发明内容
针对现有的检测方法多突变位点无法同时检测,且检测周期长、灵敏度低等问题,本申请提供一种检测高血压用药基因多态性的核酸组合物及试剂盒。
第一方面,申请提供了一种检测高血压用药基因多态性的核酸组合物,是通过以下技术方案得以实现的。
一种检测高血压用药基因多态性的核酸组合物,包括用于检测ADRB1基因1165G>C位点、CYP2D6*10基因100C>T位点、CYP2C9*3基因1075A>C位点、CYP3A5*3基因6986A>G位点、AGTR1基因1166A>C位点、NPPA基因2238T>C位点、ACE(I/D)基因、MTHFR基因677C>T位点、ApoE基因388T>C位点和ApoE基因526C>T位点的上游引物和下游引物;
ADRB1基因1165G>C位点的上游引物如SEQ ID NO:1所示;
ADRB1基因1165G>C位点的下游引物如SEQ ID NO:2所示;
CYP2D6*10基因100C>T位点的上游引物如SEQ ID NO:3所示;
CYP2D6*10基因100C>T位点的下游引物如SEQ ID NO:4所示;
CYP2C9*3基因1075A>C位点的上游引物如SEQ ID NO:5所示;
CYP2C9*3基因1075A>C位点的下游引物如SEQ ID NO:6所示;
CYP3A5*3基因6986A>G位点的上游引物如SEQ ID NO:7所示;
CYP3A5*3基因6986A>G位点的下游引物如SEQ ID NO:8所示;
AGTR1基因1166A>C位点的上游引物如SEQ ID NO:9所示;
AGTR1基因1166A>C位点的下游引物如SEQ ID NO:10所示;
NPPA基因2238T>C位点的上游引物如SEQ ID NO:11所示;
NPPA基因2238T>C位点的下游引物如SEQ ID NO:12所示;
ACE(I/D)基因的上游引物如SEQ ID NO:13所示;
ACE(I/D)基因的下游引物如SEQ ID NO:14所示;
MTHFR基因677C>T位点的上游引物如SEQ ID NO:15所示;
MTHFR基因677C>T位点的下游引物如SEQ ID NO:16所示;
ApoE基因388T>C位点的上游引物如SEQ ID NO:17所示;
ApoE基因388T>C位点的下游引物如SEQ ID NO:18所示;
ApoE基因526C>T位点的上游引物如SEQ ID NO:19所示;
ApoE基因526C>T位点的下游引物如SEQ ID NO:20所示。
通过采用上述技术方案,本申请根据NCBI上公布的人ADRB1、CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP3A5*3、AGTR1、NPPA、ACE(I/D)、MTHFR、ApoE基因序列,依照引物设计原理,设计了能扩增出包含各突变位点的特异性引物。本申请引物的扩增特异性、灵敏度以及重复性均较高,将其应用于qPCR来检测待测样本的基因多态性,检测结果准确,为高血压精准用药提供了可靠的保证,从而实现对高血压患者的个体化用药,提高治疗效果。
可选的,所述核酸组合物还包括内参ACTB基因的上游引物和下游引物;ACTB基因的上游引物如SEQ ID NO:41所示;ACTB基因的下游引物如SEQ ID NO:42所示。
通过采用上述技术方案,本申请在针对10个突变位点设计引物的同时,还设计了针对内参ACTB基因的上、下游引物,将ACTB基因与10个突变位点一同进行PCR扩增,可以有效的校正实验误差,确保实验结果有效性的同时提高实验结果的准确性。
可选的,所述核酸组合物还包括用于检测ADRB1基因1165G>C位点、CYP2D6*10基因100C>T位点、CYP2C9*3基因1075A>C位点、CYP3A5*3基因6986A>G位点、AGTR1基因1166A>C位点、NPPA基因2238T>C位点、ACE(I/D)基因、MTHFR基因677C>T位点、ApoE基因388T>C位点和ApoE基因526C>T位点的探针;
ADRB1基因1165G>C位点的突变型基因探针如SEQ ID NO:21所示;
ADRB1基因1165G>C位点的野生型基因探针如SEQ ID NO:22所示;
CYP2D6*10基因100C>T位点的突变型基因探针如SEQ ID NO:23所示;
CYP2D6*10基因100C>T位点的野生型基因探针如SEQ ID NO:24所示;
CYP2C9*3基因1075A>C位点的突变型基因探针如SEQ ID NO:25所示;
CYP2C9*3基因1075A>C位点的野生型基因探针如SEQ ID NO:26所示;
CYP3A5*3基因6986A>G位点的突变型基因探针如SEQ ID NO:27所示;
CYP3A5*3基因6986A>G位点的野生型基因探针如SEQ ID NO:28所示;
AGTR1基因1166A>C位点的突变型基因探针如SEQ ID NO:29所示;
AGTR1基因1166A>C位点的野生型基因探针如SEQ ID NO:30所示;
NPPA基因2238T>C位点的突变型基因探针如SEQ ID NO:31所示;
NPPA基因2238T>C位点的野生型基因探针如SEQ ID NO:32所示;
ACE(I/D)突变型基因探针如SEQ ID NO:33所示;
ACE(I/D)野生型基因探针如SEQ ID NO:34所示;
MTHFR基因677C>T位点的突变型基因探针如SEQ ID NO:35所示;
MTHFR基因677C>T位点的野生型基因探针如SEQ ID NO:36所示;
ApoE基因388T>C位点的突变型基因探针如SEQ ID NO:37所示;
ApoE基因388T>C位点的野生型基因探针如SEQ ID NO:38所示;
ApoE基因526C>T位点的突变型基因探针如SEQ ID NO:39所示;
ApoE基因526C>T位点的野生型基因探针如SEQ ID NO:40所示;
所述探针的5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有非荧光淬灭基团并连接有MGB修饰基团。
通过采用上述技术方案,本申请为了进一步提高检测方法的特异性和准确性,针对10个突变位点设计了相应的检测探针,且探针的5’端采用不同的荧光报告基团标记,3’端采用非荧光淬灭基团标记并连接MGB修饰基团。本申请探针3’端采用非荧光淬灭基团标记,其本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度,同时本申请探针的3’端还连接有MGB修饰基团,MGB是源于某些抗菌素分子的化学基团,其能嵌入DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合,将其与探针结合可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值,MGB修饰的探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,方便了探针的设计,提高了探针设计的成功率,同时还降低了成本。
可选的,突变型基因探针的荧光报告基团选用FAM或Cy5基团;野生型基因探针的荧光报告基团选用VIC或ROX基团。
通过采用上述技术方案,本申请采用的荧光报告基团均为常用的荧光基团,而且突变型基因探针标记的荧光基团与野生型基因探针标记的荧光基团不同,在同一体系中进行实时荧光PCR时,可以进行有效区分,便于实验结果的观察和统计。
可选的,所述CYP3A5*3基因6986A>G位点的突变型基因探针的第5个碱基进行锁核酸修饰;CYP3A5*3基因6986A>G位点的野生型基因探针的第12个碱基进行锁核酸修饰。
可选的,所述AGTR1基因1166A>C位点的突变型基因探针的第8个碱基进行锁核酸修饰;AGTR1基因1166A>C位点的野生型基因探针的第2个碱基进行锁核酸修饰。
通过采用上述技术方案,本申请还对CYP3A5*3基因探针和AGTR1基因探针进行锁核酸修饰,锁核酸(LNA)是一种特殊的双环状核苷酸衍生物,结构中含有一个或多个2'-O,4'-C-亚甲基-D-呋喃核糖核酸单体,核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥硫亚甲基桥或胺亚甲基桥并连接成环形,形成的环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架,故在PCR反应中LNA对模板DNA有很好的识别能力和强大的亲和力,从而提高了探针的特异性和灵敏度。
可选的,所述核酸组合物还包括内参ACTB基因的探针,ACTB基因探针如SEQ IDNO:43所示。
通过采用上述技术方案,本申请还设计了针对内参ACTB基因的探针,可有效校正实时荧光PCR中的实验误差,提高实验结果的准确性。
第二方面,本申请提供一种检测高血压用药基因多态性的试剂盒,是通过以下技术方案得以实现的。
一种检测高血压用药基因多态性的试剂盒,包括上述核酸组合物。
通过采用上述技术方案,本申请采用含有上述引物和探针的试剂盒对待测样本进行基因多态性的检测,只需将配置的PCR反应体系放入PCR仪中进行实时荧光检测,便可获得基因分型的检测结果,整个检测过程简单,检测周期短。而且本申请在同一体系中可对两个基因进行分型,在同一反应条件下可对9个基因的10个突变位点进行分型,特异性好,且检测灵敏度可达0.3ng/μl。
可选的,所述试剂盒中上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L,所述探针的浓度均为10μmol/L。
通过采用上述技术方案,本申请进一步限定试剂盒中上、下游引物以及探针的浓度,从而通过控制引物和探针的加入量来控制二者在反应体系中的终浓度,对引物和探针的终浓度进行限制可以有效保证实时荧光PCR的顺利进行。
可选的,所述试剂盒还包括PCR MIX。
通过采用上述技术方案,本申请将PCR缓冲液、阳离子、dNTPs、DNA聚合酶等成分预先混合成PCR MIX,在对待测样本进行基因多态性检测时,可以有效降低加样操作的复杂度,缩短反应体系的配制时间,提高检测效率,同时也降低了加样错误的发生率,提高了检测结果的准确性和可靠性。
综上所述,本申请具有以下有益效果:
1、本申请使用锁核酸修饰的TaqMan MGB探针,探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团,其本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度;同时探针上还连接有MGB修饰基团,可将探针的Tm值提高10℃左右,提高了探针设计的成功率,降低了成本;另外,锁核酸修饰探针,提高了探针对DNA模板的亲和力和识别能力,从而提高了探针的特异性和灵敏度;
2、本申请试剂盒可以对低至0.3ng/μl的待测样本进行准确的基因分型,而且在同一体系中可对两个基因进行分型,灵敏度高,检测成本较低;
3、本申请能够同时检测EDTA抗凝全血样本中ADRB1、CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP3A5*3、AGTR1、NPPA、ACE(I/D)、MTHFR、ApoE(388T>C)和ApoE(526C>T)突变型和野生型基因,特异型好,可用于指导高血压临床用药;
4、采用本申请试剂盒对待测样本进行基因分型,操作步骤简单,检测周期短,检测效率较高。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
制备例
阳性参考品的制备
根据NCBI数据库公布的ADRB1、CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP3A5*3、AGTR1、NPPA、ACE(I/D)、MTHFR、ApoE(388T>C、526T>C)9个基因序列,选取含有突变位点的基因片段并将其插入T载体中,利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒,得到阳性参考品。ADRB1、CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP3A5*3、AGTR1、NPPA、ACE(I/D)、MTHFR、ApoE(388T>C)、ApoE(526T>C)含有突变位点的基因片段的序列信息参见表1。
表1
实施例1
本申请从NCBI上搜索到人ADRB1、CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP3A5*3、AGTR1、NPPA、ACE(I/D)、MTHFR、ApoE以及内参ACTB基因cds序列,根据引物设计原理,利用primer软件设计了能扩增出包含各突变位点的多对上下游引物,并采用PCR技术对多对引物进行测试,发现不同引物会影响扩增片段的长度,不同扩增长度对该实验方案的灵敏度会有影响,并且不同引物扩增的效率不同。本申请挑选出特异性较好,灵敏度较高,扩增效率较高的引物对,引物序列信息如表2所示。
表2
序号 |
名称 |
序列(5’-3’) |
SEQ ID NO:1 |
ADRB1基因1165G>C位点的上游引物 |
ACCGCCTCTTCGTCTTCTTC |
SEQ ID NO:2 |
ADRB1基因1165G>C位点的下游引物 |
TCTCCGTGGGTCGCGT |
SEQ ID NO:3 |
CYP2D6*10基因100C>T位点的上游引物 |
CGTGATAGTGGCCATCTTCCT |
SEQ ID NO:4 |
CYP2D6*10基因100C>T位点的下游引物 |
TGGAAGTCCACATGCAGCAG |
SEQ ID NO:5 |
CYP2C9*3基因1075A>C位点的上游引物 |
ATGCAAGACAGGAGCCACAT |
SEQ ID NO:6 |
CYP2C9*3基因1075A>C位点的下游引物 |
TGGGGACTTCGAAAACATGG |
SEQ ID NO:7 |
CYP3A5*3基因6986A>G位点的上游引物 |
CACCCAGCTTAACGAATGCTC |
SEQ ID NO:8 |
CYP3A5*3基因6986A>G位点的下游引物 |
GTTGTACGACACACAGCAACC |
SEQ ID NO:9 |
AGTR1基因1166A>C位点的上游引物 |
AGAAGGAGCAAGAGAACATTCC |
SEQ ID NO:10 |
AGTR1基因1166A>C位点的下游引物 |
TTGTTGCAAAAGGAAAGAAAAGC |
SEQ ID NO:11 |
NPPA基因2238T>C位点的上游引物 |
GGAGCCTCTTGCAGTCTGTC |
SEQ ID NO:12 |
NPPA基因2238T>C位点的下游引物 |
CTTTTCCAGGACAGCCAGGT |
SEQ ID NO:13 |
ACE(I/D)基因的上游引物 |
CCACTCCCATCCTTTCTCCC |
SEQ ID NO:14 |
ACE(I/D)基因的下游引物 |
GCTTGTAAGGGGAGCTCAGA |
SEQ ID NO:15 |
MTHFR基因677C>T位点的上游引物 |
CTGGGCAGAGAGAGTCCTCTGCTTT |
SEQ ID NO:16 |
MTHFR基因677C>T位点的下游引物 |
TGAGGGGCCCAGGAGAGCCCATAAG |
SEQ ID NO:17 |
ApoE基因388T>C位点的上游引物 |
CTGGAGGAACAACTGACCCC |
SEQ ID NO:18 |
ApoE基因388T>C位点的下游引物 |
GAGCATGGCCTGCACCTC |
SEQ ID NO:19 |
ApoE基因526C>T位点的上游引物 |
CTGCGTAAGCGGCTCCTC |
SEQ ID NO:20 |
ApoE基因526C>T位点的下游引物 |
GCGGCCCTGTTCCACCA |
SEQ ID NO:41 |
ACTB基因上游引物 |
AGTGGCTTCCCCAGTGTGAC |
SEQ ID NO:42 |
ACTB基因下游引物 |
TCCATCACGATGCCAGTGGT |
实施例2
本申请针对人ADRB1、CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP3A5*3、AGTR1、NPPA、ACE(I/D)、MTHFR、ApoE以及内参ACTB基因cds序列的突变位点设计了野生型基因探针和突变型基因探针,探针的序列信息如表3所示。
表3
注:表中“+N”表示该碱基为LNA修饰
本申请的上、下游引物以及探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,每条探针的标记基团在合成时已引入。
实施例3
一种检测高血压用药基因多态性的试剂盒,包括实施例1所述上、下游引物、实施例2所述探针和PCR MIX。所述PCR MIX包括阳离子、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液等成分。本申请将每2个突变位点所对应引物和探针配制成一个反应体系,连同内参基因共配制成6个反应体系,每个反应体系的具体成分参见表4-9。
表4
表5
Tris-HCl(pH=8.8)(1M) |
2μl |
MgCl<sub>2</sub>(2M) |
0.6μl |
dNTPs(100mM) |
0.25μl |
KCl(2M) |
0.5μl |
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(0.5M) |
0.4μl |
DMSO(10%) |
0.5μl |
热启动DNA聚合酶(2U) |
0.8μl |
CYP2C9*3正向引物(10μm/L) |
1.8μl |
CYP2C9*3反向引物(10μm/L) |
1.8μl |
CYP2C9*3-MT探针(10μm/L) |
0.6μl |
CYP2C9*3-WT探针(10μm/L) |
0.6μl |
CYP3A5*3正向引物(10μm/L) |
1.8μl |
CYP3A5*3反向引物(10μm/L) |
1.8μl |
CYP3A5*3-MT探针(10μm/L) |
0.6μl |
CYP3A5*3-WT探针(10μm/L) |
0.6μl |
ddH<sub>2</sub>O |
3.35μl |
总体积 |
18μl |
表6
表7
表8
Tris-HCl(pH=8.8)(1M) |
2μl |
MgCl<sub>2</sub>(2M) |
0.6μl |
dNTPs(100mM) |
0.25μl |
KCl(2M) |
0.5μl |
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(0.5M) |
0.4μl |
DMSO(10%) |
0.5μl |
热启动DNA聚合酶(2U) |
0.8μl |
MTHFR正向引物(10μm/L) |
1.8μl |
MTHFR反向引物(10μm/L) |
1.8μl |
MTHFR-MT探针(10μm/L) |
0.6μl |
MTHFR-WT探针(10μm/L) |
0.6μl |
ApoE(388T>C)正向引物(10μm/L) |
1.8μl |
ApoE(388T>C)反向引物(10μm/L) |
1.8μl |
ApoE(388T>C)-MT探针(10μm/L) |
0.6μl |
ApoE(388T>C)-WT探针(10μm/L) |
0.6μl |
ddH<sub>2</sub>O |
3.35μl |
总体积 |
18μl |
表9
注:表中“MT”表示突变型,“WT”表示野生型。
实验过程中,将表4-9配制的PCR反应液与2μlDNA模板混合,得到20μl PCR特异扩增反应体系。
应用例1
采用本申请实施例3的试剂盒对含有ADRB1、CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP3A5*3、AGTR1、NPPA、ACE(I/D)、MTHFR、ApoE基因的阳性对照品进行检测,具体的检测方法如下:
S1.将制备例制备的阳性参考品按照相应体系以0.3ng/μl进行等浓度混合,得到DNA模板;
S2.按照实施例3配置6个实时荧光PCR反应体系,每个反应体系18μl;
S3.取2μl步骤S1得到的DNA模板加入步骤S2的PCR反应体系并置于96孔板或8联管中,封好膜或盖好管盖,轻轻涡旋混合均匀并瞬时离心;
S4.将离好心的96孔板或8联管放入实时荧光PCR仪中,设置反应程序进行PCR扩增及荧光信号采集。PCR扩增反应程序为:37℃,5分钟1个循环95℃,10分钟1个循环;95℃,30秒变性,64℃,40秒退火,72℃,20秒延伸共进行5个循环;95℃,30秒变性,60℃,40秒退火,72℃,20秒延伸共进行40个循环;98℃,10分钟1个循环;16℃保持。设置在延伸阶段采集荧光信号。
实验结果如图1-6所示,本申请的实时荧光PCR反应体系在同一反应条件下能够对10个突变位点的突变型和野生型基因进行扩增,形成对数扩增“S”型曲线。实验结果表明,本申请高血压用药基因多态性试剂盒的检测灵敏度可达0.3ng/μl,灵敏度高,特异性好。
应用例2
本申请实施例3的试剂盒可用于对临床样本的基因多态性进行检测。本申请实施例3试剂盒的具体检测方法如下:
S1.采集受试者的外周血样,使用QIAamp DNA Blood Mini Kit,参照试剂盒说明书提取正常外周血基因组DNA;获得的基因组DNA使用NanoDrop 100检测DNA纯度,凝胶电泳检测DNA的完整性,qubit4.0荧光计定量,DNA浓度范围在0.3ng/μl~50ng/μl,优选浓度为10ng/μl;
S2.按照实施例3配置6个实时荧光PCR反应体系,每个反应体系18μl;
S3.取2μl步骤S1得到的DNA模板加入步骤S2的PCR反应体系并置于96孔板或8联管中,封好膜或盖好管盖,轻轻涡旋混合均匀并瞬时离心;
S4.将离好心的96孔板或8联管放入实时荧光PCR仪中,设置反应程序进行PCR扩增及荧光信号采集,PCR扩增反应程序为:37℃,5分钟1个循环95℃,10分钟1个循环;95℃,30秒变性,64℃,40秒退火,72℃,20秒延伸共进行5个循环;95℃,30秒变性,60℃,40秒退火,72℃,20秒延伸共进行40个循环;98℃,10分钟1个循环;16℃保持。设置在延伸阶段采集荧光信号;
S5.根据实验结果对人ADRB1、CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP3A5*3、AGTR1、NPPA、ACE(I/D)、MTHFR、ApoE基因进行分型。
采用本申请试剂盒对临床样本进行基因多态性检测,检测结果准确可靠。
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例,并非依此限制本申请的保护范围,故:凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化,均应涵盖于本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 北京核子华曦医学检验实验室有限公司
<120> 一种检测高血压用药基因多态性的核酸组合物及试剂盒
<160> 63
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
accgcctctt cgtcttcttc 20
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
tctccgtggg tcgcgt 16
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
cgtgatagtg gccatcttcc t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
tggaagtcca catgcagcag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
atgcaagaca ggagccacat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
tggggacttc gaaaacatgg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
cacccagctt aacgaatgct c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
gttgtacgac acacagcaac c 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
agaaggagca agagaacatt cc 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
ttgttgcaaa aggaaagaaa agc 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
ggagcctctt gcagtctgtc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
cttttccagg acagccaggt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
ccactcccat cctttctccc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
gcttgtaagg ggagctcaga 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
ctgggcagag agagtcctct gcttt 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
tgaggggccc aggagagccc ataag 25
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 17
ctggaggaac aactgacccc 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
gagcatggcc tgcacctc 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 19
ctgcgtaagc ggctcctc 18
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 20
gcggccctgt tccacca 17
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 21
agagcagtcc ctggaa 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 22
agagcagtcg ctggaa 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 23
ctgcacgcta ctcacc 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 24
ctgcacgcta cccacc 16
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 25
tccagagata ccttgac 17
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 26
tccagagata cattgac 17
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 27
tctttcagta tctctt 16
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 28
agagatattg aaagac 16
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 29
tgagccttag ctactt 16
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 30
aaagtagcta atgctc 16
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 31
tggctgttat cttcggt 17
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 32
ctggctgtta tcttcagt 18
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 33
cggagtctcg ctctgtcgcc c 21
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 34
tgcctataca gtcactttta tg 22
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 35
cgggagtcga tttca 15
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 36
tgcgggagcc gattt 15
<210> 37
<211> 15
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 37
aggacgtgcg cggcc 15
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 38
cggccgcaca cgtcc 15
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 39
acactgccag gcactt 16
<210> 40
<211> 15
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 40
tgcagaagcg cctgg 15
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 41
agtggcttcc ccagtgtgac 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 42
tccatcacga tgccagtggt 20
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 43
atgtacgttg ctatccagg 19
<210> 44
<211> 400
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 44
cgctcaggac gctgggcatc atcatgggcg tcttcacgct ctgctggctg cccttcttcc 60
tggccaacgt ggtgaaggcc ttccaccgcg agctggtgcc cgaccgcctc ttcgtcttct 120
tcaactggct gggctacgcc aactcggcct tcaaccccat catctactgc cgcagccccg 180
acttccgcaa ggccttccag cgactgctct gctgcgcgcg cagggctgcc cgccggcgcc 240
acgcgaccca cggagaccgg ccgcgcgcct cgggctgtct ggcccggccc ggacccccgc 300
catcgcccgg ggccgcctcg gacgacgacg acgacgatgt cgtcggggcc acgccgcccg 360
cgcgcctgct ggagccctgg gccggctgca acggcggggc 400
<210> 45
<211> 400
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 45
cgctcaggac gctgggcatc atcatgggcg tcttcacgct ctgctggctg cccttcttcc 60
tggccaacgt ggtgaaggcc ttccaccgcg agctggtgcc cgaccgcctc ttcgtcttct 120
tcaactggct gggctacgcc aactcggcct tcaaccccat catctactgc cgcagccccg 180
acttccgcaa ggccttccag ggactgctct gctgcgcgcg cagggctgcc cgccggcgcc 240
acgcgaccca cggagaccgg ccgcgcgcct cgggctgtct ggcccggccc ggacccccgc 300
catcgcccgg ggccgcctcg gacgacgacg acgacgatgt cgtcggggcc acgccgcccg 360
cgcgcctgct ggagccctgg gccggctgca acggcggggc 400
<210> 46
<211> 400
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 46
acgcgctcgg tgtgctgaga gtgtcctgcc tggtcctctg tgcctggtgg ggtgggggtg 60
ccaggtgtgt ccagaggagc ccatttggta gtgaggcagg tatggggcta gaagcactgg 120
tgcccctggc cgtgatagtg gccatcttcc tgctcctggt ggacctgatg caccggcgcc 180
aacgctgggc tgcacgctac tcaccaggcc ccctgccact gcccgggctg ggcaacctgc 240
tgcatgtgga cttccagaac acaccatact gcttcgacca ggtgagggag gaggtcctgg 300
agggcggcag aggtcctgag gatgccccac caccagcaaa catgggtggt gggtgaaacc 360
acaggctgga ccagaagcca ggctgagaag gggaagcagg 400
<210> 47
<211> 400
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 47
acgcgctcgg tgtgctgaga gtgtcctgcc tggtcctctg tgcctggtgg ggtgggggtg 60
ccaggtgtgt ccagaggagc ccatttggta gtgaggcagg tatggggcta gaagcactgg 120
tgcccctggc cgtgatagtg gccatcttcc tgctcctggt ggacctgatg caccggcgcc 180
aacgctgggc tgcacgctac ccaccaggcc ccctgccact gcccgggctg ggcaacctgc 240
tgcatgtgga cttccagaac acaccatact gcttcgacca ggtgagggag gaggtcctgg 300
agggcggcag aggtcctgag gatgccccac caccagcaaa catgggtggt gggtgaaacc 360
acaggctgga ccagaagcca ggctgagaag gggaagcagg 400
<210> 48
<211> 399
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 48
ccttcatgat tcatataccc ctgaattgct acaacaaatg tgccattttt ctccttttcc 60
atcagttttt acttgtgtct tatcagctaa agtccaggaa gagattgaac gtgtgattgg 120
cagaaaccgg agcccctgca tgcaagacag gagccacatg ccctacacag atgctgtggt 180
gcacgaggtc cagagatacc ttgaccttct ccccaccagc ctgccccatg cagtgacctg 240
tgacattaaa ttcagaaact atctcattcc caaggtaagt ttgtttctcc tacactgcaa 300
ctccatgttt tcgaagtccc caaattcata gtatcatttt taaacctcta ccatcaccgg 360
gtgagagaag tgcataactc atatgtatgg cagtttaac 399
<210> 49
<211> 399
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 49
ccttcatgat tcatataccc ctgaattgct acaacaaatg tgccattttt ctccttttcc 60
atcagttttt acttgtgtct tatcagctaa agtccaggaa gagattgaac gtgtgattgg 120
cagaaaccgg agcccctgca tgcaagacag gagccacatg ccctacacag atgctgtggt 180
gcacgaggtc cagagataca ttgaccttct ccccaccagc ctgccccatg cagtgacctg 240
tgacattaaa ttcagaaact atctcattcc caaggtaagt ttgtttctcc tacactgcaa 300
ctccatgttt tcgaagtccc caaattcata gtatcatttt taaacctcta ccatcaccgg 360
gtgagagaag tgcataactc atatgtatgg cagtttaac 399
<210> 50
<211> 401
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 50
agtccttgtg agcacttgat gatttacctg ccttcaattt ttcactgacc taatattctt 60
tttgataatg aagtatttta aacatataaa acattatgga gagtggcata ggagataccc 120
acgtatgtac cacccagctt aacgaatgct ctactgtcat ttctaaccat aatctcttta 180
aagagctctt ttgtctttca gtatctcttc cctgtttgga ccacattacc cttcatcata 240
tgaagccttg ggtggctcct gtgtgagact cttgctgtgt gtcacaccct aatgaactag 300
aacctaaggt tgctgtgtgt cgtacaacta ggggtatgga ttacataaca taatgatcaa 360
agtctggctt cctgggtgtg gctccagctg cagaatcggg c 401
<210> 51
<211> 401
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 51
agtccttgtg agcacttgat gatttacctg ccttcaattt ttcactgacc taatattctt 60
tttgataatg aagtatttta aacatataaa acattatgga gagtggcata ggagataccc 120
acgtatgtac cacccagctt aacgaatgct ctactgtcat ttctaaccat aatctcttta 180
aagagctctt ttgtctttca atatctcttc cctgtttgga ccacattacc cttcatcata 240
tgaagccttg ggtggctcct gtgtgagact cttgctgtgt gtcacaccct aatgaactag 300
aacctaaggt tgctgtgtgt cgtacaacta ggggtatgga ttacataaca taatgatcaa 360
agtctggctt cctgggtgtg gctccagctg cagaatcggg c 401
<210> 52
<211> 401
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 52
aaaagccaaa tcccactcaa acctttcaac aaaaatgagc acgctttcct accgcccctc 60
agataatgta agctcatcca ccaagaagcc tgcaccatgt tttgaggttg agtgacatgt 120
tcgaaacctg tccataaagt aattttgtga aagaaggagc aagagaacat tcctctgcag 180
cacttcacta ccaaatgagc cttagctact tttcagaatt gaaggagaaa atgcattatg 240
tggactgaac cgacttttct aaagctctga acaaaagctt ttctttcctt ttgcaacaag 300
acaaagcaaa gccacatttt gcattagaca gatgacggct gctcgaagaa caatgtcaga 360
aactcgatga atgtgttgat ttgagaaatt ttactgacag a 401
<210> 53
<211> 401
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 53
aaaagccaaa tcccactcaa acctttcaac aaaaatgagc acgctttcct accgcccctc 60
agataatgta agctcatcca ccaagaagcc tgcaccatgt tttgaggttg agtgacatgt 120
tcgaaacctg tccataaagt aattttgtga aagaaggagc aagagaacat tcctctgcag 180
cacttcacta ccaaatgagc attagctact tttcagaatt gaaggagaaa atgcattatg 240
tggactgaac cgacttttct aaagctctga acaaaagctt ttctttcctt ttgcaacaag 300
acaaagcaaa gccacatttt gcattagaca gatgacggct gctcgaagaa caatgtcaga 360
aactcgatga atgtgttgat ttgagaaatt ttactgacag a 401
<210> 54
<211> 400
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 54
aggaagtcac catcaaacca ctttatctac agttagcata agatgtgaga agtgttgaca 60
ggaagctgca gcttagatgg gatgatcaca actccatggc aacaagatga cacaaatgca 120
gcagagaccc caggggacag gagcctcttg cagtctgtcc ctaggcccag ccctgcttgt 180
cctccctggc tgttatcttc ggtactgcaa agagaacaca gacatatctg gcttggtgac 240
ctggctgtcc tggaaaagtc agcttcatgt atgagtgtgc ccatcctctg aacttgatta 300
ctgaccacct gcttcccacc ggcccccacc ccagcctgat gaccctctga gcttcatgaa 360
ttgataagca agttactcat cagagtaaat ttcacttaag 400
<210> 55
<211> 400
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 55
aggaagtcac catcaaacca ctttatctac agttagcata agatgtgaga agtgttgaca 60
ggaagctgca gcttagatgg gatgatcaca actccatggc aacaagatga cacaaatgca 120
gcagagaccc caggggacag gagcctcttg cagtctgtcc ctaggcccag ccctgcttgt 180
cctccctggc tgttatcttc agtactgcaa agagaacaca gacatatctg gcttggtgac 240
ctggctgtcc tggaaaagtc agcttcatgt atgagtgtgc ccatcctctg aacttgatta 300
ctgaccacct gcttcccacc ggcccccacc ccagcctgat gaccctctga gcttcatgaa 360
ttgataagca agttactcat cagagtaaat ttcacttaag 400
<210> 56
<211> 450
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 56
agaccctgtc tcagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaggaga ggagagagac tcaagcacgc 60
ccctcacagg actgctgagg ccctgcaggt gtctgcagca tgtggcccca ggccggggac 120
tctgtaagcc actgctggag agccactccc atcctttctc ccatttctct agacctgctg 180
cctatacagt cacttttttt ttttttttga gacggagtct cgctctgtcg cccatacagt 240
cacttttatg tggtttcgcc aattttattc cagctctgaa attctctgag ctccccttac 300
aagcagaggt gagctaaggg ctggagctca aggcattcaa acccctacca gatctgacga 360
atgtgatggc cacgtcccgg aaatatgaag acctgttatg ggcatgggag ggctggcgag 420
acaaggcggg gagagccatc ctccagtttt 450
<210> 57
<211> 400
<212> DNA
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<400> 57
agaccctgtc tcagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaggaga ggagagagac tcaagcacgc 60
ccctcacagg actgctgagg ccctgcaggt gtctgcagca tgtggcccca ggccggggac 120
tctgtaagcc actgctggag agccactccc atcctttctc ccatttctct agacctgctg 180
cctatacagt cacttttatg tggtttcgcc aattttattc cagctctgaa attctctgag 240
ctccccttac aagcagaggt gagctaaggg ctggagctca aggcattcaa acccctacca 300
gatctgacga atgtgatggc cacgtcccgg aaatatgaag acctgttatg ggcatgggag 360
ggctggcgag acaaggcggg gagagccatc ctccagtttt 400
<210> 58
<211> 399
<212> DNA
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<400> 58
aaggtgcaag atcagagccc ccaaagcaga ggactctctc tgcccagtcc ctgtggtctc 60
ttcatccctc gccttgaaca ggtggaggcc agcctctcct gactgtcatc cctattggca 120
ggttacccca aaggccaccc cgaagcaggg agctttgagg ctgacctgaa gcacttgaag 180
gagaaggtgt ctgcgggagt cgatttcatc atcacgcagc ttttctttga ggctgacaca 240
ttcttccgct ttgtgaaggc atgcaccgac atgggcatca cttgccccat cgtccccggg 300
atctttccca tccaggtgag gggcccagga gagcccataa gctccctcca ccccactctc 360
accgcaccgt cctcgcacag gctgggggct ctgggtgga 399
<210> 59
<211> 399
<212> DNA
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<400> 59
aaggtgcaag atcagagccc ccaaagcaga ggactctctc tgcccagtcc ctgtggtctc 60
ttcatccctc gccttgaaca ggtggaggcc agcctctcct gactgtcatc cctattggca 120
ggttacccca aaggccaccc cgaagcaggg agctttgagg ctgacctgaa gcacttgaag 180
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ttcttccgct ttgtgaaggc atgcaccgac atgggcatca cttgccccat cgtccccggg 300
atctttccca tccaggtgag gggcccagga gagcccataa gctccctcca ccccactctc 360
accgcaccgt cctcgcacag gctgggggct ctgggtgga 399
<210> 60
<211> 399
<212> DNA
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<400> 60
tctccccgcc tcccactgtg cgacaccctc ccgccctctc ggccgcaggg cgctgatgga 60
cgagaccatg aaggagttga aggcctacaa atcggaactg gaggaacaac tgaccccggt 120
ggcggaggag acgcgggcac ggctgtccaa ggagctgcag gcggcgcagg cccggctggg 180
cgcggacatg gaggacgtgc gcggccgcct ggtgcagtac cgcggcgagg tgcaggccat 240
gctcggccag agcaccgagg agctgcgggt gcgcctcgcc tcccacctgc gcaagctgcg 300
taagcggctc ctccgcgatg ccgatgacct gcagaagcgc ctggcagtgt accaggccgg 360
ggcccgcgag ggcgccgagc gcggcctcag cgccatccg 399
<210> 61
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<400> 61
tctccccgcc tcccactgtg cgacaccctc ccgccctctc ggccgcaggg cgctgatgga 60
cgagaccatg aaggagttga aggcctacaa atcggaactg gaggaacaac tgaccccggt 120
ggcggaggag acgcgggcac ggctgtccaa ggagctgcag gcggcgcagg cccggctggg 180
cgcggacatg gaggacgtgt gcggccgcct ggtgcagtac cgcggcgagg tgcaggccat 240
gctcggccag agcaccgagg agctgcgggt gcgcctcgcc tcccacctgc gcaagctgcg 300
taagcggctc ctccgcgatg ccgatgacct gcagaagcgc ctggcagtgt accaggccgg 360
ggcccgcgag ggcgccgagc gcggcctcag cgccatccg 399
<210> 62
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<212> DNA
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<400> 62
acggctgtcc aaggagctgc aggcggcgca ggcccggctg ggcgcggaca tggaggacgt 60
gtgcggccgc ctggtgcagt accgcggcga ggtgcaggcc atgctcggcc agagcaccga 120
ggagctgcgg gtgcgcctcg cctcccacct gcgcaagctg cgtaagcggc tcctccgcga 180
tgccgatgac ctgcagaagt gcctggcagt gtaccaggcc ggggcccgcg agggcgccga 240
gcgcggcctc agcgccatcc gcgagcgcct ggggcccctg gtggaacagg gccgcgtgcg 300
ggccgccact gtgggctccc tggccggcca gccgctacag gagcgggccc aggcctgggg 360
cgagcggctg cgcgcgcgga tggaggagat gggcagccg 399
<210> 63
<211> 399
<212> DNA
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acggctgtcc aaggagctgc aggcggcgca ggcccggctg ggcgcggaca tggaggacgt 60
gtgcggccgc ctggtgcagt accgcggcga ggtgcaggcc atgctcggcc agagcaccga 120
ggagctgcgg gtgcgcctcg cctcccacct gcgcaagctg cgtaagcggc tcctccgcga 180
tgccgatgac ctgcagaagc gcctggcagt gtaccaggcc ggggcccgcg agggcgccga 240
gcgcggcctc agcgccatcc gcgagcgcct ggggcccctg gtggaacagg gccgcgtgcg 300
ggccgccact gtgggctccc tggccggcca gccgctacag gagcgggccc aggcctgggg 360
cgagcggctg cgcgcgcgga tggaggagat gggcagccg 399