CN105793436A - 对生物样品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin?resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的方法，其中该方法涉及在样品中检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性的核酸序列、mecA和mecC。还提供了用于确定样品中MRSA的存在的试剂盒。

Description

对生物样品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测
发明领域
本发明主要涉及病原体检测方法。具体而言，本发明涉及检测生物样品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的方法。
发明背景
提供下文的描述以帮助阅读者理解。提供的信息或引用的参考文献均不视为本发明的现有技术。
金黄色葡萄球菌(S.aureus)是人类中多种病况的病因，包括皮肤感染(例如毛囊炎、睑腺炎、蜂窝组织炎、脓疱疮、和疖病)、肺炎、乳腺炎、静脉炎、脑膜炎、烫伤样皮肤综合征(scalded skin syndrome)、骨髓炎、尿路感染、和食物中毒。此外，疾病控制及预防中心(CDC)已认定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是医疗环境中日渐增长的问题，因为其是医院获得性感染(如外科伤口的医院获得性(HA)感染或院内感染)的主因之一。
MRSA是两种最猖獗的耐抗生素病原体之一；另一种是耐万古霉素的肠球菌(医疗及流行病学学会(Society for Healthcare and Epidemiology)，SHEA指南2003)。特护病房内的超过50％的院内感染是由于MRSA(国立医院感染监控系统(National Nosocomial Infections Surveillance System)，NNIS报告，1992年1月-2004年6月)。因此，MRSA代表着对于公众健康的重大威胁。
甲氧西林耐药性是由获得外源基因mecA引起的，所述外源基因mecA编码青霉素结合蛋白(PBP2a或PBP2’)，其表现出对β-内酰胺抗生素的低亲和性(Wielders和Fluit,2002)。mecA携带于称为葡萄球菌盒染色体mec(SCCmec)的可移动遗传元件上，其还含有编码对于元件的移动性必需的重组酶的ccr基因复合体。SCCmec盒是能够移动至金黄色葡萄球菌基因组之中或之外的大型元件。
mecA基因也发现于凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)菌株中，该菌株比金黄色葡萄球菌致病性低。这些菌株包括表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、头状葡萄球菌(S.capitis)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、和山羊葡萄球菌(S.caprae)。这些其他葡萄球菌菌株中的一些生长在与金黄色葡萄球菌相同的环境中，如前鼻孔和皮肤。其结果是，临床样品如鼻拭子(nasal swab)或伤口拭子(wound swab)能潜在地含有多于一个葡萄球菌种的混合物。因此，单独检测mecA不足以直接从临床样品鉴定MRSA。因为MRSA的鉴定的临床意义比其他葡萄球菌更大(这是由于其增加的致病性和毒性)，需要拥有从其他含mecA基因的葡萄球菌菌株区分MRSA的诊断测定法。
更近期地，发现了一个额外的mec基因，称为mecC，其也导致β-内酰胺耐药性。mecC(GenBank登录号FR821779)，曾在早期出版物中被称为mecA同源物，其存在于SCCmec XI元件上(GenBank登录号FR823292)。已描述了人和牛金黄色葡萄球菌中的mecC基因，并且其编码与mecA编码的PBP2a具有<63％氨基酸同一性的蛋白。
通常通过监测患者和人员的感染来控制医院获得性(HA)MRSA。当感染进展时或要预防感染时，对明显具有风险的个体进行接触防范和/或患者隔离可能是适合的。社区获得的(community acquired,CA)MRSA的流行也在增加。CA-MRSA定义为没有已知MRSA感染风险因素(例如近期住院、与受感染患者接触)的人中获得的MRSA。因为对MRSA快速可靠的鉴定对于诊断和治疗受感染患者以及实施和管理医院感染控制程序而言已变得重要，需要拥有检测金黄色葡萄球菌的存在(具体为MRSA的存在)的诊断测定法。此外还需要拥有这样的测定法，所述测定法不需要与检测系统分离的前端样品制备过程。
发明概述
本文提供用于检测生物样品中的MRSA的方法和试剂盒。具体而言，描述的方法涉及通过筛选三个标志物核酸序列的存在对MRSA的阳性鉴定。本方法可以在未经加工的生物样品上进行，得到直接的、流水线化的(streamlined)样品至结果(sample-to-answer)的工艺。
本发明公开的用于在生物样品中检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在或不存在的方法，其包括：
(a)将所述生物样品与如下项接触：
(i)在严格条件下与特异性针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的靶核酸区段(如果存在的话)特异性地杂交的第一引物对，
(ii)在严格条件下与靶mecA核酸区段(如果存在的话)特异性地杂交的第二引物对，和
(iii)在严格条件下与靶mecC核酸区段(如果存在的话)特异性地杂交的第三引物对，
以产生反应-样品混合物，其中每个引物对的至少一个引物与荧光团标签相连，
(b)使所述反应-样品混合物处于实时聚合酶链式反应(PCR)条件，在该条件下所述生物样品中存在的每个靶核酸经扩增产生荧光信号，
(c)测量每个荧光团产生的荧光信号的量，及
(d)通过比较靶核酸的循环阈值，确定MRSA的存在或不存在，其中
(i)当检测到金黄色葡萄球菌特异性靶核酸及mecA和/或mecC核酸二者的荧光信号时，且
(1)来自金黄色葡萄球菌特异性核酸的循环阈值(Ct)减去来自mecA和/或mecC核酸的Ct≤1.9，或
(2)来自金黄色葡萄球菌特异性核酸的Ct减去来自mecA和/或mecC核酸的Ct>1.9且来自mecA和/或mecC核酸的Ct加1.9<来自金黄色葡萄球菌特异性核酸的Ct，
则确定生物样品中存在MRSA；
(ii)当检测到金黄色葡萄球菌特异性核酸以及mecA和/或mecC核酸二者的Ct，且来自金黄色葡萄球菌特异性核酸的Ct减去来自mecA和/或mecC核酸的Ct<1.9，且来自金黄色葡萄球菌特异性核酸的Ct加1.9<来自mecA和/或mecC核酸的Ct时，确定生物样品中存在金黄色葡萄球菌和甲氧西林耐药性基因；或
(iii)若检测到金黄色葡萄球菌特异性靶核酸序列的荧光信号但未检测到mecA和/或mecC的荧光信号，则在生物样品中确定存在金黄色葡萄球菌且确定不存在MRSA。
在与所述生物样品接触前，所有引物对一起包含于扩增主混合液(amplification master mix)中，所述混合物还包含DNA聚合酶、dNTP和PCR缓冲液。此外，扩增主混合液还包含第四引物对，所述第四引物对在严格条件下与对照靶核酸特异性地杂交。
在一些实施方案中，所述特异性针对金黄色葡萄球菌的靶核酸包含选自下组的基因序列的全部或部分：spa、agr、ssp蛋白酶、sir、sodM、cap、coa、α溶血素、γ溶血素、femA、Tuf、分选酶、纤维蛋白原结合蛋白、clfB、srC、sdrD、sdrE、sdrF、sdrG、sdrH、NAD合成酶、sar、sbi、rpoB、促旋酶A、和orfX。在一个具体的实施方案中，所述特异性针对金黄色葡萄球菌的靶核酸是spa。
第一引物对可以指向spa核酸序列且由包含SEQ ID NO:1的第一引物和包含SEQ ID NO:2的第二引物组成。第二引物对指向mecA核酸序列，其可以由包含SEQ ID NO:4的第一引物和包含SEQ ID NO:6的第二引物组成。第三引物对指向mecC核酸，其可以由包含SEQ ID NO:7的第一引物和包含SEQ IDNO:9的第二引物组成。
每个引物对的一个引物可以包含探针序列元件作为相同引物分子的一部分，得到称为引物-探针的产物(例如ScorpionTM引物-探针)。探针序列通常定位于引物的5’末端并且还可以包含与淬灭剂相连的荧光团，以降低背景荧光。在PCR延伸后，将合成的靶区域附接至同一链作为探针。在变性时，ScorpionTM的探针部分与新生成的PCR产物的一部分特异性地杂交，物理性地将荧光团从淬灭剂分开，由此产生可检测的信号。在一些实施方案中，mecA引物的荧光团和mecC引物的荧光团是相同的。引物-探针的荧光团可以是荧光素酰胺(fluorescein amidite，FAM)而mecA和mecCspa基因的荧光团可以是在可见光谱的红区中发荧光的氧杂蒽染料。
可以将生物样品与一个或多个引物对单独或同时接触。当同时发生接触(即多重接触(multiplexing))时，将第一、第二、和第三引物对的一个或多个与生物样品接触以及互相接触，以扩增靶核酸序列。任选地，可以将内部阳性对照核酸及与内部阳性对照核酸互补的第四引物对包含在扩增混合物中。
还提供了包含寡核苷酸(其可以是引物或引物-探针)的用于进行如本文所述扩增的试剂盒。
发明详述
本文使用一些定义来描述本发明，所述定义如下文及整个说明书所示。
除另有说明外，本文所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的表述。因此，例如“寡核苷酸”的表述包括多个寡核苷酸分子，而“核酸”的表述是指一个或多个核酸。
本文所用的“约”意指上下浮动10％。
在严格条件下与靶核酸特异性地杂交的引物对可以与该基因的任何部分杂交。因此，可以扩增整个基因或可以扩增基因的区段，这取决于引物所要杂交的基因部分。
本文所用的术语“扩增”或“进行扩增”包括用于复制靶核酸、由此增加所选核酸序列的拷贝数的方法。扩增可以是指数性的或线性的。靶核酸可以是DNA (诸如，例如基因组DNA和cDNA)或RNA。以此方式扩增的序列形成“扩增子”。虽然下文描述了示例性的涉及用聚合酶链式反应(PCR)来扩增的方法，本领域还已知大量其他方法用于扩增核酸(例如等温方法、滚环方法等)。技术人员会理解，这些其他方法可以用于代替PCR方法或与其一起使用。参见例如Saiki,“Amplification of Genomic DNA”in PCR Protocols,Innis等,Eds.,Academic Press,San Diego,CA 1990,pp 13-20；Wharam等,NucleicAcids Res.2001Jun 1；29(11):E54-E54；Hafner等,Biotechniques 2001Apr；30(4):852-860。
本文所用于指代多核苷酸(例如核苷酸序列如寡核苷酸或靶核酸)的术语“互补”、“互补的”或“互补性”意指标准沃森/克里克(Watson/Crick)配对规则。核酸序列的互补是按照“反向平行结合”的，如一个序列的5’末端与另一序列的3’末端序列配对。例如，序列“5’-A-G-T-3’”与序列“3’-T-C-A-5’”是互补的。可以在本文所述的核酸中包含一些天然核酸中不常见的碱基；其包括，例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)、锁核酸(LNA)、和肽核酸(PNA)。互补性不需要是完美的；稳定的双螺旋可以含有错配的碱基对、简并的(degenerative)或不匹配的碱基。核酸技术领域技术人员能按经验考虑一些变量来确定双螺旋稳定性，所述变量包括，例如寡核苷酸长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对发生率。互补序列还可以是与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列，并且还可以是cDNA。本文所用的术语“基本互补”意指两个序列特异性地杂交(如下文所定义)。技术人员会理解，基本互补的序列不一定要以其全长杂交。与参比序列“完全互补”或“完全互补的”的核酸由核苷酸序列组成，该核苷酸序列与参比序列沿其为完全互补的核酸全长为100％互补的(按照沃森/克里克配对规则)。完全互补不含与参比序列的错配。
如本文所用的，在检测来自可检测标记的信号以确定样品中靶核酸存在的内容中，所有术语“检测”不需要该方法提供100％灵敏度和/或100％特异性。众所周知的是，“灵敏度”是当人具有靶核酸时测试为阳性的概率，而“特异性”是当人不具有靶核酸时测试为阴性的概率。优选为至少50％的灵敏度，而至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％明显是更优选的。优选为至少50％的特异性，而至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％明显是更优选的。检测还涵盖了具有假阳性和假阴性的测定。假阴性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。假阳性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。
核酸的上下文中的“片段”意指核苷酸残基序列，其为至少约5个核苷酸、至少约7个核苷酸、至少约9个核苷酸、至少约11个核苷酸、或至少约17个核苷酸。片段通常小于约300个核苷酸、小于约100个核苷酸、小于约75个核苷酸、小于约50个核苷酸、或小于30个核苷酸。在一些实施方案中，片段可用于聚合酶链式反应(PCR)、多种杂交程序或微阵列程序中，以鉴定或扩增mRNA或DNA分子的相同或相关部分。片段或区段可以唯一地鉴定本发明的每个多核苷酸序列。
“基因组核酸”或“基因组DNA”意指来自染色体的DNA的一些或全部。基因组DNA可以是完整的或片段化的(例如通过本领域已知方法用限制性内切核酸酶消化的)。在一些实施方案中，基因组DNA可以包括来自单基因的全部或部分的序列或来自多基因的序列。相比之下，本文使用术语“总基因组核酸”来意指基因组中含有的DNA的全部补足物(full complement)。从各种样品纯化DNA和/或RNA的方法是本领域所熟知的。
本文所用的术语“多重PCR”意指在同一反应容器中同时扩增两个或更多个产物。每种产物用独有的引物对作引物。多重反应还可以包括针对每种产物的特异性探针，其由可检测的模块标记。
本文所用的术语“寡核苷酸”意指由脱氧核糖核酸、核糖核酸或其任意组合组成的短的聚合体。寡核苷酸通常长度为至少约10、11、12、13、14、15、20、25、40或50直至约100、110、150或200个核苷酸(nt)，更优选地长度为约10、11、12、13、14、或15直至约70或85nt，且最优选为约18直至约26nt。核苷酸的单字母代码如美国专利局专利审查流程手册第2422节表1中所述。就这一点而言，核苷酸代号“R”意指嘌呤如鸟嘌呤或腺嘌呤，“Y”意指嘧啶如胞嘧啶或胸腺嘧啶(若RNA则为尿嘧啶)；而“M”意指腺嘌呤或胞嘧啶。寡核苷酸可以用作引物或探针。
本文所用的用于扩增的“引物”是与靶核酸序列互补并在DNA或RNA聚合酶的存在下引起向引物的3’末端添加核苷酸的寡核苷酸。引物的3’核苷酸通常应与靶核酸序列在对应的核苷酸位置处相同，以用于最佳表达和扩增。本文所用的术语“引物”包括可合成的所有形式的引物，包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、带标记的引物，等等。本文所用的“正向引物”是与dsDNA的反义链互补的引物。“反向引物”是与dsDNA的有义链互补的。“外源引物”具体是指添加至反应容器的且不从反应容器中的扩增产生的寡核苷酸，所述反应容器含有要从容器外扩增的样品核酸。与荧光团或其他标记“相连的”引物是通过一些方法与标记相连接的。一个例子是引物-探针。
引物通常长度至少为10、15、18、或30个核苷酸直至长度约100、110、125、或200个核苷酸，优选地长度为至少15直至约60个核苷酸，最优选地长度为至少25直至约40个核苷酸。在一些实施方案中，引物和/或探针长度为15至35个核苷酸。不存在用于最佳杂交或聚合酶链式反应扩增的标准长度。具体引物应用的最佳长度可以容易地以H.Erlich,PCR Technology,Principlesand Application for DNA Amplification,(1989)中所述的方式来确定。
“引物对”是一对引物，其二者均指向靶核酸序列。引物对含有正向引物和反向引物，其在严格条件下各自与双链靶核酸序列的不同链杂交。正向引物与dsDNA的反义链互补而反向引物与dsDNA的有义链互补。引物对的一个引物可以是引物-探针(即双功能性分子，其含有通过聚合酶阻断基团共价连接至探针元件的PCR引物元件，并且此外还含有与淬灭剂相互作用的荧光团)。
特异性针对靶核酸的寡核苷酸(例如探针或引物)会在指定条件下与靶核酸“杂交”。本文所用的“杂交”或“进行杂交”意指这样的过程：通过该过程寡核苷酸单链在限定的杂交条件下与互补链经碱基配对而退火。
“特异性杂交”是指两个核酸序列拥有高度互补性。特异性杂交复合体在允许的退火条件下形成并在随后的任意洗涤步骤后维持为杂交状态。允许核酸序列退火的条件可由一个本领域普通技术人员常规地确定，并可以在例如65℃处在约6×SSC的存在下发生。杂交的严格度可以部分地根据进行洗涤步骤的温度来表示。此类温度通常选为比具体序列在限定的离子强度和pH处的热熔点(Tm)低约5℃至20℃。Tm是50％的靶核酸与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH处)。计算Tm的等式和用于核酸杂交的条件是本领域已知的。特异性杂交优选地发生在严格条件下，这是本领域所熟知的。严格杂交条件是50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃处，并在60℃处在0.1×SSC中洗涤的杂交。杂交程序是本领域所熟知的，并描述于例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc.,1994中。
如果在某个寡核苷酸与核酸比对时，该寡核苷酸与该核酸具有至少50％序列同一性，那么本文所用的寡核苷酸是“特异性”针对该核酸的。特异性针对核酸的寡核苷酸是这样的寡核苷酸：在合适的杂交或洗涤条件下，其能与目的靶标杂交而基本不与非目的的核酸杂交。较高水平的序列同一性是优选的，且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和更优选为至少98％序列同一性。序列同一性可以用市售的计算机程序，按照采用本领域熟知算法的初始设定来确定。如本文所用的具有“高序列同一性”的序列中，所比对核苷酸位置的至少约50％、优选所比对核苷酸位置的至少约60％、更优选为所比对核苷酸位置的至少约75％处具有相同的核苷酸。
用作引物或探针的寡核苷酸通常能够在严格条件下与靶核酸特异性地杂交，所述引物或探针用于特异性地扩增(即扩增具体的靶核酸)或特异性地检测(即检测具体的靶核酸序列)靶核酸。
本文所用的术语“样品”或“测试样品”可以包含临床样品、分离的核酸、或分离的微生物。在优选的实施方案中，从生物来源获取样品(即“生物样品”)，所述生物来源如收集自受试者的组织、体液、或微生物。样品来源包括但不限于痰(经处理的或未经处理的)、支气管肺泡灌洗液(BAL)、支气管洗涤液(BW)、血液、体液、脑脊液(CSF)、尿液、血浆、血清、或组织(例如活检材料)。优选的样品来源包括鼻咽拭子、伤口拭子、和鼻洗涤液。本文所用的术语“患者样品”意指获取自寻求疾病的诊断和/或治疗的人的样品。
本文所用的“扩增混合物”是用于核酸扩增反应的试剂的混合物，但不含引物或样品。扩增混合物包含缓冲液、dNTP、和DNA聚合酶。扩增混合物还可以包含MgCl2、KCl、非离子型和离子型去污剂(包括阳离子去污剂)的至少一种。
“扩增主混合液”包含扩增混合物和用于扩增靶核酸的引物，但不包含要扩增的样品。
本文所用的“反应-样品混合物”意指含有扩增主混合液加样品的混合物。
本文所用的“探针序列元件”意指一段核苷酸，其与引物的联系在于其连接至或其邻接至引物核酸序列，并且在严格条件下与要检测的靶核酸序列特异性地杂交。
本文所用的术语“引物-探针检测系统”意指用于实时PCR的方法，该方法利用双功能性分子(此处称为引物-探针)，其含有通过聚合酶阻断基团共价连接至探针元件的PCR引物元件。此外，每个引物-探针分子含有荧光团，其与淬灭剂相互作用以降低背景荧光。本文所用的引物-探针可以包含带有5’延长探针尾(其包含发夹结构)的3'引物，其具有荧光团/淬灭剂对。在PCR过程中，通过包含六甘醇(hexethlyene glycol)(HEG)，阻断了聚合酶延伸至探针尾中。在第一轮扩增过程中，3’靶标特异性引物与靶核酸退火，并延伸，从而使引物-探针整合至新合成的链中，其具有新合成的针对5'探针的靶区域。在下一轮变性和退火过程中，引物-探针发夹环的探针区会与靶标杂交，从而将荧光团和淬灭剂分离并产生可测量的信号。此类引物-探针描述于Whitcombe等,Nature Biotech 17:804-807(1999)中。SCORPION引物是示例性的引物-探针。
本文所用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”意指这样的序列，其包括要扩增和检测的目的核苷酸的区段。靶序列的拷贝通常在扩增反应过程中产生，其被称为扩增产物、扩增物、或扩增子。靶核酸可以由染色体区段、有或没有间隔序列的完全基因、有或没有间隔序列的基因的区段或部分、或针对其设计探针或引物的核酸序列组成。靶核酸可以包括野生型序列、突变、缺失或复制、串联重复区、目的基因、目的基因的区域或其任何上游或下游区域。靶核酸可以代表具体基因的替换序列或等位基因。靶核酸可以来源于基因组DNA、cDNA、或RNA。本文所用的靶核酸可以是提取自细胞的DNA或RNA或从其扩增的核酸拷贝，或可以包括进一步用亚硫酸氢盐反应(bisulfite reaction)转换的提取的核酸。
本文所用的“阳性对照核酸”或“内部阳性扩增对照”是已知以一定量或水平存在于样品中的核酸。在一些实施方案中，阳性对照核酸不是天然存在于样品中的，并且是在本发明公开的用于确定MRSA存在或不存在的方法中对反应-样品混合物进行的实时聚合酶链式反应之前添加至样品的。本文所用的分析物的“循环阈值”(Ct)是这样的PCR循环：在该处荧光信号超过了指定的荧光阈值。Ct取决于扩增反应效率，其包括起始模板拷贝数、有机体裂解、PCR扩增、荧光探针的杂交或切割及检测灵敏度。
本文所用的“PCR检测系统”意指一种用于实时PCR的方法。在该方法中，与扩增的核酸区段杂交的探针包含于扩增主混合液中。探针在探针的一端包含供体和淬灭剂荧光团，并且互相足够接近，从而供体的荧光被淬灭剂占据。然而，当该探针与扩增的区段杂交时，Taq聚合酶的5’-核酸外切酶活性切割探针，由此允许供体荧光团发出可检测的荧光。
本发明人发现，MRSA的阳性鉴定可以通过确定生物样品中三个标志物核酸序列的存在或不存在来进行。因而，本发明提供确定生物样品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在或不存在的方法，该方法包括：(a)将所述生物样品与如下项接触：在严格条件下与特异性针对金黄色葡萄球菌的靶核酸区段(如果存在的话)特异性地杂交的第一引物对，在严格条件下与靶mecA核酸区段(如果存在的话)特异性地杂交的第二引物对，和在严格条件下与靶mecC核酸区段(如果存在的话)特异性地杂交的第三引物对，以产生反应-样品混合物，其中每个引物对的至少一个引物与荧光标记相连，(b)使所述反应-样品混合物处于实时聚合酶链式反应(PCR)条件，在该条件下所述生物样品中存在的每个靶核酸经扩增产生荧光信号，(c)用集成热循环系统测量每个荧光团产生的荧光信号的量，及(d)通过比较来自靶核酸的荧光量和应用本发明人发现的算法，确定MRSA的存在或不存在。
生物样品及样品制备
可以用本发明的方法对MRSA进行检测和定量的生物样品来自无菌的和/或非无菌的部位。可获取样品的无菌部位是体液，如全血、血浆、无细胞血浆、尿液、脑脊液、滑液、胸膜液、心包液、眼内液体、组织活检或气管内吸入物。本文所用的“无细胞血浆”是指含有按体积低于1％细胞的血浆。可获取样品的非无菌部位是例如痰、粪便以及来自例如皮肤、腹股沟、鼻腔和/或喉咙的拭子。本发明中优选为使用来自非无菌部位的样品，更优选为伤口和/或鼻拭子。用于MRSA检测的样品还可以包含生长于合适培养基上形成菌落的分离的细菌培养物。样品还可以包括细菌分离株(bacterial isolate)。
示例性的生物样品来源包括鼻咽拭子、伤口拭子、和鼻洗涤液。可以怀疑生物样品含有MRSA和/或MRSA核酸。此外，生物样品可以获取自疑似感染MRSA的个体。可以将生物样品与扩增主混合液接触用于在微流体/微电子离心平台中使用。
虽然本发明的方法优选地采用未经处理的生物样品并因而得到直接的、流水线化的样品至结果的工艺，但如果用于纯化自生物样品的分离核酸(DNA或RNA)上(所述样品根据本领域技术人员所熟知的任何方法来分离)，本文公开的检测方法会是有效的。如果需要的话，可以通过离心等收集或浓缩样品。可以对样品的细胞进行裂解，如通过用酶、热表面活性剂、超声或其组合处理。或者，可以用市售的核酸提取试剂盒来处理生物样品。
在一些实施方案中，在接触生物样品前，一个或多个引物对存在于扩增主混合液中，其还包含DNA聚合酶、dNTP和PCR缓冲液。虽然扩增优选地以多重形式进行，但可以择一使用针对每个标志物的个别反应。可以在直接扩增盘(direct amplification disc)中将生物样品与引物对和/或扩增主混合液接触以形成反应-样品混合物。例如，可以在直接扩增盘(如Focus Diagnostics,Inc.(Cypress,CA,USA)销售的直接扩增盘)中将生物样品与扩增主混合液接触，作为SIMPLEXA Direct实时PCR测定的一部分，以同3MTM集成循环仪协同工作。直接扩增盘是薄的圆盘，其含有多个指定区域，其每一个都含有用于接收扩增主混合液的孔以及用于接收未经处理的患者样品的关联孔。在添加扩增主混合液和样品之时或之后，在直接扩增盘中产生样品-反应混合物。
实时PCR
使反应-样品混合物处于实时聚合酶链式反应(PCR)条件，在该条件下对所述生物样品中存在的每个靶核酸进行扩增并检测和测量扩增产物。在一些实施方案中，在同一盘中的RT-PCR检测和靶分析物区分后，生物样品未经分离的前端样品制备而直接加载至直接扩增盘中。优选的是，在直接扩增盘(来自Focus Diagnostics,Inc.的8孔盘)中进行扩增。在一些实施方案中，实时PCR扩增用SIMPLEXA Direct测定法在直接扩增盘中进行，而检测用集成热循环仪(integrated thermal cycler)如3M(St.Paul,MN,USA)所售的3MTM集成循环仪来进行。3MTM集成循环仪能接收直接扩增盘并能在每个盘进行多重测定。这种装置能每秒加热>5℃和每秒冷却>4℃。循环参数可以是变化的，这取决于要延伸的扩增产物长度。
可以利用寡核苷酸引物、探针和/或引物-探针，将内部阳性扩增对照(IPC)包含在样品内。
因此，在一些实施方案中，扩增反应中每个引物对的至少一个引物包含可检测模块。所述可检测模块可以在探针上，所述探针附接至引物，如引物-探针。所述探针可以通过本领域已知的方法进行可检测的标记化。有用的标记物包括，例如荧光染料(例如FITC、罗丹明、镧磷光剂(lanthamide phosphors)、德州红、荧光素酰胺(FAM)、JOE、氧杂蒽染料如CalFluor Red(“CFR610”)(其在可见光谱的红区中发荧光并能被I-BHQ2染料有效地淬灭)、Quasar 32P、35S、3H、14C、125I、131I、高电子密度试剂(例如金)、酶，例如ELISA中常用的酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记物(例如胶体金)、磁性标记物(例如DynabeadsTM)、生物素、dioxigenin、或可适用抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。其他标记物包括能与对应的受体或寡核苷酸互补物分别形成复合体的配体或寡核苷酸。可以将标记物直接整合至要检测的核酸中，或可将其附接至与要检测的核酸杂交或结合的探针(例如寡核苷酸)或抗体。
因此，在扩增后，可以通过不同的可检测模块(如尺寸和/或颜色)来鉴定多种靶区段。可检测模块可以是荧光染料。在一些实施方案中，用不同的可区分的可检测模块来标记不同的引物对。因此，例如HEX和FAM荧光染料可以存在于多重PCR中的不同引物上并与所得的扩增子相连。在其他实施方案中，用一种可检测模块来标记正向引物，而用不同的可检测模块来标记反向引物，例如正向引物用FAM染料而反向引物用HEX染料。不同可检测模块的使用对于区分相同长度或长度非常相似的扩增产物而言是有用的。在一些实施方案中，用于金黄色葡萄球菌特异性基因的引物-探针用一种可检测标记物(例如FAM)来标记，而特异性针对mecA和mecC基因的每一个的引物-探针用不同的可检测标记物(例如CFR610)来标记。因此，在一些实施方案中，用两种不同的荧光染料来标记单个扩增中使用的不同的引物-探针。
在一些实施方案中，采用的探针是带有可检测标记的，并且检测是通过检测每个扩增产物的探针标记物来完成的。还可以将淬灭剂与可检测标记物相连，其能够放置在扩增探针的靶标之前检测标记物。TAQMAN探针是此类探针的例子。
在一些实施方案中，探针和引物对的引物之一可以组成同一分子的一部分。这称为引物-探针(例如SCORPION引物-探针)。在这些实施方案中，引物-探针还含有与淬灭剂相连的荧光团，以降低背景荧光。在用这种荧光标记的引物-探针进行PCR延伸后，将合成的靶区域附接至与探针相同的链。在变性时，引物-探针的探针部分与新产生的PCR产物的一部分特异性地杂交，将荧光团从淬灭剂物理性地分开，由此产生可检测信号。因此，在一些实施方案中，每个引物对的一个引物可以是在引物的5’末端处包含探针序列元件的引物-探针，其中所述探针元件还包含荧光团和淬灭剂。
在一些实施方案中，本发明的方法中采用的探针包含短的荧光标记的DNA序列或由其组成，所述荧光标记的DNA序列设计来用于检测具有遗传变异的DNA序列的节段，如French等，HyBeacon probes:a new tool for DNAsequence detection and allele discrimination,Mol Cell Probes,2001年12月；15(6):363-74中公开的那些，其通过引用在此以其整体并入。这种类型的探针内荧光分子的中心位置相对于在DNA探针末端具有信号传输化学作用的探针提供了一些优势。是此种类型的探针的例子。
靶核酸及引物
根据本发明，所公开的方法中使用寡核苷酸引物和探针来扩增和检测靶核酸，如特异性针对金黄色葡萄球菌的标志物基因的全部或部分，以及mecA基因和mecC基因的全部或部分。在一个实施方案中，该方法涉及采用特异性指向spa、mecA和mecC(包括这些基因的任意或全部的片段)的引物对。
此外，引物还可用于扩增一个或多个对照核酸序列。
利用针对每个靶标的单独标记物，本文所述的靶核酸可以单独地或以多重的形式来检测。在一个具体实施方案中，将荧光标记的引物-探针(如SCORPION引物-探针)用于特异性指向mecA基因的引物对中，并含有与针对mecC的引物对中的荧光标记的引物-探针相同的荧光标记物。
技术人员在本发明指导下能够设计并制备适于扩增靶核酸的引物。用于在本发明中使用的扩增引物的长度取决于一些因素，包括核苷酸序列同一性和这些核酸杂交的温度或在体外核酸扩增过程中使用的温度。对于确定特定序列同一性的扩增引物的优选长度所需的考量，是本领域普通技术人员所熟知的。
可以按照与设计引物相似的方式来设计用作杂交探针的寡核苷酸。正如寡核苷酸引物一样，寡核苷酸探针常常具有相似的熔化温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交但未长到降低合成期间的保真度的程度。寡核苷酸探针长度通常为15-60个核苷酸。
在一些实施方案中，提供的引物混合物在一个或多个核苷酸位置处具有简并性。简并引物用于PCR中，其中变异性存在于靶核酸序列中，即序列信息是不明确的。通常，简并引物会在引物内的不多于约4个、不多于约3个、优选为不多于约2个、且最优选为不多于约1个核苷酸位置处表现出变异性。
靶核酸可以是全部扩增的基因。或者，在一些实施方案中，靶基因是基因的片段或区段。所述片段可以来源于完全序列的任何区域，但根据本发明方法的片段长度通常为至少30、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少250或至少300个核苷酸。本领域技术人员会理解，具体靶核酸的尺寸和位置会控制扩增引物的选择，反之亦然。
用于扩增和检测特异性针对金黄色葡萄球菌的标志物基因的全部或片段的特异性的引物、探针和引物-探针包括指向在金黄色葡萄球菌中存在而在其他葡萄球菌菌种中不存在的序列的那些。特异性的标志物基因的例子包括但不限于：spa、agr、ssp蛋白酶、sir、sodM、cap、coa、α溶血素、γ溶血素、femA、Tuf、分选酶、纤维蛋白原结合蛋白、clfB、srC、sdrD、sdrE、sdrF、sdrG、sdrH、NAD合成酶、sar、sbi、rpoB、促旋酶A、和orfX。金黄色葡萄球菌特异性基因的检测有助于从可能含有其他低致病性菌种或菌株(例如表皮葡萄球菌)的样品区分含金黄色葡萄球菌的样品。合适的标志物基因是1.55kb spa基因(参见例如GenBank登录号NC_002952，范围125378-123828)。示例性的用于扩增和检测spa的引物和带标记的引物-探针序列包括：
金黄色葡萄球菌spa引物1：
5’d CTTGATAAAAAGCATTTTGTTGAGCTTCA 3’(SEQ ID NO:1)
金黄色葡萄球菌spa引物2：
5’TGCATCTGTAACTTTAGGTACATTA 3’(SEQ ID NO:3)
金黄色葡萄球菌spa标记的引物-探针：
5’d BHQ-1-agcggtGCAGCAGGTGTTACGCCACCgc-T(FAM)-间隔基18-TGCATCTGTAACTTTAGGTACATTA 3’(SEQ ID NO:2)
技术人员会理解，可以使用其他引物、探针、和引物-探针(包括其他SCORPION引物-探针)。
选择特异性的引物和探针来扩增和检测2.0kb mecC基因的片段(参见例如GenBank登录号FR821779，范围36219-36322)。
示例性的用于扩增和检测mecC的引物和带标记的引物-探针序列包括：
mecAh引物1：
5’d TCACCGATTCCCAAATCTTGC 3’(SEQ ID NO:4)
mecAh引物2：
5’AAGCAAGCAATAGAATCATCAGACA 3’(SEQ ID NO:6)
mecAh标记的引物-探针：
5’d CFR610-acgtgCCTAATGCTAATGCAATGCGGGCAcgt-BHQ-2-间隔基18-AAGCAAGCAATAGAATCATCAGACA 3’(SEQ ID NO:5)
技术人员会理解，可以使用指向mecC的其他引物、探针、和引物-探针(包括其他SCORPIONTM引物-探针)。
选择特异性的序列和探针来扩增和检测2.0kb mecA基因的片段(参见例如GenBank登录号X52593，范围1491-1519)。示例性的用于扩增和检测mecA的引物和带标记的引物-探针序列包括：
mecA引物1：
5’d TCTTCACCAACACCTAGTTTTTTCA 3’(SEQ ID NO:7)
mecA引物2：
5’GGTAATATCGACTTAAAACAAGCAATAGA 3’(SEQ ID NO:9)
mecA标记的引物-探针：
5’d CFR610acgcggcCTTACTGCCTAATTCGAGTGCTACTCTAGCgccgcgt-BHQ-2-间隔基18GGTAATATCGACTTAAAACAAGCA ATAGA 3’(SEQ ID NO:5)
因此，用本发明的方法对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的定量检测和区分可以利用包含引物-探针的引物对和用于在直接扩增盘上用集成循环仪系统扩增和检测金黄色葡萄球菌特异性基因spa、以及甲氧西林耐药性基因mecA和mecC的实时PCR。用该方法对靶核酸(如靶基因组DNA)进行特异性扩增并同时在同一反应中通过荧光标记的探针进行检测。spa引物对的引物-探针可以包含荧光素酰胺(例如FAM)标记物并且mecA和mecC引物对的每个引物-探针可以包含在可见光谱的红区中发荧光的氧杂蒽染料(例如CFR610)。
算法
在对样品-反应混合物进行实时PCR，并检测和测量与扩增的基因相关的荧光信号之时，本发明的方法还通过使用MRSA算法来确定MRSA的存在或不存在，其通过匹配来自扩增的靶核酸序列的循环阈值(Ct)来提供最终结果。优选地，用氧杂蒽染料(例如CFR610)标记的引物-探针来扩增mecA和mecC靶核酸，所述氧杂蒽染料在可见光谱的红区中发荧光，并用引物-探针来扩增spa靶核酸序列，所述引物-探针是用荧光素酰胺荧光团(如FAM)标记的。因而，mecA和/或mecC的信号(下文称为“mecA_C(CFR610通道)的Ct”)来自氧杂蒽染料且spa的信号(下文称为“SA(FAM通道)的Ct”)来自荧光素酰胺荧光团。
MRSA算法表明：
因此，可以基于如下情形来确定样品中MRSA的存在或不存在：
(1)当检测到金黄色葡萄球菌特异性基因(FAM信号)及mecA和/或mecC基因(CFR610信号)二者的荧光信号，并且满足以下条件时，确认所述生物样品中存在MRSA：
(a)SA的Ct(FAM通道)–mecA_C的Ct(CFR610通道)≤1.9(即来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸序列(例如spa)的循环阈值减去来自mecA和/或mecC靶核酸序列的循环阈值≤1.9)，或
(b)SA的Ct(FAM通道)–mecA_C的Ct(CFR610通道)>1.9，且mecA_C的Ct(CFR610通道)+1.9<SA的Ct(FAM通道)(即来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸序列(例如spa)的循环阈值减去来自mecA和/或mecC靶核酸序列的循环阈值>1.9，且来自mecA和/或mecC靶核酸序列的循环阈值加1.9<来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸序列的循环阈值)
(2)当检测到金黄色葡萄球菌特异性靶核酸序列(FAM信号)和mecA和/或mecC靶核酸序列(CFR610信号)二者的荧光信号，并且满足以下条件时，确定样品中存在金黄色葡萄球菌和至少一个甲氧西林耐药性基因：
SA的Ct(FAM通道)–mecA_C的Ct(CFR610通道)<1.9，且SA的Ct(FAM通道)+1.9<mecA_C的Ct(CFR610通道)(即来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸序列的循环阈值减去来自mecA和/或mecC靶核酸序列的循环阈值<1.9，且来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸序列的循环阈值加1.9<来自mecA和/或mecC靶核酸序列的循环阈值)。
在这种情况下，样品中存在金黄色葡萄球菌以及甲氧西林耐药性基因，但该甲氧西林耐药性基因可以来自金黄色葡萄球菌或来自同一样品中的凝固酶阴性的葡萄球菌属。
(3)具有针对金黄色葡萄球菌特异性靶核酸序列的可检测信号(FAM)但没有针对mecA和/或mecC的可检测CFR610信号的样品，解释为含有金黄色葡萄球菌但不含MRSA。
(4)如果未检测到针对金黄色葡萄球菌靶核酸序列的信号(FAM)且同样未检测到针对mecA或mecC的信号(CFR610)，则该样品解释为金黄色葡萄球菌及MRSA阴性。
试剂盒
本发明还提供包含寡核苷酸(其可以是引物或引物-探针)的试剂盒，其用于按本文所述进行扩增以确定生物样品中MRSA的存在或不存在。本发明的试剂盒还可以包含寡核苷酸(其可用作探针来检测扩增的核酸)，和/或一个或多个用于消化非靶标核酸的限制酶，以通过寡核苷酸引物增加对靶核酸的检测。
在一些实施方案中，试剂盒包含：
(i)在严格条件下与特异性针对金黄色葡萄球菌的靶标志物基因区段特异性地杂交的第一引物对，
(ii)在严格条件下与靶mecA基因区段特异性地杂交的第二引物对，和
(iii)在严格条件下与靶mecC基因区段特异性地杂交的第三引物对。
第一引物对可以与spa基因特异性地杂交，并且可以由包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸以及包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸或由SEQ ID NO:2组成的引物-探针的任一个组成。第二引物对可以由包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸以及包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸或由SEQ ID NO:5组成的引物-探针的任一个组成。第三引物对可以由包含SEQ ID NO:7的寡核苷酸以及包含SEQ ID NO:9的寡核苷酸或由SEQ ID NO:8组成的引物-探针的任一个组成。
试剂盒可以额外地包含用于在测定中使用所述寡核苷酸的测定定义扫描卡和/或说明，如印刷的或电子的说明。在一些实施方案中，试剂盒包含用于分析生物样品以确定MRSA的存在或不存在的说明。在一些实施方案中，试剂盒包含扩增反应混合物或扩增主混合液。试剂盒中所含的试剂可以包含于一个或多个容器，例如小瓶中。
特异性针对扩增和检测内部对照的引物、探针、和/或引物-探针可包含于扩增主混合液中作为靶引物对，以监测潜在的PCR抑制。可将用于扩增和检测靶标和内部对照的必需试剂配制为一体式扩增主混合液，其可以作为单反应小份试样在试剂盒中提供。
实施例
实施例1
在合适的收集装置中获取来自个体的鼻拭子样品。将50μl的未经处理的鼻拭子样品直接加载至SIMPLEXA直接扩增盘(Focus Diagnostics,Inc.,Cypress,CA,USA)的楔1的样品孔中，而没有单独的前端样品制备步骤。吸取50μl的扩增主混合液至盘的楔1的样品孔中，其中所述扩增主混合液含有PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、氯化镁、氯化钾、硫酸铵、由SEQ ID NO:1、2、4、5、7和8组成的引物以及内部对照DNA片段和特异性针对对照片段的引物对。由SEQ ID NO:2、5和8组成的引物是SCORPION引物-探针并且用FAM(SEQ ID NO:2)和CFR610(SEQ ID NO:6和8)标记。
用箔将楔封住，然后将直接扩增盘插入至3MTM集成循环仪(3M,St.Paul,MN,USA)中并且RT-PCR在循环仪中开始。PCR循环条件包括如下步骤：i)于97℃处样品预热480秒，1个循环，ii)于97℃处聚合酶活化120秒，1个循环，iii)于97℃处变性10秒，及58℃处退火30秒，37个循环。
特异性地扩增靶基因组DNA并同时通过荧光标记的引物-探针在同一反应中对其进行检测。通过如下MRSA算法来确定MRSA的存在，该算法通过匹配FAM和CFR610通道中的循环阈值(Ct)提供最终结果：
如果：
1)SA(FAM通道)的Ct-mecA_C(CFR610通道)的Ct≤1.9，或
2)SA(FAM通道)的Ct-mecA_C(CFR610通道)的Ct>1.9且mecA_C(CFR610通道)的Ct+1.9<SA(FAM通道)的Ct
则将在FAM和CFR610通道中有信号的样品解释为MRSA。
如果：
1)SA(FAM通道)的Ct-mecA_C(CFR610通道)的Ct<1.9且SA(FAM通道)的Ct+1.9<mecA_C(CFR610通道)的Ct
则将在FAM和CFR610通道中有信号的样品解释为耐甲氧西林的SA(SA,meth resist)。
除另有限定外，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员的通常理解的相同含义。
本文说明性地描述的发明，可以适当地在缺少任一要素或任意多个要素、任一限定或任意多个限定的条件的情况下实施，这些要素或限定条件的省略没有在本文中具体公开。此外，本文采用的术语和表达方式用作描述性术语而非限定性术语，并且在对这些术语和表达方式的使用中并不意在将显示和描述的特征及其部分的任何等效物排除在外，而是公认在本发明要求保护的范围内多种修改都是可能的。
因此，应当理解，虽然本发明通过优选的实施方案和最优的特征来进行了具体公开，但在其中体现的对于本文公开的发明修改、改进和变化是本领域技术人员可以采取的，并且这些修改、改进和变化视为在本发明的范围内。此处提供的材料、方法、和实施例代表优选的实施方案，是示例性的，并且不是意在限制本发明的范围。
本文广泛地且类属性地(generically)描述了本发明。落在类属性公开内的每个较窄的种类和亚类属(subgeneric)分组也形成本发明的一部分。这包括对本发明的类属性描述，以及附带条件或从该类属去除任何主题的否定性限制，无论切离的(excised)材料是否在本文具体记载。
此外，当本发明的特征或方面以马库什组群来描述时，本领域技术人员会认识到本发明还由此以马库什组群的任何单个成员或成员亚组得以描述。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利、和其他参考文献在此通过引用以其整体明确并入，其程度如同其各自通过引用单独并入一样。在冲突情况下，以本说明书(包括定义)为准。
其他实施方案示于所附的权利要求书中。

Claims (20)

1.一种用于在生物样品中确定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的存在或不存在的方法，其包括：
(a)将所述生物样品与如下项接触：
(i)在严格条件下与特异性针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的靶核酸区段(如果存在的话)特异性地杂交的第一引物对，
(ii)在严格条件下与靶mecA核酸区段(如果存在的话)特异性地杂交的第二引物对，和
(iii)在严格条件下与靶mecC核酸区段(如果存在的话)特异性地杂交的第三引物对，
以产生反应-样品混合物，其中每个引物对的至少一个引物与荧光团标签相连，
(b)使所述反应-样品混合物处于实时聚合酶链式反应(PCR)条件，在该条件下所述生物样品中存在的每个靶核酸经扩增产生荧光信号，
(c)测量每个荧光团产生的荧光信号的量，及
(d)通过比较来自靶标志物核酸的荧光量，确定MRSA的存在或不存在，其中
(i)当检测到金黄色葡萄球菌特异性靶核酸以及mecA和/或mecC核酸二者的荧光信号时，且
(1)来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸的循环阈值(Ct)减去来自mecA和/或mecC核酸的Ct≤1.9，或
(2)来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸的Ct减去来自mecA和/或mecC核酸的Ct>1.9且来自mecA和/或mecC核酸的Ct加1.9<来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸的Ct，
则确定生物样品中存在MRSA；
(ii)当检测到金黄色葡萄球菌特异性靶核酸及mecA和/或mecC核酸二者的Ct，且来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸的Ct减去来自mecA和/或mecC核酸的Ct<1.9，且来自金黄色葡萄球菌特异性靶核酸的Ct加1.9<来自mecA和/或mecC核酸的Ct时，确定生物样品中存在金黄色葡萄球菌和甲氧西林耐药性基因；或
(iii)若检测到金黄色葡萄球菌特异性靶核酸序列的荧光信号但未检测到mecA和/或mecC的荧光信号，则在生物样品中确定存在金黄色葡萄球菌且确定不存在MRSA。
2.权利要求1的方法，其中每个引物对的一个引物是在引物的5’端包含探针序列元件的引物-探针，其中所述探针序列元件还包含荧光团和淬灭剂，并且其中mecA引物的荧光团和mecC引物的荧光团是相同的。
3.权利要求1的方法，其中在与所述生物样品接触前，所有引物对一起包含于扩增主混合液中，所述混合物还包含DNA聚合酶、dNTP和PCR缓冲液。
4.权利要求1的方法，其中步骤(a)还包括将所述生物样品与第四引物对接触，所述第四引物对在严格条件下与对照靶核酸区段特异性地杂交。
5.权利要求2的方法，其中所述特异性针对金黄色葡萄球菌的靶核酸包含选自下组的基因序列的全部或部分：spa、agr、ssp蛋白酶、sir、sodM、cap、coa、α溶血素、γ溶血素、femA、Tuf、分选酶、纤维蛋白原结合蛋白、clfB、srC、sdrD、sdrE、sdrF、sdrG、sdrH、NAD合成酶、sar、sbi、rpoB、促旋酶A、和orfX。
6.权利要求5的方法，其中所述特异性针对金黄色葡萄球菌的靶核酸是spa。
7.权利要求6的方法，其中所述第一引物对由包含SEQ ID NO:1的第一引物和包含SEQ ID NO:2的第二引物组成。
8.权利要求7的方法，其中所述第二引物对由包含SEQ ID NO:4的第一引物和包含SEQ ID NO:6的第二引物组成。
9.权利要求8的方法，其中所述第三引物对由包含SEQ ID NO:7的第一引物和包含SEQ ID NO:9的第二引物组成。
10.权利要求6的方法，其中所述spa引物-探针包含荧光素酰胺荧光团且mecA和mecC引物-探针包含在可见光谱的红区中发荧光的氧杂蒽染料。
11.一种用于在生物样品中确定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在或不存在的试剂盒，其包含
(i)在严格条件下与特异性针对金黄色葡萄球菌的靶核酸区段特异性地杂交的第一引物对，
(ii)在严格条件下与靶mecA核酸区段特异性地杂交的第二引物对，和
(iii)在严格条件下与靶mecC核酸区段特异性地杂交的第三引物对，
其中每个引物对的一个引物是在引物的5’端包含探针序列元件的引物-探针，其中所述探针序列元件还包含荧光团和淬灭剂，并且其中mecA引物的荧光团和mecC引物的荧光团是相同的。
12.权利要求12的试剂盒，其还包含在严格条件下与对照基因序列特异性地杂交的引物对。
13.权利要求13的试剂盒，其中所有引物对一起存在于扩增主混合液中，所述混合物还包含DNA聚合酶、dNTP和PCR缓冲液。
14.权利要求12的试剂盒，其中所述特异性针对金黄色葡萄球菌的靶核酸选自下组：spa、agr、ssp蛋白酶、sir、sodM、cap、coa、α溶血素、γ溶血素、femA、Tuf、分选酶、纤维蛋白原结合蛋白、clfB、srC、sdrD、sdrE、sdrF、sdrG、sdrH、NAD合成酶、sar、sbi、rpoB、促旋酶A、和orfX。
15.权利要求15的试剂盒，其中所述特异性针对金黄色葡萄球菌的靶核酸是spa。
16.权利要求16的试剂盒，其中所述第一引物对由包含SEQ ID NO:1的第一引物和包含SEQ ID NO:2的第二引物组成。
17.权利要求17的试剂盒，其中所述第二引物对由包含SEQ ID NO:4的第一引物和包含SEQ ID NO:6的第二引物组成。
18.权利要求18的试剂盒，其中所述第三引物对由包含SEQ ID NO:7的第一引物和包含SEQ ID NO:9的第二引物组成。
19.权利要求19的试剂盒，其中所述spa引物-探针包含荧光素酰胺荧光团且mecA和mecC引物-探针包含在可见光谱的红区中发荧光的氧杂蒽染料。
20.权利要求12的试剂盒，其还包含印刷的或电子的说明。
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