CN103397102A

CN103397102A - 一种对基因突变丰度定量的检测方法

Info

Publication number: CN103397102A
Application number: CN2013103710050A
Authority: CN
Inventors: 王弢; 庄义; 张丽
Original assignee: SUZHOU MICRO DIAG BIOMEDICINE CO Ltd
Current assignee: PUSHI HUAKANG JIANGSU MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-08-23
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2013-11-20

Abstract

本发明公开了一种对基因突变丰度定量的检测方法，以特异性寡糖核苷酸序列为引物，分别以待测DNA样品和多个标准品为模板进行PCR扩增，再依次进行高分辨率熔解曲线分析和基因扫描技术分析，选取异源杂合链先溶解的温度区间，记录相对差异荧光强度，建立标准曲线，将待测样品与标准曲线比较获得样品突变丰度。通过上述方式，本发明对基因突变丰度定量的检测方法，检测成本低，价格便宜，操作过程简单，能大规模对多个临床样本进行同时检测，对于点突变与短片段插入或缺失突变的检测结果具有较好的准确性和重复性，临床普及程度高，能对无法作组织取样的肿瘤患者的早期诊断、选择用药、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监控。

Description

一种对基因突变丰度定量的检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种对基因突变丰度定量的检测方法。

背景技术

突变即基因突变在生物学上的含义是指细胞中的遗传基因发生的改变，遗传基因通常指存在于细胞核中的脱氧核糖核酸。它包括单个碱基改变所引起的点突变，或多个碱基的缺失、重复和插入。一般是由细胞分裂时遗传基因的复制发生错误、或受化学物质、辐射或病毒的影响而引起的。突变通常会导致细胞运作不正常或死亡，甚至可以在较高等生物中引发癌症。

以往的一些研究表明，在肿瘤组织、外周血（血浆/血清）、肿瘤累及器官相关的体液（如唾液、痰等）中均可以发现肿瘤相关的突变DNA癌变细胞可以释放DNA到外周血或者体液中，因而可以检测到肿瘤相关基因的突变。

现代生物医学研究表明，肿瘤的发病机制和治疗效果与肿瘤相关基因，即癌基因和抑癌基因的体细胞突变具有密切关系。肿瘤相关基因包括：EGFR、KRAS等，检测EGFR、KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后，放化疗疗效的重要指标，另外，分子靶向药物是根据肿瘤细胞与正常细胞分子生物学特征差异而研发的，阻断肿瘤细胞信号转导途径的新型抗癌药物，如易瑞沙（Iressa）、阿瓦斯汀（Avastin）等，靶向治疗药物有其特殊性，它仅对部分有特殊基因突变或肿瘤标志物表达的患者有较好的疗效。检测EGFR的突变丰度，能够预测表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗非小细胞肺癌的疗效，得出明确的量效结论，EGFR突变丰度高的病人靶向药物疗效最好，低丰度的病人效果较差，没有突变的没有效果。对于术后患者，通过连续监测血浆中突变DNA丰度的变化，可以有效的检测肿瘤的复发及评估的治疗疗效，因此检测基因突变丰度有着十分重要的临床意义。

但一些对基因突变丰度的检测方法仅仅是对突变体的定性分析，缺乏对突变体的精确定量。目前能够做突变定量的方法有：二代测序、BEAMING、PARE等技术，但这几种技术的检测成本高，且操作繁琐，临床普及程度低，存在不能同时大规模检测临床标本等缺点。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种对基因突变丰度定量的检测方法，能够得到高通量、低成本、准确的检测结果。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种对基因突变丰度定量的检测方法，包括步骤为：

（1）以特异性寡糖核苷酸序列为引物，分别以待测DNA样品和多个标准品为模板进行PCR扩增，再依次进行高分辨率熔解曲线分析和基因扫描技术分析，得到分析结果曲线；

（2）选取所述分析结果曲线上的异源杂合链先溶解的温度区间，记录所述待测DNA样品和每个所述标准品的相对差异荧光强度，根据所述标准品的相对差异荧光强度建立标准曲线，将所述待测DNA样品的相对差异荧光强度代入所述标准曲线中得到所述待测DNA样品突变丰度。

在本发明一个较佳实施例中，所述待测DNA样品为人类基因组DNA，所述标准品DNA为与待测DNA相匹配的、已确定的纯的突变人类基因组DNA。

在本发明一个较佳实施例中，所述待测DNA样品为人类正常DNA，细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物DNA。

在本发明一个较佳实施例中，所述肿瘤组织基因组DNA为EGFR基因、EGFR突变基因、KRAS基因或KRAS突变基因。

在本发明一个较佳实施例中，所述EGFR突变基因的位点为EGFR exon 19、EGFR exon 20或EGFR exon 21，所述KRAS突变基因的位点为KRAS exon 2或KRAS exon 3。

在本发明一个较佳实施例中，所述PCR扩增的反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM引物序列、0.05～2ng/ul模版DNA、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM二氯化镁、1～3×荧光染料。

在本发明一个较佳实施例中，所述荧光染料为DNA饱和性染料，所述DNA饱和性染料为EvaGreen染料、LC Green^®PLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料中的一种或多种，所述dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP和10mM dGTP，所述PCR缓冲液中包括Tris•Cl、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述PCR扩增的具体过程为：92～97℃预变性2～5分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，92～97 ℃变性10～30s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，并进行35～55个循环。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述高分辨率熔解曲线分析的具体过程为：92～97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，然后初始溶解温度为60～65℃开始程序升温溶解至95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，每秒30～50次。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述标准曲线是通过以突变敏感性高分辨率溶解曲线制作方法建立的。

本发明的有益效果是：本发明的对基因突变丰度定量的检测方法，该检测方法能实现基因突变丰度定量检测，检测成本低，价格便宜，操作过程简单，能大规模对多个临床样本进行同时检测，对于点突变与短片段插入或缺失突变的检测结果具有较好的准确性和重复性，临床普及程度高，是一种简单、闭管、快速、高通量的检测方法。对实验员的技术水平要求不高，特别是对无法作组织取样的肿瘤患者的早期诊断、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监控。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第一较佳实施例的qPCR-HRM检测程序图；

图2是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第一较佳实施例的qPCR检测结果图；

图3是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第一较佳实施例的HRM；

图4是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第一较佳实施例的分型曲线图；

图5是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第一较佳实施例的DNA突变的突变标准品曲线图；

图6是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第二较佳实施例的KRAS E3突变质粒的第一突变标准品曲线图；

图7是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第二较佳实施例的KRAS E3突变质粒的第二突变标准品曲线图；

图8是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第二较佳实施例的KRAS E3突变质粒的第三突变标准品曲线图；

图9是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第二较佳实施例的KRAS E3突变质粒的第四突变标准品曲线图；

图10是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第二较佳实施例的KRAS E3突变质粒含有0-30%的突变标准品曲线图；

图11是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第二较佳实施例的KRAS E3突变质粒含有35-50%的突变标准品曲线图；

图12是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第三较佳实施例的KRAS E2突变质粒的第一突变标准品曲线图；

图13是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第三较佳实施例的KRAS E2突变质粒的第二突变标准品曲线图；

图14是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第三较佳实施例的KRAS E2突变质粒的第三突变标准品曲线图；

图15是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第四较佳实施例的EGFR E19突变质粒的第一突变标准品曲线图；

图16是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第四较佳实施例的EGFR E19突变质粒的第二突变标准品曲线图；

图17是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第四较佳实施例的EGFR E19突变质粒的第三突变标准品曲线图；

图18是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第五较佳实施例的EGFR E21突变质粒的第一突变标准品曲线图；

图19是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第五较佳实施例的EGFR E21突变质粒的第二突变标准品曲线图；

图20是本发明的对基因突变丰度定量的检测方法第五较佳实施例的EGFR E21突变质粒的第三突变标准品曲线图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

材料：待检血浆样本、血细胞基因组DNA、EGFR、KRAS突变质粒。

仪器：Lightcycler 480、nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。

试剂：DNA聚合酶（罗氏公司）、10×PCR Buffer（罗氏公司）、MgCl₂（罗氏公司）、dNTP（TaKaRa）、纯化水。

引物：所有引物纯度应达到电泳级（PAGE）或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。

EGFR的引物和检测位点：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE004

KRAS的引物和检测位点：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE006

实施例一：

（1）质粒标准品DNA的制备

将突变质粒和野生质粒稀释到10⁶拷贝数。

以野生质粒作为稀释剂，分别制成0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%系列浓度的标准品DNA。

（2）实时荧光定量核酸扩增检测（qPCR）和高分辨率熔解检测（HRM）的反应体系

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE010

（3）反应条件

请参阅图1，qPCR-HRM程序设置：

第一阶段：酶激活阶段，温度设置为95℃进行5min；

第二阶段：PCR扩增阶段，温度设置为95℃进行10s，温度设置为60℃进行15s，温度设置为72℃进行25s，并循环50次；

第三阶段：熔解过程，温度设置为95℃进行1min，温度设置为40℃进行1min，温度设置为65℃进行1s，温度设置为95℃每秒检测荧光40次；

第四阶段：冷却过程，温度设置为40℃进行10s。

（4）分析过程

使用基因扫描（GENE SCANNING）分析样本，进入归一化温度偏移差（Normalized and Temp-Shifted Difference Plot）选项，选取特定温度范围即异源杂合链先熔解的温度区间，记录范围内相对差异信号值。假设突变丰度与相对差异信号值呈线性关系，求出其方程。

（5）结果分析

样本为DNA突变质粒，位点为K3。

由图2和图3可知，异源杂合链TM值较低，会先于其他链熔解，先熔解的这部分杂合链信号值的高低，能够反映整个体系中突变DNA所占比率。在讨论差异值时，限定为异源杂合链熔解的温度范围内的相对差异值，即图3中81℃~82℃内的差异值有效。而其他温度点，即使对应差异值很大，也与突变位点无关。

由图4可知，粗实线与差异曲线交点为切值点，交点的纵坐标为有效的相对信号差异值。差异值如表所示：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE012

HRM法主要靠异源杂合链，由于纯突变质粒不会形成异源杂合链，故不含突变质粒的纯野生质粒差异仅为-0.60。含有50%突变质粒的混合物由于能形成最多的异源杂合链，故差异值最大。

由图5可知，根据方程可推算出样本中突变DNA的丰度。

实施例二：

步骤（1）至（4）与实施例一相同。

（5）结果分析

样本为KRAS E3。差异值如表所示：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE014

由图6可知，图上的散点不符合严格的线性关系。同样重复实验，请参阅图7和图8，结果依然如此。但将含有50%突变质粒的混合物的相对差异值人为调高4个单位，得到图9，拟合的结果非常好。

分析是因为含有50%突变质粒的DNA混合物形成异源杂合双链的效率低于其他比例，故差异值会处于拟合的斜线下方。如当只含有1%突变质粒的DNA混合物时，100个DNA双链中有99个野生DNA链，1个突变DNA链，所以那条突变DNA链会100% 与野生链形成异源杂合双链。当含有50%突变质粒的DNA混合物时，一部分会形成正常链，一部分形成杂合链，所以如图10和图11所示，分两个区间建立标准曲线。

分段函数为：，

得到标准曲线。

实施例三：

样本为KRAS E2。差异值如表所示：

结果请参阅图12。

重复一次实验，差异值如表所示：

结果请参阅图13。

再重复一次实验，差异值如表所示：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE022

结果请参阅图14。

实施例四：

样本为EGFR E19。差异值如表所示：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE024

结果请参阅图15。

重复一次实验，差异值如表所示：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE026

结果请参阅图16。

再重复一次实验，差异值如表所示：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE028

结果请参阅图17。

实施例四：

样本为EGFR E19。差异值如表所示：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE030

结果请参阅图18。

重复一次实验，差异值如表所示：

Figure 2013103710050100002DEST_PATH_IMAGE032

结果请参阅图19。

再重复一次实验，差异值如表所示：

结果请参阅图20。

此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种对基因突变丰度定量的检测方法，其特征在于，包括步骤为：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类基因组DNA，所述标准品DNA为与待测DNA相匹配的、已确定的纯的突变人类基因组DNA。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常DNA，细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物DNA。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述肿瘤组织基因组DNA为EGFR基因、EGFR突变基因、KRAS基因或KRAS突变基因。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述EGFR突变基因的位点为EGFR exon 19、EGFR exon 20或EGFR exon 21，所述KRAS突变基因的位点为KRAS exon 2或KRAS exon 3。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM引物序列、0.05～2ng/ul模版DNA、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM二氯化镁、1～3×荧光染料。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述荧光染料为DNA饱和性染料，所述DNA饱和性染料为EvaGreen染料、LC Green^®PLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料中的一种或多种，所述dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP和10mM dGTP，所述PCR缓冲液中包括Tris•Cl、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述PCR扩增的具体过程为：92～97℃预变性2～5分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，92～97 ℃变性10～30s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，并进行35～55个循环。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述高分辨率熔解曲线分析的具体过程为：92～97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，然后初始溶解温度为60～65℃开始程序升温溶解至95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，每秒30～50次。

10.根据权利要求1所述的检测方法，步骤（2）中所述标准曲线是通过以突变敏感性高分辨率溶解曲线制作方法建立的。