CN112708669A - 用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒 - Google Patents
用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括分别针对TNF rs1800629、KLRC1rs7301582、FCGR2A rs1801274、PTPRCrs10919563、HLA‑E rs1264457、TRAF1rs3761847和KLRD1rs2302489等位基因及GAPDH内参基因的扩增引物；所述试剂盒包括包含所述扩增引物的引物液。本发明提供的试剂盒灵敏度高，可达万分之一，最低检测限仅为1‑2拷贝，特别适合于低含量突变样本的检测；与测序法相比，本发明的检测结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；此外，还具有检测速度快，适用于高通量样本检测的优点。
Description
技术领域
本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒。
背景技术
阿达木单抗(修美乐)先后在国家食品药品监督管理总局(CFDA)获批了3个适应症，分别是类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病。三种疾病存量患者都是500万人，共计1500万人。
类风湿关节炎(RA)是一种以对称性、多关节、小关节为主的慢性自身免疫性疾病，素有“不死癌症”之称，患病者的免疫系统会破坏健康关节，引发关节疼痛、肿胀、僵硬，产生疲劳和无力的症状，晚期可强直和畸形、功能严重受损，并最终导致关节功能丧失。修美乐与甲氨蝶呤合用，用于治疗对改善病情抗风湿药(DMARDs)，包括甲氨蝶呤疗效不佳的成年中重度活动性类风湿关节炎患者。修美乐与甲氨蝶呤联合用药，可以减缓患者关节损伤的进展(X线显示)，并且可以改善身体机能。与传统的药物相比，这类药物的疗效强且持久，能有效缓解疾病症状、影像学进展及功能水平，且安全性良好，适用于各种类风湿关节炎患者。
强直性脊柱炎(AS)是以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要症状的疾病。强直性脊柱炎是四肢大关节，以及椎间盘纤维环及其附近结缔组织纤维化和骨化，以及关节强直为病变特点的慢性炎性疾病。修美乐用于常规治疗效果不佳的成年重度活动性强直性脊柱炎患者。有起效快，疗效好的特点。大多数患者的病情可迅速获得显著改善，如晨僵、腰背痛、外周关节炎、肌腱末端炎、扩胸度、ESR和CRP等，应用一段时间后，患者的身体功能及健康相关生活质量明显提高，特别是可使一些新近出现的脊柱活动功能障碍得到恢复。
银屑病，是一种慢性、系统性、复发性、非传染性的自体免疫疾病，可累及多个系统。银屑病发病率逐年上升，是全球性的健康难题之一。广泛的临床研究和真实世界的证据显示，修美乐能快速清除皮损，并持续有效地改善银屑病症状，且具有公认的安全性。
自2002年上市至今，修美乐已经连续7年位居全球畅销药物榜首。其在全球拥有15个跨领域跨学科适应症，2018年全球销售额高达204.85亿美元，比第二名的阿哌沙班高出106亿美元。但是2018年在中国区战绩不足2亿元，相比于修美乐全球获批的15个适应症，其在中国也仅有类风湿关节炎、强直性脊柱炎及银屑病3个适应症获批，适应人群较小；修美乐由于没有进入医保，因此患者均以自费为主，价格过高。就以风湿性关节炎为例，患者1～2周注射一次，一年花费就高达20万元。随着国内药企阿达木单抗生物类药的报批，修美乐在各地开始“诚意”降价，最终降价59％，价格竞争力提高，药物可及性明显增强。
假设，国产阿达木单抗上市后进一步降价为4万元/年(降价80％)，医保支付后自费为2万元/年。存量患者渗透率即使只有1％，市场规模也高达＝1500万人*1％*4万元/年＝60亿元。存量患者渗透率如果达到5％，市场规模将高达300亿元。
近年来，药物基因组学研究发现，阿达木单抗与多个基因位点的多态性具有相关性，如下表：
针对上表，本领域技术人员一般(不付出创造性劳动时)在做基因检测项目研发时会根据各自的实际需求选择具体的基因位点，如采用实时荧光定量PCR(QPCR)时，可能会选择PTPRC rs10919563这个位点(该位点循证等级高)，如采用二代测序平台时，可能选择上述位点同时检测(尽管目前还未发现有针对阿达木单抗上述所有相关位点的现有技术)。QPCR技术平台适用用于临床快速出检测报告(适用于阿达木单抗这类住院周期短的用药患者)，但是通量及检测灵敏度一般；二代测序平台适用于临床高通量长周期检测项目报告(适于肿瘤类长期住院患者)，但是不适于临床常规用药基因检测，尤其不适于阿达木单抗这类住院周期极短的用药患者，无论是经济性还是周期性都不能满足临床实际需求。
因此，本申请人采用ARMS PCR技术平台(ARMS也称作等位基因特异性PCR，AlleleSpecific PCR，AS-PCR)，在检测灵敏度及成本方面均具有显著优势(目前用于基因检测的“金标准”是PCR直接测序法，但直接测序法的操作程序较复杂，敏感性不高，仅能检测出20～30％以上的突变株等；相比于直接测序法，ARMS-TaqMan法的灵敏性更高、成本更低。)。
另外，本申请人通过创造性的工作(通过查阅文献，整理各基因位点循证等级，整理各基因中国人群突变频率等数据，结合药物经济学因素)选择TNF rs1800629、KLRC1rs7301582、FCGR2A rs1801274、PTPRC rs10919563、HLA-E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489这七个基因位点，以此确定中国风湿性疾病患者人群在进行阿达木单抗用药时，通过该组合基因位点的检测，更适宜中国患者人群(CHB+CHS)阿达木单抗的精准用药。
本试剂盒采用ARMS结合TaqMan荧光探针法：设计等位基因特异性PCR扩增引物，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'～3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
在现有已公开报道的文献中，只有单独对TNF、KLRC1、FCGR2A、PTPRC、HLA-E、TRAF1和KLRD1基因的分型检测(用途也并非针对阿达木单抗用药)，但单独应用时往往不能满足临床阿达木单抗用药相关基因分型的需求，需要对七个基因检测结合使用，在临床实践中存在诸多操作问题及体系交叉问题；
因此，将阿达木单抗用药相关七基因引物重新设计优化及对应PCR体系稳定性尚有较大的改进空间；我们在经过大量创意设计及实验筛选后，将上述七基因检测合而为一，优化了试剂盒的PCR反应体系，并显著改进了试剂盒产品性能。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供一种检测结果准确、操作程序简单、敏感性高、特异性强、测序速度快并有效满足临床检验要求的检测阿达木单抗用药相关TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2A rs1801274、PTPRC rs10919563、HLA-Ers1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489基因多态性的引物对及试剂盒；采用ARMS结合QPCR技术来实现。
本发明提供一种用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对，所述阿达木单抗用药相关基因检测的多态性位点分别为TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2Ars1801274、PTPRC rs10919563、HLA-E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489，所述引物对包括：
针对TNF rs1800629等位基因的扩增引物，如下：
扩增TNF rs1800629野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：1所示，5’-AAGCCCCTCCCAGTTCTAGTTC-3’，
探针，如SEQ ID NO：2所示5’CATGCCCCTCAAAACCTATTGCCTCC-3’；
扩增TNF rs1800629野生型上游引物，如SEQ ID NO：3所示：5’-AGGCTGAACCCCGTGCT-3’；
扩增TNF rs1800629突变型上游引物，如SEQ ID NO：4所示：5’-AGGCTGAACCCCGTGCC-3’；
针对KLRC1 rs7301582等位基因的扩增引物，如下：
扩增KLRC1 rs7301582野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：5所示，5’-GTGATCAATCTGCATGACCAGATC-3’，
探针，如SEQ ID NO：6所示5’CAGATCACATCATGCCCGATAAAATTAGATAGCA-3’；
扩增KLRC1 rs7301582野生型上游引物，如SEQ ID NO：7所示：5’-CCGGCCGATTGACTTAATACTG-3’；
扩增KLRC1 rs7301582突变型上游引物，如SEQ ID NO：8所示：5’-CCGGCCGATTGACTTAATACTA-3’；
针对KLRC1 rs7301582等位基因的扩增引物，如下：
扩增FCGR2A rs1801274野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：9所示，5’-TGGACAGTGATGGTCACAGG-3’，
探针，如SEQ ID NO：10所示5’TTTGGATCCCACCTTCTCCATCCCAC-3’；
扩增FCGR2A rs1801274野生型上游引物，如SEQ ID NO：11所示：5’-GAAAATCCCAGAAATTCTCGCG-3’；
扩增FCGR2A rs1801274突变型上游引物，如SEQ ID NO：12所示：5’-GAAAATCCCAGAAATTCTCGCA-3’；
针对PTPRC rs10919563等位基因的扩增引物，如下：
扩增PTPRC rs10919563野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：13所示，5’-AGCTGAGTCATGGGTATAAGGG-3’，
探针，如SEQ ID NO：14所示，5’-TATATGCATTTTATAGCAATTACTATAATTATTTA-3’；
扩增PTPRC rs10919563野生型上游引物，如SEQ ID NO：15所示，5’-CCATTATAAGGACATTCACGTTTCAC-3’；
扩增PTPRC rs10919563突变型上游引物，如SEQ ID NO：16所示，5’-CCATTATAAGGACATTCACGTTTCAT-3’；
针对HLA-E rs1264457等位基因的扩增引物，如下：
扩增HLA-E rs1264457野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：17所示，5’-GAGAGTCTCAGGCGCCTT-3’，
探针，如SEQ ID NO：18所示5’-TCGGGCCCCAGCTCGCAGCCAT-3’；
扩增HLA-E rs1264457野生型上游引物，如SEQ ID NO：19所示：5’-GCGGAGGAAGCGACC-3’；
扩增HLA-E rs1264457突变型上游引物，如SEQ ID NO：20所示：5’-GCGGAGGAAGCGACT-3’；
针对TRAF1 rs3761847等位基因的扩增引物，如下：
扩增TRAF1 rs3761847野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：21所示，5’-GATGGCAATACCTGCTTCACAG-3’，
探针，如SEQ ID NO：22所示，5’-CCTCAATACCACCCTCTCTACCTGCT-3’；
扩增TRAF1 rs3761847野生型上游引物，如SEQ ID NO：23所示，5’-GTCCCTTCTCTCCCCTGCA-3’；
扩增TRAF1 rs3761847突变型上游引物，如SEQ ID NO：24所示，5’-GTCCCTTCTCTCCCCTGCG-3’；
针对KLRD1 rs2302489等位基因的扩增引物，如下：
扩增KLRD1 rs2302489野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：25所示，5’-GTAGAGAAGGCACGATGTGTAC-3’，
探针，如SEQ ID NO：26所示，5’-TTTGCTAAATTTCTTCATACTCAACTTTCAGATTC-3’；
扩增KLRD1 rs2302489野生型上游引物，如SEQ ID NO：27所示，5’-CATTTAAATACACAATTTTTCATTCTCGA-3’；
扩增KLRD1 rs2302489突变型上游引物，如SEQ ID NO：28所示，5’-CATTTAAATACACAATTTTTCATTCTCGT-3’；
针对GAPDH内参基因的扩增引物，如下：
扩增GAPDH基因的上游引物，如SEQ ID NO：29所示，5’-ATCCTGGGCTACACTGAGCAC-3’；
扩增GAPDH基因的下游引物，如SEQ ID NO：30所示，5’-CTCAGTGTAGCCCAGGATGCCCTT-3’；
扩增GAPDH基因的探针，如SEQ ID NO：31所示，5’-AGGTGGTCTCCTCTGACTTCAA-3’。
以上所述引物对的探针标记包括：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO:26所示的探针5’端采用荧光报告基团(FAM)标记；SEQ ID NO:31所示的探针5’端采用荧光报告基团(JOE)标记；SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:21所示的探针3’端均采用荧光淬灭基团(TAMRA)标记。
本发明还提供一种用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的试剂盒，所述阿达木单抗用药相关基因检测的多态性位点分别为TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2Ars1801274、PTPRC rs10919563、HLA-E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1rs2302489，所述试剂盒包括：
引物液1，所述引物液1含有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液2，所述引物液2含有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液3，所述引物液3含有如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液4，所述引物液4含有如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液5，所述引物液5含有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液6，所述引物液6含有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液7，所述引物液7含有如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液8，所述引物液8含有如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液9，所述引物液9含有如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液10，所述引物液10含有如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液11，所述引物液11含有如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液12，所述引物液12含有如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液13，所述引物液11含有如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液14，所述引物液12含有如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针。
在本发明提供的用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的试剂盒的一较佳实施例中，所述试剂盒还包括：阳性对照为插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3扩增产物、插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4扩增产物、插有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7扩增产物、插有SEQID NO：5和SEQ ID NO：8扩增产物、插有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11扩增产物、插有SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：12扩增产物、插有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15扩增产物、插有SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：16扩增产物、插有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19扩增产物、插有SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：20扩增产物、插有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23扩增产物、插有SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：24扩增产物、插有SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：27扩增产物、插有SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：28扩增产物、插有SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30扩增产物的15种质粒所组成的质粒混合物；
其中，质粒载体为pMD18-T质粒。
在本发明提供的用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的试剂盒的一较佳实施例中，所述阳性对照质粒混合物中TNF rs1800629野生纯合子质粒、TNF rs1800629突变纯合子质粒、KLRC1 rs7301582野生纯合子质粒、KLRC1 rs7301582突变纯合子质粒、FCGR2Ars1801274野生纯合子质粒、FCGR2A rs1801274突变纯合子质粒、PTPRC rs10919563野生纯合子质粒、PTPRC rs10919563突变纯合子质粒、HLA-E rs1264457野生纯合子质粒、HLA-Ers1264457突变纯合子质粒、TRAF1 rs3761847野生纯合子质粒、TRAF1 rs3761847突变纯合子质粒、KLRD1 rs2302489野生纯合子质粒、KLRD1 rs2302489突变纯合子质粒和内参GAPDH质粒的数量比为1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：2。
在本发明提供的用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的试剂盒的一较佳实施例中，所述试剂盒还包括空白对照，所述空白对照为灭菌纯化水。
相较于现有技术，本发明提供的用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒具有以下有益效果：
一、通过利用ARMS结合QPCR技术重新设计并优化了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2Ars1801274、PTPRC rs10919563、HLA-E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489基因多态性时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、一个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点荧光曲线及结果直观的优点；
二、通过利用ARMS结合QPCR技术重新设计并优化了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2Ars1801274、PTPRC rs10919563、HLA-E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489基因多态性时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上荧光定量PCR仪、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于突变分析；
三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照和阳性对照，使得所述试剂盒在检测TNFrs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2A rs1801274、PTPRC rs10919563、HLA-E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489基因多态性时，可以更好的确保检测结果的准确性。
附图说明
图1为临床样品TNF rs1800629野生型的荧光扩增曲线图；
图2为临床样品TNF rs1800629突变杂合型的荧光扩增曲线图；
图3为临床样品TNF rs1800629突变纯合型的荧光扩增曲线图；
图4为临床样品TNF rs1800629阳性对照的荧光扩增曲线图；
图5为临床样品TNF rs1800629空白对照的荧光扩增曲线图；
图6为临床样品KLRC1 rs7301582野生型的荧光扩增曲线图；
图7为临床样品KLRC1 rs7301582突变杂合型的荧光扩增曲线图；
图8为临床样品KLRC1 rs7301582突变纯合型的荧光扩增曲线图；
图9为临床样品KLRC1 rs7301582阳性对照的荧光扩增曲线图；
图10为临床样品KLRC1 rs7301582空白对照的荧光扩增曲线图；
图11为临床样品FCGR2A rs1801274野生型的荧光扩增曲线图；
图12为临床样品FCGR2A rs1801274突变杂合型的荧光扩增曲线图；
图13为临床样品FCGR2A rs1801274突变纯合型的荧光扩增曲线图；
图14为临床样品FCGR2A rs1801274阳性对照的荧光扩增曲线图；
图15为临床样品FCGR2A rs1801274空白对照的荧光扩增曲线图；
图16为临床样品PTPRC rs10919563野生型的荧光扩增曲线图；
图17为临床样品PTPRC rs10919563突变杂合型的荧光扩增曲线图；
图18为临床样品PTPRC rs10919563突变纯合型的荧光扩增曲线图；
图19为临床样品PTPRC rs10919563阳性对照的荧光扩增曲线图；
图20为临床样品PTPRC rs10919563空白对照的荧光扩增曲线图；
图21为临床样品HLA-E rs1264457野生型的荧光扩增曲线图；
图22为临床样品HLA-E rs1264457突变杂合型的荧光扩增曲线图；
图23为临床样品HLA-E rs1264457突变纯合型的荧光扩增曲线图；
图24为临床样品HLA-E rs1264457阳性对照的荧光扩增曲线图；
图25为临床样品HLA-E rs1264457空白对照的荧光扩增曲线图；
图26为临床样品TRAF1 rs3761847野生型的荧光扩增曲线图；
图27为临床样品TRAF1 rs3761847突变杂合型的荧光扩增曲线图；
图28为临床样品TRAF1 rs3761847突变纯合型的荧光扩增曲线图；
图29为临床样品TRAF1 rs3761847阳性对照的荧光扩增曲线图；
图30为临床样品TRAF1 rs3761847空白对照的荧光扩增曲线图；
图31为临床样品KLRD1 rs2302489野生型的荧光扩增曲线图；
图32为临床样品KLRD1 rs2302489突变杂合型的荧光扩增曲线图；
图33为临床样品KLRD1 rs2302489突变纯合型的荧光扩增曲线图；
图34为临床样品KLRD1 rs2302489阳性对照的荧光扩增曲线图；
图35为临床样品KLRD1 rs2302489空白对照的荧光扩增曲线图；
图36至图37为TNF rs1800629多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图36的结果均不准确，只有图37的结果真实可靠；
图38至图39为KLRC1 rs7301582多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图38的结果均不准确，只有图39的结果真实可靠；
图40至图41为FCGR2A rs1801274多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图40的结果均不准确，只有图41的结果真实可靠；
图42至图43为PTPRC rs10919563多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图42的结果均不准确，只有图43的结果真实可靠；
图44至图45为HLA-E rs1264457多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图44的结果均不准确，只有图45的结果真实可靠；
图46至图47为TRAF1 rs3761847多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图46的结果均不准确，只有图47的结果真实可靠；
图48至图49为KLRD1 rs2302489多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图48的结果均不准确，只有图49的结果真实可靠。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：试剂盒的制备(30测试/盒)
1、引物和探针的设计与合成
针对人TNF基因、KLRC1基因、FCGR2A基因、PTPRC基因、HLA-E基因、TRAF1基因和KLRD1基因，选择特异的突变位点rs1800629、rs7301582、rs1801274、rs10919563、rs1264457、rs3761847和rs2302489，选用的引物和探针设计在突变位点和附近的保守区，避免在引物结合区域出现有SNP(通过在线NCBI网站对靶基因序列的SNP进行检索)，通过在线NCBI网站进行Primer Blast，设计等位基因特异性PCR扩增引物，确认引物对的特异性扩增，PCR引物的3’端末位碱基与其模板DNA存在错配时，将导致扩增效率急剧下降，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增信号。探针位于一对引物之间的区域，且避免其结合区域出现有SNP；其中扩增引物和荧光探针先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中目的探针SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:26的5’端采用荧光报告基团(FAM)标记，内参探针SEQ ID NO:31的5’端采用荧光报告基团(JOE)标记，3’端均采用荧光淬灭基团(TAMRA)标记。
表1.突变位点与类型
扩增序列如表2：
表2.特异性扩增引物及引物序列
2、对照品选择
阳性对照为插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3扩增产物、插有SEQ ID NO：1和SEQID NO：4扩增产物、插有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7扩增产物、插有SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：8扩增产物、插有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11扩增产物、插有SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：12扩增产物、插有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15扩增产物、插有SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：16扩增产物、插有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19扩增产物、插有SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：20扩增产物、插有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23扩增产物、插有SEQ ID NO：21和SEQ IDNO：24扩增产物、插有SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：27扩增产物、插有SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：28扩增产物、插有SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30扩增产物的15种质粒所组成的质粒混合物；所述质粒混合物中TNF rs1800629野生纯合子质粒、TNF rs1800629突变纯合子质粒、KLRC1 rs7301582野生纯合子质粒、KLRC1 rs7301582突变纯合子质粒、FCGR2A rs1801274野生纯合子质粒、FCGR2A rs1801274突变纯合子质粒、PTPRC rs10919563野生纯合子质粒、PTPRC rs10919563突变纯合子质粒、HLA-E rs1264457野生纯合子质粒、HLA-E rs1264457突变纯合子质粒、TRAF1 rs3761847野生纯合子质粒、TRAF1 rs3761847突变纯合子质粒、KLRD1 rs2302489野生纯合子质粒、KLRD1 rs2302489突变纯合子质粒和内参GAPDH质粒的数量比为1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：2。其中，质粒载体为pMD18-T质粒。
空白对照为灭菌纯化水。
3、PCR预混液组成
表3.PCR预混液组成
4、引物液1的组成
表4.引物液1的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| TNF-WT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| TNF-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| TNF-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
5、引物液2的组成
表5.引物液2的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| TNF-MT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| TNF-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| TNF-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
6、引物液3的组成
表6.引物液3的组成
7、引物液4的组成
表7.引物液4的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| KLRC1-MT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| KLRC1-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| KLRC1-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
8、引物液5的组成
表8.引物液5的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| FCGR2A-WT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| FCGR2A-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| FCGR2A-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
9、引物液6的组成
表9.引物液6的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| FCGR2A-MT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| FCGR2A-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| FCGR2A-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
10、引物液7的组成
表10.引物液7的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| PTPRC-WT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| PTPRC-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| PTPRC-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
11、引物液8的组成
表11.引物液8的组成
12、引物液9的组成
表12.引物液9的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| HLA-E-WT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| HLA-E-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| HLA-E-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
13、引物液10的组成
表13.引物液10的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| HLA-E-MT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| HLA-E-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| HLA-E-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
14、引物液11的组成
表14.引物液11的组成
15、引物液12的组成
表15.引物液12的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| TRAF1-MT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| TRAF1-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| TRAF1-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
16、引物液13的组成
表16.引物液13的组成
| 原料名称 | 测试单人份用量(μL) | 30测试/盒(μL) |
| KLRD1-WT-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| KLRD1-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| KLRD1-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-F(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-R(10uM) | 0.5 | 15 |
| Ref2-P(10uM) | 0.5 | 15 |
| 总量 | 3 | 90 |
17、引物液14的组成
表17.引物液14的组成
16、阳性对照的组成
表16.阳性对照的组成
| 原料名称 | 体积(μL) | 30测试/盒(μL) |
| 15种质粒混合物 | 7 | 210 |
17、空白对照的组成
表17.空白对照的组成
| 原料名称 | 体积(μL) | 30测试/盒(μL) |
| 灭菌纯化水 | 126 | 3780 |
实施例2：试剂盒的使用
1、样品检测
按照模板数配制体系：取PCR反应管，加入对应引物液、PCR预混液、灭菌纯化水，加入样品DNA、灭菌纯化水或阳性对照为模板，组成PCR反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。
每个位点有野生(WT)和突变(MT)两种反应液，7个位点即14种反应液。各反应液配制如下：
表18.各反应液配制组成
该体系反应程序如下：
表19.PCR反应程序
2、ABI7500荧光定量PCR
按下右端开机键，启动ABI 7500。开机后机器左端“power”指示灯长亮。打开仓门，将配好的试剂放入仓内，记好自己摆放的位置。
1)双击“7500Software v2.0.5”图标打开软件。在弹出的窗口中点击“OK”进入程序。
2)单击“New Experiment”，在弹出“Experiment Properties”界面中依次选中“7500(96wells)”、“Quantitaion-Standad Curve”、“
Reagents”图标使其变亮。
3)点击“Plate Setup”，在“Reporter”栏内的下拉选框里选择“FAM”，在“Quencher”栏内的下拉选框里选择“TAMRA)”，点击“Add New Target”，在“Reporter”栏内的下拉选框里选择“JOE”，在“Quencher”栏内的下拉选框里选择“TAMRA)”；反复点击“AddNew Sample”，使“Sample Name”下方弹出足够数量的方框，在这些方框内输入各样本的唯一编号。
4)点击“Assign Targets and Samples”，在“Passive Reference”栏内的下拉选框里选择“ROX”，选中试剂所放的孔位，确认与仪器相对应，在“Assign sample(s)to theselected wells”栏内的方框里打“√”，在“Assign target(s)to the selected wells”栏内的方框里打“√”，并点击对应的图标使其变亮：“U”(待测样本)、“S”(阳性对照品)、“N”(空白对照品)。
5)反应条件设置：单击“Run Method”进入反应条件设置面板，制定所需的扩增程序，在“Holding Stage”栏内设置95℃30秒，将光标移至“Cycling Stage”栏，在第1节“Step1”中设置95℃10秒，在“Step 2”中设置60℃30秒，并在该节中点击荧光采集图标使其变亮，在“Number of Cycles”栏内输入50，并在“Reaction Volume Per Well”栏内输入25。
6)确认无误后，点击“START R…”对当次PCR编号并保存在对应的文件夹，点击确定，开始运行。开始后会有一段预热，正式开始循环时“IN USE”指示灯闪烁。
7)运行完后，打开仓门，将产物倒入垃圾桶，填写仪器使用记录等。
3、结果判断
反应结束后，进行自动调整基线和阈值。设定之后，点击“Analyse”(分析)按键，即可从“View Well Table”窗口的“Ct”处得到各样本的Ct值。
4、质控标准
阳性对照：FAM、JOE通道有明显S型扩增曲线，且曲线Ct≤35；
空白对照：FAM、JOE通道无明显S型扩增曲线；或曲线Ct＞35；
以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。
5、结果报告：
【阳性判断值或者参考区间】
(1)阳性结果：有明显S型扩增曲线，且曲线Ct≤35
(2)阴性结果：无明显S型扩增曲线；或曲线Ct＞35
【检测结果分析】
样本检测孔JOE通道为阳性湿，按下表对样本结果进行判定，确定样本基因型。
图1显示的是临床检测结果中TNF rs1800629的野生型，图2显示的是临床检测结果中TNF rs1800629的突变杂合型，图3显示的是临床检测结果中TNF rs1800629的突变纯合型，图4、图5分别显示的是临床检测结果中的阳性对照和空白对照的荧光曲线图。图1TNF(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，TNF(MT)反应液中FAM无明显S型曲线，判定为TNF rs1800629野生型。图2TNF(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，TNF(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为TNFrs1800629杂合型。图3TNF(WT)反应液中FAM无明显S型曲线，TNF(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为TNF rs1800629突变型。图4TNF(WT)反应液和TNF(MT)反应液的FAM曲线均Ct≤35，JOE曲线均Ct≤35。图5TNF(WT)反应液和TNF(MT)反应液的FAM无明显S型曲线，JOE也无明显S型曲线。
图6显示的是临床检测结果中KLRC1 rs7301582的野生型，图7显示的是临床检测结果中KLRC1 rs7301582的突变杂合型，图8显示的是临床检测结果中KLRC1 rs7301582的突变纯合型，图9、图10分别显示的是临床检测结果中的阳性对照和空白对照的荧光曲线图。图6STAT4(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，STAT4(MT)反应液中FAM无明显S型曲线，判定为KLRC1 rs7301582野生型。图7STAT4(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，STAT4(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为KLRC1 rs7301582杂合型。图8STAT4(WT)反应液中FAM无明显S型曲线，STAT4(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为KLRC1 rs7301582突变型。图9STAT4(WT)反应液和STAT4(MT)反应液的FAM曲线均Ct≤35，JOE曲线均Ct≤35。图10STAT4(WT)反应液和STAT4(MT)反应液的FAM无明显S型曲线，JOE也无明显S型曲线。
图11显示的是临床检测结果中FCGR2A rs1801274的野生型，图12显示的是临床检测结果中FCGR2A rs1801274的突变杂合型，图13显示的是临床检测结果中FCGR2Ars1801274的突变纯合型，图14、图15分别显示的是临床检测结果中的阳性对照和空白对照的荧光曲线图。图11STAT4(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，STAT4(MT)反应液中FAM无明显S型曲线，判定为FCGR2A rs1801274野生型。图12STAT4(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，STAT4(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为FCGR2A rs1801274杂合型。图13STAT4(WT)反应液中FAM无明显S型曲线，STAT4(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为FCGR2A rs1801274突变型。图14STAT4(WT)反应液和STAT4(MT)反应液的FAM曲线均Ct≤35，JOE曲线均Ct≤35。图15STAT4(WT)反应液和STAT4(MT)反应液的FAM无明显S型曲线，JOE也无明显S型曲线。
图16显示的是临床检测结果中PTPRC rs10919563的野生型，图17显示的是临床检测结果中PTPRC rs10919563的突变杂合型，图18显示的是临床检测结果中PTPRCrs10919563的突变纯合型，图19、图20分别显示的是临床检测结果中的阳性对照和空白对照的荧光曲线图。图16PTPRC(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，PTPRC(MT)反应液中FAM无明显S型曲线，判定为PTPRC rs10919563野生型。图17PTPRC(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，PTPRC(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为PTPRC rs10919563杂合型。图18PTPRC(WT)反应液中FAM无明显S型曲线，PTPRC(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为PTPRC rs10919563突变型。图19PTPRC(WT)反应液和PTPRC(MT)反应液的FAM曲线均Ct≤35，JOE曲线均Ct≤35。图20PTPRC(WT)反应液和PTPRC(MT)反应液的FAM无明显S型曲线，JOE也无明显S型曲线。
图21显示的是临床检测结果中HLA-E rs1264457的野生型，图22显示的是临床检测结果中HLA-E rs1264457的突变杂合型，图23显示的是临床检测结果中HLA-E rs1264457的突变纯合型，图24、图25分别显示的是临床检测结果中的阳性对照和空白对照的荧光曲线图。图21HLA-E(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，HLA-E(MT)反应液中FAM无明显S型曲线，判定为HLA-E rs1264457野生型。图22HLA-E(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，HLA-E(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为HLA-E rs1264457杂合型。图23HLA-E(WT)反应液中FAM无明显S型曲线，HLA-E(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为HLA-E rs1264457突变型。图24HLA-E(WT)反应液和HLA-E(MT)反应液的FAM曲线均Ct≤35，JOE曲线均Ct≤35。图25HLA-E(WT)反应液和HLA-E(MT)反应液的FAM无明显S型曲线，JOE也无明显S型曲线。
图26显示的是临床检测结果中TRAF1 rs3761847的野生型，图27显示的是临床检测结果中TRAF1 rs3761847的突变杂合型，图28显示的是临床检测结果中TRAF1 rs3761847的突变纯合型，图29、图30分别显示的是临床检测结果中的阳性对照和空白对照的荧光曲线图。图26TRAF1(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，TRAF1(MT)反应液中FAM无明显S型曲线，判定为TRAF1 rs3761847野生型。图27TRAF1(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，TRAF1(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为TRAF1 rs3761847杂合型。图28TRAF1(WT)反应液中FAM无明显S型曲线，TRAF1(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为TRAF1 rs3761847突变型。图29TRAF1(WT)反应液和TRAF1(MT)反应液的FAM曲线均Ct≤35，JOE曲线均Ct≤35。图30TRAF1(WT)反应液和TRAF1(MT)反应液的FAM无明显S型曲线，JOE也无明显S型曲线。
图31显示的是临床检测结果中KLRD1 rs2302489的野生型，图32显示的是临床检测结果中KLRD1 rs2302489的突变杂合型，图33显示的是临床检测结果中KLRD1 rs2302489的突变纯合型，图34、图35分别显示的是临床检测结果中的阳性对照和空白对照的荧光曲线图。图31KLRD1(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，KLRD1(MT)反应液中FAM无明显S型曲线，判定为KLRD1 rs2302489野生型。图32KLRD1(WT)反应液中FAM曲线Ct≤35，KLRD1(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为KLRD1 rs2302489杂合型。图33KLRD1(WT)反应液中FAM无明显S型曲线，KLRD1(MT)反应液中FAM曲线Ct≤35，判定为KLRD1 rs2302489突变型。图34KLRD1(WT)反应液和KLRD1(MT)反应液的FAM曲线均Ct≤35，JOE曲线均Ct≤35。图35KLRD1(WT)反应液和KLRD1(MT)反应液的FAM无明显S型曲线，JOE也无明显S型曲线。
图36至图37为TNF rs1800629多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图36的结果均不准确，只有图37的结果真实可靠；
图38至图39为KLRC1 rs7301582多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图38的结果均不准确，只有图39的结果真实可靠；
图40至图41为FCGR2A rs1801274多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图40的结果均不准确，只有图41的结果真实可靠；
图42至图43为PTPRC rs10919563多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图42的结果均不准确，只有图43的结果真实可靠；
图44至图45为HLA-E rs1264457多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图44的结果均不准确，只有图45的结果真实可靠；
图46至图47为TRAF1 rs3761847多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图46的结果均不准确，只有图47的结果真实可靠；
图48至图49为KLRD1 rs2302489多组设计引物的荧光扩增曲线图；其中图48的结果均不准确，只有图49的结果真实可靠。
实施例3：试剂盒的大样本验证
1、按照实施例1所示的配制方法，配制试剂盒相关组分，于-20℃保存备用。
2、取30例已知基因型全血样本，采用“核酸提取或纯化试剂”(备案号：湘长械备20160167)提取样本DNA，用核酸蛋白测定仪检测DNA样本浓度，30例样本A260/280皆在1.6～2.0之间。
3、按照实施例2所示的步骤，进行DNA加样并上ABI 7500荧光定量PCR仪进行检测。
4、按照实施例2所示判读标准，对结果进行判读并统计(检测结果符合率统计)，样品符合率为100％；检测结果具体信息如下表：
本发明提供的用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒具有以下有益效果：
一、通过利用ARMS结合QPCR技术重新设计并优化了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2Ars1801274、PTPRC rs10919563、HLA-E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489基因多态性时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、一个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点荧光曲线及结果直观的优点；
二、通过利用ARMS结合QPCR技术重新设计并优化了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2Ars1801274、PTPRC rs10919563、HLA-E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489基因多态性时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上荧光定量PCR仪、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于突变分析；
三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照和阳性对照，使得所述试剂盒在检测TNFrs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2A rs1801274、PTPRC rs10919563、HLA-E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489基因多态性时，可以更好的确保检测结果的准确性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 南昌豪仕医学检验实验室有限公司
<120> 用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcccctcc cagttctagt tc 22
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgcccctc aaaacctatt gcctcc 26
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggctgaacc ccgtgct 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggctgaacc ccgtgcc 17
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgatcaatc tgcatgacca gatc 24
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagatcacat catgcccgat aaaattagat agca 34
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccggccgatt gacttaatac tg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccggccgatt gacttaatac ta 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggacagtga tggtcacagg 20
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttggatccc accttctcca tcccac 26
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaaatccca gaaattctcg cg 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaaaatccca gaaattctcg ca 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agctgagtca tgggtataag gg 22
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tatatgcatt ttatagcaat tactataatt attta 35
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccattataag gacattcacg tttcac 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccattataag gacattcacg tttcat 26
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gagagtctca ggcgcctt 18
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgggcccca gctcgcagcc at 22
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcggaggaag cgacc 15
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcggaggaag cgact 15
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatggcaata cctgcttcac ag 22
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cctcaatacc accctctcta cctgct 26
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtcccttctc tcccctgca 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtcccttctc tcccctgcg 19
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtagagaagg cacgatgtgt ac 22
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttgctaaat ttcttcatac tcaactttca gattc 35
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
catttaaata cacaattttt cattctcga 29
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
catttaaata cacaattttt cattctcgt 29
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atcctgggct acactgagca c 21
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctcagtgtag cccaggatgc cctt 24
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aggtggtctc ctctgacttc aa 22
Claims (6)
1.一种用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对，其特征在于，所述阿达木单抗用药相关基因检测的多态性位点分别为TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2Ars1801274、PTPRC rs10919563、HLA-Ers1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1rs2302489，所述引物对包括：
针对TNF rs1800629等位基因的扩增引物，如下：
扩增TNF rs1800629野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：1所示，5’-AAGCCCCTCCCAGTTCTAGTTC-3’，
探针，如SEQ ID NO：2所示5’CATGCCCCTCAAAACCTATTGCCTCC-3’；
扩增TNF rs1800629野生型上游引物，如SEQ ID NO：3所示：5’-AGGCTGAACCCCGTGCT-3’；
扩增TNF rs1800629突变型上游引物，如SEQ ID NO：4所示：5’-AGGCTGAACCCCGTGCC-3’；
针对KLRC1 rs7301582等位基因的扩增引物，如下：
扩增KLRC1 rs7301582野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：5所示，5’-GTGATCAATCTGCATGACCAGATC-3’，
探针，如SEQ ID NO：6所示5’CAGATCACATCATGCCCGATAAAATTAGATAGCA-3’；
扩增KLRC1 rs7301582野生型上游引物，如SEQ ID NO：7所示：5’-CCGGCCGATTGACTTAATACTG-3’；
扩增KLRC1 rs7301582突变型上游引物，如SEQ ID NO：8所示：5’-CCGGCCGATTGACTTAATACTA -3’；
针对KLRC1 rs7301582等位基因的扩增引物，如下：
扩增FCGR2A rs1801274野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：9所示，5’-TGGACAGTGATGGTCACAGG-3’，
探针，如SEQ ID NO：10所示5’TTTGGATCCCACCTTCTCCATCCCAC-3’；
扩增FCGR2A rs1801274野生型上游引物，如SEQ ID NO：11所示：5’-GAAAATCCCAGAAATTCTCGCG-3’；
扩增FCGR2A rs1801274突变型上游引物，如SEQ ID NO：12所示：5’-GAAAATCCCAGAAATTCTCGCA-3’；
针对PTPRC rs10919563等位基因的扩增引物，如下：
扩增PTPRC rs10919563野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：13所示，5’-AGCTGAGTCATGGGTATAAGGG-3’，
探针，如SEQ ID NO：14所示，5’-TATATGCATTTTATAGCAATTACTATAATTATTTA-3’；
扩增PTPRC rs10919563野生型上游引物，如SEQ ID NO：15所示，5’-CCATTATAAGGACATTCACGTTTCAC-3’；
扩增PTPRC rs10919563突变型上游引物，如SEQ ID NO：16所示，5’-CCATTATAAGGACATTCACGTTTCAT-3’；
针对HLA-Ers1264457等位基因的扩增引物，如下：
扩增HLA-Ers1264457野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：17所示，5’-GAGAGTCTCAGGCGCCTT-3’，
探针，如SEQ ID NO：18所示5’-TCGGGCCCCAGCTCGCAGCCAT-3’；
扩增HLA-Ers1264457野生型上游引物，如SEQ ID NO：19所示：5’-GCGGAGGAAGCGACC-3’；
扩增HLA-Ers1264457突变型上游引物，如SEQ ID NO：20所示：5’-GCGGAGGAAGCGACT-3’；
针对TRAF1 rs3761847等位基因的扩增引物，如下：
扩增TRAF1 rs3761847野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：21所示，5’-GATGGCAATACCTGCTTCACAG-3’，
探针，如SEQ ID NO：22所示，5’-CCTCAATACCACCCTCTCTACCTGCT-3’；
扩增TRAF1 rs3761847野生型上游引物，如SEQ ID NO：23所示，5’-GTCCCTTCTCTCCCCTGCA-3’；
扩增TRAF1 rs3761847突变型上游引物，如SEQ ID NO：24所示，5’-GTCCCTTCTCTCCCCTGCG-3’；
针对KLRD1 rs2302489等位基因的扩增引物，如下：
扩增KLRD1 rs2302489野生型和突变型通用下游引物和探针：
下游引物，如SEQ ID NO：25所示，5’-GTAGAGAAGGCACGATGTGTAC-3’，
探针，如SEQ ID NO：26所示，5’-TTTGCTAAATTTCTTCATACTCAACTTTCAGATTC-3’；
扩增KLRD1 rs2302489野生型上游引物，如SEQ ID NO：27所示，5’-CATTTAAATACACAATTTTTCATTCTCGA-3’；
扩增KLRD1 rs2302489突变型上游引物，如SEQ ID NO：28所示，5’-CATTTAAATACACAATTTTTCATTCTCGT-3’；
针对GAPDH内参基因的扩增引物，如下：
扩增GAPDH基因的上游引物，如SEQ ID NO：29所示，5’-ATCCTGGGCTACACTGAGCAC-3’；
扩增GAPDH基因的下游引物，如SEQ ID NO：30所示，5’-CTCAGTGTAGCCCAGGATGCCCTT-3’；
扩增GAPDH基因的探针，如SEQ ID NO：31所示，5’-AGGTGGTCTCCTCTGACTTCAA-3’。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述探针还包括：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22和所示SEQ ID NO：26的探针5’端采用荧光报告基团(FAM)标记；SEQ ID NO:31所示的探针5’端采用荧光报告基团(JOE)标记；SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQID NO：22、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:31所示的探针3’端均采用荧光淬灭基团(TAMRA)标记。
3.一种用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述阿达木单抗用药相关基因检测的多态性位点分别为TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2Ars1801274、PTPRC rs10919563、HLA-Ers1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1rs2302489，所述试剂盒包括：
引物液1，所述引物液1含有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液2，所述引物液2含有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液3，所述引物液3含有如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液4，所述引物液4含有如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液5，所述引物液5含有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液6，所述引物液6含有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液7，所述引物液7含有如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液8，所述引物液8含有如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液9，所述引物液9含有如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液10，所述引物液10含有如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液11，所述引物液11含有如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液12，所述引物液12含有如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液13，所述引物液11含有如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针；
引物液14，所述引物液12含有如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的扩增引物及探针。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性对照，其为插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3扩增产物、插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4扩增产物、插有SEQID NO：5和SEQ ID NO：7扩增产物、插有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8扩增产物、插有SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：11扩增产物、插有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12扩增产物、插有SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：15扩增产物、插有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16扩增产物、插有SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：19扩增产物、插有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20扩增产物、插有SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：23扩增产物、插有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：24扩增产物、插有SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:27扩增产物、插有SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28扩增产物、插有SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30扩增产物的15种质粒所组成的质粒混合物；
其中，质粒载体为pMD18-T质粒。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照1质粒混合物中TNFrs1800629野生纯合子质粒、TNF rs1800629突变纯合子质粒、KLRC1 rs7301582野生纯合子质粒、KLRC1 rs7301582突变纯合子质粒、FCGR2A rs1801274野生纯合子质粒、FCGR2Ars1801274突变纯合子质粒、PTPRC rs10919563野生纯合子质粒、PTPRC rs10919563突变纯合子质粒、HLA-Ers1264457野生纯合子质粒、HLA-Ers1264457突变纯合子质粒、TRAF1rs3761847野生纯合子质粒、TRAF1 rs3761847突变纯合子质粒、KLRD1 rs2302489野生纯合子质粒、KLRD1 rs2302489突变纯合子质粒和内参GAPDH质粒的数量比为1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：2。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括空白对照，所述空白对照为灭菌纯化水。
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