CN106702019A - 一种人cyp2c19基因snp的检测探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人CYP2C19基因SNP的检测探针，所述检测引物由基因特异性上、下游引物对和特异性Taqman双荧光探针组成，分别对应检测CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17位点的SNP，具有快速检测，特异性强的特点，且检测方法简单，去除了传统荧光定量PCR所必需的阳性对照和阴性对照，减少了操作步骤和实验成本，更快更好地指导后续的临床治疗策略。

Description

一种人CYP2C19基因SNP的检测探针及其应用
技术领域
本发明属于核苷酸和基因分子检测领域，具体涉及一种人CYP2C19基因多态性包括CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17位点的检测探针及其应用。
技术背景
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核昔酸的变异所引起的DNA序列多态性。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP可分为2种：一种是同义cSNP，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP，指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。SNP与许多疾病相关，决定了人类疾病的易感性和药物反应的差异性。因此，SNP在分析诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等方面具有重要的应用价值。
CYP2C19基因是人体内一种重要的药物代谢酶,其对药物反应起着关键性的作用,这是因为CYP2C19基因的活性存在显著的个体差异,表现为遗传多态性,从而产生血药浓度的个体差异,研究其遗传多态性将为临床确定最住治疗剂量、制定合理用药方案、发挥最大疗效、避免和減少不良反应提供指导依据。在CYP2C19基因中，CYP2C19基因的CYP2C19*2多态性和CYP2C19*3多态性在我国人群中的分布频率分别为39.9％和6.1％，会使CYP2C19蛋白功能部分丧失，药物在患者体内代谢障碍蓄积性中毒。而CYP2C19基因的CYP2C19*17多态性在我国人群中的分布频率为0.7％，其导致CYP2C19蛋白活性增加，药物在患者体内加速代谢，降低了药物的治疗效果。
目前研究发现，CYP2C19在人体内参与氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等药物的代谢。
氯吡格雷是一种抗血小板药物，广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症。心脏支架手术后的患者需长期服用氯目比格雷以防止支架内再梗。氯吡格雷主要经CYP2C19代谢活化后发挥抗血小板效应。CYP2C19*2和CYP2C19*3突变个体应用常规剂量的氯口比格雷后体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作用下降。临床心脏病学会建议，对于CYP2C19代谢障碍患者需考虑改变治疗方案。
伏立康唑是一种广谱三哇类抗真菌药，CYP2C19是其主要代谢酶之一。CYP2C19加速代谢与代谢障碍个体间伏立康唑的血液浓度存在显著差异，代谢障碍个体(CYP2C19*2和CYP2C19*3突变)在应用常规剂量药物时可能出现毒副反应，建议减少用药剂量；加速代谢(CYP2C19*17突变)和正常代谢个体可给予常规剂量。在常规剂量治疗时，若加速代谢个体出现毒副反应或代谢障碍个体疗效不佳，均应考虑更换药物。美国FDA指出个体应用伏立康唑前需检测CYP2C19基因型，以确保用药安全。
由上述可见，CYP2C19的活性在在临床指导用药上具有非常广泛的作用，而CYP2C19多态性的检测凸显其重要性。目前用于检测一般采用直接测序或定性PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)检测技术检测CYP2C19基因CYP2C19*2多态性、CYP2C19*3多态性和CYP2C 19*17多态性。直接测序和定性PCR电泳鉴定检测的灵敏度和特异性均不高，不能准确检测出CYP2C19基因多态性，不利于预测药物疗效及指导药物选择性用药。另外，直接测序目前大多采用外包实验，检测时间过长，一般需要48小时以上，为快速检测CYP2C19基因多态性带来不便。因此临床治疗中，迫切需要一种能够快速检测CYP2C19多个SNP位点的类型，且不需要测序，特异性高的检测探针，快速得到准确的SNP结果，知道后续临床治疗。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种人CYP2C19基因SNP的检测探针，其中，所述检测探针由特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针组成，所述CYP2C19基因SNP位点由CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17三个位点构成，所述检测探针至少检测所述SNP位点中的一组SNP；所述检测探针的特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针至少为以下一组：
组1：所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性上游引物的序列为序列表中SEQ IDNO:1；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性下游引物的序列为序列表中SEQ ID NO:2；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:3；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:4；
组2：所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:5；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:6；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:7；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:8；
组3：所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:9；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:10；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:11；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:12；
优选任意两组，更优选三组。
所述特异性野生型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团I,3’端连接有荧光淬灭基团III；
所述特异性突变型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团II,3’端连接有荧光淬灭基团III，所述I和II为不相同的荧光报告基团。
荧光报告基团I和II可以选自CY5、JOE、ROX、HEX、VIC等商用探针荧光报告基团，荧光萃灭基团选自MGB、TAMRA和BHQ等常见商用荧光萃灭基团；所属I和II不能为相同的荧光基团。(可参见Lakowicz,JR(2006).Principles of fluorescence spectroscopy(3rded.).Springer.)
优选地，本发明还提供一种人CYP2C19基因SNP的检测探针，其中，所述荧光报告基团I为CY5,荧光报告基团II为JOE，所述荧光淬灭基团III为MGB。
即所述特异性野生型Taquman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团CY5,3’端连接有荧光淬灭基团MGB；
所述特异性突变型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团JOE,3’端连接有荧光淬灭基团MGB。
CY5
Cyanine dyes 5，菁类染料5，波长670nm
JOE
Carboxy-4',5'-dichloro-2'，7'-dimethoxyfluorescein，羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素，波长548nm
MGB
Minor groove binder oligo deoxynucleotide conjugate，低聚糖脱氧核苷酸共轭小沟粘合剂，不发光。
ROX
ROX Roxithromycin，罗丹明荧光染料，波长602nm。
HEX
Hexachloro fluorescein，六氯－6－甲基荧光素，波长556nm。
TAMRA
Carboxytetramethylrhodamine，6-羧基四甲基罗丹明，波长576nm
CYP指人细胞色素酶家族，2C19指基因名称，*2等位基因上的核苷酸位点，CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17分别代表细胞色素酶家族2C19等位基因3个SNP位点
这种检测引物可以同时对CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的SNP情况进行检测，快速得到所需的结果。
本发明进一步提供一种人CYP2C19基因SNP的检测探针，其中，所述检测探针检测所述SNP位点中的两组SNP；所述特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针为以下任意两组：
组1：所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性上游引物的序列为序列表中SEQ IDNO:1；所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性下游引物的序列为序列表中SEQ ID NO:2；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:3；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:4；
组2：所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:5；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:6；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:7；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:8；
组3：所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:9；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:10；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:11；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:12；
所述特异性野生型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团I,3’端连接有荧光淬灭基团III；
所述特异性突变型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团II,3’端连接有荧光淬灭基团III，所述I和II为不相同的荧光报告基团。
本发明进一步提供一种人CYP2C19基因SNP的检测探针，其中，所述检测探针检测所述SNP位点中的三组SNP；所述检测探针的特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针为以下三组：
组1：所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性上游引物的序列为序列表中SEQ IDNO:1；所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性下游引物的序列为序列表中SEQ ID NO:2；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:3；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:4；
组2：所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:5；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:6；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:7；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:8；
组3：所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性上游引物序列为序列表中SEQ IDNO:9；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:10；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:11；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQ ID NO:12；
所述特异性野生型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团I,3’端连接有荧光淬灭基团III；
所述特异性突变型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团II,3’端连接有荧光淬灭基团III，所述I和II为不相同的荧光报告基团。
虽然临床上常用了只有CYP2C19*2、CYP2C19*3的SNP检测，但CYP2C19*17在中国人群SNP突变率不高，但三种SNP同时检测，可以减小漏检率，且使本发明的应用更具有国际化视野。
本发明还提供一种检测探针在CYP2C19基因SNP检测中的应用，其中，所述应用包含以下步骤：
1)使用基因组提取方法提取受检者的基因组DNA；
2)使用荧光定量PCR反应试剂或者荧光定量PCR反应试剂的混合物配置荧光定量PCR反应体系，所述荧光定量PCR反应体系含有：PCR预混合液、Mg2+、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)和水；
3)合成所述CYP2C19相关的所述特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针，向步骤2中的一个荧光定量PCR反应体系加入步骤1所述的基因组DNA和所述特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针的一组；
4)启动PCR扩增程序，进行荧光定量PCR扩增反应，获得扩增数据进行分析，即可获得SNP检测结果。
其中基因组提取方法优选实验室经典基因组提取方法或商用试剂盒提取法。
DNA聚合酶优选Hot-Start Taq酶。其中dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以混合为dNTP混合液进行使用。
步骤三中每一组PCR反应体系分别加入一组所述特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针。即以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:2所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的Taqman荧光探针，或对CYP2C19基因CYP2C19*2多态性进行荧光定量PCR扩增；以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:5所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:6所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的Taqman荧光探针，或对CYP2C19基因CYP2C19*17多态性进行荧光定量PCR扩增；以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:9所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:10所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的Taqman荧光探针，对CYP2C19基因CYP2C19*17多态性进行荧光定量PCR扩增；其中所述步骤二中的荧光定量PCR扩增的反应条件相同。
所述荧光定量PCR反应体系中组分及终浓度进一步优选如下：PCR反应预混合液、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的混合物、0.3-0.6mM的dUTP、0.1-0.2U/μL Hot-Start Taq酶、和0.01-0.05U/μL的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)。
所述PCR扩增程序为：95℃，5分钟预变性，然后95℃，15秒,62℃，35秒扩增，40个循环，每个循环结束采集I和II荧光讯号，优选CY5和JOE荧光。
本发明的创造点为：
(1)敏感性高：由于人基因组DNA整体差异较小，引物匹配率较高，通过PCR反应放大后再用较灵敏的荧光采集系统，能够在极微量基因组DNA存在情况下检测出CYP2C19基因中CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性。
(2)特异性强：使用特异性双探针对SNP变异进行识别，同时Taqman探针用MGB修饰后大大提高探针的Tm值，增加了其信噪比，MGB信噪比为6～10，普通修饰的探针信噪比只有1.5左右，所以MGB修饰的探针具有更低的荧光背景，更高的退火Tm值。
(3)PCR反应试剂中加入dUTP和UNG酶，可以防止PCR扩增模板气溶胶的污染。同时扩增和检测在同一管中进行，只需加开盖加一次模板DNA，大大降低了污染的可能性；扩增和检测一步完成，不需后期特殊处理，不必担心放射性污染。
(4)结果分析简单：该方法中只有检测基因SNP的两条特异性Taqman探针，不需要内参，降低了PCR反应体系中引物和探针的复杂程度，进一步提高定性判断SNP突变的准确性。
(5)检测快速：PCR反应时间短，同时检测通量较高，可在3小时内完成检测。
综上所述，本发明所提供的检测探针具有突出的实质性特点和限制的进步，具有专利法所规定的创造性。
具体实施方式
为进一步阐明本技术方法，以下结合具体实施例进行详细说明。未注明具体条件的常规实验方法，请参考《分子克隆实验手册》(第三版)(科学出版社，2002)软件或试剂盒请按照厂家提供的建议或说明书。
实施例1
CYP2C19基因来源于NCBI GenBank，参考序列号为NG 008384.2。
因SNP检测是其基因组上的序列，但基因组上的CYP2C19基因有内含子，序列分布较广，约有90000bp长度，下面只列出CYP2C19基因经转录加工后的mRNA序列，1709bp，序列如下：
GTCTTAACAAGAGGAGAAGGCTTCAATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTGCTCTGTCTCTCATGTTTGCTTCTCCTTTCAATCTGGAGACAGAGCTCTGGGAGAGGAAAACTCCCTCCTGGCCCCACTCCTCTCCCAGTGATTGGAAATATCCTACAGATAGATATTAAGGATGTCAGCAAATCCTTAACCAATCTCTCAAAAATCTATGGCCCTGTGTTCACTCTGTATTTTGGCCTGGAACGCATGGTGGTGCTGCATGGATATGAAGTGGTGAAGGAAGCCCTGATTGATCTTGGAGAGGAGTTTTCTGGAAGAGGCCATTTCCCACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAGGATTTGGAATCGTTTTCAGCAATGGAAAGAGATGGAAGGAGATCCGGCGTTTCTCCCTCATGACGCTGCGGAATTTTGGGATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACCGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCTTGTGGAGGAGTTGAGAAAAACCAAGGCTTCACCCTGTGATCCCACTTTCATCCTGGGCTGTGCTCCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGGATCCAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGAAAAGCAAAACCAACAGTCTGAATTCACTATTGAAAACTTGGTAATCACTGCAGCTGACTTACTTGGAGCTGGGACAGAGACAACAAGCACAACCCTGAGATATGCTCTCCTTCTCCTGCTGAAGCACCCAGAGGTCACAGCTAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACGTGTCATTGGCAGAAACCGGAGCCCCTGCATGCAGGACAGGGGCCACATGCCCTACACAGATGCTGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACATCGACCTCATCCCCACCAGCCTGCCCCATGCAGTGACCTGTGACGTTAAATTCAGAAACTACCTCATTCCCAAGGGCACAACCATATTAACTTCCCTCACTTCTGTGCTACATGACAACAAAGAATTTCCCAACCCAGAGATGTTTGACCCTCGTCACTTTCTGGATGAAGGTGGAAATTTTAAGAAAAGTAACTACTTCATGCCTTTCTCAGCAGGAAAACGGATTTGTGTGGGAGAGGGCCTGGCCCGCATGGAGCTGTTTTTATTCCTGACCTTCATTTTACAGAACTTTAACCTGAAATCTCTGATTGACCCAAAGGACCTTGACACAACTCCTGTTGTCAATGGATTTGCTTCTGTCCCGCCCTTCTATCAGCTGTGCTTCATTCCTGTCTGAAGAAGCACAGATGGTCTGGCTGCTCCTGTGCTGTCCCTGCAGCTCTCTTTCCTCTGGTCCAAATTTCACTATCTGTGATGCTTCTTCTGACCCGTCATCTCACATTTTCCCTTCCCCCAAGATCTAGTGAACATTCAGCCTCCATTAAAAAAGTTTCACTGTGCAAATATATCTGCTATTCCCCATACTCTATAATAGTTACATTGAGTGCCACATAATGCTGATACTTGTCTAATGTTGAGTTATTAACATATTATTATTAAATAGAGAAAGATGATTTGTGTATTATAAAAAAAAAAAA
见序列表SEQ ID NO：13
采用Vector NTI 10.0核酸比对软件和Primer5.0引物设计软件分别设计引物和探针：CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性野生和突变Taqman荧光探针、CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性野生和突变Taqman荧光探针、CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性野生和突变Taqman荧光探针。
按照软件设计后得到引物如下：
CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性上游引物序列：
5’-CAACCAGAGCTTGGCATATTG-3’(序列表中SEQ ID N0:1所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性下游引物序列：
5’-GTCCATCGATTCTTGGTGTTC-3’(序列表中SEQ ID N0:2所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性野生型Taqman荧光探针序列：
5’-GATTATTTCCCGGGAACCC-3’(序列表中SEQ ID N0:3所示，其中5’端连有CY5,3’端连有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性突变型Taqman荧光探针序列：
5’-GATTATTTCCCAGGAACCC-3’(序列表中SEQ ID N0:4所示，其中5’端连有JOE,3’端连有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性上游引物序列：
5’-CCCTGCAATGTGATCTGCTCC-3’(序列表中SEQ ID N0:5所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性下游引物序列：
5’-GCTGTCTAGGCAAGACTGTAG-3’(序列表中SEQ ID N0:6所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性野生型Taqman荧光探针序列：
5’-GCACCCCCTGGATCCAGG-3’(序列表中SEQ ID N0:7所示，其中5’端连有CY5,3’端连有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性突变型Taqman荧光探针序列：
5’-GCACCCCCTGAATCCAGG-3’(序列表中SEQ ID N0:8所示，其中5’端连有JOE,3’端连有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性上游引物序列：
5’-GCTGCATGGATATGAAGTGGTG-3’(序列表中SEQ ID N0:9所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性下游引物序列：
5’-CGAGAAGCTCTGCTAGTCTGTT-3’(序列表中SEQ ID N0:10所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性野生型Taqman荧光探针序列：
5’-TTGGAGAGGAGTTTTCTG-3’(序列表中SEQ ID N0:11所示，其中5’端连有CY5,3’端连有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性突变型Taqman荧光探针序列：
5’-TTGGAGAAGAGTTTTCTG-MGB-3’(序列表中SEQ ID N0:12所示，其中5’端连有JOE,3’端连有MGB)。
所有核酸序列均由上海生工合成，引物经PAGE纯化，荧光标记探针经HPLC纯化并提供质谱报告。
实施例2
PCR产物熔解曲线的单一程度可以反应其产物的单一程度，产物单一说明引物特异性好。利用熔解曲线法来确定设计引物的特异性。
①基因组DNA提取：留取受试者EDTA抗凝全血0.5ml，采用Qiagen GenemicBloodKit提取全血DNA，严格按照试剂盒说明书操作，提取DNA样本-20℃保存，使用时室温溶解并充分混匀、离心。
②实验所述特异性引物为CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性上游引物和下游引物(SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2)；CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性上游引物和下游引物(SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6)；CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性上游引物和下游引物(SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:10)。
PCR反应体系采用2×Takara SYBR PreMix，0.2uM正向和反向引物，0.2U Taq DNA聚合酶，直接加入1～2ul模板DNA样本，用水补足50ul。
反应条件：95℃5分钟；95℃20秒，60℃40秒×5循环；95℃15秒，60℃35秒(采光)×35循环；70℃～95℃熔解曲线。
③实验结果：
1.CYP2C19*2引物扩增曲线及熔解曲线
扩增曲线良好，熔解曲线单一平滑，说明扩增产物单一，引物特异性良好。
2.CYP2C19*3引物扩增曲线及熔解曲线
扩增曲线良好，熔解曲线单一平滑，说明扩增产物单一，引物特异性良好。
3.CYP2C19*17引物扩增曲线及熔解曲线
扩增曲线良好，熔解曲线单一平滑，说明扩增产物单一，引物特异性良好。
实施例3
以随机选取8份受试者外周全血样本为例。
用本发明方法检测某一受检者的CYP2C19*2基因多态性、CYP2C19*3基因多态性和CYP2C 19*17基因多态性的检测流程为：首先获取临床受检者外周血样本,快速提取基因组DNA；接下来再配制CYP2C19*2基因多态性、CYP2C19*3基因多态性和CYP2C19*17基因多态性的荧光定量PCR反应液，进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪采集CY5和JOE的荧光信号，仅有CY5标记的Taqman探针扩增是野生型，仅有JOE标记的Taqman探针扩增是突变型，既有CY5标记的Taqman探针扩增又有JOE标记的Taqman探针扩增是杂合型，所以样本总会有阳性探针扩增，不需要再单加内参。
具体步骤：
步骤1：提取受检者外周血样本基因组DNA；
步骤2：以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:2所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的Taqman荧光探针，或对CYP2C19基因CYP2C19*2多态性进行荧光定量PCR扩增；以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:5所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:6所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的Taqman荧光探针，或对CYP2C19基因CYP2C19*17多态性进行荧光定量PCR扩增；以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ IDNO:9所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:10所示的下游引物和如序列表中SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示的Taqman荧光探针，对CYP2C19基因CYP2C19*17多态性进行荧光定量PCR扩增；
PCR反应体系首选为：4.0mM的Mg2+、0.2mM的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的混合物、0.3mM的dUTP、0.1U/μL Hot-Start Taq酶、和0.05U/μL的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)加入1～2ul模板DNA样本，加入一组CYP2C19的SNP检测探针，用水补足50ul。(所加入的基因组模板的具体含量和引物的具体含量，可根据基因组抽提试剂盒要求和引物制备厂家要求进行添加。属于本领域常规技术。)
PCR反应条件首选为：95℃，5分钟预变性，然后95℃，15秒,62℃，35秒扩增，40个循环，每个循环结束采集荧光讯号，优选CY5和JOE荧光。
根据所示CYP2C19*2基因多态性Taqman双探针检测扩增曲线、CYP2C19*3基因多态性Taqman双探针检测扩增曲线和CYP2C19*17基因多态性Taqman双探针检测扩增曲线分析结果与测序比对结果发现，使用本发明提供的检测探针，检测SNP结果的正确率为100％。
表1 8份全血样本CYP2C19基因多态性检测结果分析
*1/*1表示野生型纯合子，*1/*2表示杂合子，*2/*2为完全突变型。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改造，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京一立科技发展有限公司
<120> 一种人CYP2C19基因SNP的检测探针及其应用
<130> 0
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caaccagagc ttggcatatt g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtccatcgat tcttggtgtt c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gattatttcc cgggaaccc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gattatttcc caggaaccc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccctgcaatg tgatctgctc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctgtctagg caagactgta g 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcaccccctg gatccagg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcaccccctg aatccagg 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctgcatgga tatgaagtgg tg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgagaagctc tgctagtctg tt 22
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttggagagga gttttctg 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttggagaaga gttttctg 18
<210> 13
<211> 1799
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
gtcttaacaa gaggagaagg cttcaatgga tccttttgtg gtccttgtgc tctgtctctc 60
atgtttgctt ctcctttcaa tctggagaca gagctctggg agaggaaaac tccctcctgg 120
ccccactcct ctcccagtga ttggaaatat cctacagata gatattaagg atgtcagcaa 180
atccttaacc aatctctcaa aaatctatgg ccctgtgttc actctgtatt ttggcctgga 240
acgcatggtg gtgctgcatg gatatgaagt ggtgaaggaa gccctgattg atcttggaga 300
ggagttttct ggaagaggcc atttcccact ggctgaaaga gctaacagag gatttggaat 360
cgttttcagc aatggaaaga gatggaagga gatccggcgt ttctccctca tgacgctgcg 420
gaattttggg atggggaaga ggagcattga ggaccgtgtt caagaggaag cccgctgcct 480
tgtggaggag ttgagaaaaa ccaaggcttc accctgtgat cccactttca tcctgggctg 540
tgctccctgc aatgtgatct gctccattat tttccagaaa cgtttcgatt ataaagatca 600
gcaatttctt aacttgatgg aaaaattgaa tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg 660
gatccagata tgcaataatt ttcccactat cattgattat ttcccgggaa cccataacaa 720
attacttaaa aaccttgctt ttatggaaag tgatattttg gagaaagtaa aagaacacca 780
agaatcgatg gacatcaaca accctcggga ctttattgat tgcttcctga tcaaaatgga 840
gaaggaaaag caaaaccaac agtctgaatt cactattgaa aacttggtaa tcactgcagc 900
tgacttactt ggagctggga cagagacaac aagcacaacc ctgagatatg ctctccttct 960
cctgctgaag cacccagagg tcacagctaa agtccaggaa gagattgaac gtgtcattgg 1020
cagaaaccgg agcccctgca tgcaggacag gggccacatg ccctacacag atgctgtggt 1080
gcacgaggtc cagagataca tcgacctcat ccccaccagc ctgccccatg cagtgacctg 1140
tgacgttaaa ttcagaaact acctcattcc caagggcaca accatattaa cttccctcac 1200
ttctgtgcta catgacaaca aagaatttcc caacccagag atgtttgacc ctcgtcactt 1260
tctggatgaa ggtggaaatt ttaagaaaag taactacttc atgcctttct cagcaggaaa 1320
acggatttgt gtgggagagg gcctggcccg catggagctg tttttattcc tgaccttcat 1380
tttacagaac tttaacctga aatctctgat tgacccaaag gaccttgaca caactcctgt 1440
tgtcaatgga tttgcttctg tcccgccctt ctatcagctg tgcttcattc ctgtctgaag 1500
aagcacagat ggtctggctg ctcctgtgct gtccctgcag ctctctttcc tctggtccaa 1560
atttcactat ctgtgatgct tcttctgacc cgtcatctca cattttccct tcccccaaga 1620
tctagtgaac attcagcctc cattaaaaaa gtttcactgt gcaaatatat ctgctattcc 1680
ccatactcta taatagttac attgagtgcc acataatgct gatacttgtc taatgttgag 1740
ttattaacat attattatta aatagagaaa gatgatttgt gtattataaa aaaaaaaaa 1799

Claims (10)

1.一种人CYP2C19基因SNP的检测探针，其特征在于，所述检测探针由特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针组成，所述CYP2C19基因SNP位点由CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17三个位点构成，所述检测探针至少检测所述SNP位点中的一组SNP；所述检测探针的特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针至少为以下一组：
组1：所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性上游引物的序列为序列表中SEQ ID NO:1；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性下游引物的序列为序列表中SEQ ID NO:2；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:3；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:4；
组2：所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:5；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:6；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:7；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:8；
组3：所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:9；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:10；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:11；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:12；
所述特异性野生型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团I,3’端连接有荧光淬灭基团III；
所述特异性突变型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团II,3’端连接有荧光淬灭基团III，所述I和II为不相同的荧光报告基团。
2.根据权利要求1所述的人CYP2C19基因SNP的检测探针，其特征在于，所述荧光报告基团I和II选自CY5、JOE、ROX、HEX或VIC的一种，所述荧光淬灭基团III为MGB、TAMRA或BHQ的一种。
3.根据权利要求1所述的人CYP2C19基因SNP的检测探针，其特征在于，所述检测探针检测所述SNP位点中的两组SNP位点；所述检测探针的特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针为以下任意两组：
组1：所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性上游引物的序列为序列表中SEQ ID NO:1；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性下游引物的序列为序列表中SEQ ID NO:2；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:3；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:4；
组2：所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:5；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:6；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:7；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:8；
组3：所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:9；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:10；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:11；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:12；
所述特异性野生型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团I,3’端连接有荧光淬灭基团III；
所述特异性突变型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团II,3’端连接有荧光淬灭基团III，所述I和II为不相同的荧光报告基团。
4.根据权利要求1所述的人CYP2C19基因SNP的检测探针，其特征在于，所述检测探针检测所述SNP位点中的三组SNP；所述检测探针的特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针为以下三组：
组1：所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性上游引物的序列为序列表中SEQ ID NO:1；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性下游引物的序列为序列表中SEQ ID NO:2；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:3；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:4；
组2：所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:5；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:6；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:7；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:8；
组3：所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性上游引物序列为序列表中SEQ ID NO:9；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性下游引物序列为序列表中SEQ ID NO:10；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性野生型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:11；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特异性突变型Taqman荧光探针的序列为序列表中SEQID NO:12；
所述特异性野生型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团I,3’端连接有荧光淬灭基团III；
所述特异性突变型Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团II,3’端连接有荧光淬灭基团III，所述I和II为不相同的荧光报告基团。
5.一种权利要求1所述检测探针在CYP2C19基因SNP检测中的应用，其特征在于，所述应用包含以下步骤：
1)使用基因组提取方法提取受检者的基因组DNA；
2)使用荧光定量PCR反应试剂或者荧光定量PCR反应试剂的混合物配置荧光定量PCR反应体系，所述荧光定量PCR反应体系含有：PCR预混合液、Mg2+、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶和水；
3)合成所述CYP2C19相关的所述特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针，向步骤2中的一个荧光定量PCR反应体系加入步骤1所述的基因组DNA和所述特异性上、下游引物、特异性野生型Taqman荧光探针和特异性突变型Taqman荧光探针的一组检测探针；
4)启动PCR扩增程序，进行荧光定量PCR扩增反应，获得扩增数据进行分析，即可获得SNP检测结果。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述基因组提取方法为实验室经典基因组提取方法或商用试剂盒提取法。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述DNA聚合酶为Hot-Start Taq酶。
8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述水为双蒸去离子水。
9.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系中组分及终浓度如下：PCR反应预混合液、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物、0.3-0.6mM的dUTP、0.1-0.2U/μL Hot-Start Taq酶和0.01-0.05U/μL的尿嘧啶-N-糖基化酶。
10.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述PCR扩增程序为：95℃，5分钟预变性，然后95℃，15秒；62℃，35秒扩增；40个循环，每个循环结束采集所述I和II的荧光讯号。
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