CN110699440A - 一种检测二甲双胍个体化用药相关基因snp位点的引物及方法 - Google Patents

一种检测二甲双胍个体化用药相关基因snp位点的引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的引物及方法，所述的引物可对SLC47A1基因rs2289669 SNP位点进行检测，所述的引物序列包括野生型上游引物、突变型上游引物、共用下游引物；本发明在ARMS‑PCR基础上做了改进，针对SNP序列设计的特异性引物及共用下游引物，特异性引物于3’末端第二位引入错配碱基，以此扩大特异性引物3’末端碱基与DNA模版上SNP位点碱基互补和不互补情况下扩增效率间的差距，从而大幅度提高检测的特异性和准确性；引入了Real‑time PCR技术，可根据△ct值进行判读，即△Ct＝突变Ct－野生Ct，一般情况下△Ct＞7为野生型，△Ct＜‑7为突变型，‑2＜△Ct＜2为杂合型。本发明的优点是，快速、简便、经济、结果判读准确可靠，且特异性高。

Description

一种检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的引物及 方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的引物及方法。
背景技术
糖尿病是由胰岛素缺乏或生物效应降低所致的内分泌代谢疾病，其发病率逐年上升。世界卫生组织指出，2025年全世界将出现3.8亿名糖尿病患者。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢性病监测及糖尿病患病率为2.6％，60岁以上老年人患病率高达19.6％，全国有成年糖尿病患者9700万人，已超越印度成为全球糖尿病人数最多的国家”，给患者的身心健康及经济造成沉重的负担。二甲双胍被认为是国内外治疗2型糖尿病临床治疗的一线口服药物，二甲双胍可有效地降低糖尿病前期人群发生2型糖尿病的风险，具有良好的耐受性和长期有效性，此外，还具有改善血脂，抗肿瘤、保护心血管等作用。但在临床应用中，二甲双胍仍存在较为显著的个体差异(39％-71％)，因此，探讨决定其个体疗效差异的基因多态性位点，是实现糖尿病精准医学的第一步，通过基因分型检测，可以更有效的指导医生进行个体化用药治疗，提高二甲双胍的治疗水平。
二甲双胍结构稳定，几乎不与血浆蛋白结合，进入人体后不易被代谢，主要以原型通过各种有机阳离子转运体从肝脏和肾脏排出，所以位于肝脏和肾脏的各种转运体成为了二甲双胍药物疗效个体差异的重点研究对象。
SLC47A1基因编码多药及毒素外排转运体MATE1(multidrug and toxinextrusion)蛋白。主要表达于肾脏近端小管和肝脏胆小管的官腔侧刷状缘膜，介导着阳离子药物从肾小管上皮细胞的外排和从胆小管排泄到胆汁。SLC47A1可通过作用于二甲双胍的肾脏清除率和排泄率，影响药物浓度，进而影响二甲双胍的降糖作用。研究报道，在中国人群中，SLC47A1基因rs2289669(G>A)位点多态性是影响二甲双胍个体反应差异的主要因素之一。且AA基因型患者较GA/GG型患者的二甲双胍药代能力更强，服用二甲双胍后AA基因型HbA1c下降更明显且在服用二甲双胍后一年内的血糖降低效果更明显。因此，通过检测SLC47A1基因rs2289669位点多态性，可指导临床医生合理选择二甲双胍。
基因多态性检测是指以含有遗传信息的物质(如血液)为起始材料，通过核酸提取、扩增和对扩增产物进行表征等过程检测基因序列的差异，目前报道的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法主要有：直接测序法、高分辨率熔解曲线法(HRM)、PCR-RFLP法、Taqman探针法、突变扩增系统(amplification refractorymutation system,ARMS)PCR法等。直接测序法虽是SNP分析的金标准，可发现已知和未知的SNP位点，但每个位点均需经PCR扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期长、不适合大样本做疾病关联分析，且易发生交叉污染。Taqman探针法适合少量位点大量样本的分型项目，但其探针合成价格昂贵，不适合少量样本多位点分型，特别是频率偏低的位点。PCR-RFLP法优点是分型技术简单，结果判定容易，避免测量误差，结果稳；其缺点是序列多态性座位中大约只有1/3的碱基涉及限制酶识别序列，遗传标记系统的个人识别能力有限，限制酶消化条件较高。HRM法可高通量检测基因的突变情况，但其所需检测仪器比普通的荧光PCR仪更为精密，对温度敏感性要求高，受仪器影响大很难普及。ARMS-PCR法，又称等位基因特异性扩增法，其基本原理是因为Taq DNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。ARMS-PCR可检测DNA分子上任何点突变和小的缺失，其方法可靠、不依赖于任何特殊标记，但往往反应结束后还需进行凝胶电泳，增加了PCR污染的机会，且耗时费力。因此，迫切需要开发一直高灵敏度，经济实惠、快速且结果判读准确可靠的SNP检测方法，以实现对SLC47A1rs2289669SNP位点的检测，指导临床医生个体化用药。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题，提供一种快速、简便、经济、结果判读准确可靠的检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的引物及方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的引物，其对对SLC47A1基因rs2289669SNP位点进行检测；
所述用于SLC47A1基因rs2289669SNP位点检测的引物序列包括：野生型上游引物、突变型上游引物及共用下游引物，具体为：
SEQ ID NO.01：CTCAGTTTCCACAGTAGCGTAGG，
SEQ ID NO.02：GCTCAGTTTCCACAGTAGCGTAGA，
SEQ ID NO.03：AGCAGGGAAACGGTAGAGGAC。
检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的方法，包括以下步骤：
(1)临床样本DNA提取：
按照天根血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取，将所得的DNA样品用紫外分光光度计进行定量，并将其稀释到40ng/μL，用于后续实验；
(2)ARMS-qPCR法扩增临床样本DNA：设置A组(野生型引物扩增组)及B组(突变型引物扩增组)，具体操作步骤如下：
2.1将检测所需试剂及样本置于冰上融化并轻弹混匀，将样本及试剂加入联管，并按照体积由高到低依次加入反应孔中；
2.2加样完毕后扣紧管盖，用手轻轻震荡混匀反应体系，避免产生气泡，离心；
2.3取出离心后的样品，放入荧光定量PCR仪中；
2.4设定PCR反应程序；
2.5对检测结果进行判读：根据溶解曲线确定扩增反应效果，溶解曲线只有单峰且出峰位置是目的产物退火温度Tm＝90℃(Tm相差范围为±2℃)，那么实验结果有效，可对数据进行判读，ΔCt＝Ct B组-CtA组，当ΔCt＞7为野生型(基因型为GG)，ΔCt＜-7为突变型(基因型为AA)，-2＜ΔCt＜2为杂合型(基因型为GA)。
作为优选，所述步骤(2)的检测仪器为TL988实时荧光定量PCR仪，或ABI7500实时荧光定量PCR仪。
作为优选，所述步骤2.1的联管为与检测仪器相配套的八联管，所采用的酶为SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)预混液。
本发明的有益效果在于：
本发明主要是在ARMS-qPCR法的基础上鉴定SLC47A1基因多态性，以此为依据为二甲双胍的个体化用药提供指导。其成本低且特异性高：联合Real-time PCR技术，根据扩增曲线的Ct值进行分析，大大提高了检测基因的特异性；操作简单，一次加样，从PCR反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，可有效降低污染；检测时间短，从样本接收到检测完成只需3个小时左右；结果判读准确直观，一份样本的检测只需要两个PCR管反应就可以完成，根据各反应的Ct差值直接确定其基因型，结果准确可靠，与一代测序结果检测对比，一致率达100％，有望在临床快速基因分型中得到广泛的应用。解决现有其它检测技术价格昂贵、操作复杂、周期长、特异性不高、通量低等问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明利用本发明中的引物对1号待测临床样本的SLC47A1基因rs2289669SNP位点进行检测的结果示意图；
图2为利用本发明中的引物对2号待测临床样本的SLC47A1基因rs2289669SNP位点进行检测的结果示意图；
图3是利用本发明中的引物对3号待测临床样本的SLC47A1基因rs2289669SNP位点进行检测的结果示意图；
图4为利用直接测序法对1号临床样本进行SLC47A1基因rs2289669SNP位点的检测结果示意图；
图5是利用直接测序法对2号临床样本进行SLC47A1基因rs2289669SNP位点的检测结果示意图；
图6是利用直接测序法对3号临床样本进行SLC47A1基因rs2289669SNP位点的检测结果示意图。
具体实施方式
本发明的原理是：在ARMS-PCR基础上对其做了改进，针对SNP序列设计的特异性引物及共用下游引物，特异性引物于3’末端第二位引入错配碱基，以此扩大特异性引物3’末端碱基与DNA模版上SNP位点碱基互补和不互补情况下扩增效率间的差距，从而大幅度提高检测的特异性和准确性。其次，引入了Real-time PCR技术，可根据△ct值进行判读，即△Ct＝突变Ct-野生Ct，一般情况下△Ct＞7为野生型，△Ct＜-7为突变型，-2＜△Ct＜2为杂合型，该法相比较于其他方法，其操作简单、结果直观，检测时间短，成本低且特异性高。因此，本发明主要是在ARMS-qPCR法的基础上鉴定SLC47A1基因多态性，以此为依据为二甲双胍的个体化用药提供指导。
本发明的方案为：一种用于检测二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP位点的引物及方法。所述的引物可对SLC47A1基因rs2289669SNP位点进行检测。
所述的用于SLC47A1基因rs2289669SNP位点检测的引物序列包括野生型上游引物、突变型上游引物、共用下游引物，如下所示：
SEQ ID NO.01：CTCAGTTTCCACAGTAGCGTAGG
SEQ ID NO.02：GCTCAGTTTCCACAGTAGCGTAGA
SEQ ID NO.03：AGCAGGGAAACGGTAGAGGAC
如图1，是利用本发明中的引物对1号待测临床样本的SLC47A1基因rs2289669SNP位点进行检测的结果。结果显示为G/G型，提示该患者接受二甲双胍治疗疗效较弱。
如图2，是利用本发明中的引物对2号待测临床样本(A/A型)的SLC47A1基因rs2289669SNP位点进行检测的结果。结果显示为A/A型，提示该患者接受二甲双胍治疗疗效较强。
如图3，是利用本发明中的引物对3号待测临床样本的SLC47A1基因rs2289669SNP位点进行检测的结果。结果显示为G/A型，提示该患者接受二甲双胍治疗疗效一般。
如图4，是利用直接测序法对1号临床样本进行SLC47A1基因rs2289669SNP位点的检测结果，结果显示为单峰，基因型为G/G型。
如图5，是利用直接测序法对2号临床样本进行SLC47A1基因rs2289669SNP位点的检测结果，结果显示为单峰，基因型为A/A型。
如图6，是利用直接测序法对3号临床样本进行SLC47A1基因rs2289669SNP位点的检测结果，结果出现重叠峰，基因型为G/A型。
本发明方法所提供的实施例为：
(1)临床样本DNA提取
本实施例是从2型糖尿病患者的血液中提取DNA，并对其进行定量，以此作为ARMS-qPCR检测用模板。DNA提取试剂盒为天根血液基因组DNA提取试剂盒。将所得的DNA样品用紫外分光光度计进行定量，并将其稀释到40ng/μL，用于后续实验。
(2)ARMS-qPCR法扩增临床样本DNA
检测仪器可选用天隆TL988实时荧光定量PCR仪，或者ABI7500实时荧光定量PCR仪，应注意与仪器对应的反应体系不同。每个样本检测过程中需设A组(野生型引物扩增组)及B组(突变型引物扩增组)，除上游引物不同外，A/B两组的反应体系应一致，并且必须在同一台仪器上同时对A/B两组进行检测，具体操作步骤如下：
2.1将检测所需试剂及样本置于冰上融化并轻弹混匀，按照表1或表2所示反应体系将样本及试剂加入8联管(需使用与仪器配套8联管)，并且应按照体积由高到低依次加入反应孔中，所用酶为天根公司的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)预混液；
表1 ARMS-qPCR反应体系(限天隆TL988使用)
Figure BDA0001723378940000061
表2 ARMS-qPCR反应体系(限ABI 7500使用)
Figure BDA0001723378940000062
2.2加样完毕后扣紧管盖，应注意避免磨损或弄脏管盖，用手轻轻震荡混匀反应体系，同时避免产生气泡，离心机离心30s；
2.3小心取出离心后的样品，放入荧光定量PCR仪中，操作过程中应垂直拿放8联管，避免部分样品溅到管壁或管盖上，影响反应体系及荧光信号的采集；
2.4设定PCR反应程序，具体内容如下：
表3 ARMS-qPCR反应程序
Figure BDA0001723378940000071
2.5对检测结果进行判读：根据溶解曲线确定扩增反应效果，溶解曲线只有单峰且出峰位置是目的产物退火温度Tm＝90℃(Tm相差范围为±2℃)，那么实验结果有效，可对数据进行判读，ΔCt＝Ct B组-CtA组，当ΔCt＞7为野生型(基因型为GG)，ΔCt＜-7为突变型(基因型为AA)，-2＜ΔCt＜2为杂合型(基因型为GA)。
采用上述方法对56例临床样本进行SLC47A1rs2289669SNP位点基因型分析，所得结果与直接测序结果100％一致。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果和显著进步：
(1)特异性高，本发明联合Real-time PCR技术，根据扩增曲线的Ct值进行分析，大大提高了检测基因的特异性。
(2)检测时间短，从样本接收到检测完成只需3个小时左右。
(3)操作简单，一次加样，从PCR反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，可有效降低污染。
(4)结果判读准确直观，一份样本的检测只需要2个PCR管反应就可以完成，根据各反应的Ct差值直接确定其基因型，结果准确可靠，与一代测序结果检测对比，一致率达100％，有望在临床快速基因分型中得到广泛的应用。解决现有其它检测技术价格昂贵、操作复杂、周期长、特异性不高、通量低等问题。
本发明中未做详细描述的内容均为现有技术。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的引物，其特征在于，其对SLC47A1基因rs2289669SNP位点进行检测；
所述用于SLC47A1基因rs2289669SNP位点检测的引物序列包括：野生型上游引物、突变型上游引物及共用下游引物，具体为：
SEQ ID NO.01：CTCAGTTTCCACAGTAGCGTAGG，
SEQ ID NO.02：GCTCAGTTTCCACAGTAGCGTAGA，
SEQ ID NO.03：AGCAGGGAAACGGTAGAGGAC。
2.一种检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)临床样本DNA提取：
按照天根血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取，将所得的DNA样品用紫外分光光度计进行定量，并将其稀释到40ng/μL，用于后续实验；
(2)ARMS-qPCR法扩增临床样本DNA：设置A组(野生型引物扩增组)及B组(突变型引物扩增组)，具体操作步骤如下：
2.1将检测所需试剂及样本置于冰上融化并轻弹混匀，将样本及试剂加入联管，并按照体积由高到低依次加入反应孔中；
2.2加样完毕后扣紧管盖，用手轻轻震荡混匀反应体系，避免产生气泡，离心；
2.3取出离心后的样品，放入荧光定量PCR仪中；
2.4设定PCR反应程序；
2.5对检测结果进行判读：根据溶解曲线确定扩增反应效果，溶解曲线只有单峰且出峰位置是目的产物退火温度Tm＝90℃，则实验结果有效，对数据进行判读，ΔCt＝Ct B组－CtA组，当ΔCt＞7为野生型，ΔCt＜-7为突变型，-2＜ΔCt＜2为杂合型。
3.根据权利要求2所述的一种检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的方法，其特征在于，所述步骤2.5中野生型的基因型为GG，突变型的基因型为AA，杂合型的基因型为GA，退火温度Tm相差范围为±2℃。
4.根据权利要求2所述的一种检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的方法，其特征在于，所述步骤(2)的检测仪器为TL988实时荧光定量PCR仪，或ABI7500实时荧光定量PCR仪。
5.根据权利要求2所述的一种检测二甲双胍个体化用药相关基因SNP位点的方法，其特征在于，所述步骤2.1的联管为与检测仪器相配套的八联管，所采用的酶为SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)预混液。
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