여, 검출 성능을 확인하였다.

비대칭 PCR을 위해 2pM 순방향 프라이머 1㎕, 20pM 역방향 프라이머 2㎕가 사용되었고, PNA 프로브는 5pM 농도로 0.5㎕씩 사용되었으며, 이들 프라이머와 PNA 프로브를 섞어 올리고머 믹스를 제조하였다. fast PCR buffer 버퍼의 조성은 2X의 사용 농도로 nTaq-HOT(0.2 unit/㎕), nTaq-HOT buffer(4mM MgCl₂ 함유), dNTP 혼합물(A, T, G, C 각각 0.4mM) 및 안정제(Stabilizer)를 포함하도록 하였다.

리얼타임) PCR 반응물의 조성은 표 7에 나타내었다. 키트의 마스터 믹스(master mix)를 만든 후 DNA를 1μL 첨가하여 표 8의 조건에서 분석을 수행하였다.

각 실험 결과들은 마지막 융해 단계에서 나타난 피크를 바탕으로 선별 및 분석을 진행하였다.

조성	용량
2X PCR buffer	10μL
올리고머 믹스 (PNA 프로브, 프라이머)	7μL
주형(Template, DNA)	1μL
증류수	up to 20μL

단계	온도(℃)	반응시간 및 사이클
Predenaturation	95	10 min
유전자 증폭	95	10 sec	45 cycle
	52	30 sec
	76	60 sec
변성(Denaturation)	95	30 sec
프로브 결합 (Probe binding)	75	30 sec
	55	30 sec
융해(Melting)	45 to 85	Increment 1.0℃, 5 sec

4종 세균에 대한 PNA 프로브 선별은 도 3 및 도 4에 나타내었으며, Flexibacter maritimus에 대한 검출 결과는 도 3에 나타난 바와 같이, FAM 형광 PNA 프로브 서열번호 9의 경우 melting curve에서 62℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었지만, 서열번호 10과 서열번호 11의 경우 peak결과를 확인할 수 없어서, Flexibacter maritimus 검출을 위한 프로브로는 최종적으로 서열번호 9의 PNA 프로브를 선별하였다.

Lactococcus garvieae에 대한 검출 결과는 도 3에 나타난 바와 같이, HEX 형광 PNA 프로브 서열번호 12의 경우 Melt curve에서 65℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인 할 수 있었다. 서열번호 13 의 경우 예상치 못한 마이너스 시그널을 확인할 수 있었으며 서열 번호 14의 경우 peak결과를 확인 할 수 없었다. 따라서, Lactococcus garvieae 검출을 위한 프로브는 최종적으로 서열번호 12의 PNA 프로브를 선별하였다.

Streptococcus parauberis에 대한 검출 결과는 도 4에 나타난 바와 같이, TxR 형광 PNA 프로브 서열번호 15의 경우 melting curve에서 70℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었지만, 서열번호 16의 예상치 못한 마이너스 시그널을 확인할 수 있었으며, 서열번호 17의 경우 peak 결과를 확인할 수 없었다. 따라서, Streptococcus parauberis 검출을 위한 프로브는 최종적으로 서열번호 17의 PNA 프로브를 선별하였다.

Edwardsiella tarda에 대한 검출 결과는 도 4에 나타난 바와 같이, Cy5 형광 PNA 프로브 서열번호 18의 경우 melting curve에서 67℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었다. 서열번호 19의 50℃ 부근에서 낮은 형광 값의 peak 결과를 확인했고 서열번호 20의 경우 peak 결과를 확인할 수 없었다. 따라서, Edwardsiella tarda 검출을 위한 프로브는 최종적으로 서열번호 18의 PNA 프로브를 선별하였다.

4종 기생충에 대한 PNA 프로브 선별 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

Kudoa septempunctata에 대한 검출 결과는 도 5에 나타난 바와 같이, FAM 형광 PNA 프로브 서열번호 29의 경우 melting curve에서 63℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었지만, 서열번호 30의 경우 예상치 못한 마이너스 시그널을 확인할 수 있었으며, 서열번호 31의 경우 50℃ 부근에서 낮은 형광 값의 peak 결과가 확인되었다. 따라서, Kudoa septempuctata 검출을 위한 프로브는 최종적으로 서열번호 29의 PNA 프로브를 선별하였다.

Parvicapsula anisocaudata에 대한 검출 결과는 도 5에 나타난 바와 같이, HEX 형광 PNA 프로브 서열번호 32의 경우 melting curve에서 60℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었다. 서열번호 33과 서열번호 34의 경우 peak 결과를 확인할 수 없었다. 따라서, Parvicapsula anisocaudata 검출을 위한 프로브는 최종적으로 서열번호 32의 PNA 프로브를 선별하였다.

Enteromyxum leei에 대한 검출 결과는 도 6에 나타난 바와 같이, TxR 형광 PNA 프로브 서열번호 35의 경우 melting curve에서 68℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었지만, 서열번호 36의 경우 peak 결과를 확인 할 수 없었고, 서열번호 37의 경우 40℃ 부근에서 낮은 형광 값의 peak 결과를 확인되었다. 따라서, Enteromyxum leei 검출을 위한 프로브는 최종적으로 서열번호 35의 PNA 프로브를 선별하였다.

Enteromyxum scophthalmi에 대한 검출 결과는 도 6에 나타난 바와 같이, Cy5 형광 PNA 프로브 서열번호 38의 경우 melting curve에서 69℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었지만, 서열번호 39와 서열번호 40의 경우 peak 결과를 확인할 수 없었다. 따라서, Enteromyxum scophthalmi 검출을 위한 프로브는 최종적으로 서열번호 38의 PNA 프로브를 선별하였다.

4종 바이러스에 대한 PNA 프로브 선별 결과는 도 7 및 도 8에 나타내었다.

바이러스성출혈성패혈증(VHSV)에 대한 검출결과는 도 7에 나타난 바와 같이, FAM 형광 PNA 프로브 서열번호 49의 경우 melting curve에서 69℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었지만, 서열번호 50의 경우 peak 결과를 확인할 수 없었고, 서열번호 51의 경우 40℃ 부근에서 낮은 형광 값의 peak 결과가 확인되었다. 따라서, VHSV 검출을 위한 프로브는 최종적으로 서열번호 49의 PNA 프로브를 선별하였다.

마린버나바이러스(MBV)에 대한 검출결과는 도 7에 나타난 바와 같이, HEX 형광 PNA 프로브 서열번호 52의 경우 melting curve에서 66℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었다. 서열번호 53의 경우 50℃ 부근에서 낮은 형광 값의 peak 결과가 확인되었고 서열번호 54의 경우 61℃에서 낮은 형광 값의 peak 결과가 확인되었다. 따라서, MBV 검출을 위한 프로브로는 최종적으로 서열번호 52의 PNA 프로브를 선별하였다.

바이러스성신경괴사증 바이러스(VNNV, Viral Nervous Necrosis Virus)에 대한 검출결과는 도 8에 나타난 바와 같이, TxR 형광 PNA 프로브 서열번호 55의 경우 melting curve에서 72℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었지만, 서열번호 56의 경우 예상치 못한 마이너스 시그널을 확인할 수 있었으며, 서열번호 57의 경우 peak 결과를 확인할 수 없었다. VERV 검출을 위한 프로브로는 최종적으로 서열번호 57의 PNA 프로브를 선별하였다.

넙치랍도바이러스(HIRRV, Hirame Rhabdovirus)에 대한 검출결과는 도 8에 나타난 바와 같이, Cy5 형광 PNA 프로브 서열번호 58의 경우 melting curve에서 67℃ Tm을 나타내는 peak 결과를 확인할 수 있었지만, 서열번호 59의 경우 40℃ 부근에서 낮은 형광 값의 peak가 확인되고 서열번호 60의 경우 peak 결과를 확인할 수 없었다. 따라서, HIRRV 검출을 위한 프로브로는 최종적으로 서열번호 58의 PNA 프로브를 선별하였다.

이렇게 선별된 PNA 프로브의 결과를 도 9에 나타내었다. 각각 얻어진 Tm 값에서 장비의 차이로 인한 오차범위로 ㅁ3의 값에 들어올 때 각 병원체임을 확인할 수 있다.

실시예 3: 본 발명에 따른 넙치 병원체 검출용 프라이머와 PNA 프로브의 특이도 확인

실시예 2에서 선별된 프라이머와 PNA 프로브의 특이도를 확인하기 위하여 대상 종이 아닐 경우에 다른 결과가 나타나는지 확인하였다. 세균을 진단하는 프라이머와 프로브들을 이용하여 기생충과 바이러스 DNA를 이용하여 위양성 유무를 확인하였고, 기생충을 진단하는 프라이머와 프로브들을 이용하여 세균과 바이러스 DNA를 이용하여 위양성 유무를 확인하였고, 바이러스를 진단하는 프라이머와 프로브들을 이용하여 기생충과 세균 DNA를 이용하여 위양성 유무를 확인하였다. 분석은 실시예 2와 동일한 실험방법으로 실험을 진행하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명으로부터 개발된 검사법이 다른 종들에 대해서는 융해 곡선이 전혀 확인되지 않았으며, 목표로 하는 종 이외에 다른 종에서는 간섭 없이 특이적으로 반응하는 것을 검증할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 해당 업계의 통상 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> National Institute of Fisheries Science <120> Methods for Identification and Discrimination of Infectious Parasitic Pathogens in SPF Flounder(Paralichthys olivaceus) <130> P21-B067 <160> 60 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for F. maritimus <400> 1 tgtagcttgc tacagatga 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for F. maritimus <400> 2 acgcatagtc atcttctacc g 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for L. garvieae <400> 3 ggcaaccctg accgagcaa 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for L. garvieae <400> 4 gttagatacc gtcacttaag t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S. parauberis <400> 5 tttcgtctga ggcaatgttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S. parauberis <400> 6 gcttcatata tcgctatact 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E. tarda <400> 7 ggtaacctga tttggcgttc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E. tarda <400> 8 ggatcacctg gatcttatcc 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for F. maritimus <400> 9 aagattaata cctcataa 18 <210> 10 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for F. maritimus <400> 10 gcgcacgggt gcg 13 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for F. maritimus <400> 11 cgcgtataga atc 13 <210> 12 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for L. garvieae <400> 12 acgttaagta gagt 14 <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for L. garvieae <400> 13 gagtgaagaa gg 12 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for L. garvieae <400> 14 ttcggatcgt aa 12 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for S. parauberis <400> 15 aaatcaatcg tagagt 16 <210> 16 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for S. parauberis <400> 16 gggcttagtg atcc 14 <210> 17 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for S. parauberis <400> 17 taccctgggg at 12 <210> 18 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for E. tarda <400> 18 tggggtttcg atca 14 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for E. tarda <400> 19 gagagcacgc ct 12 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for E. tarda <400> 20 cgccgccggc gg 12 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for K. septempunctata <400> 21 gtgtgtgatc agacttgata tg 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for K. septempunctata <400> 22 aagccaaaac tgctggccat tt 22 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for P. anisocaudata <400> 23 cgatagcaga acgccgg 17 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for P. anisocaudata <400> 24 gagcaggcct gctctaacat gta 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E. leei <400> 25 gtagcttggt acgaatatcg g 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E. leei <400> 26 ttcccggaga agccaacgta t 21 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E. scophthalmi <400> 27 gatgtgtcag tatcttacgc aagt 24 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E. scophthalmi <400> 28 gtccctttta atcgagacca ag 22 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for K. septempunctata <400> 29 cggctcaaac tcattt 16 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for K. septempunctata <400> 30 gagtggaatg tgagttt 17 <210> 31 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for K. septempunctata <400> 31 catttcaaat gaga 14 <210> 32 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for P. anisocaudata <400> 32 caagtcccgg ctgt 14 <210> 33 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for P. anisocaudata <400> 33 ccggctgtgg gct 13 <210> 34 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for P. anisocaudata <400> 34 gtggccggtc gctt 14 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for E. leei <400> 35 ttttggattg gtgtcta 17 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for E. leei <400> 36 cgaatatcgg tgacgcc 17 <210> 37 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for E. leei <400> 37 aacgaaggtt gg 12 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for E. scophthalmi <400> 38 tgtagatggt cacttg 16 <210> 39 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for E. scophthalmi <400> 39 aaattaagtt ttt 13 <210> 40 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for E. scophthalmi <400> 40 gaccagttct ttttat 16 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for MBV <400> 41 cccggatgag gtgcacag 18 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for MBV <400> 42 agtcgagctg gaagtcgtac 20 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for VNNV <400> 43 gtcgtattgc tggtccgca 19 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for VNNV <400> 44 gcccgctgta acggcttg 18 <210> 45 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for HRV <400> 45 ctcggattgg ggcagcg 17 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for HRV <400> 46 ctcatggcac aaagggcctt 20 <210> 47 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for VHSV <400> 47 gcaggatgtg tgcgtcc 17 <210> 48 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for VHSV <400> 48 cccaggttgt tggcggc 17 <210> 49 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for MBV <400> 49 gacatcagct tcagac 16 <210> 50 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for MBV <400> 50 gcaccacgaa ggta 14 <210> 51 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for MBV <400> 51 cgactgggac cctc 14 <210> 52 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for VNNV <400> 52 cgactgggac cctc 14 <210> 53 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for VNNV <400> 53 aaactgctgt attt 14 <210> 54 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for VNNV <400> 54 cgctcctgga ccg 13 <210> 55 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for HRV <400> 55 atcccgccac tgct 14 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for HRV <400> 56 ggatcattct tatcaacc 18 <210> 57 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for HRV <400> 57 ggtaagaccg gg 12 <210> 58 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for VHSV <400> 58 ggaatgacca tgat 14 <210> 59 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for VHSV <400> 59 cccttgactg gg 12 <210> 60 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for VHSV <400> 60 ggtcaggatg aa 12

Claims

서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 35 및 서열번호 38로 표시되는 PNA 프로브; 및 서열번호 21 내지 서열번호 28로 표시되는 프라이머 셋트를 포함하는 넙치 감염병 병원체 기생충 쿠도아 셉템펑타타(Kudoa septempunctata), 파비캡슐라 아니소카우다타(Parvicapsula anisocaudata), 엔테로믹슘 레이(Enteromyxum leei) 및 엔테로믹슘 스코프탈미(Enteromyxum scophthalmi)에 대한 동시검출 또는 동시 진단을 위한 리얼타임 PCR용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 4종의 PNA 프로브는 각기 서로 다른 리포터(reporter)를 포함하고, 리포터에 대한 소광자(quencher)를 포함하는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR용 조성물.
삭제
제1항의 리얼타임 PCR용 조성물을 포함하는 넙치 감염병 병원체의 동시 진단용 키트.
제1항의 리얼타임 PCR용 조성물을 이용한 넙치 감염병 병원체의 동시 진단 방법.