CN108034735A - 一种关节假体感染诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种关节假体感染诊断试剂盒，包括引物、无镁离子PCR反应缓冲液、MgCl2、Taq聚合酶、dNTP混合物及ddH2O，所述引物包括通用引物、特异性引物及内参引物，所述特异性引物组成如下：ica D基因检测引物、eno基因检测引物、sar A基因检测引物、agr基因检测引物、Mec A基因检测引物及Mre B基因检测引物。本发明对于关节假体感染诊断尤其是早期诊断的灵敏度和特异度高，检测准确性高，在关节假体感染未出现临床症状的早起就能快速准确检测出感染的发生，能够及时采取治疗措施，防止病情的进一步恶化。

Description

一种关节假体感染诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及关节假体感染诊断技术领域，特别涉及一种关节假体感染诊断试剂盒。
背景技术
关节假体术后感染（PJI，Prosthetic joint infections）是关节置换术后公认最严重的并发症之一，虽然PJI的发病率并不高，但自抗生素应用以来一直没有显著降低。据报道，髋和肩PJI的发病率约为1%，膝PJI的发病率约为2%，肘PJI的发病率约为9%；而对于关节翻修术，PJI的发病率甚至高达40%；另外，导致全踝关节置换手术失败的并发症中有33%是PJI。
当今，在面对PJI时，临床医生感到最困扰的问题就是早期诊断困难，当出现临床感染症状时多为晚期，常延误治疗并导致手术的失败和关节功能的丧失。PJI 的发病机制与假体表面生物膜的形成有关，关节假体术后生物膜形成很快，致病菌黏附于假体表面组成生物膜结构，导致PJI早期的临床标本中罕见常规培养阳性的浮游菌。所以，在PJI早期，临床上收集的关节液、血液及周围组织等标本中致病菌培养检测的敏感度极低；即使少量浮游菌从生物膜脱落进入临床标本，机体免疫机制的杀灭作用也会降低其培养检测的敏感度；另外，抗生素的使用会诱导致病菌的生长模式进入一种“活的非可培养状态”，这也进一步降低PJI早期标本培养检测的敏感度。不难想象，随着病例随访时间的延长，临床医生可能会困惑于“为什么PJI的发病率要比文献报道的数据高得多”，因此，迫切需要开展PJI早期诊断的研究工作。
对于PJI诊断当前临床上一直在应用的传统微生物培养技术，早在140 多年前就开始应用至今，且无根本性的改进，用其对PJI致病菌的流行病学分析并不准确。其原因包括：许多PJI的致病菌因为呈生物膜生长状态或需要特殊培养条件，常规培养检测的敏感度不高；低毒力致病菌（通常是皮肤的正常菌群，如凝固酶阴性葡萄球菌和丙酸杆菌）培养的阳性结果难以与标本污染相鉴别，常规培养检测的特异度不高；而抗生素的使用会使得致病菌进入一种“活的非可培养”生长状态，常规培养检测的敏感度不高。
PJI早期诊断技术的研究：至今，临床上依然没有准确可靠的PJI早期诊断技术，因为传统的标本培养技术敏感度极低，医生往往只能依靠个人的临床经验怀疑PJI发病的可能性。据国内学者报道，初次人工全膝关节置换术后PJI常规培养的敏感度只有65.5%。炎症标志物（白细胞计数、C 反应蛋白及红细胞沉降率）是临床实验室最常用的检测指标，但其对PJI早期诊断的特异度低。
近年来，许多研究者尝试寻找其他能够早期提示PJI的炎性标志物，如白细胞介素-6和降钙素原具有更高的特异度，但白细胞介素-6作为诊断指标的有效性尚需足够临床数据的支持，而降钙素原的敏感度也只有33%。术后早期出现疼痛症状仅提示PJI的可能性，其特异度不高；关节假体置换术后出现脓肿、窦道形成等临床症状时已是PJI的中晚期。因此，PJI早期高敏感度和特异度的诊断技术是当前亟待解决的难题。
根据PJI的特殊发病机制，如果将离体假体表面固定后通过扫描电镜观察或者荧光染色后通过激光共聚焦显微镜观察将能够明确诊断PJI，但受限于技术条件的影响，临床难以常规开展这两项技术；国外学者报道取出假体收集其超声振荡液进行致病菌培养来诊断PJI具有更高的敏感度和特异度；不过该项技术的关键还依赖于传统的微生物培养技术，仍然难以避免致病菌进入“活的非可培养状态”或者某些致病菌离体培养困难所致的假阴性结果，对PJI诊断的敏感度并没有初始想象的那样高；而且仅仅因为诊断的需要就提前取出假体等若宣告手术的失败，因此在PJI早期只能寻求常规的临床标本来替代假体用于诊断。另外，据报道，临床各种标本中“活的非可培养状态” 的致病菌和离体培养困难的致病菌都可以通过分子生物学技术检测。
对于PJI的诊断，无论是哪种标本，致病菌培养结果的敏感度和特异度都不够高，而分子生物学技术，如聚合酶链反应（PCR）鉴定细菌的DNA，对PJI的诊断具有非常重要的潜在应用价值。PCR技术不依靠传统的微生物培养，能够高效地检测出标本中生物膜和“活的非可培养”生长状态的致病菌。因此，近年来诸多研究尝试将其用于PJI的早期诊断，但至今尚无公认的PJI早期基因诊断技术。原核细胞特异性核糖体基因（16S rRNA）是有别于真核细胞为所有原核细胞所共有的基因，该基因存在于所有细菌及衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、放线菌等原核生物的染色体中，故用其作为检测致病菌的指标，理论上具有极高的敏感度；但若仅以此作为PJI早期诊断的指标，其特异度不够高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种关节假体感染诊断试剂盒，对于关节假体感染诊断尤其是早期诊断的灵敏度和特异度高，检测准确性高，在关节假体感染未出现临床症状的早起就能快速准确检测出感染的发生，能够及时采取治疗措施，防止病情的进一步恶化。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种关节假体感染诊断试剂盒，包括引物、无镁离子PCR反应缓冲液、MgCl2、Taq 聚合酶、dNTP混合物及ddH2O，所述引物包括通用引物、特异性引物及内参引物，所述特异性引物组成如下：
ica D基因检测引物：上游引物5'-ATCGTTGTGATGATTGTTTA-3'和下游引物5'-GATATGTCACGACCTTTCTT-3'；
eno基因检测引物：上游引物5'-ACGTGCAGCAGCTGACT-3'和下游引物5'-CAACAGCATYCTTCAGTACCTTC-3'；
sar A基因检测引物：上游引物5'-CATCAGCGAAAAGAGAAA-3'和下游引物5'-TGTTTGCTTCAGTAATTCGTTT-3'；
agr基因检测引物：上游引物5'-GCGCCATAGGATTGTAGAGTG-3'和下游引物5'-CTCAGTAAGAATCCATTTCGCCC-3'；
Mec A基因检测引物：上游引物5'-TATTAGGTTATGTTGGTCCC-3'和下游引物5'-TGTATGTGCGATTGTATTGC-3'；
Mre B基因检测引物：上游引物5'-GGGTCGTACACCTGGTAACATT-3'和下游引物5'-GAACTTCATCACCTGGGTAAGC-3'。
本发明针对关节假体感染早期诊断难点，开发了特定的检测试剂盒，针对特定的基因设计了灵敏度和特异度高的特异性引物，极大地提高了对于关节假体感染早期诊断的检测准确性。
所述通用引物为16s rRNA基因检测引物：
上游引物5'-TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA-3'，
下游引物5'-GGTTTCGCTGCCCTTTGTATTGT-3'。
所述内参引物为gyrB基因检测引物：
上游引物5'-TTATGGTGCTGGACAGATACA-3'，
下游引物5'-CACCGTGAAGACCGCCAGATA-3'。
所述关节假体感染诊断试剂盒检测时的检测反应体系如下：
模板3μL，
10×无镁离子PCR反应缓冲液 5μL，
dNTP混合物3μL，浓度各200μmol/L；
MgCl2 3μL，浓度1.5mmol/L；
Taq 聚合酶0.25μL，浓度10U/μL；
目的基因的上游引物2μL，浓度10pmol/L；
目的基因的下游引物2μL，浓度10pmol/L；
gyrB基因检测引物的上游引物2μL，浓度10pmol/L；
gyrB基因检测引物的下游引物2μL，浓度10pmol/L；
ddH2O补足至50μL。
目的基因的上游引物及下游引物选自16s rRNA基因检测引物、ica D基因检测引物、eno基因检测引物、sar A基因检测引物、agr基因检测引物、Mec A基因检测引物、Mre B基因检测引物的中的一种。
一种用于关节假体感染早期诊断的引物，包括通用引物、特异性引物及内参引物，所述特异性引物组成如下：
ica D基因检测引物：上游引物5'-ATCGTTGTGATGATTGTTTA-3'和下游引物5'-GATATGTCACGACCTTTCTT-3'；
eno基因检测引物：上游引物5'-ACGTGCAGCAGCTGACT-3'和下游引物5'-CAACAGCATYCTTCAGTACCTTC-3'；
sar A基因检测引物：上游引物5'-CATCAGCGAAAAGAGAAA-3'和下游引物5'-TGTTTGCTTCAGTAATTCGTTT-3'；
agr基因检测引物：上游引物5'-GCGCCATAGGATTGTAGAGTG-3'和下游引物5'-CTCAGTAAGAATCCATTTCGCCC-3'；
Mec A基因检测引物：上游引物5'-TATTAGGTTATGTTGGTCCC-3'和下游引物5'-TGTATGTGCGATTGTATTGC-3'；
Mre B基因检测引物：上游引物5'-GGGTCGTACACCTGGTAACATT-3'和下游引物5'-GAACTTCATCACCTGGGTAAGC-3'。
所述通用引物为16s rRNA基因检测引物：
上游引物5'-TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA-3'，
下游引物5'-GGTTTCGCTGCCCTTTGTATTGT-3'。
所述内参引物为gyrB基因检测引物：
上游引物5'-TTATGGTGCTGGACAGATACA-3'，
下游引物5'-CACCGTGAAGACCGCCAGATA-3'。
本发明的有益效果是：对于关节假体感染诊断尤其是早期诊断的灵敏度和特异度高，检测准确性高，在关节假体感染未出现临床症状的早起就能快速准确检测出感染的发生，能够及时采取治疗措施，防止病情的进一步恶化。
附图说明
图1是关节假体感染检测策略图。
图2是本发明试剂盒检测后的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
10×无镁离子PCR反应缓冲液（10×PCR buffer，无镁离子，市售，宝生物工程（大连）有限公司）。所有引物均委托生物公司合成。
实施例：
一种关节假体感染诊断试剂盒，包括引物、无镁离子PCR反应缓冲液、MgCl2、Taq 聚合酶、dNTP混合物及ddH2O，所述引物包括通用引物、特异性引物及内参引物，所述特异性引物组成如下：
ica D基因检测引物：上游引物5'-ATCGTTGTGATGATTGTTTA-3'（SEQ ID No.3）和下游引物5'-GATATGTCACGACCTTTCTT-3'（SEQ ID No.4）；
eno基因检测引物：上游引物5'-ACGTGCAGCAGCTGACT-3'（SEQ ID No.5）和下游引物5'-CAACAGCATYCTTCAGTACCTTC-3'（SEQ ID No.6）；
sar A基因检测引物：上游引物5'-CATCAGCGAAAAGAGAAA-3'（SEQ ID No.7）和下游引物5'-TGTTTGCTTCAGTAATTCGTTT-3'（SEQ ID No.8）；
agr基因检测引物：上游引物5'-GCGCCATAGGATTGTAGAGTG-3'（SEQ ID No.9）和下游引物5'-CTCAGTAAGAATCCATTTCGCCC-3'（SEQ ID No.10）；
Mec A基因检测引物：上游引物5'-TATTAGGTTATGTTGGTCCC-3'（SEQ ID No.11）和下游引物5'-TGTATGTGCGATTGTATTGC-3'（SEQ ID No.12）；
Mre B基因检测引物：上游引物5'-GGGTCGTACACCTGGTAACATT-3'（SEQ ID No.13）和下游引物5'-GAACTTCATCACCTGGGTAAGC-3'（SEQ ID No.14）。
所述通用引物为16s rRNA基因检测引物：
上游引物5'-TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA-3'（SEQ ID No.1），
下游引物5'-GGTTTCGCTGCCCTTTGTATTGT-3'（SEQ ID No.2）。
所述内参引物为gyrB基因检测引物：
上游引物5'-TTATGGTGCTGGACAGATACA-3'（SEQ ID No.15），
下游引物5'-CACCGTGAAGACCGCCAGATA-3'（SEQ ID No.6）。
基因表达的检测：
1、样本制备：不同关节假体材料（钛合金、PMMA骨水泥、超高分子量聚乙烯）制作实验样本，在其表面接种从临床PJI分离的最常见致病菌：金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、生物膜阳性的表皮葡萄球菌标准株（ATCC 35984）和大肠杆菌标准株(ATCC 25922)。
2、总RNA提取：每个样本取出后放入10ml无菌RNAprotect保护液中，置涡旋振荡器振荡30s，然后放入超声仪（频率：40±2 kHz，功率密度：0.22±0.04 W/cm2）超声 5min后取出，再次转移至涡旋振荡器震荡30s。超声振荡液离心后用含有100µg/ml溶葡萄球菌酶（Sigma公司）的TE缓冲液200µl溶解菌珠，并在37℃下孵育10min。总RNA提取用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen公司），所用的方法按照其说明书进行。
3、逆转录：提取的总RNA采用市售的BIO-RAD(伯乐)逆转录试剂盒按照其说明书进行逆转录，获得cDNA作为PCR检测模板。
4、PCR扩增：
取逆转录反应产物进行PCR反应，反应体系如下：
逆转录反应产物cDNA（模板）3μL，
10×无镁离子PCR反应缓冲液 5μL，
dNTP混合物3μL，浓度各200μmol/L；
MgCl2 3μL，浓度1.5mmol/L；
Taq 聚合酶0.25μL，浓度10U/μL；
目的基因的上游引物2μL，浓度10pmol/L；
目的基因的下游引物2μL，浓度10pmol/L；
gyrB基因检测引物的上游引物2μL，浓度10pmol/L；
gyrB基因检测引物的下游引物2μL，浓度10pmol/L；
ddH2O补足至50μL。
反应程序为：(1) 94℃，预变性5min；(2) 94℃变性，40 sec；60℃退火，40sec；72℃延伸，40sec；28 个循环；(3) 72℃终止，7min。
目的基因的上游引物及下游引物选自16s rRNA基因检测引物、ica D基因检测引物、eno基因检测引物、sar A基因检测引物、agr基因检测引物、Mec A基因检测引物、Mre B基因检测引物的中的一种（即每种引物单独加入上述PCR扩增体系进行扩增）。
如图1所示，本发明的检测策略为：如果16S rRNA 的检测结果为阴性，则排除PJI；如果16S rRNA 的检测结果为阳性，则需要进一步针对PJI常见致病菌的特异基因分型进行检测。
icaADBC 是调节葡萄球菌生物膜形成的最主要相关基因，其中以ica D在葡萄球菌生物膜的检出率为最高；eno 基因编码所有葡萄球菌的层粘连蛋白结合蛋白，也是一种生物膜相关基因，其在葡萄球菌生物膜中的检出率更高，在凝固酶阴性葡萄球菌生物膜的检出率也高达92.6%；sar A 和agr 基因可以调节不依赖于ica 基因的葡萄球菌生物膜形成；我们认为ica D、eno 基因、sar A 和agr基因可以作为PJI早期诊断的特异基因型，若16S rRNA 的检测结果为阳性，结合上述四者任一基因型的阳性结果即可做出PJI的诊断，并确诊其致病菌为葡萄球菌。
Mec A 是耐甲氧西林葡萄球菌的主要耐药因子，金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌对甲氧西林耐药后都可产生该基因，临床上PJI 致病菌绝大多数为耐药菌株，故在16S rRNA检测结果为阳性后，再检测出该基因即可确诊PJI，且能够提示致病菌为耐药葡萄球菌。MreB 是一种表达类肌动蛋白的基因，存在于所有非球状细菌，16S rRNA 检测结果为阳性再结合该基因的阳性结果也可确诊PJI，且提示致病菌为非球状菌株。若16S rRNA 检测结果为阳性，而一系列特异基因型检测结果为阴性，可暂时排除PJI的诊断。
5、PCR产物电泳：PCR产物经凝胶电泳，感染样本的凝胶电泳结果如图2所示，16srRNA基因检测引物、ica D基因检测引物、eno基因检测引物、sar A基因检测引物、agr基因检测引物、Mec A基因检测引物、Mre B基因检测引物均能出现扩增条带。
采用本发明的试剂盒，对20份动物感染模型进行检测，检测准确率为100%，对10份临床确证的感染样本进行检测，检测准确率也为100%。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 宁波市医疗中心李惠利医院
<120> 一种关节假体感染诊断试剂盒
<130> 2017.11
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 1
tcgtgtcgtg agatgttggg tta 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 2
ggtttcgctg ccctttgtat tgt 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 3
atcgttgtga tgattgttta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 4
gatatgtcac gacctttctt 20
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 5
acgtgcagca gctgact 17
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 6
caacagcaty cttcagtacc ttc 23
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 7
catcagcgaa aagagaaa 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 8
tgtttgcttc agtaattcgt tt 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 9
gcgccatagg attgtagagt g 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 10
ctcagtaaga atccatttcg ccc 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 11
tattaggtta tgttggtccc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 12
tgtatgtgcg attgtattgc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 13
gggtcgtaca cctggtaaca tt 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 14
gaacttcatc acctgggtaa gc 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 15
ttatggtgct ggacagatac a 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 16
caccgtgaag accgccagat a 21

Claims (8)

1.一种关节假体感染诊断试剂盒，其特征在于，包括引物、无镁离子PCR反应缓冲液、MgCl2、Taq 聚合酶、dNTP混合物及ddH2O，所述引物包括通用引物、特异性引物及内参引物，所述特异性引物组成如下：
ica D基因检测引物：上游引物5'-ATCGTTGTGATGATTGTTTA-3'和下游引物5'-GATATGTCACGACCTTTCTT-3'；
eno基因检测引物：上游引物5'-ACGTGCAGCAGCTGACT-3'和下游引物5'-CAACAGCATYCTTCAGTACCTTC-3'；
sar A基因检测引物：上游引物5'-CATCAGCGAAAAGAGAAA-3'和下游引物5'-TGTTTGCTTCAGTAATTCGTTT-3'；
agr基因检测引物：上游引物5'-GCGCCATAGGATTGTAGAGTG-3'和下游引物5'-CTCAGTAAGAATCCATTTCGCCC-3'；
Mec A基因检测引物：上游引物5'-TATTAGGTTATGTTGGTCCC-3'和下游引物5'-TGTATGTGCGATTGTATTGC-3'；
Mre B基因检测引物：上游引物5'-GGGTCGTACACCTGGTAACATT-3'和下游引物5'-GAACTTCATCACCTGGGTAAGC-3'。
2.根据权利要求1所述的一种关节假体感染诊断试剂盒，其特征在于，所述通用引物为16s rRNA基因检测引物：
上游引物5'-TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA-3'，
下游引物5'-GGTTTCGCTGCCCTTTGTATTGT-3'。
3.根据权利要求1所述的一种关节假体感染诊断试剂盒，其特征在于，所述内参引物为gyrB基因检测引物：
上游引物5'-TTATGGTGCTGGACAGATACA-3'，
下游引物5'-CACCGTGAAGACCGCCAGATA-3'。
4.根据权利要求1所述的一种关节假体感染诊断试剂盒，其特征在于，所述关节假体感染诊断试剂盒检测时的检测反应体系如下：
模板3μL，
10×无镁离子PCR反应缓冲液 5μL，
dNTP混合物3μL，
MgCl2 3μL，
Taq 聚合酶0.25μL，
目的基因的上游引物2μL，
目的基因的下游引物2μL，
gyrB基因检测引物的上游引物2μL，
gyrB基因检测引物的下游引物2μL，
ddH2O补足至50μL。
5.根据权利要求4所述的一种关节假体感染诊断试剂盒，其特征在于，目的基因的上游引物及下游引物选自16s rRNA基因检测引物、ica D基因检测引物、eno基因检测引物、sarA基因检测引物、agr基因检测引物、Mec A基因检测引物、Mre B基因检测引物的中的一种。
6.一种用于关节假体感染早期诊断的引物，包括通用引物、特异性引物及内参引物，其特征在于，所述特异性引物组成如下：
ica D基因检测引物：上游引物5'-ATCGTTGTGATGATTGTTTA-3'和下游引物5'-GATATGTCACGACCTTTCTT-3'；
eno基因检测引物：上游引物5'-ACGTGCAGCAGCTGACT-3'和下游引物5'-CAACAGCATYCTTCAGTACCTTC-3'；
sar A基因检测引物：上游引物5'-CATCAGCGAAAAGAGAAA-3'和下游引物5'-TGTTTGCTTCAGTAATTCGTTT-3'；
agr基因检测引物：上游引物5'-GCGCCATAGGATTGTAGAGTG-3'和下游引物5'-CTCAGTAAGAATCCATTTCGCCC-3'；
Mec A基因检测引物：上游引物5'-TATTAGGTTATGTTGGTCCC-3'和下游引物5'-TGTATGTGCGATTGTATTGC-3'；
Mre B基因检测引物：上游引物5'-GGGTCGTACACCTGGTAACATT-3'和下游引物5'-GAACTTCATCACCTGGGTAAGC-3'。
7.根据权利要求6所述的引物，其特征在于，所述通用引物为16s rRNA基因检测引物：
上游引物5'-TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA-3'，
下游引物5'-GGTTTCGCTGCCCTTTGTATTGT-3'。
8.根据权利要求6所述的引物，其特征在于，所述内参引物为gyrB基因检测引物：
上游引物5'-TTATGGTGCTGGACAGATACA-3'，
下游引物5'-CACCGTGAAGACCGCCAGATA-3'。
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