KR101110396B1

KR101110396B1 - 변이의 검출 방법 및 그것에 이용하는 키트

Info

Publication number: KR101110396B1
Application number: KR1020087023332A
Authority: KR
Inventors: 미츠하루 히라이; 사토시 마지마; 다이라 마에카와; 신야 기무라
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2006-08-08
Filing date: 2007-07-27
Publication date: 2012-07-04
Also published as: KR20110036646A; CN101421420B; JP2012040029A; WO2008018305A1; EP2031074A1; CN101421420A; JPWO2008018305A1; EP2031074A4; KR20080106292A; KR101171635B1; US20100216123A1

Abstract

본 발명은 Tm 해석을 이용한 검출 감도가 우수한 변이의 검출 방법을 제공한다. 검출 부위가 변이된 검출 대상 DNA와 상기 검출 부위가 미변이된 비검출 대상 DNA를 함유하는 시료에, 변이된 상기 검출 부위를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 검출용 프로브 및 미변이된 상기 검출 부위를 포함하는 비검출 대상 서열에 상보적인 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하여, 상기 DNA에 상기 검출용 프로브를 하이브리드화시킨다. 그리고, 상기 DNA와 상기 검출용 프로브의 하이브리드 형성체를 가열하여 온도 상승에 따르는 시그널의 변동을 측정하고, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm치를 결정함으로써 변이의 유무를 결정한다.

Description

변이의 검출 방법 및 그것에 이용하는 키트{METHOD OF DETECTING VARIATION AND KIT TO BE USED THEREIN}

본 발명은 변이의 검출 방법 및 그것에 이용하는 키트에 관한 것이다.

모든 질환의 원인이나, 개체간의 질환역이환성(질환의 걸리기 쉬움), 개체간에 있어서의 약효의 차이 등을 유전자 레벨d에서 해석하는 방법으로서, 점 돌연변이, 소위 단일염기다형(SNP)의 검출이 널리 행해지고 있다.

점 돌연변이의 일반적인 검출 방법으로서는 예컨대, (1) 시료의 표적 DNA에 대해, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 증폭시켜, 얻어진 증폭 산물의 염기 서열을 해석하는 Direct Sequencing법, (2) Pyrosequencing법, (3) 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 증폭시켜, 얻어진 증폭 산물에 대해 온도 경사 컬럼 내에서 HPLC를 행하여, 용출되는 시간에 따라 변이의 유무를 검출하는 Denaturing HPLC법, (4) 목적의 변이를 포함하는 영역에 형광 프로브가 결합하면 형광을 발하는 것을 이용하여, 상기 형광의 검출에 의해 변이를 검출하는 Invadar법, (5) 3'말단 영역에 목적의 변이가 위치하는 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, 증폭의 유무에 따라 변이를 판단하는 ASP-PCR 법 등을 들 수 있다.

그러나, 상기 (1), (2) 및 (4)의 방법은 각각 약 20％, 약 5％, 약 5％ 정도 로 감도가 낮고, 조작에 많은 수고와 시간이 걸린다. 상기 (3)의 방법은 감도가 약 10％로 낮고, 또한, 변이의 유무를 확인할 수 있을 뿐 어떤 부위에 어떠한 변이가 생긴 것인지를 해석할 수 없고, 특이성이 부족하다고 하는 문제가 있다. 또한, 상기 (5)의 방법은 감도는 높지만 특이성이 낮고, 위양성이 생기기 쉽다고 하는 문제가 있다. 또한, 감도는 수치(％)가 작을수록 고감도이다.

이러한 문제로부터 최근, 점 돌연변이의 검출 방법으로서, Tm 해석을 이용한 검출이 행해지고 있다. 이 방법은, 예컨대, 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 우선, 검출 목적의 점 돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 시료 중의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하여, 온도 상승에 따르는 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널 측정에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm치를 결정함으로써 점 돌연변이의 유무를 판단한다. Tm치는 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮게 된다. 이 때문에, 점 돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해, 미리 Tm치(평가 기준치)를 요구하고 있고, 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브의 Tm치(측정치)를 측정하면, 이하와 같은 판단이 가능하다. 상기 측정치가 상기 평가 기준치와 동일하면, 매치, 즉, 표적 DNA에 점 돌연변이가 존재한다고 판단할 수 있다. 한편, 상기 측정치가 상기 평가 기준치보다 낮으면, 미스 매치, 즉, 표적 DNA에 점 돌연변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.

그러나, 이러한 Tm 해석을 이용한 검출 방법은, 감도가 낮다고 하는 문제가 있다. 구체예로서, 백혈병 환자의 혈액 세포 유래 DNA에 대해 점 돌연변이를 검출할 때에 문제가 되고 있다(특허 문헌 1). 백혈병은, 골수 중의 조혈 줄기세포가 암화함으로써 발생하는 질환이다. 그 중에서도 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia: CML)은 9번째의 염색체와 22번째의 염색체의 전좌에 의해 형성되는 bcr-abl1 융합 유전자가 발증 원인으로서 알려져 있고, 그 치료에는, abl1 키나아제 억제제인 이마티닙(imatinib) 등이 널리 사용되고 있다. 그러나, 이 abl1 유전자(상기 융합 유전자에 있어서의 abl1 유전자를 포함한다)에 점 돌연변이가 존재하면, 이마티닙에 대해 내성을 발현한다고 하는 문제가 있다. 그 경우, 치료에 있어서, 예컨대, 이마티닙 투여량의 증가, 다른 치료약으로의 변경, 골수 이식 등으로의 전환 등이 필요하게 된다. 따라서, 백혈병, 특히 CML의 치료에 있어서는, abl1 유전자에 있어서의 점 돌연변이의 유무를 검출하는 것이 매우 중요하게 되어있다. 그러나, 한사람의 CML 환자의 혈액이더라도, 그 혈액 세포에는 abl1 유전자에 점 돌연변이가 발생한 경우(검출 대상 서열)와 발생하지 않은 경우(비검출 대상 서열)가 포함되어 있고, 양자의 차이는, 점 돌연변이 즉 일염기의 서열에 지나지 않는다. 그렇다면, 점 돌연변이를 검출하기 위한 프로브는, 점 돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열에 하이브리드화(매치)하고, 또한, 점 돌연변이를 포함하지 않는 비검출 대상 서열에도 하이브리드화(미스 매치)하는 현상이 발생하게 된다. 이러한 경우에, Tm 해석에 따라 시그널의 강도와 온도의 관계를 나타내는 융해 곡선을 작성하면, 매치하고 있는 검출 대상 서열에 대한 고온측의 피크가, 미스 매치인 비검출 대상 서열에 대한 저온측의 피크의 존재에 의해 검출하기 어렵게 되고, 또한 검출 감도의 저하가 생기게 된다.

[특허 문헌 1] 일본 특허 공표 제2004-537992호 공보

-발명이 해결하려는 과제-

그래서, 본 발명은 Tm 해석을 이용한 검출 감도에 우수한 변이의 검출 방법 및 그것에 이용하는 검출용 프로브 키트의 제공을 목적으로 한다.

-과제를 해결하기 위한 수단-

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 변이의 검출 방법은, 상기 시료가, 검출 부위가 변이된 검출 대상 DNA와, 상기 검출 부위가 미변이된 비검출 대상 DNA를 함유하는 시료이고,

하기 (A) ~(E) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

(A) 상기 DNA를 포함하는 시료에, 검출 대상 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 검출용 프로브 및 비검출 대상 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드(이하, 「저해용 폴리뉴클레오티드」라고 한다)를 첨가하는 공정으로서,

상기 검출 대상 서열이, 상기 검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 변이된 상기 검출 부위를 포함하고,

상기 비검출 대상 서열이, 상기 비검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 미변이된 상기 검출 부위를 포함하는 것인 공정,

(B) 상기 DNA에 상기 검출용 프로브를 하이브리드화시키는 공정,

(C) 상기 DNA와 상기 검출용 프로브의 하이브리드 형성체에 대해, 온도 변화에 따른 시그널의 변동을 측정하는 공정,

(D) 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm치를 결정하는 공정,

(E) 상기 Tm치로부터 상기 검출 대상 부위에 있어서의 변이의 유무를 결정하는 공정.

본 발명의 검출용 프로브 키트는 본 발명의 변이의 검출 방법에 사용하는 검출용 프로브 키트로서,

검출 대상 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 검출용 프로브와, 비검출 대상 서열에 상보적인 저해용 폴리뉴클레오티드를 포함하고,

상기 검출 대상 서열이, 검출 부위가 변이된 검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 변이된 상기 검출 부위를 포함하며,

상기 비검출 대상 서열이, 상기 검출 부위가 미변이된 상기 비검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 미변이된 상기 검출 부위를 포함하는 것을 특징으로 한다.

[발명의 효과]

본 발명의 변이의 검출 방법은, 시료에, 검출 부위가 변이된 상기 검출 대상 서열에 대한 검출용 프로브뿐만 아니라, 또한, 검출 부위가 미변이된 상기 비검출 대상 서열에 대한 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하고 있다. 이 때문에, 비검출 대상 서열에의 상기 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제할 수 있고, 그 결과, 종래보다도 우수한 감도(약 3％)로 상기 검출 부위에 있어서의 변이를 검출할 수 있다. 이와 같이, 검출용 프로브의 비검출 대상 서열에의 하이브리드화를 억제할 수 있는 것은, 상기 검출용 프로브와 비교하여, 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 상기 비검출 대상 서열에 대한 상동성이 높은 것에 의한다. 따라서, 본 발명의 검출 방법은, 예컨대, 시료 중에 검출 대상 DNA와 비검출 대상 DNA의 양쪽이 포함되는 시료에 대해 유용하다. 특히, 백혈병 환자의 시료에 대해 유용하고, 그 중에서도, 만성 골수성 백혈병(CML) 환자에 대해, abl1 유전자의 변이(bcr-abl1 융합유전자에 있어서의 abl1 유전자의 변이를 포함)를 검출할 때에 유용하다. 전술한 바와 같이, 변이를 고감도로 검출할 수 있기 때문에, 예컨대, 환자마다의 백혈병 치료약의 적정을, 유전자 레벨로 해석하는 것이 가능해져, 의료 분야에 있어서 매우 유용한 방법이라고 할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출용 프로브 키트를 이용하면, 본 발명의 변이의 검출 방법을 간편하게 행할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 있어서의, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.

도 2는 비교예 1에 있어서의, 저해용 폴리뉴클레오티드 무첨가에서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 상기 실시예 1에 있어서의, 검출용 프로브의 첨가 비율을 변화시킨 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 상기 실시예 1에 있어서의, 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가 비율을 변화시킨 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.

도 5는 본 발명의 실시예 2에 있어서의, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.

도 6은 본 발명의 실시예 3에 있어서의, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.

도 7은 본 발명의 실시예 4에 있어서의, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.

-본 발명을 실시하기 위한 최량의 형태-

본 발명의 변이의 검출 방법은, 전술한 바와 같이, 시료 중의 DNA의 변이를 검출하는 방법으로서, 상기 시료가 검출 부위가 변이된 검출 대상 DNA와, 상기 검출 부위가 미변이된 비검출 대상 DNA를 함유하는 시료이고, 하기 (A) ~(E) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

(A) 상기 DNA를 포함하는 시료에, 검출 대상 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 검출용 프로브 및 비검출 대상 서열에 상보적인 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하는 공정,

(C) 상기 DNA와 상기 검출용 프로브의 하이브리드 형성체에 대해, 온도 변화에 따르는 시그널의 변동을 측정하는 공정,

(D) 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm치를 결정하는 공정,

상기 (A) 공정에 있어서, 상기 검출 대상 서열이란, 상기 검출 대상 DNA 또 는 그 부분 서열로서, 변이된 상기 검출 대상 부위를 포함하는 서열이다. 또한, 상기 비검출 대상 서열이란, 상기 비검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 미변이된 상기 검출 대상 부위를 포함하는 서열이다.

본 발명에 있어서, 검출 부위에 변이가 존재하는 상기 검출 대상 서열을 「변이 서열」, 상기 검출 대상 서열을 포함하는 검출 대상 DNA를 「변이 DNA」라고도 말하며, 검출 부위에 변이가 존재하지 않는 상기 비검출 대상 서열을 「정상 서열」, 상기 비검출 대상 서열을 포함하는 DNA를 「정상 DNA」라고도 말한다. 또한, 검출 부위에 있어서의 변이를 「검출 목적의 변이」라고도 말한다. 변이의 유무를 검출하는 표적이 되는 시료 중 DNA를 「표적 DNA」라고도 말한다. 본 발명에 있어서 검출하는 변이로서는 예컨대, 단일염기다형(SNP) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 DNA는 단일쇄 DNA이더라도 좋고 이중쇄 DNA이더라도 좋다. 상기 DNA가 이중쇄 DNA인 경우는 예컨대, 상기 (B) 하이브리드화 공정에 앞서서, 가열에 의해 상기 시료 중의 이중쇄 DNA를 해리시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 이중쇄 DNA를 단일쇄 DNA에 해리함으로써, 다음 (B) 하이브리드화 공정에 있어서, 검출용 프로브나 저해용 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화를 효율적으로 행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 DNA는 예컨대, 유전자이더라도 좋고, 유전자의 부분 서열이더라도 좋다. 또한, 상기 시료 중의 DNA는 예컨대, 생체 시료 등의 시료에 원래 포함되는 DNA이더라도 좋지만, 예컨대, 검출 정밀도를 향상할 수 있기 때문에, 유전자 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물인 것이 바람직하다. 구체 적으로는 예컨대, 상기 시료에 원래 포함되어 있는 DNA를 주형으로 하여, 유전자 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물이나, 상기 시료에 원래 포함되어 있는 RNA(전체 RNA, mRNA 등)로부터 역전사 반응[예컨대, RT-PCR(Reverse Transcription PCR)]에 의해 생성시킨 cDNA를 주형으로 하여, 유전자 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물을 들 수 있다. 상기 증폭 산물의 길이는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 50~1000 mer이고, 바람직하게는 80~200 mer이다.

본 발명의 검출 방법을 적용하는 시료는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명은, 예컨대, 전술한 바와 같이, 표적 DNA로서, 목적의 변이를 갖는 DNA(검출 대상 DNA)와 목적의 변이를 갖지 않는 DNA(비검출 대상 DNA)의 양쪽을 포함하는 시료에 대해, 매우 유용하다. 상기 DNA나 RNA의 유래는, 제한되지 않고, 예컨대, 각종 암 세포 등의 세포, 바이러스, 미토콘드리아 등을 들 수 있다. 특히, 전술한 바와 같이, 백혈병 환자의 생체 시료(예컨대, 혈액 시료)에 대해 변이의 검출을 행하는 경우, 암화한 혈액 세포에는, 변이가 발생한 DNA를 갖는 세포와, 변이가 발생하지 않은 DNA를 갖는 세포가 포함되기 때문에, 전술한 바와 같은 문제가 발생하기 쉽다. 따라서, 본 발명의 검출 방법은, 특히, 변이가 발생한 DNA와 변이가 발생하지 않는 DNA를 갖는 시료에의 적용이 바람직하고, 예컨대, 백혈병의 생체 시료, 구체예로서는, 혈액 시료나 백혈구 세포 등에 적용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 시료의 채취 방법, DNA의 조제 방법 등은, 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 검출 목적의 변이는 제한되지 않는다. 전술한 바와 같이, 백혈병에 관련되는 변이를 검출할 때, 비검출 대상 서열에 대해 검출용 프로브가 하이브리드화하는 것이 알려져 있다. 그렇기 때문에, 구체예로서, 백혈병에 관련되는 유전자의 변이를 검출할 때, 본 발명의 방법은 유용하다. 상기 백혈병에 관련되는 유전자의 변이로서는 예컨대, abl1 유전자의 변이(bcr-abl1 융합 유전자에 있어서의 abl1 유전자의 변이를 포함한다)를 들 수 있다. 예컨대, 서열 번호 1에 나타내는 abl1 유전자의 cDNA서열(mRNA 서열)에 있어서, 756번째의 염기 G, 758번째의 염기 A, 763번째의 염기 G의 변이를 들 수 있다. 이들의 염기에 대해서는 예컨대, 이하와 같은 염기로의 변이가 보고되어 있다. 또한, abl1 유전자의 서열은, NCBI 기탁 번호 NM_005157로 등록되어 있다.

변이G756C 756번째의 염기 G가 C로 변이

변이A758T 758번째의 염기 A가 T로 변이

변이G763A 763번째의 염기 G가 A로 변이

본 발명에 있어서, 상기 검출용 프로브는 검출 부위가 변이된 상기 검출 대상 서열에 상보적인 서열이면 좋고, 상기 저해용 폴리뉴클레오티드는 검출 부위가 미변이된 상기 비검출 대상 서열에 상보적인 서열이면 좋다. 상기 프로브와 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 않지만, 동일한 길이인 것이 바람직하다. 상기 검출용 프로브의 서열과 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 서열은, 예컨대, 하이브리드를 형성할 때에 상기 검출 부위(목적의 변이가 발생하는 부위)와 쌍을 이루는 부위(염기)를 제외하고, 90％~100％ 동일한 서열인 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 100％이다. 또한, 상기 검출용 프로브와 상기 저해용 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 동일한 쇄이면, DNA의 순쇄 및 역쇄 중 어는 것에 하이브리드화하도록 설계하여도 좋다.

이하에, abl1 유전자의 상기 3종류의 변이(G756C, A758T, G763A)의 검출에 사용하는 검출용 프로브와 저해용 폴리뉴클레오티드의 조합을 예시한다. 또한, 각 서열에 있어서, 대문자로 나타낸 염기가, abl1 유전자의 756번째, 758번째, 763번째에 각각 대응한다. 본 발명은, 이들에는 제한되지 않는다.

변이 G756C ( 순쇄의 검출용)

검출용 프로브 서열 번호 2

5'-ccgtaGtggcccccgc-3'

저해용 폴리뉴클레오티드 서열 번호 3

5'-ccgtaCtggcccccgc-3'

변이 A758T( 순쇄의 검출용)

검출용 프로브 서열 번호 4

5'-ccgAactggcccccgc-3'

저해용 폴리뉴클레오티드 서열 번호 5

5'-cctccccgTactggcccccg-3'

저해용 폴리뉴클레오티드 서열 번호 6

5'-ccgTactggcccccgc-3'

변이G763A(역쇄의 검출용)

검출용 프로브 서열 번호 7

5'-ccagtacgggAaggtgt-3'

저해용 폴리뉴클레오티드 서열 번호 8

5'-ccagtacgggGaggtgt-3'

본 발명에 있어서, 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 상기 검출용 프로브의 길이, 검출 대상 서열의 GC 함량 등, 검출계의 조건에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 상기 검출용 프로브에 대한 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 하한은, 예컨대, 몰비로 0.1배 이상이고, 바람직하게는 1배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상이다. 또한, 상한은, 예컨대, 몰비로 100배 이하이다. 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 5~50 mer이며, 바람직하게는 10~30 mer이고, 상기 검출용 프로브와 동일한 길이로 설정하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 검출 대상 서열에 상보적인 검출용 프로브의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 검출 시그널을 충분히 확보할 수 있기 때문에, 상기 시료 중의 DNA에 대해 몰비로 1배 이하가 바람직하다. 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가에 부가하여, 또한, 상기 검출용 프로브의 첨가 비율을 제어함으로써, 예컨대, 검출 감도의 한층 더한 향상을 도모할 수 있다. 또한, 상기 검출용 프로브의 첨가 비율을 설정하는 것만으로 충분하기 때문에, 조작이 매우 간편하다. 상기 검출용 프로브의 첨가 비율은, 보다 바람직하게는, 상기 DNA에 대해 몰비로 0.1배 이하이다. 이 때, 시료 중의 DNA란, 예컨대, 검출 대상 DNA와 비검출 대상 DNA의 합계라도 좋고, 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물의 합계라도 좋다. 또한, 시료 중의 DNA에 있어서의 검출 대상 DNA의 비율은, 통상 불명확하지만, 결과적으로, 상기 검출용 프로브의 첨가 비율은 예컨대, 검출 대상 DNA(또는, 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대해 몰비로 10배 이하로 되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5배 이하, 보다 바람직하게는 3배 이하이다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 상기 검출 대상 DNA등에 대해, 몰비로, 0.001배 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.01배 이상이며, 보다 바람직하게는 0.1배 이상이다.

또한, 상기 DNA에 대한 검출용 프로브의 첨가 비율은, 예컨대, 이중쇄 DNA에 대한 몰비라도 좋고, 단일쇄 DNA에 대한 몰비라도 좋다. 또한, 상기 검출용 프로브의 길이는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 5~50 mer이며, 바람직하게는 10~30 mer이다.

Tm치에 대해 설명한다. 이중쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 나가면, 260 nm에서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 이중쇄 DNA에 있어서의 양쇄 사이의 수소결합이 가열에 의해 풀어지고, 단일쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 이중쇄 DNA가 해리하여 단일쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시 시의 흡광도(이중쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 따라 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. 이 현상에 기초하여, 융해 온도 Tm이란, 일반적으로 흡광도가, 흡광도 전체 상승분의 50％에 도달했을 시의 온도로 정의된다.

본 발명에 있어서, Tm치를 결정하기 위한 온도 상승에 따르는 시그널 변동의 측정은, 예컨대, 전술한 바와 같은 원리로부터, 260 nm의 흡광도 측정에 의해 행할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 검출용 프로브로서, 표지화 물질로 표지화된 프로브를 사용하여, 시그널 변동의 측정을 행한다. 상기 검출용 프로브에 있어서 표지화 부위는 특별히 제한되지 않는다. 또한, 표지화 물질은 특별히 제한되지 않지만, 통상, 뉴클레오티드의 인산기에 결합할 수 있다.

상기 표지화 프로브로서는 예컨대, 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널을 나타낸다. 또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 예컨대, 이 표지화 물질에 의한 시그널을 시그널특유의 조건(흡광도 등)으로 검출함으로써, 상기 260 nm의 흡광도 측정과 동일하게, 융해의 진행 및 Tm치의 결정을 행할 수 있다.

상기 표지화 물질로서는, 제한되지 않지만, 예컨대, 형광 색소(형광단)를 들 수 있다. 상기 표지화 프로브의 구체예로서는 예컨대, 형광 색소로 표지되어, 단독으로 형광을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예컨대, 소광)하는 프로브가 바람직하다. 이러한 형광소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 형광소광 프로브라고 불린다. 그 중에서도, 검출용 프로브로서는, 올리고뉴클레오티드의 3'말단 혹은 5'말단이 형광 색소로 표지화되어 있는 것이 바람직 하고, 표지화되는 상기 말단의 염기는, C인 것이 바람직하다. 이 경우, 검출용 프로브가 하이브리드화하는 검출 대상 DNA에 있어서, 상기 검출용 프로브의 말단염기 C와 쌍을 이루는 염기 혹은 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1~3 염기 떨어진 염기가 G가 되도록, 상기 검출용 프로브의 염기 서열을 설계하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는, 일반적으로 구아닌소광 프로브라고 불리고, 소위 QProbe(등록 상표)로서 알려져 있다. 이러한 구아닌소광 프로브가 검출 대상 DNA에 하이브리드화하면, 형광 색소로 표지화된 말단의 C가, 상기 검출 대상 DNA에 있어서의 G에 근접함으로써, 상기 형광 색소의 발광이 약해지는(형광 강도가 감소한다) 현상을 나타낸다.

상기 형광 색소로서는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있다. 시판의 형광 색소로서는 예컨대, BODIPYFL(상표명, 몰레큘러 프로브(molecular probes)사 제조), FluorePrime(상품명, 아마샴 파마시아(Amersham Pharmacia)사 제조), Fluoredite(상품명, 미리포아사 제조), FAM(ABI사 제조), Cy3 및 Cy5(아마샴 파마시아사 제조), TARMA(몰레큘러·프로브사 제조) 등을 들 수 있다. 검출 조건은 특별히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 의해 적절하게 결정할 수 있다. 구체예로서, Pacific Blue는 예컨대, 검출 파장 450~480 nm, TAMRA는 예컨대, 검출 파장 585~700 nm, BODIPY FL은, 예컨대, 검출 파장 515~555 nm에서 검출할 수 있다. 이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리드화와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 한편, 상기 저해용 폴리뉴클레오티드는 표지화되지 않는 것이 바람직하다.

다음으로, abl1 유전자(서열 번호 1)에 있어서의 758번째의 염기 A의 점 돌연변이(A→ T)를 예로 들어, 본 발명의 검출 방법에 대해 설명한다. 또한, 본 발명은, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한 점이 특징이고, 그 외의 공정이나 조건에 대해서는 어떠한 제한도 없다. 또한, 검출용 프로브가 하이브리드화하는 검출 대상 서열은, 예컨대, 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서 758번째의 염기 A가 T로 변이한 전장 서열이라도 좋지만, 검출 부위인 758번째의 염기(A→ T)를 포함하고 있으면 부분 서열인 것이 바람직하다.

우선, 전혈로부터 게놈 DNA를 단리한다. 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있고, 예컨대, 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 등을 사용할 수 있다.

다음으로, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 시료에, 검출용 프로브 및 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한다. 상기 검출용 프로브와 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가 시는, 후술하는 바와 같이 어떠한 제한도 없지만, 본 실시형태에 있어서는, 일례로서, 검출용 프로브를 첨가한 후에 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하는 방법을 예로 들고 있다.

즉, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 시료에 우선, 검출용 프로브를 첨가한다. 상기 검출용 프로브로서는 예컨대, 전술한 바와 같은 것을 들 수 있지만, 그 중에서도, QProbe가 바람직하다. 이 QProbe는, 전술한 바와 같이, 일반적으로, 말단염기가 시토신이고, 상기 말단을 형광 색소로 표지화한 프로브이다. 그리고, 이것이 검출 대상 서열에 하이브리드함으로써, 상기 형광 색소와 검출 대상 서열의 구아닌이 상호 작용하여, 그 결과, 형광이 감소(또는 소광)하는 것이다.

상기 검출용 프로브의 서열은, 전술한 바와 같이, 점 돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적이면 좋고, 상기 검출 대상 서열에 따라 적절하게 설계할 수 있다. abl1 유전자(서열 번호 1)에 있어서의 758번째 염기 A의 점 돌연변이(A→ T)를 검출하는 경우는 예컨대, 전술의 서열 번호 4의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다.

변이 A758T의 검출용 프로브 서열 번호 4

5'-ccgaActggcccccgc-3'(GC 함량 81.3％)

상기 시료 중의 DNA나 RNA를 주형으로서 유전자 증폭법을 행하는 경우도, 상기 검출용 프로브의 첨가의 타이밍은 특별히 제한되지 않는다. 상기 검출용 프로브는 예컨대, 후술하는 유전자 증폭 처리 후, 얻어진 증폭 산물에 대해 첨가하여도 좋지만, 유전자 증폭 처리 전에 첨가하는 것이 바람직하다. 이와 같이 유전자 증폭 처리 전에 상기 검출용 프로브를 첨가하는 경우, 예컨대, 프로브 자체의 신장을 예방하기 위해, 그 3'말단에, 인산기가 더욱 부가되어도 좋고, 전술한 바와 같은 형광 색소로 3'말단을 표지화하여도 좋다.

상기 검출용 프로브는 예컨대, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 액체 시료에 첨가하여도 좋고, 용매 중에 게놈 DNA와 혼합하여도 좋다. 상기 용매로서는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 포함하는 용매, PCR 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.

계속해서, 단리한 게놈 DNA를 주형으로서, 유전자 증폭법에 의해, 목적 서열의 증폭을 행한다. 구체적으로는, 검출 목적의 점 돌연변이가 생기는 염기 부위를 포함하는 서열, 즉, 검출 대상 서열 및 비검출 대상 서열을 증폭시킨다.

유전자 증폭법은, 제한되지 않고, 예컨대, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있지만, PCR 법이 바람직하다. 또한, 이하, PCR 법을 예로 들어, 본 발명을 설명하지만, 이것에는 제한되지 않는다. 또한, PCR의 조건은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

PCR의 프라이머의 서열은, 예컨대, 목적의 검출 대상 서열을 증폭할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 목적의 서열에 따라, 종래 공지의 방법에 의해 적절하게 설계할 수 있다. 증폭시키는 영역은, 예컨대, 목적의 검출 대상 서열만이라도 좋고, 상기 검출 대상 서열을 포함하는 영역만이라도 좋다. 프라이머의 길이는 특별히 제한되지 않고, 일반적인 길이로 설정할 수 있으며, 예컨대, 10~30 mer이다. 전술한 바와 같이, abl1 유전자(서열 번호 1)에 있어서의 758번째 염기 A의 점 돌연변이(A→ T)를 검출하는 경우, 구체예로서, 이하에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머를 사용할 수 있다. 이들의 프라이머의 조합은 특별히 제한되지 않는다. 또한, 서열 번호 9의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드(센스 프라이머)와 서열 번호 10의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드(안티센스 프라이머)를 조합한 경우, 얻어지는 증폭 산물의 길이는 103 mer정도이다.

(프라이머 셋트 1)

센스 프라이머 서열 번호 9

5'-ggagatggaacgcacggac-3'(GC 함량 63.2％)

안티센스 프라이머 서열 번호 10

5'-ggccaccgtcaggctg-3'(GC 함량 75％)

(프라이머 셋트 2)

센스 프라이머 서열 번호 11

5'-gacaagtgggagatggaacgc-3'

안티센스 프라이머 서열 번호 12

5'-cacggccaccgtcagg-3'

다음으로, 후술하는 하이브리드화 공정에 앞서서, 상기 증폭 산물을 포함하는 시료에 상기 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한다. 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가 비율은, 전술한 바와 같다. 전술한 바와 같이, 첨가의 타이밍은, 여기에 제한되지 않고, 예컨대, 상기 검출용 프로브 첨가의 전후 혹은 동시에 행할 수 있다. 또한, 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가는 예컨대, 전술의 유전자 증폭 처리의 전후 어느쪽이라도 좋지만, 예컨대, 처리가 간편하기 때문에, 유전자 증폭 처리 전에 첨가해 두는 것이 바람직하다.

이와 같이 유전자 증폭 처리 전에 상기 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하는 경우, 예컨대, 저해용 폴리뉴클레오티드 자체가 신장하는 것을 예방하기 위해, 그 3'말단에, 인산기가 더욱 부가되어도 좋다.

전술한 바와 같이, abl1 유전자(서열 번호 1)에 있어서의 758번째 염기 A의 점 돌연변이(A→ T)를 검출하는 경우, 저해용 폴리뉴클레오티드로서는 예컨대, 점 돌연변이를 포함하지 않고, 서열 번호 5의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 이 저해용 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 전술의 서열 번호 4의 염기 서열로 이루어지는 검출용 프로브와 조합하여 사용하는 것이 바람직하다.

변이 A758T의 저해용 폴리뉴클레오티드 서열 번호 5

5'-cctccccgTactggcccccg-3'(GC 함량 80％)

다음으로, 얻어진 증폭 산물의 해리 및 해리에 의해 얻어진 단일쇄 DNA와 상기 검출용 프로브 및 저해용 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화를 행한다.

상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도는 상기 증폭 산물이 해리할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 85℃ 이상이며, 바람직하게는, 85℃~95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 1초~10분이며, 바람직하게는 1초~5분이다.

또한, 해리한 단일쇄 DNA와 상기 검출용 프로브의 하이브리드화 및 상기 단일쇄 DNA와 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화는, 예컨대, 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시킴으로써 행할 수 있다. 온도 조건으로서는 예컨대, 40℃ 이하이다.

하이브리드화 공정의 반응액에 있어서의 각 조성의 체적이나 농도는 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 상기 반응액에 있어서, DNA의 농도는 예컨대, 0.01~1 μM이고, 바람직하게는 0.1~0.5 μM, 상기 검출용 프로브의 농도는 예컨대, 상기 DNA에 대한 첨가 비율을 만족하는 범위가 바람직하고, 예컨대, 0.001~10 μM 이며, 바람직하게는 0.001~1 μM, 상기 저해용 폴리뉴클레오티드의 농도는 예컨대, 0.1 nM~1 mM이고, 바람직하게는 0.1 nM~100 μM이다.

본 발명에 있어서는, 전술한 바와 같이 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가가 중요하고, 예컨대, 검출 대상 DNA, 검출용 프로브, 저해용 폴리뉴클레오티드의 반응액에 있어서의 농도 등은 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 후술하는 시그널의 검출에 있어서, 예컨대, 사용하는 장치의 검출 감도가 상대적으로 높을수록, 반응액에 있어서의 검출 대상 DNA의 농도를 저감할 수 있고, 사용하는 장치의 검출 감도가 상대적으로 낮을수록, 반응액에 있어서의 검출 대상 DNA의 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 구체예로서, 후술하는 시그널 검출로 시판 장치(상품명 Smart Cycler; Cepheid사 제조)를 사용하는 경우, 예컨대, 반응액에 있어서, 검출 대상 DNA 농도 5~1000 nM, 상기 검출용 프로브 농도 50~1000 nM, 상기 저해용 폴리뉴클레오티드 농도 5 nM~100 μM으로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 검출 대상 DNA 농도 10~500 nM, 상기 검출용 프로브 농도 100~500 nM, 상기 저해용 폴리뉴클레오티드 농도 10 nM~50 μM이다.

그리고, 형성된, 상기 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브 또는 저해용 폴리뉴클레오티드의 하이브리드 형성체를 가열하여 온도 상승에 따르는 시그널의 변동을 측정한다. 예컨대, Q-Probe를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 하이브리드화한 상태에서는, 형광이 감소(또는 소광)하고, 해리한 상태에서는, 형광을 발한다. 따라서, 예 컨대, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드 형성체를 서서히 가열하여 온도 상승에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 좋다.

시그널 변동을 측정할 때의 온도 범위는 특별히 제한되지 않는다. 개시 온도는 예컨대, 실온(예컨대, 10℃)~85℃이고, 바람직하게는 25~70℃이며, 종료 온도는 예컨대, 40~105℃이다. 또한, 온도의 상승 속도는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 0.1~20℃/초이며, 바람직하게는 0.3~5℃/초이다.

다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm치를 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 값(-d 형광 강도 증가량/dt)을 산출하여, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm치로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 점을 Tm치로서 결정할 수도 있다. 또한, 검출용 프로브로서, 소광 프로브가 아닌, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용한 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 좋다.

상기 Tm치는 예컨대, 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있고, 또한, 인접법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다.

또한, 본 발명에 있어서는, 전술한 바와 같이, 하이브리드 형성체를 가열하여 온도 상승에 따르는 시그널 변동을 측정하는 방법 대신에, 예컨대, 하이브리드 형성 시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행하여도 좋다. 즉, 상기 프로브를 첨가한 시료의 온도를 강하시켜 하이브리드 형성체를 형성할 때에, 상기 온도 강하에 따르는 시그널 변동을 측정하여도 좋다.

구체예를 이하에 나타낸다. 검출용 프로브로서, 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브(예컨대, Q-Probe)를 사용한 경우, 상기 검출용 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리하고 있기 때문에 형광을 발하고 있지만, 온도의 강하에 따라 하이브리드를 형성하면 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예컨대, 상기 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하면 좋다. 한편, 검출용 프로브로서, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 사용한 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리하고 있기 때문에 형광을 발하지 않지만, 온도의 강하에 따라 하이브리드를 형성하면, 형광을 발하게 된다. 따라서, 예컨대, 상기 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 좋다.

이어서, 본 발명의 검출용 프로브 키트는, 전술한 바와 같이, 본 발명의 변이의 검출 방법에 사용하는 키트로서, 검출 대상 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 검출용 프로브와, 비검출 대상 서열에 상보적인 저해용 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 상기 검출 대상 서열은, 전술한 바와 같이, 검출 부위가 변이된 검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 변이된 상기 검출 부위를 포함하는 서열이다. 또한, 상기 비검출 대상 서열은, 전술한 바와 같이, 상기 검출 부위가 미변이된 상기 비검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 미변이된 상기 검출 부위를 포함하는 서열이다. 본 발명의 검출용 프로브 키트는, 상기 프로브와 상기 저해용 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있으면 좋고, 그 외의 구성은 제한되지 않는다.

상기 프로브 및 상기 저해용 폴리뉴클레오티드로서는, 제한되지 않고, 전술과 동일한 것을 이용할 수 있으며, 바람직한 조합도 전술한 바와 같다.

본 발명의 검출용 프로브 키트에 있어서, 상기 프로브와 상기 저해용 폴리뉴클레오티드는, 하나의 시약으로서 혼합되어도 좋고, 별개의 시약으로서 독립된 것이어도 좋다. 전자의 경우, 상기 프로브와 상기 저해용 폴리뉴클레오티드는, 전술한 바와 같은 비율로 혼합되어 있는 것이 바람직하다. 후자의 경우에는 예컨대, 반응액 중의 비율이 전술한 바와 같은 범위가 되도록 사용하면 좋다. 또한, 본 발명의 검출용 프로브 키트는, 상기 프로브와 상보적인 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 더욱 갖더라도 좋다.

또한, 본 발명의 데이터 해석 방법은, DNA의 변이의 유무를 결정하기 위한 데이터의 해석 방법으로서, 하기 (a) ~(b) 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.

(a) 본 발명의 변이 검출 방법에 있어서의 (C) 공정에서 얻어진 시그널 변동을 해석하여 Tm치를 연산하는 공정,

(b) 상기 연산 공정에 있어서 연산한 상기 Tm치로부터 DNA의 변이의 유무를 결정하는 공정.

본 발명의 시스템은, 시료 중의 DNA의 변이의 유무를 검출하기 위한 시스템으로서, 본 발명의 변이의 검출 방법에 있어서의 (C) 공정에서 얻어진 시그널 변동 을 입력하는 입력 수단, 상기 입력 수단에 따라 입력한 상기 시그널 변동으로부터 Tm치를 연산하는 연산 수단 및 상기 연산 수단에 의해 연산한 Tm치에 기초하여, DNA의 변이의 유무를 결정하는 결정 수단을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 시스템은, 예컨대, 컴퓨터 시스템에 의해 구축된 검출 장치를 들 수 있다. 상기 시스템의 하드웨어 구조는, 제한되지 않고, 예컨대, 제어부인 CPU에 기억 장치, 키보드나 마우스 등의 입력 장치가 접속되어 있고, 또한, 예컨대, 결과의 출력 장치, 입력 데이터나 결과를 표시하는 표시 장치(디스플레이) 등이 접속되어도 좋다. 또한, 각 수단은, 예컨대, 컴퓨터의 CPU가 소정의 프로그램을 실행함으로써 실현되는 기능적 블록이면 좋다. 이 때문에, 예컨대, 각 구성 수단이, 하드웨어로서 실제 장착되어 있지 않아도 좋고, 네트워크 시스템이더라도 좋다.

또한, 본 발명의 시스템은, 예컨대, 본 발명의 변이의 검출 방법에 있어서의 (B) 공정이나 (C) 공정을 실행하기 위한 수단을 갖고 있어도 좋다. 상기 공정을 실행하기 위한 수단으로서는 예컨대, 온도 제어 수단, 시그널의 검출 수단을 들 수 있다. 상기 온도 제어 수단의 실행에 의해, 예컨대, 하이브리드화에 의한 이중쇄 DNA(하이브리드 형성체)의 형성이나, 하이브리드 형성체의 해리를 행할 수 있다. 또한, 상기 시그널 검출 수단의 실행에 의해, 예컨대, 온도 변화에 따라 하이브리드 형성체가 형성되는 것에 따르는 시그널 변동량이나, 하이브리드 형성체가 해리함에 따르는 시그널 변동량을 검출할 수 있다. 이 경우, 예컨대, 상기 입력 수단 대신에, 상기 시그널 검출 수단에 의해 검출된 시그널 변동을 기록하는 기록 수단을 갖더라도 좋다. 또한, 본 발명의 시스템은 상기 결정 수단에 의해 결정된 DNA의 변이의 유무를 출력하는 출력하는 수단을 구비하여도 좋다.

본 발명의 프로그램은 본 발명의 데이터 해석 방법을 컴퓨터 상에서 실행 가능한 컴퓨터 프로그램이다.

또한, 본 발명의 전자 매체는, 본 발명의 컴퓨터 프로그램을 저장한 컴퓨터판독 가능한 전자 매체(「기록 매체」라고도 한다)이다.

다음으로, 본 발명의 실시예에 대해, 비교예와 함께 설명한다. 단, 본 발명은 하기의 실시예 및 비교예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예 1]

abl1 유전자에 있어서의 758번째 염기의 점 돌연변이(A→ T)

(1) 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하여, abl1 유전자에 있어서의 758번째 염기의 점 돌연변이(A→ T)에 대한 Tm 해석을 행했다.

abl1 유전자 758번째의 염기에 변이를 갖지 않는 백혈구 세포주의 게놈 DNA(서열 번호 1)와, abl1 유전자 758번째의 염기에 변이를 갖는 백혈구 세포주의 게놈 DNA[서열 번호 1에 있어서 758번째 염기가 T: abl1 티로신키나아제 A758T(= Y253F)]를 조제했다. 이하, 변이를 갖지 않는 전자를 「wtDNA」, 변이를 갖는 후자를 「mtDNA」라고 한다. 그리고, 양자를 소정의 비율(mtDNA: wtDNA= 100:0, 50:50, 10:90, 5:95, 3:97, 0:100)로 조제하여, 10⁴ copy/test(1 ㎕)를 하기 PCR 반응액 50 ㎕에 첨가하여 PCR 반응을 행했다. 상기 PCR 반응액에 있어서의 저해용 폴리뉴클레오티드의 최종 농도는 200 nM, 검출용 프로브의 최종 농도는 50 nM로 했다. 상기 PCR 반응은, 서멀사이클러에 의해, 95℃로 60초 처리한 후, 95℃ 10초 및 60℃ 30초를 1사이클로서 50 사이클 반복하고 또한 95℃로 1초, 40℃로 60초 처리했다. 그리고, 계속해서, 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 PCR 반응액을 40℃로부터 95℃로 가열하여 시간 경과적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 측정 파장은 585~700 nm로 했다. 또한, 검출용 프로브의 첨가 비율은, 상기 PCR 증폭 산물에 대해 몰비로 0.1배이고, 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가 비율은 상기 PCR 증폭 산물에 대해 몰비로 0.4배 및 상기 프로브에 대해 몰비로 4배이다. 또한, 검출용 프로브의 검출 대상 DNA(검출 대상 서열의 증폭 산물)에 대한 첨가 비율은, 이하와 같다. 이들의 결과를 실시예 1-1로 한다. 또한, 비교예 1-1로서, 저해용 폴리뉴클레오티드 2 ㎕ 대신에 증류수 2 ㎕를 하기 PCR 반응액에 첨가한 외에는, 동일하게 하여 형광 강도의 측정을 행했다.

[표 1]

샘플 (mtDNA:wtDNA)	검출 대상 DNA에 대한 첨가 비율
100:0 50:50 10:90 5:95 3:97 0:100	0.1배 0.2배 1배 2배 3.3배 -

[표 2]

(PCR 반응액: 단위 ㎕)
증류수 10×gene Taq 완충액* 40% 글리세롤 2.5 mM dNTP 100 uM 센스 프라이머 100 uM 안티센스 프라이머 5 uM 검출용 프로브 5 uM 저해용 폴리뉴클레오티드 5 U/㎕ Gene Taq FP*	34.375 5 3.125 4 0.5 0.25 0.5 2 0.25
총량	50 ㎕

*상표명 Gene Taq FP: 닛폰진사 제조 (이하, 동일)

센스 프라이머 서열 번호 9

5'-ggagatggaacgcacggac-3'

안티센스 프라이머 서열 번호 10

5'-ggccaccgtcaggctg-3'

검출용 프로브 서열 번호 4

5'-(TAMRA)-ccgAactggcccccgc-P-3'

저해용 폴리뉴클레오티드 서열 번호 5

5'-cctccccgTactggcccccg-3'

이들의 결과를 도 1 및 도 2에 도시한다. 양 도면은 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 도시하는 Tm 해석 그래프이고, 종축의 미분치란 「-d 형광 강도 증가량/dt」을 도시한다(이하, 동일). 도 1은 실시예 1-1, 도 2는 비교예 1-1의 결과이다. 도 1에 있어서, (A)는 전체 게놈의 100％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (B)는 전체 게놈 중 5％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (C)는 전체 게놈 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (D)는 전체 게놈이 점 돌연변이를 갖지 않는 시료에 대한 결 과이다. 도 2에 있어서, (A)는 전체 게놈 100％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (B)는 전체 게놈 중 50％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (C)는 전체 게놈 중 5％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (D)는 전체 게놈 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (E)는 전체 게놈이 점 돌연변이를 갖지 않는 시료에 대한 결과이다.

도 1(A) 및 도 2(A)에 도시한 바와 같이, mtDNA는 69.5℃, 도 1(D) 및 도 2(E)에 도시한 바와 같이, wtDNA는 61.5℃에서 시그널의 피크가 검출되었다. 이것을 표준으로 하여 각 시료를 평가했다. 그 결과, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하지 않은 비교예 1-1에서는, mtDNA가 50％인 경우, 도 2(B)에 도시한 바와 같이 mtDNA의 시그널을 검출할 수 있지만, mtDNA가 소량(5％, 3％)인 경우에는, 도 2(C) 및 (D)에 도시한 바와 같이 mtDNA의 시그널을 전혀 검출할 수 없었다. 이에 비해, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한 실시예 1-1에서는, mtDNA가 소량(5％, 3％)이더라도, 도 1(B) 및 (C)에 도시한 바와 같이, mtDNA의 시그널을 검출할 수 있었다. 즉, 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가에 의해, 점 돌연변이를 갖지 않는 wtDNA에의 검출용 프로브의 하이브리드화가 저해되었기 때문에, 결과적으로, mtDNA에 결합하는 검출용 프로브의 양이 증가하여, 그에 따라 검출 감도가 향상했다고 말할 수 있다.

(2) 또한, 검출용 프로브의 첨가 비율을 변화시켜, abl1 유전자에 있어서의 758번째 염기의 점 돌연변이(A→ T)에 대한 Tm 해석을 행했다.

상기 실시예 1에 있어서의 PCR 반응액의 검출용 프로브 첨가량 0.5 ㎕를 0.1 ㎕, 증류수 첨가량 34.375 ㎕을 34.775 ㎕로 하여, 상기 검출용 프로브의 최종 농 도를 1/5의 10 nM로 설정한 외에는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 Tm 해석을 행했다. 이 결과를 실시예 1-2로서, 도 3에 도시한다. 도 3에 있어서, (A)는 전체 게놈 100％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (B)는 전체 게놈 중 10％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (C)는 전체 게놈 중 5％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (D)는 전체 게놈 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료에 대한 결과이다.

이 결과, 상기 도에 도시한 바와 같이, mtDNA의 피크가 현저하게 검출되었다. 예컨대, 프로브 첨가량 외에는 동일한 조건으로 해석을 행한 실시예 1-1의 결과와 비교하면, 도 3(C)와 전술의 도 1(B), 도 3(D)와 도 1(C)에 도시한 바와 같이, 프로브의 첨가량을 실시예 1-1보다도 경감(PCR 증폭 산물에 대해 몰비로 0.02배)함으로써, wtDNA의 피크가 더욱 감소하여, mtDNA의 상대적 피크가 커졌다. 이러한 점에서, 프로브 첨가량을 조절함으로써, 검출 감도가 더욱 향상하는 것을 알 수 있었다.

(3) 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가량을 증가하여, abl1 유전자에 있어서의 758번째 염기의 점 돌연변이(A→ T)에 대한 Tm 해석을 행했다.

상기 실시예 1에 있어서의 PCR 반응액의 저해용 폴리뉴클레오티드 첨가량 2 ㎕을 3 ㎕, 증류수 첨가량 34.375 ㎕을 33.775 ㎕로 한 외에는, 상기 (2)의 실시예 1-2와 동일하게 하여 Tm 해석을 행했다. 상기 PCR 반응액에 있어서의 저해용 폴리뉴클레오티드의 최종 농도는 300 nM이며, 검출용 프로브의 최종 농도는 10 nM이다. 이들의 결과를 실시예 1-3로서 도 4에 도시한다. 도 4에 있어서, (A)는 전체 게놈 100％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (B)는 전체 게놈 중 10％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (C)는 전체 게놈 중 5％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (D)는 전체 게놈 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료에 대한 결과이다.

이 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, mtDNA의 피크가 매우 현저하게 검출되었다. 특히, 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가량 외에는 동일한 조건으로 해석을 행한 실시예 1-2의 결과와 비교하면, 도 4(B)와 전술의 도 3(B), 도 4(C)와 도 3(C), 도 4(D)와 도 3(D)에 도시한 바와 같이, 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가량을 실시예 1-2보다도 증가(상기 프로브에 대해 몰비로 30배)함으로써, 또한, wtDNA의 피크가 감소하고, mtDNA의 상대적 피크가 커지고 있다. 이러한 점에서, 저해용 폴리뉴클레오티드 첨가량을 조절함으로써, 한층 더, 검출 감도가 향상하는 것을 알 수 있었다.

[실시예 2]

abl1 유전자의 756번째 염기의 점 돌연변이(G→ C)

저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하여, abl1 유전자에 있어서의 756번째 염기의 점 돌연변이(G→ C)에 대한 Tm 해석을 행했다.

서열 번호 1에 나타내는 756번째의 염기 G에 변이를 갖지 않는 정상 abl1 유전자 서열을 삽입한 플라스미드와, 상기 756번째의 염기 G가 C로 변이한 변이 abl1 유전자[abl1 티로신키나아제 G756C(= Q250E)]를 삽입한 플라스미드를 조제했다. 이하, 변이를 갖지 않는 전자를 「wtDNA」, 변이를 갖는 후자를 「mtDNA」라고 한다. 그리고, 상기 실시예 1의 표 1과 동일하게, 양자를 소정의 비율(mtDNA: wtDNA= 0:100, 3:97, 100:0)로 조제하여, 10⁴ copy/test(1 ㎕)를 하기 PCR 반응액 49 ㎕에 첨가하여 PCR 반응을 행했다. 상기 PCR 반응액에 있어서, 저해용 폴리뉴클레오티드의 최종 농도는 300 nM, 검출용 프로브의 최종 농도는 50 nM로 했다. 상기 PCR 반응은, 서멀사이클러에 의해, 95℃로 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 58℃ 30초를 1사이클로서 50 사이클 반복하고, 또한 95℃로 1초, 40℃로 60초 처리했다. 그리고, 계속해서 온도의 상승 속도를 1℃/3초로서, 상기 PCR 반응액을 40℃로부터 95℃로 가열하여 시간 경과적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 측정 파장은 585~700 nm로 했다. 검출용 프로브의 첨가 비율은 PCR 증폭 산물에 대해 몰비로 0.05배이고, 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가 비율은 상기 PCR 증폭 산물에 대해 몰비로 0.3배 및 상기 프로브에 대해 몰비로 6배이다. 또한, 비교예 2로서, 하기 PCR 반응액에 저해용 폴리뉴클레오티드 3 ㎕ 대신에 증류수 3 ㎕를 첨가한 외에는, 동일하게 하여 형광 강도의 측정을 행했다.

[표 3]

(PCR 반응액: 단위 ㎕)
증류수 10×gene Taq 완충액* 40% 글리세롤 2.5 mM dNTP 100 mM MgCl₂ 100 uM 센스 프라이머 100 uM 안티센스 프라이머 5 uM 검출용 프로브 5 uM 저해용 폴리뉴클레오티드 5 U/㎕ Gene Taq FP*	21.75 5 12.5 4 0.5 1 0.5 0.5 3 0.25
총량	49 ㎕

센스 프라이머 서열 번호 13

5'-gacaagtgggagatggaacgc-3'

안티센스 프라이머 서열 번호 14

5'-cacggccaccgtcagg-3'

검출용 프로브 서열 번호 2

5'-(BODIPYFL)-ccgtaGtggcccccgc-P-3'

저해용 폴리뉴클레오티드 서열 번호 3

5'-ccgtaCtggcccccgc-P-3'

이들의 결과를 도 5에 도시한다. 도 5는 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 도시하는 Tm 해석의 그래프이다. 도 5에 있어서, (A)는 전체 플라스미드가 점 돌연변이를 갖지 않는 시료, (B)는 전체 플라스미드의 100％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (C) 및 (D)는 전체 플라스미드 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료이다. 그리고, 상기 (C)는 비교예 2의 결과, 상기 (D)는 실시예 2의 결과이다.

도 5(A)에 도시한 바와 같이, wtDNA는 61.0℃, 도 5(B)에 도시한 바와 같이, mtDNA는 67.0℃로, 각각 시그널의 피크가 검출되었다. 이것을 표준으로 하여 전체 플라스미드 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료를 평가했다. 그 결과, 도 5(C)에 도시한 바와 같이, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하지 않는 비교예 2에서는, mtDNA의 시그널을 전혀 검출할 수 없었다. 이에 비해, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한 실시예 2에서는, 도 5(D)에 도시한 바와 같이, mtDNA가 소량이더라도, wtDNA와 mtDNA 양쪽의 시그널을 검출할 수 있었다.

[실시예 3]

abl1 유전자의 763번째 염기의 점 돌연변이(G→ A)

저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하여, abl1 유전자에 있어서의 763번째 염기의 점 돌연변이(G→ A)에 대한 Tm 해석을 행했다.

서열 번호 1에 나타내는 763번째의 염기 G에 변이를 갖지 않는 정상 abl1 유전자 서열을 삽입한 플라스미드와, 상기 763번째의 염기 G가 A로 변이한 변이 abl1 유전자[abl1 티로신키나아제 G763A(= E255K)]를 삽입한 플라스미드를 조제했다. 이하, 변이를 갖지 않는 전자를 「wtDNA」, 변이를 갖는 후자를 「mtDNA」라고 한다. 그리고, 상기 실시예 1의 표 1과 동일하게, 양자를 소정의 비율(mtDNA: wtDNA= 0:100, 3:97, 100:0)로 조제하여, 10⁴ copy/test(1 ㎕)를 하기 PCR 반응액 49 ㎕에 첨가하여 PCR 반응을 행했다. 상기 PCR 반응액에 있어서, 저해용 폴리뉴클레오티드의 최종 농도는 500 nM, 검출용 프로브의 최종 농도는 50 nM로 했다. 상기 PCR 반응은, 상기 실시예 2와 동일하게 행하고, 시간 경과적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 측정 파장은 585~700 nm로 했다. 검출용 프로브의 첨가 비율은 상기 PCR 증폭 산물에 대해 몰비로 0.05배이고, 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가 비율은 상기 PCR 증폭 산물에 대해 몰비로 0.5배 및 상기 프로브에 대해 몰비로 10배이다. 또한, 비교예 3으로서, 하기 PCR 반응액에 저해용 폴리뉴클레오티드 5 ㎕ 대신에 증류수 5 ㎕을 첨가한 외에는, 동일하게 하여 형광 강도의 측정을 행했다.

[표 4]

(PCR 반응액: 단위 ㎕)
증류수 10×gene Taq 완충액* 40% 글리세롤 2.5 mM dNTP 100 uM 센스 프라이머 100 uM 안티센스 프라이머 5 uM 검출용 프로브 5 uM 저해용 폴리뉴클레오티드 5 U/㎕ Gene Taq FP*	23.375 5 9.375 4 0.5 1 0.5 5 0.25
총량	49 ㎕

센스 프라이머 서열 번호 15

5'-gacaagtgggagatggaacgc-3'

안티센스 프라이머 서열 번호 16

5'-cacggccaccgtcagg-3'

검출용 프로브 서열 번호 7

5'-(BODIPY FL)-ccagtacgggAaggtgt-P-3'

저해용 폴리뉴클레오티드 서열 번호 8

5'-ccagtacgggGaggtgt-P-3'

이들의 결과를 도 6에 도시한다. 도 6은 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 도시하는 Tm 해석의 그래프이다. 도 6에 있어서, (A)는 전체 플라스미드가 점 돌연변이를 갖지 않는 시료, (B)는 전체 플라스미드의 100％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (C) 및 (D)는 전체 플라스미드 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료이다. 그리고, 상기 (C)는 비교예 3의 결과, 상기 (D)는 실시예 3의 결과이다.

도 6(A)에 도시한 바와 같이, wtDNA는 50.0℃, 도 6(B)에 도시한 바와 같이, mtDNA는 59.0℃로, 각각 시그널의 피크가 검출되었다. 이것을 표준으로 하여 전체 플라스미드 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료를 평가했다. 그 결과, 도 6(C)에 도시한 바와 같이, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하지 않은 비교예 3에서는, mtDNA의 시그널을 전혀 검출할 수 없었다. 이에 비해, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한 실시예 3에서는, 도 6(D)에 도시한 바와 같이, mtDNA가 소량이더라도, wtDNA와 mtDNA의 양쪽의 시그널을 검출할 수 있었다.

[실시예 4]

abl1 유전자의 758번째 염기의 점 돌연변이(A→ T)

저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하여, abl1 유전자에 있어서의 758번째 염기의 점 돌연변이(A→ T)에 대한 Tm 해석을 행했다.

서열 번호 1에 나타내는 758번째의 염기 A에 변이를 갖지 않는 정상 abl1 유전자 서열을 삽입한 플라스미드와, 상기 758번째의 염기 A가 T로 변이한 변이 abl1 유전자[abl1 티로신키나아제 A758T(= Y253F)]를 삽입한 플라스미드를 조제했다. 이하, 변이를 갖지 않는 전자를 「wtDNA」, 변이를 갖는 후자를 「mtDNA」라고 한다. 그리고, 상기 실시예 1의 표 1과 동일하게, 양자를 소정의 비율(mtDNA: wtDNA= 0:100, 3:97, 100:0)로 조제하여, 10⁴ copy/test(1 ㎕)를 하기 PCR 반응액 49 ㎕에 첨가하여 PCR 반응을 행했다. 상기 PCR 반응액에 있어서, 저해용 폴리뉴클레오티드의 최종 농도는 500 nM, 검출용 프로브의 최종 농도는 50 nM로 했다. 상기 PCR 반응은, 상기 실시예 2와 동일하게 행하고, 시간 경과적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 측정 파장은 585~700 nm로 했다. 검출용 프로브의 첨가 비율은, 상기 PCR 증폭 산물에 대해 몰비로 0.05배이고, 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가 비율은, 상기 PCR 증폭 산물에 대해 몰비로 0.5배 및 상기 프로브에 대해 몰비로 10배이다. 또한, 비교예 4로서, 하기 PCR 반응액에 저해용 폴리뉴클레오티드 5 ㎕ 대신 증류수 5 ㎕를 첨가한 외에는, 동일하게 하여 형광 강도의 측정을 행했다.

[표 5]

(PCR 반응액: 단위 ㎕)
증류수 10×gene Taq 완충액* 40% 글리세롤 2.5 mM dNTP 100 uM 센스 프라이머 100 uM 안티센스 프라이머 5 uM 검출용 프로브 5 uM 저해용 폴리뉴클레오티드 5 U/㎕ Gene Taq FP*	20.25 5 12.5 4 1 0.5 0.5 5 0.25
총량	49 ㎕

센스 프라이머 서열 번호 11

5'-gacaagtgggagatggaacgc-3'

안티센스 프라이머 서열 번호 12

5'-cacggccaccgtcagg-3'

검출용 프로브 서열 번호 4

5'-(TAMRA)-ccgAactggcccccgc-P-3'

저해용 폴리뉴클레오티드 서열 번호 6

5'-ccgTactggcccccgc-P-3'

이들의 결과를 도 7에 도시한다. 도 7은 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 도시하는 Tm 해석의 그래프이다. 도 7에 있어서, (A)는 전체 플라스미드가 점 돌연변이를 갖지 않는 시료, (B)는 전체 플라스미드의 100％가 점 돌연변이를 갖는 시료, (C) 및 (D)는 전체 플라스미드 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료이다. 그리고, 상기 (C)는 비교예 4의 결과, 상기 (D)는 실시예 4의 결과이다.

도 7(A)에 도시한 바와 같이, wtDNA는 60.0℃, 도 7(B)에 도시한 바와 같이, mtDNA는 67.0℃로, 각각 시그널의 피크가 검출되었다. 이것을 표준으로 하여 전체 플라스미드 중 3％가 점 돌연변이를 갖는 시료를 평가한 결과, 도 7(C)에 도시한 바와 같이, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하지 않은 비교예 4에서는, mtDNA의 시그널을 전혀 검출할 수 없었다. 이에 비해, 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가한 실시예 4에서는, 도 7(D)에 도시한 바와 같이, mtDNA가 소량이더라도, wtDNA와 mtDNA의 양쪽의 시그널을 검출할 수 있었다.

이상과 같이, 본 발명의 변이 검출 방법에 따르면, 전술한 바와 같은 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가함으로써, 예컨대, 백혈병 환자의 백혈구 시료와 같이, 점 돌연변이를 갖는 검출 대상 DNA와 상기 점 돌연변이를 갖지 않는 비검출 대상 DNA가 혼재하는 시료이더라도, 우수한 감도로 상기 점 돌연변이를 검출할 수 있다. 또한, 변이의 종류를 특정할 수 있기 때문에, 특이성에도 우수한 검출 방법이다. 따라서, 이 방법은, 특히 백혈병 환자의 점 돌연변이 검출에 유용하고, 예컨대, 백혈병 치료약이 개인간에 있어서 적합한지의 여부를 유전자 레벨로 해석하는 것도 가능하게 되기 때문에, 의료의 분야에서 매우 유용한 방법이라고 할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, Inc. <120> Method for detection of mutation and kit therefor <130> TF07027-01 <150> JP2006/216194 <151> 2006-08-08 <150> JP2007/040078 <151> 2007-02-20 <160> 16 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 5381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgttggaga tctgcctgaa gctggtgggc tgcaaatcca agaaggggct gtcctcgtcc 60 tccagctgtt atctggaaga agcccttcag cggccagtag catctgactt tgagcctcag 120 ggtctgagtg aagccgctcg ttggaactcc aaggaaaacc ttctcgctgg acccagtgaa 180 aatgacccca accttttcgt tgcactgtat gattttgtgg ccagtggaga taacactcta 240 agcataacta aaggtgaaaa gctccgggtc ttaggctata atcacaatgg ggaatggtgt 300 gaagcccaaa ccaaaaatgg ccaaggctgg gtcccaagca actacatcac gccagtcaac 360 agtctggaga aacactcctg gtaccatggg cctgtgtccc gcaatgccgc tgagtatctg 420 ctgagcagcg ggatcaatgg cagcttcttg gtgcgtgaga gtgagagcag tcctggccag 480 aggtccatct cgctgagata cgaagggagg gtgtaccatt acaggatcaa cactgcttct 540 gatggcaagc tctacgtctc ctccgagagc cgcttcaaca ccctggccga gttggttcat 600 catcattcaa cggtggccga cgggctcatc accacgctcc attatccagc cccaaagcgc 660 aacaagccca ctgtctatgg tgtgtccccc aactacgaca agtgggagat ggaacgcacg 720 gacatcacca tgaagcacaa gctgggcggg ggccagtacg gggaggtgta cgagggcgtg 780 tggaagaaat acagcctgac ggtggccgtg aagaccttga aggaggacac catggaggtg 840 gaagagttct tgaaagaagc tgcagtcatg aaagagatca aacaccctaa cctggtgcag 900 ctccttgggg tctgcacccg ggagcccccg ttctatatca tcactgagtt catgacctac 960 gggaacctcc tggactacct gagggagtgc aaccggcagg aggtgaacgc cgtggtgctg 1020 ctgtacatgg ccactcagat ctcgtcagcc atggagtacc tggagaagaa aaacttcatc 1080 cacagagatc ttgctgcccg aaactgcctg gtaggggaga accacttggt gaaggtagct 1140 gattttggcc tgagcaggtt gatgacaggg gacacctaca cagcccatgc tggagccaag 1200 ttccccatca aatggactgc acccgagagc ctggcctaca acaagttctc catcaagtcc 1260 gacgtctggg catttggagt attgctttgg gaaattgcta cctatggcat gtccccttac 1320 ccgggaattg acctgtccca ggtgtatgag ctgctagaga aggactaccg catggagcgc 1380 ccagaaggct gcccagagaa ggtctatgaa ctcatgcgag catgttggca gtggaatccc 1440 tctgaccggc cctcctttgc tgaaatccac caagcctttg aaacaatgtt ccaggaatcc 1500 agtatctcag acgaagtgga aaaggagctg gggaaacaag gcgtccgtgg ggctgtgagt 1560 accttgctgc aggccccaga gctgcccacc aagacgagga cctccaggag agctgcagag 1620 cacagagaca ccactgacgt gcctgagatg cctcactcca agggccaggg agagagcgat 1680 cctctggacc atgagcctgc cgtgtctcca ttgctccctc gaaaagagcg aggtcccccg 1740 gagggcggcc tgaatgaaga tgagcgcctt ctccccaaag acaaaaagac caacttgttc 1800 agcgccttga tcaagaagaa gaagaagaca gccccaaccc ctcccaaacg cagcagctcc 1860 ttccgggaga tggacggcca gccggagcgc agaggggccg gcgaggaaga gggccgagac 1920 atcagcaacg gggcactggc tttcaccccc ttggacacag ctgacccagc caagtcccca 1980 aagcccagca atggggctgg ggtccccaat ggagccctcc gggagtccgg gggctcaggc 2040 ttccggtctc cccacctgtg gaagaagtcc agcacgctga ccagcagccg cctagccacc 2100 ggcgaggagg agggcggtgg cagctccagc aagcgcttcc tgcgctcttg ctccgcctcc 2160 tgcgttcccc atggggccaa ggacacggag tggaggtcag tcacgctgcc tcgggacttg 2220 cagtccacgg gaagacagtt tgactcgtcc acatttggag ggcacaaaag tgagaagccg 2280 gctctgcctc ggaagagggc aggggagaac aggtctgacc aggtgacccg aggcacagta 2340 acgcctcccc ccaggctggt gaaaaagaat gaggaagctg ctgatgaggt cttcaaagac 2400 atcatggagt ccagcccggg ctccagcccg cccaacctga ctccaaaacc cctccggcgg 2460 caggtcaccg tggcccctgc ctcgggcctc ccccacaagg aagaagctgg aaagggcagt 2520 gccttaggga cccctgctgc agctgagcca gtgaccccca ccagcaaagc aggctcaggt 2580 gcaccagggg gcaccagcaa gggccccgcc gaggagtcca gagtgaggag gcacaagcac 2640 tcctctgagt cgccagggag ggacaagggg aaattgtcca ggctcaaacc tgccccgccg 2700 cccccaccag cagcctctgc agggaaggct ggaggaaagc cctcgcagag cccgagccag 2760 gaggcggccg gggaggcagt cctgggcgca aagacaaaag ccacgagtct ggttgatgct 2820 gtgaacagtg acgctgccaa gcccagccag ccgggagagg gcctcaaaaa gcccgtgctc 2880 ccggccactc caaagccaca gtccgccaag ccgtcgggga cccccatcag cccagccccc 2940 gttccctcca cgttgccatc agcatcctcg gccctggcag gggaccagcc gtcttccacc 3000 gccttcatcc ctctcatatc aacccgagtg tctcttcgga aaacccgcca gcctccagag 3060 cggatcgcca gcggcgccat caccaagggc gtggtcctgg acagcaccga ggcgctgtgc 3120 ctcgccatct ctaggaactc cgagcagatg gccagccaca gcgcagtgct ggaggccggc 3180 aaaaacctct acacgttctg cgtgagctat gtggattcca tccagcaaat gaggaacaag 3240 tttgccttcc gagaggccat caacaaactg gagaataatc tccgggagct tcagatctgc 3300 ccggcgacag caggcagtgg tccagcggcc actcaggact tcagcaagct cctcagttcg 3360 gtgaaggaaa tcagtgacat agtgcagagg tagcagcagt caggggtcag gtgtcaggcc 3420 cgtcggagct gcctgcagca catgcgggct cgcccatacc cgtgacagtg gctgacaagg 3480 gactagtgag tcagcacctt ggcccaggag ctctgcgcca ggcagagctg agggccctgt 3540 ggagtccagc tctactacct acgtttgcac cgcctgccct cccgcacctt cctcctcccc 3600 gctccgtctc tgtcctcgaa ttttatctgt ggagttcctg ctccgtggac tgcagtcggc 3660 atgccaggac ccgccagccc cgctcccacc tagtgcccca gactgagctc tccaggccag 3720 gtgggaacgg ctgatgtgga ctgtcttttt catttttttc tctctggagc ccctcctccc 3780 ccggctgggc ctccttcttc cacttctcca agaatggaag cctgaactga ggccttgtgt 3840 gtcaggccct ctgcctgcac tccctggcct tgcccgtcgt gtgctgaaga catgtttcaa 3900 gaaccgcatt tcgggaaggg catgcacggg catgcacacg gctggtcact ctgccctctg 3960 ctgctgcccg gggtggggtg cactcgccat ttcctcacgt gcaggacagc tcttgatttg 4020 ggtggaaaac agggtgctaa agccaaccag cctttgggtc ctgggcaggt gggagctgaa 4080 aaggatcgag gcatggggca tgtcctttcc atctgtccac atccccagag cccagctctt 4140 gctctcttgt gacgtgcact gtgaatcctg gcaagaaagc ttgagtctca agggtggcag 4200 gtcactgtca ctgccgacat ccctccccca gcagaatgga ggcaggggac aagggaggca 4260 gtggctagtg gggtgaacag ctggtgccaa atagccccag actgggccca ggcaggtctg 4320 caagggccca gagtgaaccg tcctttcaca catctgggtg ccctgaaagg gcccttcccc 4380 tcccccactc ctctaagaca aagtagattc ttacaaggcc ctttcctttg gaacaagaca 4440 gccttcactt ttctgagttc ttgaagcatt tcaaagccct gcctctgtgt agccgccctg 4500 agagagaata gagctgccac tgggcacctg cgcacaggtg ggaggaaagg gcctggccag 4560 tcctggtcct ggctgcactc ttgaactggg cgaatgtctt atttaattac cgtgagtgac 4620 atagcctcat gttctgtggg ggtcatcagg gagggttagg aaaaccacaa acggagcccc 4680 tgaaagcctc acgtatttca cagagcacgc ctgccatctt ctccccgagg ctgccccagg 4740 ccggagccca gatacggggg ctgtgactct gggcagggac ccggggtctc ctggaccttg 4800 acagagcagc taactccgag agcagtgggc aggtggccgc ccctgaggct tcacgccggg 4860 agaagccacc ttcccacccc ttcataccgc ctcgtgccag cagcctcgca caggccctag 4920 ctttacgctc atcacctaaa cttgtacttt atttttctga tagaaatggt ttcctctgga 4980 tcgttttatg cggttcttac agcacatcac ctctttgccc ccgacggctg tgacgcagcc 5040 ggagggaggc actagtcacc gacagcggcc ttgaagacag agcaaagcgc ccacccaggt 5100 cccccgactg cctgtctcca tgaggtactg gtcccttcct tttgttaacg tgatgtgcca 5160 ctatatttta cacgtatctc ttggtatgca tcttttatag acgctctttt ctaagtggcg 5220 tgtgcatagc gtcctgccct gccccctcgg gggcctgtgg tggctccccc tctgcttctc 5280 ggggtccagt gcattttgtt tctgtatatg attctctgtg gttttttttg aatccaaatc 5340 tgtcctctgt agtatttttt aaataaatca gtgtttacat t 5381 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 2 ccgtagtggc ccccgc 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> polynucleotide <400> 3 ccgtactggc ccccgc 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 4 ccgaactggc ccccgc 16 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> polynucleotide <400> 5 cctccccgta ctggcccccg 20 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> polynucleotide <400> 6 ccgtactggc ccccgc 16 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> purobe <400> 7 ccagtacggg aaggtgt 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> polynucleotide <400> 8 ccagtacggg gaggtgt 17 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense primer <400> 9 ggagatggaa cgcacggac 19 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense primer <400> 10 ggccaccgtc aggctg 16 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense primer <400> 11 gacaagtggg agatggaacg c 21 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense primer <400> 12 cacggccacc gtcagg 16 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense primer <400> 13 gacaagtggg agatggaacg c 21 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense primer <400> 14 cacggccacc gtcagg 16 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense primer <400> 15 gacaagtggg agatggaacg c 21 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense primer <400> 16 cacggccacc gtcagg 16

Claims

시료 중 DNA의 변이를 검출하는 방법으로서,

상기 시료는 검출 부위가 변이된 검출 대상 DNA와 상기 검출 부위가 미변이된 비검출 대상 DNA를 함유하는 시료이고,

하기 (A) ~(E) 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이의 검출 방법:

(A) 상기 DNA를 포함하는 시료에, 검출 대상 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 검출용 프로브 및 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하는 공정으로서,

상기 검출 대상 서열은 상기 검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 변이된 상기 검출 부위를 포함하고,

상기 비검출 대상 서열은 상기 비검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 미변이된 상기 검출 부위를 포함하는 것인 공정,

(B) 상기 DNA에 상기 검출용 프로브를 하이브리드화시키는 공정,

(C) 상기 DNA와 상기 검출용 프로브의 하이브리드 형성체에 대해 온도 변화에 따른 시그널의 변동을 측정하는 공정,

(D) 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm치를 결정하는 공정,

(E) 상기 Tm치로부터 상기 검출 대상 부위에서의 변이의 유무를 결정하는 공정.
제1항에 있어서, 상기 검출용 프로브는 표지화 물질로 표지화된 프로브인 변이의 검출 방법.
제2항에 있어서, 상기 표지화 프로브는 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브, 또는 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브인 변이의 검출 방법.
제2항에 있어서, 상기 표지화 물질은 형광 색소이고, 상기 표지화 프로브가 단독으로 형광을 나타내며 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소하는 프로브인 변이의 검출 방법.
제2항에 있어서, 상기 표지화 프로브는 그 3' 말단의 염기가 시토신이고, 또한, 상기 3' 말단이 표지화된 프로브인 변이의 검출 방법.
제2항에 있어서, 상기 표지화 프로브는 그 5' 말단의 염기가 시토신이고, 또한, 상기 5' 말단이 표지화된 프로브인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 검출 대상 서열에 상보적인 검출용 프로브와 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드는 상기 검출 부위와 쌍을 이루는 부위를 제외하고 동일한 서열인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드의 첨가 비율은 상기 검출용 프로브에 대해 몰비로 0.1~100배인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 검출용 프로브의 첨가 비율은 상기 DNA에 대해 몰비로 1배 이하인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA는 백혈구 유래의 DNA인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 변이는 abl1 유전자의 변이인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 변이는 서열 번호 1의 염기 서열에서 756번째 염기 G의 C로의 변이인 변이의 검출 방법.
제12항에 있어서, 상기 검출용 프로브는 서열 번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프로브이고, 상기 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 변이는 서열 번호 1의 염기 서열에서 758번째 염기 A 의 T로의 변이인 변이의 검출 방법.
제14항에 있어서, 상기 검출용 프로브는 서열 번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프로브이고, 상기 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 적어도 하나의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 변이는 서열 번호 1의 염기 서열에서 763번째 염기 G의 A로의 변이인 변이의 검출 방법.
제16항에 있어서, 상기 검출용 프로브는 서열 번호 7의 염기 서열로 이루어지는 프로브이고, 상기 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료 중의 DNA는 이중쇄 DNA이고, 상기 (B) 공정에 앞서 가열에 의해 상기 시료 중의 이중쇄 DNA를 해리시키는 공정을 포함하는 것인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA는 상기 시료 유래의 DNA를 주형으로 하여 유전자 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA는 상기 시료 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 생성시킨 cDNA를 주형으로 하여 유전자 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 (C) 공정에 있어서, 상기 DNA와 상기 검출용 프로브의 하이브리드 형성체를 가열하여 온도 상승에 따른 시그널의 변동을 측정하는 것인 변이의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 (B) 공정과 상기 (C) 공정을 병행하여 행하는 방법으로서, 상기 시료의 온도를 강하시켜 상기 하이브리드 형성체를 형성하고, 상기 온도 강하에 따른 시그널의 변동을 측정하는 것인 변이의 검출 방법.
제1항에 기재한 변이의 검출 방법에 사용하는 검출용 프로브 키트로서, 검출 대상 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 검출용 프로브와, 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드를 포함하고,

상기 검출 대상 서열은 검출 부위가 변이된 검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 변이된 상기 검출 부위를 포함하며,

상기 비검출 대상 서열은 상기 검출 부위가 미변이된 상기 비검출 대상 DNA 또는 그 부분 서열로서, 미변이된 상기 검출 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출용 프로브 키트.
제23항에 있어서, 상기 검출용 프로브는 표지화 물질로 표지화된 프로브인 검출용 프로브 키트.
제23항에 있어서, 상기 검출 대상 서열에 상보적인 검출용 프로브와 상기 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드는 상기 검출 부위와 쌍을 이루는 부위를 제외하고 동일한 서열인 검출용 프로브 키트.
제23항에 있어서, 상기 변이는 abl1 유전자의 변이인 검출용 프로브 키트.
제23항에 있어서, 상기 변이는 서열 번호 1의 염기 서열에서 756번째 염기 G의 C로의 변이이고, 상기 검출용 프로브는 서열 번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프로브이며, 상기 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 검출용 프로브 키트.
제23항에 있어서, 상기 변이는 서열 번호 1의 염기 서열에서 758번째 염기 A의 T로의 변이이고, 상기 검출용 프로브는 서열 번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프로브이며, 상기 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 적어도 하나의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 검출용 프로브 키트.
제23항에 있어서, 상기 변이는 서열 번호 1의 염기 서열에서 763번째 염기 G의 A로의 변이이고, 상기 검출용 프로브는 서열 번호 7의 염기 서열로 이루어지는 프로브이며, 상기 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 검출용 프로브 키트.
DNA의 변이의 유무를 결정하기 위한 데이터를 해석하는 방법으로서,

하기 (a) ~(b) 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 데이터의 해석 방법:

(a) 제1항에 기재한 변이의 검출 방법의 (C) 공정에서 얻은 시그널 변동으로부터 Tm치를 연산하는 공정, 및

(b) 상기 연산 공정에서 연산한 상기 Tm치로부터 DNA의 변이의 유무를 결정하는 공정.
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제1항에 있어서, 상기 (A) 공정에서 상기 DNA를 포함하는 시료에 상기 검출용 프로브 및 상기 비검출 대상 서열에의 검출용 프로브의 하이브리드화를 억제하는 저해용 폴리뉴클레오티드를 첨가하고 유전자 증폭에 의해 DNA의 증폭을 행하고, 상기 (B) 공정에서 상기 유전자 증폭법에 의해 증폭된 DNA 증폭산물에 상기 프로브를 하이브리드화시키는 것인 변이의 검출 방법.