CN107312833A - 用于检测人类brca1基因突变的lsp引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物及试剂盒，其中，该LSP引物的5’端为一段带有不同双荧光标记的线型探针，3’端为一段与模板互补的序列，两段序列之间用Spacer18进行连接；当模板存在时，该LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，该LSP引物的5’端探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下，剪切探针部分，从而发光。本发明的LSP引物检测的特异性好，灵敏度高，相近基因型间互不干扰，检测结果具有更高的荧光信噪比。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物及试剂盒。
背景技术
乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibllity gene1，BRCA1)是一种肿瘤抑癌基因，该基因位于17q12-21区，基因组长约80Kb，编码区5711bp，共24个外显子，编码一个具有1863个氨基酸残基的蛋白质。BRCA1蛋白具有N-端锌指结构域、BRCA1C末端基序(BRCT)、Rad51结合区、核定位区和转录活性区等5个特征性结构域。BRCA1蛋白参与DNA损伤修复、转录活化与抑制、细胞周期的调节、中心体复制的负性调节、对肿瘤生长起负性调节作用、在维持基因组稳定性中起重要作用。若BRCA1基因发生突变，导致损伤的双链DNA不能得到修复，引起P53水平升高，继而P21升高，导致细胞凋亡和细胞周期停滞。如果是P53的基因修复失败，细胞过度增殖，从而导致肿瘤的发生。
BRCA1基因可发生多形式、多位点基因突变，主要有移码突变、错义突变、无义突变。研究表明，BRCA1基因突变会导致家族遗传性乳腺癌及卵巢癌，带有BRCA1基因突变的患者一生中罹患乳腺癌的几率为40％-87％，卵巢癌的几率为16％-60％，除此之外也容易患其他癌症。通过检测BRCA1基因突变，能够凭借乳腺癌患病风险及采取预防措施，降低乳腺癌或卵巢癌的发病率。
目前用于BRCA1突变检测方法的金标准为测序法技术。测序法是基因突变检测的可靠方法，也是应用最多的方法。其需要对样品进行扩增、纯化、序列分析，所需的时间长，成本高，对取材和技术的要求都比较高，最重要的是限制灵敏度不高，只能对含量大于30％的突变基因进行检测，对环境和操作者有危害，因此在临床应用上具有一定的限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物及试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物，所述LSP引物的5’端为一段带有不同双荧光标记的线型探针，3’端为一段与模板互补的序列，两段序列之间用Spacer18进行连接；
当模板存在时，所述LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，所述LSP引物的5’端探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下剪切探针部分，从而发光。
进一步的，所述BRCA1基因的引物序列如SEQ ID NO:1-42所示，其中一对上游引物序列为荧光基团-SEQ ID NO:1-淬灭基团-Spacer18-SEQ ID NO:2，相应下游引物为SEQ IDNO:3，上游引物序列为荧光基团-SEQ ID NO:4-淬灭基团-Spacer18-SEQ ID NO:5，相应下游引物为SEQ ID NO:6，以此类推至上游引物序列为荧光基团-SEQ ID NO:40-淬灭基团-Spacer18-SEQ ID NO:41，相应下游引物为SEQ ID NO:42。
本发明的另一个目的在于提供一种含有上述的LSP引物，用于检测人类BRCA1基因突变的试剂盒。
进一步的，所述用于检测人类BRCA1基因突变的试剂盒，还含有BRCA1基因反应缓冲液1，BRCA1基因反应缓冲液2，BRCA1基因反应缓冲液3，BRCA1基因反应缓冲液4，BRCA1基因外控反应缓冲液，BRCA1基因阴性对照，BRCA1基因阳性对照。
本发明的技术为线型蝎子引物(Linear Scorpion Primer，LSP)，该方法具有特异性强、灵敏度高的特点，同时拥有同一个反应管中通过不同荧光通道进行区分不同突变型的特点。该LSP引物的5’端为一段带有不同双荧光标记的线型探针，3’端为一段与模板互补序列，两段序列之间用Spacer18进行连接。当模板存在时，LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，LSP引物的5’端探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；接下来下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下，剪切探针部分，从而发光。
本发明的试剂盒包含：上述LSP引物，BRCA1基因反应缓冲液1，BRCA1基因反应缓冲液2，BRCA1基因反应缓冲液3，BRCA1基因反应缓冲液4，BRCA1基因外控反应缓冲液，BRCA1基因阴性对照，BRCA1基因阳性对照。
其中，BRCA1反应缓冲液1—BRCA1反应缓冲液4都包含200nmol/L突变型引物，200nmol/L人基因组内标(DNA)引物(即为表1中的BRCA1内参对应的上下游引物)，3.2mmol/LHCl、16.8mmol/LBase、60mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、0.1mmol/LEDTA·2Na、200μmmol/L dATP、200μmmol/L dGTP、200μmmol/L dCTP、200μmmol/L dUTP、100μmmol/L dTTP。
BRCA1反应缓冲液1的突变引物是S4P、A7C、G10L突变类型的引物(表1中对应的序列)；BRCA1反应缓冲液2的突变引物是M18T、C24A、H1732del突变类型的引物(表1中对应的序列)；BRCA1反应缓冲液3的突变引物是G1731dup、G1735L、G1738G突变类型的引物(表1中对应的序列)；BRCA1反应缓冲液4的突变引物是A1739G、H1746A、L1750A突变类型的引物(表1中对应的序列)。
BRCA1外控反应缓冲液包含200nmol/L BRCA1外控引物(即表1中BRCA1外控的上下游引物)，3.2mmol/L HCl、16.8mmol/LBase、60mmol/L KCl、2.5mmol/LMgCl2、0.1mmol/L EDTA·2Na、200μmmol/L dATP、200μmmol/L dGTP、200μmmol/L dCTP、200μmmol/L dUTP、100μmmol/L dTTP。
BRCA1阴性对照为生理盐水。
BRCA1阳性对照由S4P、A7C、G10L、M18T、C24A、H1732del、G1731dup、G1735L、G1738G、A1739G、H1746A、L1750A的12种突变型质粒与人基因组DNA按1:1体积比混合而来。
DNA酶混合液：2.0U/0.5μL的Taq聚合酶，0.002U/0.5μL的UNG酶，酶储存缓冲液补足至0.5uL。
酶储存缓冲液配置方法：加入0.5mol/L EDTA·2Na 20μL，25体积％的Triton X-100 4mL，5mol/L NaCl 2mL，0.5mol/LHCl 5.6mL，0.5mol/LBase4.4mL，加入30mL双重蒸馏水，50mL甘油，充分混合均匀后，补加双重蒸馏水定容至100mL。
BRCA1反应缓冲液1能够检测S4P、A7C、G10L突变类型；
BRCA1反应缓冲液2能够检测M18T、C24A、H1732del突变类型；
BRCA1反应缓冲液3能够检测G1731dup、G1735L、G1738G突变类型；
BRCA1反应缓冲液4能够检测A1739G、H1746A、L1750A突变类型；
BRCA1外控反应缓冲液作为判断结果用。
在8联PCR反应条的每个反应管中加入25μL石蜡油，备用。取48μL反应缓冲液加入相应的8联PCR管中，再将制备的基因组DNA各取2μL依次加入8联PCR管中，振摇混匀，稍微离心，置入荧光PCR扩增仪内。扩增曲线通过连接于PCR扩增仪的终端电脑获取，用于分析为BRCA1哪种突变类型。
对照品用于检测核酸提取过程和PCR扩增过程是否正常进行。
线型蝎子引物(LSP)作为一种组分加入到反应缓冲液。
线型蝎子引物(LSP)：
(1)线型蝎子引物(LSP)技术的应用在于BRCA1突变型检测引物结构的改造，该引物包括：5’端为一段带有不同双荧光标记的线性探针，3’端为一段与模板互补序列，两段序列之间用Spacer18进行连接。当模板存在时，LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，LSP引物的5’端线性探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；接下来下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下，剪切线性探针部分，从而发光。原理见图1。其中为淬灭基团，为发光基团，……为间臂，为剪切后发光基团发光。
(2)本发明是应用线型蝎子引物(LSP)技术设计的人类BRCA1基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)，靶基因为包含各种突变的基因序列，根据人类基因组的特点，选择了管家基因作为外控的目的基因和内参基因。设计的引物探针如表1所示：
表1 各突变类型的上下游引物序列表
本发明的试剂盒设计线型蝎子引物(LSP)的引物部分退火温度为56℃-60℃，同时探针部分TM值为55℃-60℃。
1.和普通引物探针组合相比，线型蝎子引物(LSP)具有引物的延伸功能和探针的发光检测功能，有效减少反应体系引物量，减少引物二聚体，增加反应特异性。
2.和普通引物相比，线型蝎子引物(LSP)的引物部分3’端引入特异突变，增加反应特异性。
3.线型蝎子引物(LSP)的结构使反应体系检测具有相近碱基突变互不干扰的功能，可以达到同管分型的效果。
4.线型蝎子引物(LSP)具有单一稳定结构，具有高灵敏度检测效果，可以检测低至0.1％的突变。
5.线型蝎子引物(LSP)的5’端探针部分和靶基因序列的互补链完全匹配，为链内互补，具有更好的结合稳定度，检测结果具有更高的荧光信噪比。
附图说明
图1是线型蝎子引物(LSP)反应原理图；
图2是实施例样品荧光值分析图；
图3是阳性对照品荧光值分析图；
图4是阴性参考品实验结果图；
图5是阳性参考品实验结果图；
图6是最低检测限参考品实验结果图；
图7是重复性参考品实验结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
(一)样本
质粒制备：由通用生物系统(安徽)有限公司分别合成以下基因片段(分别见表2所示序列)，TA克隆进PGEM-T-EASY载体获得重组菌。
表2 质粒及其对应的基因片段序列表
将重组菌扩大培养，用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit提取获得带有目的基因片段的质粒：S4P质粒、A7C质粒、G10L质粒、M18T质粒、C24A质粒、H1732del质粒、G1731dup质粒、G1735L质粒、G1738G质粒、A1739G质粒、H1746A质粒、L1750A质粒。
1.阴性参考品(为不同正常人的基因组DNA)
提取不同正常亚洲人的血液DNA即可。
2.阳性参考品(为突变含量为0.1％的样本)
分别将S4P、A7C、G10L、M18T、C24A、H1732del、G1731dup、G1735L、G1738G、A1739G、H1746A、L1750A的质粒和正常人基因组DNA的浓度均调节到1.0×107copies/μL，然后按照上述质粒和正常人基因组DNA体积比1:1000分别进行混合，得到突变含量为0.1％的样本，即为阳性参考品。
3.最低检测限参考品(核酸浓度为50ng/μL，突变含量为0.1％)
分别将S4P、A7C、G10L、M18T、C24A、H1732del、G1731dup、G1735L、G1738G、A1739G、H1746A、L1750A的质粒和正常人基因组DNA的浓度均调节到1.0×106copies/μL，然后按照突变质粒和正常人基因组DNA体积比1:1000分别进行混合，得到突变含量为0.1％的样本，即为最低检测限参考品
4.重复性参考品
用突变含量为1％的重复性参考品进行重复测定10次，变异系数(CV)应不高于5.0％(n＝10)。分别将S4P、A7C、G10L、M18T、C24A、H1732del、G1731dup、G1735L、G1738G、A1739G、H1746A、L1750A的质粒和正常人基因组DNA的浓度均调节到1.0×107copies/μL，然后按照突变质粒和正常人基因组DNA体积比1:100将所有突变质粒与正常人基因组DNA进行混合，得到突变含量为1％的样本，即为重复性参考品。
5.阳性对照品
将S4P、A7C、G10L、M18T、C24A、H1732del、G1731dup、G1735L、G1738G、A1739G、H1746A、L1750A的质粒和正常人基因组DNA的浓度均调节到1.0×106copies/μL，然后按照上述质粒和正常人基因组DNA体积比1:1分别进行混合，得到的样本，即为阳性参考品。
(二)实验过程
1.试剂准备(试剂准备区)
(1)取出BRCA1各基因突变的反应缓冲液(即反应缓冲液1-反应缓冲液4以及外控反应缓冲液)、DNA酶混合液、石蜡油等室温放置，使其充分溶解，备用。
(2)若一支反应缓冲液能一次性用完，则直接分别取13μL DNA酶混合液加入各反应缓冲液中，充分混合均匀，3000-5000g离心5秒，移至标本处理区。
(3)不满24人份，则取干净离心管，配制反应体系(每人份配置体系：50μL反应缓冲液+0.5μLDNA酶混合液)，按照需要计算好试剂用量，充分混合均匀后，3000-5000g离心5秒，移至标本处理区。
2.加样(标本处理区)
在8联PCR反应条的每个反应管中加入25μL石蜡油，备用。取48μL反应缓冲液加入相应的8联PCR管中，每个PCR管添加48μL反应缓冲液，再将对照品(BRCA1阴性对照和BRCA1阳性对照)和参考品各取2μL依次加入8联PCR管中，振摇混匀，稍微离心，置入荧光PCR扩增仪内。反应布局如表3所示。
表3 8联PCR反应条反应布局表
| 序号 | 名称 | 1 | … | 10 | 11 | 12 |
| 1 | BRCA1反应缓冲液1 | 样本1 | … | 样本10 | BRCA1阴性对照 | BRCA1阳性对照 |
| 2 | BRCA1反应缓冲液2 | 样本1 | … | 样本10 | BRCA1阴性对照 | BRCA1阳性对照 |
| 3 | BRCA1反应缓冲液3 | 样本1 | … | 样本10 | BRCA1阴性对照 | BRCA1阳性对照 |
| 4 | BRCA1反应缓冲液4 | 样本1 | … | 样本10 | BRCA1阴性对照 | BRCA1阳性对照 |
| 5 | BRCA1外控反应缓冲液 | 样本1 | … | 样本10 | BRCA1阴性对照 | BRCA1阳性对照 |
3.上机检测(扩增检测区)
(1)循环条件设置
38℃5分钟，95℃10分钟；
进入以下循环：
95℃15秒，60℃50秒，5循环；
95℃15秒，58℃50秒(30秒后读荧光)，35循环；
38℃30秒。
(2)仪器检测通道选择
荧光素设定为FAM、ROX、HEX和CY5，荧光信号收集设在58℃30秒，具体设置方法请参考仪器(全自动医用PCR分析系统GeneLight 9800)使用说明书。
4.结果分析条件设定
使用全自动医用PCR分析系统(GeneLight 9800)进行分析时，基线取3～12个循环的荧光信号，阈值可以根据仪器噪音情况调整，设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值＝0.0为准。阈值循环数则为荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
(三)检验结果的解释
其中突变反应孔代表的是BRCA1反应缓冲液1-BRCA1反应缓冲液4的PCR管对应的孔位，代表检测突变型；
外控反应孔代表的是BRCA1外控反应缓冲液的PCR管对应的孔位，检测的是外控，用于最终判断标准。
1.阴性对照的突变反应孔的FAM通道、ROX通道、HEX通道和CY5通道应均无扩增曲线，BRCA1外控反应孔的FAM通道和CY5通道应无扩增曲线，否则该次实验视为无效。阳性对照BRCA1突变反应孔的FAM通道、ROX通道、HEX通道和CY5通道应均有扩增曲线，BRCA1外控反应孔的FAM通道和CY5通道应有扩增曲线，否则该次实验视为无效。所有待测反应孔的CY5通道应有扩增曲线，否则该次实验视为无效。
2.待测样本BRCA1外控反应孔的FAM通道应有扩增曲线，且Ct值应控制在15-25之间。若Ct值大于25则说明存在PCR抑制或者加入的DNA量过少，需重新提取DNA或者加大加入的DNA量；若Ct值小于15，则说明加入的DNA过量，需减少DNA量。
3.突变结果的判断：确定待测样本BRCA1突变检测反应孔的FAM通道、ROX通道、HEX通道三个通道各自Ct值和BRCA1外控反应孔的FAM通道Ct值，计算ΔCt(ΔCt＝突变孔Ct值－BRCA1外控Ct值)，通过比较|ΔCt|与cut-offΔCt之间的关系来判读结果，如表所示进行判断。若突变反应孔的FAM通道Ct值＝0，则判断为阴性；若15<突变反应孔的FAM通道Ct值<35，则判断|ΔCt|值：|ΔCt|大于或等于cut-offΔCt时，则判断为阴性；|ΔCt|小于cut-offΔCt时，则判断为突变阳性。如下表4所示。
表4 实验结果判断表
(四)检测结果分析
1.荧光值分析
(1)本底荧光值在300-700之间，具有较低的荧光本底。结果见图2。
图2主要是对所有的样品(包括阴性参考品、阳性参考品、最低检测限参考品、重复性参考品)的荧光本底截图，是对荧光本底进行分析，荧光本底较低，说明荧光淬灭效果佳。
(2)能够达到3-4.5倍的扩增效率，具有较高的信噪比，见图3。
图3主要是对阳性对照品扩增效率进行分析，由图可知扩增的倍率有达到3-4.5倍，说明该方法扩增效率高，信噪比高。
(3)扩增阴性参考品时，无扩增曲线，具有良好的特异性。
2.实验数据分析
(1)检测阴性参考品，结果均为阴性。结果见图4。
只有BRCA1外控反应管有扩增曲线，突变反应孔均无扩增曲线。
(2)检测阳性参考品，结果均为阳性，结果见图5。
每个反应孔的每个通道均有扩增曲线。
(3)检测最低检测参考品，结果全为阳性，无假阴性。结果见图6。
(4)重复检测重复性参考品10次，结果全为阳性且变异系数(CV)均小于5％，满足实验设计要求。结果见图7和表5。
从表5可以看出，检测重复性参考品10次，结果全为阳性且变异系数(CV)均小于5％。
表5 试验结果表
综上说明，本发明的线型蝎子引物(LSP)检测的特异性好，灵敏度高，相近基因型间互不干扰，检测结果具有更高的荧光信噪比。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 厦门安普利生物工程有限公司
<120> 用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物及试剂盒
<130> APLS17001I
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ctcttcgcgt tgaagaagt 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<210> 3
<211> 21
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<213> 人工合成
<400> 14
agtacaaaat gtcattaatg cgac 24
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<212> DNA
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ggtcaattct gttcatttgc at 22
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<212> DNA
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aatctcaccc caccactct 19
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<212> DNA
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gtttggtttc tttcaggtaa agc 23
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<212> DNA
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ctgcaaaggg gagtggaat 19
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tggtcaatgg aagaaaccac 20
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ccaggacaga aagcatgatt 20
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gattctcttg ctcgctttgg 20
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tggtcaatgg aagaaaccac 20
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ttggtttctt tcagcatgat tgta 24
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gattctcttg ctcgctttgg 20
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tggtcaatgg aagaaaccac 20
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gcatgatttt gaagtcagcg a 21
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gattctcttg ctcgctttgg 20
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tggtcaatgg aagaaaccac 20
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gattttgaag tcagaggcgg 20
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gattctcttg ctcgctttgg 20
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caaagcgagc aagagaatc 19
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tgtggtcaat ggaagaacca 20
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cagagtggtg gggtgagatt 20
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aatcccagga cagaaaggt 19
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aaccaccaag gtccaaacg 19
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cagagtggtg gggtgagatt 20
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gctatccctg tacgcctctg 20
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agggcatacc cctcgtagat 20
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ctggcatcgt gatggact 18
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gctatccctg tacgcctctg 20
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agggcatacc cctcgtagat 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gtattattct aaaaccttcc aaatcttaaa tttactttat tttaaaatga taaaatgaag 60
ttgtcatttt ataaaccttt taaaaagata tatatatatg tttttctaat gtgttaaagt 120
tcattggaac agaaagaaat ggatttattt gctcttcgcg ttgaagaagt acaaaatgtc 180
attaatgcta tgcagaaaat cttagagtgt cccatctggt aagtcagcac aagagtgtat 240
taatttggga ttcctatgat tatctcctat gcaaatgaac agaattgacc ttacatacta 300
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
gtattattct aaaaccttcc aaatcttaaa tttactttat tttaaaatga taaaatgaag 60
ttgtcatttt ataaaccttt taaaaagata tatatatatg tttttctaat gtgttaaagt 120
tcattggaac agaaagaaat ggatttatct gctctttgcg ttgaagaagt acaaaatgtc 180
attaatgcta tgcagaaaat cttagagtgt cccatctggt aagtcagcac aagagtgtat 240
taatttggga ttcctatgat tatctcctat gcaaatgaac agaattgacc ttacatacta 300
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gtattattct aaaaccttcc aaatcttaaa tttactttat tttaaaatga taaaatgaag 60
ttgtcatttt ataaaccttt taaaaagata tatatatatg tttttctaat gtgttaaagt 120
tcattggaac agaaagaaat ggatttatct gctcttcgcg ttgaaaaagt acaaaatgtc 180
attaatgcta tgcagaaaat cttagagtgt cccatctggt aagtcagcac aagagtgtat 240
taatttggga ttcctatgat tatctcctat gcaaatgaac agaattgacc ttacatacta 300
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<213> 人工合成
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gtattattct aaaaccttcc aaatcttaaa tttactttat tttaaaatga taaaatgaag 60
ttgtcatttt ataaaccttt taaaaagata tatatatatg tttttctaat gtgttaaagt 120
tcattggaac agaaagaaat ggatttatct gctcttcgcg ttgaagaagt acaaaatgtc 180
attaatgcta cgcagaaaat cttagagtgt cccatctggt aagtcagcac aagagtgtat 240
taatttggga ttcctatgat tatctcctat gcaaatgaac agaattgacc ttacatacta 300
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gtattattct aaaaccttcc aaatcttaaa tttactttat tttaaaatga taaaatgaag 60
ttgtcatttt ataaaccttt taaaaagata tatatatatg tttttctaat gtgttaaagt 120
tcattggaac agaaagaaat ggatttatct gctcttcgcg ttgaagaagt acaaaatgtc 180
attaatgcta tgcagaaaat cttagagcgt cccatctggt aagtcagcac aagagtgtat 240
taatttggga ttcctatgat tatctcctat gcaaatgaac agaattgacc ttacatacta 300
gggaagaaaa gacatgtcta gtaagattag gctattgtaa ttgctgattt ccttaactga 360
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
ctcccaaagt gctaggatta caggggtgag ccactgcgcc tggcctgaat gccttaaata 60
tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 120
tgtttggttt ctttcaggta aagctccctc cctcaagttg acaaaaatct caccccacca 180
ctctgtattc cactcccctt tgcagagatg ggccgcttca ttttgtaaga cttattacat 240
acatacacag tgctagatac tttcacacag gttctt 276
<210> 49
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 49
ctcccaaagt gctaggatta caggggtgag ccactgcgcc tggcctgaat gccttaaata 60
tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 120
tgtttggttt ctttcagcat gattttgaag tcagaggaga tgtggtcaat ggaagaaacc 180
accaaggtcc aaagcgagca agagaatccc aggacagaaa gcatgatttt gaagtcagag 240
gagatgtggt caatggaaga aaccaccaag gtccaaagcg agcaagagaa tcccaggaca 300
gaaaggtaaa gctccctccc tcaagttgac aaaaatctca ccccaccact ctgtattcca 360
ctcccctttg cagagatggg ccgcttcatt ttgtaagact tattacatac atacacagtg 420
ctagatactt tcacacaggt tctt 444
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<213> 人工合成
<400> 50
ctcccaaagt gctaggatta caggggtgag ccactgcgcc tggcctgaat gccttaaata 60
tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 120
tgtttggttt ctttcagcat gattttaaag tcagaggaga tgtggtcaat ggaagaaacc 180
accaaggtcc aaagcgagca agagaatccc aggacagaaa ggtaaagctc cctccctcaa 240
gttgacaaaa atctcacccc accactctgt attccactcc cctttgcaga gatgggccgc 300
<210> 51
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 51
ctcccaaagt gctaggatta caggggtgag ccactgcgcc tggcctgaat gccttaaata 60
tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 120
tgtttggttt ctttcagcat gattttgaag tcagagaaga tgtggtcaat ggaagaaacc 180
accaaggtcc aaagcgagca agagaatccc ggacagaaag gtaaagctcc ctccctcaag 240
ttgacaaaaa tctcacccca ccactctgta ttccactccc ctttgcagag atgggccgc 299
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 52
ctcccaaagt gctaggatta caggggtgag ccactgcgcc tggcctgaat gccttaaata 60
tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 120
tgtttggttt ctttcagcat gattttgaag tcagaggagg tgtggtcaat ggaagaaacc 180
accaaggtcc aaagcgagca agagaatccc aggacagaaa ggtaaagctc cctccctcaa 240
gttgacaaaa atctcacccc accactctgt attccactcc cctttgcaga gatgggccgc 300
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<400> 53
ctcccaaagt gctaggatta caggggtgag ccactgcgcc tggcctgaat gccttaaata 60
tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 120
tgtttggttt ctttcagcat gattttgaag tcagaggaga tgtggtcaat ggaagaaaca 180
accaaggtcc aaagcgagca agagaatccc aggacagaaa ggtaaagctc cctccctcaa 240
gttgacaaaa atctcacccc accactctgt attccactcc cctttgcaga gatgggccgc 300
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 54
ctcccaaagt gctaggatta caggggtgag ccactgcgcc tggcctgaat gccttaaata 60
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accaaggtcc aaacgagcaa gagaatccca ggacagaaag gtaaagctcc ctccctcaag 240
ttgacaaaaa tctcacccca ccactctgta ttccactccc ctttgcagag atgggccgc 299
Claims (4)
1.一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物，其特征在于，所述LSP引物的5’端为一段带有不同双荧光标记的线型探针，3’端为一段与模板互补的序列，两段序列之间用Spacer18进行连接；
当模板存在时，所述LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，所述LSP引物的5’端探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下剪切探针部分，从而发光。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物，其特征在于，所述BRCA1基因的引物序列如SEQ ID NO:1-42所示，其中一对上游引物序列为荧光基团-SEQ IDNO:1-淬灭基团-Spacer18-SEQ ID NO:2，相应下游引物为SEQ ID NO:3，上游引物序列为荧光基团-SEQ ID NO:4-淬灭基团-Spacer18-SEQ ID NO:5，相应下游引物为SEQ ID NO:6，以此类推至上游引物序列为荧光基团-SEQ ID NO:40-淬灭基团-Spacer18-SEQ ID NO:41，相应下游引物为SEQ ID NO:42。
3.一种用于检测人类BRCA1基因突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-2任一所述的LSP引物。
4.根据权利要求3所述的用于检测人类BRCA1基因突变的试剂盒，其特征在于，还含有BRCA1基因反应缓冲液1，BRCA1基因反应缓冲液2，BRCA1基因反应缓冲液3，BRCA1基因反应缓冲液4，BRCA1基因外控反应缓冲液，BRCA1基因阴性对照，BRCA1基因阳性对照。
Priority Applications (1)
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- 2017-06-01 CN CN201710398723.5A patent/CN107312833B/zh active Active
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